Charakterystyka funkcjonalna i wizualizacja fibroblastów przełyku przy użyciu kokultur organoidowych

Summary

Współhodowle organoidów i fibroblastów dostarczają modelu do badania niszy komórek macierzystych in vivo. W tym miejscu opisano protokół dla kokultur organoidów i fibroblastów przełyku. Dodatkowo obrazowanie całego mocowania służy do wizualizacji interakcji fibroblast-organoid.

Abstract

Nabłonkowe komórki macierzyste i progenitorowe przyczyniają się do tworzenia i utrzymywania bariery nabłonkowej przez całe życie. Większość populacji komórek macierzystych i progenitorowych jest ukryta w anatomicznie odrębnych miejscach, co umożliwia ekskluzywne interakcje z sygnałami niszowymi, które utrzymują łodygę. Podczas gdy rozwój nabłonkowych kultur organoidowych stanowi potężne narzędzie do zrozumienia roli komórek macierzystych i progenitorowych w homeostazie i chorobie, interakcja w środowisku niszowym jest w dużej mierze nieobecna, co utrudnia identyfikację czynników wpływających na zachowanie komórek macierzystych. Fibroblasty odgrywają kluczową rolę w kierowaniu losem pnia nabłonka i progenitorów. W artykule przedstawiono kompleksowy protokół kohodowli organoidów i fibroblastów, umożliwiający wyznaczenie subpopulacji fibroblastów w odnowie i różnicowaniu komórek progenitorowych przełyku. W tym protokole opisano metodę izolowania zarówno komórek nabłonkowych, jak i fibroblastów równolegle z przełyku. Przedstawiono odrębne strategie sortowania komórek aktywowane fluorescencją w celu wyizolowania zarówno komórek progenitorowych przełyku, jak i subpopulacji fibroblastów od transgenicznych myszy reporterowych lub dzikich myszy. Protokół ten zapewnia wszechstronne podejście, które można dostosować do izolacji określonych subpopulacji fibroblastów. Ustanawianie i pasażowanie monokultur organoidowych nabłonka przełyku jest zawarte w tym protokole, co umożliwia bezpośrednie porównanie z systemem kokultur. Ponadto opisano metodę oczyszczania 3D, która pozwala na szczegółową analizę obrazu interakcji nabłonek-fibroblasty. Podsumowując, protokół ten opisuje porównawczą i stosunkowo wysokoprzepustową metodę identyfikacji i zrozumienia niszowych składników komórek macierzystych przełyku in vitro.

Introduction

Organoidy są używane jako testy 3D in vitro do charakteryzowania komórek macierzystych i progenitorowych, a także do zrozumienia sygnałów sygnałowych pochodzących ze składników komórkowych niszy komórek macierzystych^1,2,3,4. Organoidy przełyku myszy zostały po raz pierwszy opisane w 2014 roku, a w kilku artykułach zidentyfikowano czynniki wzrostu, takie jak R-Spondyna (RSPO), NOGGIN i naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), potrzebne do utrzymania i przejścia organoidów przełyku^5,6,7, argumentując, że podobne sygnały sygnalizacyjne są wymagane w in vivo odnowa komórek progenitorowych. Jednak czynniki wzrostu są zwykle dodawane w stężeniach niefizjologicznych, co skutkuje warunkami wzrostu organoidów, które niekoniecznie odzwierciedlają środowisko sygnalizacyjne in vivo.

Fibroblasty to heterogeniczne populacje komórek zrębowych, które wspierają właściwości komórek progenitorowych w wielu niszach komórek macierzystych⁸. Połączenie nabłonkowych komórek progenitorowych i fibroblastów w tej samej kulturze organoidów umożliwia tworzenie organoidów w obniżonych stężeniach egzogennie suplementowanych czynników wzrostu. Opisano systemy kohodowli organoidów z nabłonka jelitowego i wątrobowego, ale protokół ustanawiający kokultury organoidów i fibroblastów przełyku jest nadal znany^9,10,11.

W tym protokole przedstawiono dwie strategie sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) dla fibroblastów z przełyku, przy użyciu transgenicznych myszy^{Pdgfrα H2BeGFP12} lub myszy typu dzikiego z klasycznym barwieniem przeciwciałami. Różne subpopulacje fibroblastów można izolować za pomocą wybranych markerów powierzchni komórek, zapewniając w ten sposób elastyczność protokołu. Ponadto do scharakteryzowania oddziaływań fibroblast-organoid stosuje się technikę obrazowania fluorescencyjnego 3D zachowującą morfologię organoidów. Oczyszczanie organoidów zapewnia szybką metodę zwiększania głębokości penetracji światła w organoidach, poprawiając wizualizację połączeń organoid-fibroblasty i umożliwiając rekapitulację struktury organoidu w całości. Protokół ten łączy kohodowlę organoidów przełyku z całą strategią obrazowania wierzchowca, umożliwiając funkcjonalną charakterystykę interakcji fibroblast-organoid

.

Protocol

Eksperymenty na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Stockholms Norra djurförsöksetiska nämnd (zezwolenie etyczne nr 14051-2019). Zwierzęta trzymano w warunkach wolnych od patogenów zgodnie z zaleceniami Federacji Europejskiego Stowarzyszenia Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych.

1. Przygotowanie

1. Rozmrozić enzymatyczne roztwory podstawowe używane do dysocjacji (patrz tabela materiałów) na lodzie. Rozmrozić podwielokrotność matrycy (matrycy) błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu (GFR) w temperaturze 4 °C.
2. Przygotuj pożywkę hodowlaną. Należy użyć pożywki opisanej w Tabeli 1 dla kultur organoidowych i kokultur i przygotować ją przed rozpoczęciem protokołu.

2. Rozwarstwienie i oddzielenie nabłonka przełyku i zrębu

UWAGA: Upewnij się, że wszystkie narzędzia używane do preparowania i przetwarzania tkanek są sterylne. Przygotuj 2 ml roztworu dysocjacyjnego (patrz tabela materiałów) w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS) na trzy przełyki.

1. Użyj wybranego szczepu myszy, takiego jak myszy C57BL/6J. Rozwój przełyku u myszy kończy się po dniu pourodzeniowym (p) 70, dlatego zaleca się używanie myszy starszych niż p70¹³. Użyj czterech lub pięciu myszy, ponieważ dostarczają one wystarczającego materiału do założenia 8-10 wspólnych kultur organoidów.
   UWAGA: Wydajność tworzenia organoidów zmniejsza się wraz z wiekiem myszy. Jeśli przedmiotem zainteresowania są określone subpopulacje fibroblastów, możliwe jest, że niska wydajność fibroblastów ogranicza liczbę możliwych do ustalenia kokultur organoidów.
2. Użyj myszy zmodyfikowanych genetycznie (np.^{Pdgfrα H2BeGFP}) lub dzikich (WT) do izolacji populacji fibroblastów. W przypadku korzystania z myszy WT należy wykonać barwienie przeciwciałami, aby wyizolować określone subpopulacje fibroblastów ze zrębu za pomocą FACS.
3. Poddać myszy eutanazji przez uduszenie CO₂ . Wypreparuj przełyk za pomocą kleszczy i nożyczek preparacyjnych. Aby usunąć cały przełyk, odetnij dystalny koniec przełyku bezpośrednio nad żołądkiem i bliższy koniec na początku tchawicy. Zanurz przełyk w PBS i umieść go na lodzie.
4. Mechanicznie usuń mięsień zewnętrzny za pomocą mikroskopu preparacyjnego (całkowity zakres powiększenia 8x-40x) i kleszczy. Przytrzymaj dystalny koniec rozciętego przełyku za pomocą jednej pary kleszczy, a drugą kleszczami użyj do chwycenia i pociągnięcia mięśnia od dystalnego do bliższego końca rozciętego przełyku. Usuń i wyrzuć warstwę mięśni.
5. Otwórz przełyk wzdłużnie. Działa to najlepiej przy użyciu nożyczek sprężynowych do mikrodysekcji z końcówką kulkową, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek. Przytrzymaj jeden koniec przełyku, aby włożyć kulkę nożyczek sprężynowych do światła przełyku i rozciąć przełyk, trzymając się końca.
6. Umieść przełyk w mikroprobówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml lub na płytce 24-dołkowej. Inkubować otwarty przełyk w 0,5 mg/ml termolizyny w HBSS w temperaturze 37 °C na wytrząsarce kołyskowej przez 15 minut. Całkowicie zanurz przełyk w roztworze termolizyny.
   UWAGA: Objętość użytego roztworu termolizyny zależy od wielkości studzienki lub probówki. Kilka przełyków można umieścić i zanurzyć w tej samej studni lub rurze.
7. Wyjmij przełyk z roztworu termolizyny. Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby ostrożnie oddzielić nabłonek przełyku od zrębu. Za pomocą cienkich kleszczy chwyć zarówno stronę nabłonkową, jak i stronę zrębu tkanki i powoli rozsuń je, aby oddzielić dwie warstwy.
   UWAGA: Zrąb można rozpoznać po jego białym i nieprzezroczystym wyglądzie, w przeciwieństwie do przezroczystego nabłonka. Zrąb zawiera blaszkę właściwą i warstwę podśluzówkową.
8. Przenieść warstwę nabłonkową i zrębową do dwóch oddzielnych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml z 200 μl roztworu dysocjacyjnego w HBSS. Połóż na lodzie.

3. Izolacja komórek progenitorowych przełyku

UWAGA: Izolacja komórek progenitorowych przełyku (krok 2) i fibroblastów (krok 3) może być przeprowadzona równocześnie. Przygotuj probówkę o pojemności 50 ml z 1% FBS w HBSS (1% FBS).

1. Przenieść oddzielony nabłonek przełyku z probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml (krok 2.8) na czystą szalkę Petriego i użyć ostrego skalpela do zmielenia. Zebrać zmieloną tkankę z płytki Petriego z 200 μl roztworu dysocjacyjnego i przenieść ją z powrotem do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
   UWAGA: Nabłonek jest odpowiednio rozdrobniony, gdy kawałki można umieścić z powrotem w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl.
2. Dodać 800 μl świeżego roztworu dysocjacyjnego do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej do całkowitej objętości 1 ml.
   UWAGA: Ważne jest, aby dodać wystarczającą ilość roztworu dysocjacyjnego. Na jeden do trzech przełyków zaleca się 1 ml roztworu. Zwiększ skalę, gdy jednocześnie przetwarzanych jest więcej przełyku.
3. Umieścić probówkę z rozdrobnioną warstwą nabłonka na wytrząsarce w temperaturze 37 °C na 60 minut. Pipetować roztwór w górę i w dół około 20 razy za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl co 15 minut, aby poprawić trawienie.
4. Po 60 minutach pipetuj w górę i w dół kolejne 20 razy, używając końcówki do pipety o pojemności 200 μl. Przepuść roztwór przez sitko o wielkości 40 μm do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Zwilż sitko komórek 1% FBS przed odcedzeniem komórek, aby zminimalizować przyleganie komórek do filtra. Nabłonek nie zostanie całkowicie strawiony, a fragmenty tkanki będą nadal widoczne. Dłuższa inkubacja zmniejszy jednak przeżywalność komórek i nie spowoduje wyższej wydajności żywych komórek.
5. Odrzucić supernatant, usuwając nadmiar cieczy za pomocą pipety o pojemności 1 ml i ponownie zawiesić osad w 1 ml 1% FBS. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   1. Podczas wirowania przygotuj sprzężoną mieszankę przeciwciał do FACS komórek progenitorowych przełyku.
   2. Wymieszaj 1 μl CD324-PE-Cy7 (ECADHERIN) i CD104-A647 (INTEGRIN-β4) w 200 μl 1% FBS na milion komórek.
      UWAGA: 1 μL przeciwciała (200 μL objętości końcowej) wystarcza na jeden lub dwa przełyki. Podczas przetwarzania większej ilości przełyku na raz zwiększ objętość roztworu barwiącego przeciwciała.
6. Zawiesić osad w 200 μl mieszaniny przeciwciał i przenieść do probówki do cytometrii przepływowej. Po dodaniu przeciwciał fluorescencyjnych należy przechowywać zawiesiny komórek w ciemności, aby uniknąć blaknięcia sygnału. Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Dodać 3 ml 1% FBS i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie ponownie zawiesić komórki w minimum 200 μl 1% FBS.
   UWAGA: 500 μL 1% FBS stosuje się do czterech lub pięciu przełyków. Zwiększ objętość, gdy jednocześnie przetwarzanych jest więcej przełyku, aby można było osiągnąć natężenie przepływu FACS na poziomie 100-300 zdarzeń/s. Więcej zdarzeń zmniejszy wydajność sortowania, a wzrost natężenia przepływu zmniejszy przeżywalność komórek.
7. Dodaj marker barwienia martwych komórek do końcowego stężenia 1:10 000 na 5 minut przed sortowaniem FACS, aby wyizolować żywe komórki. Posortuj komórki progenitorowe za pomocą maszyny FACS (patrz Rysunek 1 dla strategii bramkowania). Zebrać komórki do 1,5 ml probówek do mikrowirówek wypełnionych 200 μl podstawowej pożywki organoidowej (Tabela 1).

4. Izolacja fibroblastów z warstwy zrębu

1. Pokrój warstwę stomii na drobne kawałki w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 200 μl roztworu dysocjacyjnego (krok 2.8) za pomocą nożyczek do preparacji. Tkanka jest odpowiednio mielona, gdy roztwór można pipetować w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl.
2. Dodać 800 μl świeżego roztworu dysocjacyjnego do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej do całkowitej objętości 1 ml.
   UWAGA: Ważne jest, aby dodać wystarczającą ilość roztworu dysocjacyjnego. Na jeden do trzech przełyków zaleca się 1 ml roztworu. Zwiększ skalę, gdy jednocześnie przetwarzanych jest więcej przełyku.
3. Umieścić probówkę na wytrząsarce kołyskowej w temperaturze 37 °C na 30 minut. Po 15 minutach odpipetuj roztwór w górę i w dół około 20 razy, używając końcówki do pipety o pojemności 200 μl, aby poprawić trawienie.
4. Po 30 minutach trawienia enzymatycznego pipetuj pipetą w górę i w dół kolejne 20 razy za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl. Przecedzić roztwór przez sitko o wielkości 70 μm do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Zwilż sitko komórek 1% FBS przed odcedzeniem komórek, aby zminimalizować przyleganie komórek do filtra.
5. Odrzucić supernatant, usuwając nadmiar cieczy za pomocą pipety o pojemności 1 ml i ponownie zawiesić osad w 1 ml 1% FBS. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: W przypadku stosowania genetycznie zmodyfikowanego szczepu myszy zawierającego fibroblasty znakowane fluorescencyjnie, barwienie przeciwciałami jest opcjonalne. Jeśli barwienie przeciwciałami nie jest wymagane, należy przejść do kroku 3.7 i przenieść próbkę do probówki do cytometrii przepływowej.
   1. Podczas wirowania należy przygotować sprzężoną mieszaninę przeciwciał do izolacji fibroblastów metodą FACS. Wymieszaj 1 μl CD26-APC (DPP4) w 200 μl 1% FBS na milion komórek.
      UWAGA: 1 μL przeciwciała wystarcza na jeden lub dwa przełyki. Podczas przetwarzania większej ilości przełyku na raz zwiększ objętość roztworu barwiącego przeciwciała.
6. Zawiesić osad w 200 μl mieszaniny sprzężonych przeciwciał w 1% FBS i przenieść do probówki do cytometrii przepływowej. Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
7. Dodać 3 ml 1% FBS i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w co najmniej 200 μl 1% FBS.
   UWAGA: 500 μL 1% FBS stosuje się do czterech lub pięciu przełyków. Zwiększ objętość, gdy jednocześnie przetwarzanych jest więcej przełyku, aby można było osiągnąć natężenie przepływu 100-300 zdarzeń / s. Więcej zdarzeń zmniejszy wydajność sortowania, a zwiększenie natężenia przepływu zmniejszy przeżywalność komórek. Po dodaniu przeciwciał fluorescencyjnych zawiesiny komórek powinny być ciemne, aby uniknąć blaknięcia sygnału.
8. Dodaj marker barwienia martwych komórek do końcowego stężenia 1:10 000 na 5 minut przed sortowaniem FACS, aby wyizolować żywe komórki. Posortuj komórki za pomocą maszyny FACS (zobacz Rysunek 1 dla strategii bramkowania). Zebrać komórki do 1,5 ml probówek do mikrowirówek wypełnionych 200 μl podstawowej pożywki organoidowej (Tabela 1).

5. Zakładanie i hodowla organoidów przełyku

UWAGA: Wstępnie podgrzej ER_nisko (kokultura organoidowa), ENR (organoid) pożywka (patrz Tabela 1 dla opisu) i 48-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C. Umieść rozmrożoną matrycę (przygotowaną w kroku 1) podwielokrotność na lodzie. Zaleca się stosowanie dostarczonej tutaj matrycy (patrz Tabela materiałów) do hodowli organoidów przełyku myszy, ponieważ inne marki matryc negatywnie wpływają na wydajność tworzenia organoidów.

1. W przypadku kohodowli organoidów wymieszaj posortowane komórki nabłonkowe i fibroblasty w stosunku 1:2 w probówce. Do każdej kopuły macierzy użyj 5 000 komórek nabłonka i 10 000 fibroblastów. Przygotowując się do większej liczby kopuł, dodaj wielokrotność 5 000 komórek nabłonka i 10 000 fibroblastów do jednej probówki. W przypadku kultur organoidowych bez fibroblastów należy użyć 5 000 komórek nabłonkowych na kopułę macierzy.
2. Odwirować populację mieszanych komórek przy sile 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant, ostrożnie usuwając go pipetą o pojemności 200 μl.
3. Umyj komórki raz, ponownie zawieszając osad w zimnym podstawowym podłożu organoidowym i wiruj przy 300 x g przez 5 minut. Umieść komórki na lodzie.
4. Przygotuj mieszankę składającą się w 80% z matrycy i w 20% z zimnego zasadowego podłoża organoidowego. Umieść wszystko na lodzie, gdy matryca zestala się w temperaturze pokojowej (RT).
5. Po odwirowaniu odrzucić sklarowany osad, ostrożnie usuwając go pipetą o pojemności 200 μl. Zawiesić komórki w 10 μl mieszanki matrycowej/kopuły i umieścić z powrotem na lodzie.
6. Pobrać wstępnie ogrzaną 48-dołkową płytkę z inkubatora o temperaturze 37 °C i wykonać jedną kopułę matrycy na dołek za pomocą pipety o pojemności 20 μl. Każda kopuła zawiera 10 μl 80% matrycy, 5 000 komórek nabłonka i 10 000 fibroblastów. Przenieść płytkę do góry dnem do inkubatora i pozostawić kopuły do zestalenia się przez kolejne 20-30 minut w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Zmniejszenie objętości kopuły matrycy i/lub wzrost liczby komórek wpłynie na wydajność tworzenia organoidów.
7. Dodać 200 μl wstępnie podgrzanej pożywki o_niskiej zawartości ER (tabela 1) do kopuł matrycy zawierających kokultury organoidów, a pożywki ENR (tabela 1) do odpowiednich kopuł matrycy zawierających tylko organoidy nabłonkowe i umieścić płytkę w inkubatorze.
8. Hodować organoidy w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Przez pierwsze 2 dni należy uzupełnić podłoże 10 μM inhibitorem skał (Y-27623). Inhibitor skał zapobiega śmierci komórek wywołanej stresem i zwiększa szansę na pomyślne założenie kultur organoidowych.
9. Odświeżaj podłoże co 2-3 dni. Upewnij się, że podłoże jest ciepłe, aby zapobiec dysocjacji matrycy wrażliwej na temperaturę.
10. Analizy eksperymentu należy przeprowadzić 6 do 8 dni po posiewie. Organoidy można przechowywać w hodowli do 14 dni. Około 14 dnia obserwuje się utratę integralności kopuły.

6. Pasaż organoidów

UWAGA: Pasażowanie organoidów hodowanych w kokulturze powoduje utratę fibroblastów. Dlatego zaleca się stosowanie pożywki ENR dla wszystkich organoidów podczas pasażowania. Rozgrzej ENR, PBS i 48-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C.

1. Usunąć pożywkę i umyć studzienkę zawierającą kopułę matrycy wstępnie podgrzanym PBS. Dodać 200 μl zimnego 0,25% roztworu trypsyny i pipetować w górę iw dół, aby rozbić kopułę matrycy.
   UWAGA: Zaleca się stosowanie zimnej 0,25% trypsyny, ponieważ matryca jest wrażliwa na temperaturę, co pomaga w rozbijaniu kopuł matrycy.
2. Inkubować organoidy z trypsyną w temperaturze 37 °C przez ~20 min. Pipetować w górę i w dół po 10 minutach, aby zwiększyć dysocjację organoidów. Monitoruj proces dysocjacji za pomocą mikroskopu co 5-10 minut. Ponieważ trypsyna zmniejsza żywotność komórek, może to pomóc w określeniu idealnego czasu dysocjacji.
3. Po 20 minutach pipetować organoidy w górę i w dół pipetą o pojemności 200 μl, aby oddzielić organoidy. Zebrać komórki do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, dodać 1 ml podstawowej pożywki organoidowej i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
4. Opcjonalnie: Aby zapewnić najlepsze warunki wzrostu organoidów i aby nowe organoidy pochodziły z pojedynczych komórek, należy przecedzić komórki przez wstępnie zwilżone sitko o średnicy 40 μm. Filtrowanie zawiesiny komórkowej powoduje usunięcie rdzeni organoidów i grudek komórek, które są trudne do dysocjacji.
5. Przygotować mieszankę matrycową składającą się w 80% z matrycy i w 20% z zimnej zasadowej pożywki organoidowej. Umieść wszystko na lodzie, gdy matryca zestala się w temperaturze pokojowej.
6. Odrzucić supernatant ostrożnie usuwając go pipetą o pojemności 200 μl, ponownie zawiesić komórki w 10 μl mieszanki matrycowej/kopułki i umieścić mieszaninę z powrotem na lodzie.
   UWAGA: Organoidy można dzielić w stosunku 1:5 do 1:10, w zależności od gęstości kopuły. Komórki nabłonkowe można również liczyć i ponownie platerować z prędkością 5 000 komórek/kopułę.
7. Pobrać wstępnie podgrzaną 48-dołkową płytkę z inkubatora o temperaturze 37 °C i wykonać jedną kopułę na każdy dołek. Przenieść płytkę do góry nogami do inkubatora i pozostawić kopuły do zestalenia się przez kolejne 20-30 minut w temperaturze 37 °C.
8. Dodaj 200 μl wstępnie podgrzanej pożywki ENR do odpowiednich kopuł organoidowych. Uzupełnij pożywkę 10 μM inhibitorem skał (Y-27623) przez pierwsze 2 dni.
9. Odświeżaj podłoże co 2-3 dni. Upewnij się, że podłoże jest ciepłe, aby zapobiec dysocjacji matrycy wrażliwej na temperaturę.

7. Przetwarzanie organoidów do barwienia całego wierzchowca

UWAGA: Przed użyciem pokryj końcówki i rurki 10% FBS w PBS, aby uniknąć przylegania organoidów do plastiku. W przypadku końcówek do pipet wystarczy raz lub dwa razy pipetować w górę i w dół w 10% roztworze FBS/PBS przed użyciem końcówki. W przypadku probówek napełnij probówkę 10% FBS/PBS, a następnie usuń roztwór.

1. Usunąć pożywkę organoidową i dodać 200 μl lodowatego PBS do kopuł matrycy. Umieść talerz na lodzie na 5-10 minut.
2. Pipetować w górę i w dół i przenieść roztwór do 0,6 ml nieprzywierających probówek do mikrowirówek. Wirować krótko przez 30-60 s przy 100 x g, aby organoidy osiadły na dnie.
   UWAGA: Nadmierne pipetowanie i długie wirowanie rozbija organoidy i zakłóca interakcję fibroblast-organoid.
3. Usuń nadmiar płynu i dodaj lodowaty PBS. Wirować krótko przez 30-60 s przy 100 x g, aby organoidy mogły osiąść na dnie.
4. Usuń nadmiar płynu i utrwal organoid za pomocą 200 μl zimnego 4% formaldehydu w roztworze PBS przez 30 minut na lodzie.
   UWAGA: Formaldehyd jest toksyczny i musi być zawsze stosowany w dygestoriach chemicznych. Należy zawsze nosić rękawice nitrylowe, okulary ochronne i fartuchy laboratoryjne.
5. Utrwalenie organoidu powoduje ich opadanie, a wirowanie nie jest już potrzebne. Pozwól organoidom opaść, umieszczając rurkę pionowo i odczekaj 2-3 minuty, usuń formaldehyd i dodaj 500 μl zimnego PBS, aby zmyć formaldehyd.
6. Pozwól organoidom zatonąć, usuń nadmiar PBS i dodaj 500 μl świeżego zimnego PBS. Pozwól organoidom zatonąć, usuń nadmiar PBS i dodaj 500 μl buforu blokującego (5% normalnej surowicy osła, 1% BSA i 0,5% Triton X-100 w PBS). Umieść rurkę na wytrząsarce kołyskowej na 60 minut przy RT.
   UWAGA: Blokowanie można również wykonać przez noc (O/N) w temperaturze 4 °C.
7. Pozwól organoidom zatonąć, usuń bufor blokujący i ponownie zawieś organoidy w 200 μl buforu blokującego z przeciwciałami pierwszorzędowymi (patrz Tabela materiałów). Przechowywać organoidy na wytrząsarce kołyskowej O/N w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Aby poprawić barwienie białek jądrowych, białek o niskiej ekspresji lub przeciwciał, które wykazują niespecyficzne barwienie, czas inkubacji można wydłużyć o 1 lub 2 dni w temperaturze 4 °C. Umieszczenie organoidów na wytrząsarce jest niezbędne, ponieważ zapobiega zbrylaniu się organoidów i zwiększa wydajność barwienia.
8. Pozwól organoidom zatonąć, usuń pierwotną mieszaninę przeciwciał i umyj organoidy za pomocą 500 μl 0,02% Triton X-100 w PBS (0,02% Tx) przez 60 minut w RT. Powtórz trzy razy.
   UWAGA: Gdy potrzebna jest dłuższa inkubacja przeciwciał pierwotnych, dodać etap przemywania z 0,02% Tx w PBS O/N w temperaturze 4 °C.
9. Pozostawić organoidy do opadnięcia, usunąć bufor płuczący i dodać 200 μl sprzężonego z fluorescencją przeciwciała drugorzędowego w buforze blokującym O/N w temperaturze 4 °C. Po dodaniu fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych należy przechowywać organoidy w ciemności, aby uniknąć blaknięcia sygnału.
10. Pozwól organoidom zatonąć, usuń wtórną mieszaninę przeciwciał i umyj organoidy za pomocą 500 μl 0,02% Tx przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz trzy razy.
11. W razie potrzeby przeciwbarwić organoidy 200 μl roztworu DAPI (0,25 μg/ml) do barwienia jądrowego. Inkubować próbki przez 60 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce kołyskowej.
12. Pozwól organoidom zatonąć, usuń roztwór DAPI i umyj organoidy w 500 μl PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz trzy razy.
13. Pozwól organoidom opaść i usuń cały nadmiar płynu. Dodać 10 μl roztworu klarującego do organoidów i inkubować przez 15 minut w temperaturze RT.
    UWAGA: Roztwór czyszczący jest lepki, dlatego przed pipetowaniem roztworu czyszczącego należy odciąć zewnętrzną część końcówki pipety o pojemności 20 μl. Więcej rozwiązania czyszczącego można dodać, jeśli do obrazowania używana jest większa przekładka. Roztwór montażowy może być używany zamiast roztworu czyszczącego, gdy nie usuwa organoidów. Rozwiązanie czyszczące zmniejsza tło podczas obrazowania i zwiększa głębokość obrazowania.
14. Umieść dwustronną, lepką 4-dołkową przekładkę o średnicy 0.05 mm na szkiełku mikroskopowym. Dodać 10 μl roztworu klarującego z organoidami do jednego dołka i umieścić szkiełko nakrywkowe na wierzchu przekładki.
    UWAGA: Organoidy można również montować bez użycia podkładki dystansowej. Przekładka utrzymuje kształt organoidu w stanie nienaruszonym i zapobiega spłaszczaniu się organoidów.
15. Trzymaj szkiełko w pozycji RT O/N, aby usunąć organoidy. W przypadku długotrwałego przechowywania szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Obrazy należy uzyskiwać za pomocą systemu mikroskopii konfokalnej.

Results

Przełyk jest podzielony na różne warstwy: nabłonek, blaszkę właściwą, błonę podśluzówkową i mięśnie zewnętrzne (Rysunek 1A). Fibroblasty znajdują się w obrębie błony podśluzowej i blaszki właściwej, zwanej zrębem. W tym protokole mięsień zewnętrzny jest usuwany mechanicznie (Rysunek 1B), co nie prowadzi do utraty fibroblastów (^{Pdgfrα H2BeGFP}+) znajdujących się w zrębie (Rysunek 1C). Przed dysocjacją nabłonek jest oddzielany od zrębu, w wyniku czego powstają dwa segmenty tkanki (Rysunek 1B). Rozdzielenie dwóch warstw daje możliwość wydłużenia czasu dysocjacji dla bardziej wytrzymałej warstwy nabłonkowej w porównaniu z delikatną warstwą zrębu. W ten sposób ustalany jest skuteczny protokół izolacji, w wyniku którego powstają zarówno żywotne komórki progenitorowe nabłonka, jak i fibroblasty zrębu (Rysunek 1B). Komórki progenitorowe przełyku są sortowane na podstawie ich wysokiej ekspresji INTEGRIN-β4 i E-CADHERIN (Rysunek 1C, D).

Subpopulacje fibroblastów mogą być izolowane za pomocą odrębnych markerów. W niniejszym protokole przedstawiono strategię izolacji fibroblastów opartą na powszechnie stosowanych markerach fibroblastów PDGFRα i DPP4 (CD26). Izolacja za pomocą ekspresji reporterowej^{Pdgfrα H2BeGFP} lub przeciwciała DPP4 pokazuje, że około 50% izolowanych komórek to fibroblasty (Figura 1E,F). Ponadto 70% fibroblastów PDGFRα + to DPP4 +, co wskazuje, że uzyskuje się w dużej mierze nakładającą się, ale nie identyczną populację fibroblastów. Po wyizolowaniu zarówno populacji komórek nabłonkowych, jak i zrębu, komórki progenitorowe przełyku są hodowane samodzielnie lub razem z fibroblastami w kopule macierzy. Aby zbadać udział fibroblastów w tworzeniu organoidów, kokultura jest utrzymywana w pożywce o zredukowanym czynniku wzrostu (Rysunek 1G).

Komórki progenitorowe przełyku tworzą organoidy w obecności EGF, NOGGIN i RSPO (ENR). Usunięcie NOGGIN i zmniejszenie ilości RSPO (25 ng/μL; ER_niski) jest wystarczający, aby zapobiec tworzeniu się organoidów (Rysunek 2A). Co ciekawe, dodanie fibroblastów DPP4 + lub PDGFRα + do komórek progenitorowych przełyku w pożywce ER_low przywraca zdolność tworzenia organoidów, wykazując funkcję pomocniczą dla obu populacji fibroblastów (Figura 2A-D). Wizualizacja transgenu Pdgfrα^H2BeGFP pokazuje, że fibroblasty są w bliskim kontakcie z nabłonkowymi komórkami progenitorowymi podczas tworzenia organoidów (Figura 2A). W dniu 6 fibroblasty Pdgfrα^H2BeGFP+ są nadal obficie obecne w kokulturze. Fibroblasty są obecne w całej kopule, w pobliżu i dotykając organoidów (pełna strzałka) lub przyczepione do organoidów (grot strzały; Rysunek 2D).

Barwienie całego wierzchowca pokazuje trójwymiarową reprezentację interakcji fibroblastów z organoidami (Rysunek 3). Chociaż możliwe jest wykonanie całego protokołu montażu bez użycia rozwiązania czyszczącego, zmniejsza to przezroczystość i penetrację laserową organoidu (Rysunek 3B, widok z). Podczas montowania organoidów przekładka pomaga utrzymać morfologię organoidów. W przeciwieństwie do tego, posiewanie szkiełka nakrywkowego bezpośrednio na organoidach (bez przekładki) spłaszcza organoidy i powoduje utratę struktury organoidów (Rysunek 3A,B).

Zarówno fibroblasty DPP4+, jak i PDGFRα+ są owinięte wokół organoidów (Rysunek 3C, Wideo1 i Wideo 2). Różnicowanie organoidów przełyku można ocenić za pomocą różnych markerów. Rysunek 4 pokazuje, że dostarczony protokół barwienia jest odpowiedni dla łatwiejszych do barwienia keratyn (KRT14/13), jak również dla trudniejszych do zabarwienia czynników transkrypcyjnych (TRP63/KLF4). Protokół wspólnej hodowli generuje organoidy o podobnym wzorcu różnicowania, jak wykazano in vivo^13,14 i jak widać w organoidach hodowanych na pożywce ENR; Komórki progenitorowe KRT14+ lub TRP63+ tworzą warstwę zewnętrzną, a komórki zróżnicowane KRT13+ lub KLF4+ orientują się do wewnątrz.

Ten protokół dostarcza narzędzia do badania niszy komórek macierzystych przełyku in vitro i wizualizuje interakcję między organoidami a fibroblastami. Dzięki wdrożeniu protokołu izolacji fibroblastów za pomocą przeciwciał, metoda jest elastyczna i może być stosowana do badania subpopulacji fibroblastów bez konieczności stosowania myszy transgenicznych.

Rysunek 1: Izolacja komórek progenitorowych i subpopulacji fibroblastów z przełyku. (A) Schematyczny przegląd różnych warstw w przełyku. Zrąb zawiera blaszkę właściwą i błonę podśluzową. (B) Schematyczny przegląd protokołu izolacji. Mięsień (muscularis externa) jest usuwany mechanicznie za pomocą kleszczy; Pozostały przełyk jest rozcinany i inkubowany w termolizynie w celu oddzielenia warstwy nabłonkowej od zrębu. Nabłonek i zrąb są oddzielane, mechanicznie mielone i trawione enzymatycznie do zawiesin jednokomórkowych. Zdysocjowane komórki są następnie barwione i przygotowywane do FACS. (C) Przekrój poprzeczny przełyku pozbawiony mięśnia zewnętrznego pokazujący fibroblasty Pdgfrα^H2BeGFP+ w zrębie. Podwójnie dodatnie komórki INTEGRYNA-β4 (ITGβ4) i E-KADHERYNA (ECAD) są nabłonkowymi komórkami progenitorowymi przełyku. Podziałka = 100 μm. (D) Reprezentatywny wykres cytometrii przepływowej izolacji komórek nabłonkowych przedstawiający procent żywych komórek (górny panel) ze wszystkich pojedynczych komórek. Dolny panel pokazuje procent wyizolowanych komórek progenitorowych (Prog.) ITGβ4+ ECAD+ ze wszystkich żywych komórek. (E) Reprezentatywny wykres cytometrii przepływowej izolacji komórek zrębu przedstawiający odsetek żywych komórek (lewy górny panel). Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej przedstawiające procent izolowanych fibroblastów DPP4+ (Fibr.; prawy górny panel) i fibroblastów Pdgfrα+ (lewy dolny panel) wszystkich żywych komórek. 70% fibroblastów Pdgfrα+ to również DPP4+ (prawy dolny panel). (F) Reprezentatywny wykres cytometrii przepływowej zrębu przedstawiający tylko komórki DPP4 + (2,5%), komórki DPP4 + PDGFRα + (37,5%) i tylko komórki PDGFRα + (17,7%). Wartości procentowe dotyczą wszystkich żywych komórek. (G) Komórki tylko nabłonkowe są siane w kopule matrycy w obecności 50 ng/μL EGF, 100 ng/μL NOGGIN i 250 ng/μL RSPO (ENR) lub razem z fibroblastami w obecności EGF i niskiego stężenia RSPO (25 ng/μL). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki kokultur organoidów. (A) Obrazy w jasnym polu pokazujące wzrost organoidów od dnia 1 do dnia 6. Obrazy w jasnym polu z organoidami hodowanymi wspólnie z fibroblastami Pdgfrα^H2BeGFP+ pokazują również jądrowy sygnał eGFP. Pasek skali = 25 μm. (B) Obrazy w jasnym polu całej kopuły matrycy w dniu 6. Lewa kolumna przedstawia kokultury organoidów hodowane w obecności fibroblastów Pdgfrα+ w pożywce ER_low lub E_lowR_low. Środkowa kolumna przedstawia kokultury organoidów hodowane w obecności fibroblastów DPP4+ w pożywce ER_low lub E_lowR_low. Prawa kolumna przedstawia monokultury organoidowe wyhodowane na pożywce ENR. Podłoże ENR = EGF (50 ng/μL), NOGGIN (100 ng/μL) i RSPO (250 ng/μL). ER_niski = EGF i 25 ng/μL RSPO. E_niskieR_niskie = 5 ng/μL EGF i 25 ng/μL RSPO. Podziałka skali = 500 μm. (C) Wykres przedstawiający wydajność tworzenia organoidów (%) (tj. procent komórek tworzących organoidy w różnych warunkach hodowli). Każda kropka reprezentuje kopułę macierzy, a słupek reprezentuje średnią wszystkich punktów na warunek. (D) Jasny obraz i obraz fluorescencyjny organoidów dnia 6 hodowanych wspólnie z fibroblastami Pdgfrα^H2BeGFP+. Fibroblasty^{Pdgfrα H2BeGFP}+ są obecne w całej kopule, przyczepione do organoidów (grot strzały) i nieprzyczepione, ale w kontakcie z organoidami (pełna strzałka). Podziałka = 250 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Protokół barwienia całego wierzchowca do badania interakcji fibroblast-organoid. (A) Schematyczny przegląd całego protokołu immunofluorescencji mount. AB = przeciwciało. (B) Obraz immunofluorescencyjny nieoczyszczonego barwienia całej mocowania, wykazujący zmniejszoną przezroczystość i penetrację światła laserowego w porównaniu z oczyszczonymi organoidami. Brak przekładki powoduje spłaszczenie organoidu i utratę morfologii organoidów. (C) Obrazy całych wierzchowców współhodowanych organoidów pokazują powierzchnie 3D organoidów z fibroblastami VIMENTIN+ (Fibr.) owiniętymi wokół organoidu i w bliskim kontakcie z nim. Przekroje 3D i obrazy płaszczyzny 2D pokazują światło organoidu. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Obrazy całego mocowania ujawniają różne populacje komórek podstawnych i nadpodstawnych. (A) Barwienie całych wierzchowców organoidów mono- i kokulturowych fibroblastami Pdgfrα^H2BeGFP+ wykazujące komórki podstawne KRT14+ w warstwie zewnętrznej i KRT13+ zróżnicowane komórki nadpodstawne. Pasek skali = 50 μm. (B) Barwienie w całości organoidów z mono- i kokulturą za pomocą fibroblastów Pdgfrα^H2BeGFP+ wykazujących komórki podstawne TRP63+ w warstwie zewnętrznej i KLF4+ zróżnicowane komórki nadpodstawne. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Tabela opisująca składniki pożywek dla kultur organoidowych. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Wideo 1: Pdgfrα^H2BeGFP+ fibroblast owinięty wokół organoidu i w bliskim kontakcie z nim. Film towarzyszy górnemu panelowi Rysunek 3C. Podziałka w Rysunek 3C ma średnicę 50 μm, a organoid ma średnicę ~120 μm. VIMENTIN jest pokazany w kolorze białym, E-CADHERIN w kolorze czerwonym, Pdgfrα^H2BeGFP w kolorze zielonym, a DAPI w kolorze niebieskim. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo 2: Fibroblast DPP4+ owinięty wokół organoidu i w bliskim kontakcie z nim. Film towarzyszy dolnemu panelowi Rysunek 3C. Podziałka w Rysunek 3C ma średnicę 50 μm, a organoid ma średnicę ~120 μm. VIMENTIN jest pokazany w kolorze białym, E-CADHERIN w kolorze czerwonym, a DAPI w kolorze niebieskim. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Discussion

Przedstawiony tutaj protokół ustanawia model in vitro do badania funkcjonalnych interakcji nabłonek przełyku i fibroblasty.

Warstwa nabłonkowa jest oddzielona od zrębu, co pozwala na zoptymalizowany protokół dysocjacji zarówno dla przedziału nabłonkowego, jak i zrębu. Pomimo optymalizacji protokołu dysocjacji nabłonka, grudki tkanek pozostają widoczne. Energiczne pipetowanie w górę i w dół co 15 minut znacznie zmniejsza liczbę i rozmiar grudek. Inne protokoły wykorzystują trypsynę do dalszej dysocjacji warstwy nabłonkowej ^5,6. W tym przypadku stosowanie trypsyny lub dalsze wydłużanie czasu dysocjacji nie jest zalecane, ponieważ prowadzi to do zmniejszenia żywotności komórek nabłonka i wydajności tworzenia organoidów. W przeciwieństwie do nabłonka, zrąb łatwo ulega dysocjacji, a 30 minut w roztworze dysocjacyjnym powoduje powstanie zawiesiny jednokomórkowej o żywotności fibroblastów ~90% (ryc. 1E). Wykluczenie w protokole etapu separacji nabłonkowo-stomijnej znacznie wydłuża czas dysocjacji, co skutkuje zmniejszoną żywotnością fibroblastów i niższą wydajnością komórek nabłonkowych. Dodatkowo, oddzielenie nabłonka od zrębu daje możliwość określenia liczby komórek w każdej populacji i wymieszania komórek nabłonkowych i fibroblastów z różnych linii myszy podczas zakładania kokultur.

Badanie funkcji fibroblastów na wzroście organoidów jest powszechnie stosowaną metodą w biologii komórek macierzystych 9,10,11,15,16. Ustalone pożywki do współhodowli są albo uzupełnione DMEM 10% płodową surowicą cielęcą (FCS)^9,15, albo pożywką o zredukowanym czynniku wzrostu^10,16. W tym protokole pożywka o zredukowanym czynniku wzrostu jest używana do naśladowania warunków panujących w niszy komórek macierzystych in vivo, w której fibroblasty są w dużej mierze w stanie spoczynku. FCS jest surowicą bogatą w czynnik wzrostu, która powoduje aktywację i proliferację fibroblastów w kokulturach, prawdopodobnie odpowiadając stanowi komórki fibroblastów odmiennemu od stanu in vivo. Poprzez wykluczenie FCS i zmniejszenie czynników wzrostu, tak aby sama pożywka (ER_low) nie wspierała wzrostu organoidów i nie stymulowała proliferacji fibroblastów, możliwe jest wyizolowanie wpływu fibroblastów na wzrost organoidów. W tym podłożu NOGGIN jest usuwany, a RSPO redukowane do minimum (10% RPSO). Wykazano, że zarówno NOGGIN, jak i RSPO są niezbędne do wzrostu organoidów przełyku⁶. EGF został zachowany w pożywce do kohodowli, ponieważ sam w sobie nie wspomaga wzrostu organoidów. Jednak fibroblasty są również zdolne do wspierania wzrostu organoidów w pożywce o obniżonej EGF (E_lowR_low; Rysunek 2B,D).

Kokultury organoidów nie mogą być podtrzymywane przez pasażowanie, ponieważ fibroblasty są tracone podczas trypsynizacji. Jednak pasażowanie organoidów zostało uwzględnione w protokole, ponieważ organoidy przełyku mogą być utrzymywane, rozwijane i wykorzystywane do dalszych eksperymentów jako monokultury. Pasażowane organoidy z monokultur mogą być używane do tworzenia kokultur ze świeżo wyizolowanymi fibroblastami. Wadą stosowania komórek pierwotnych jest liczba myszy potrzebnych do założenia wielu kokultur organoidowych. Koncentrując się na małych subpopulacjach fibroblastów, liczba uzyskanych kokultur jest ograniczona. W innych protokołach fibroblasty są najpierw namnażane w hodowli przed użyciem ich do tworzenia kokultur organoidowych¹⁰. Jednak fibroblasty zmieniają morfologię i tożsamość podczas pasażu, co wykazano przy użyciu pierwotnych fibroblastów skóry i serca^17,18. Konwencjonalne pasażowanie 2D fibroblastów przełyku powoduje zarówno zmiany morfologii, jak i fenotypu, co pokazuje, że wzbogacanie fibroblastów in vitro nie jest odpowiednie dla kokultur mających na celu fenokopię niszy endogennych komórek macierzystych.

Barwienie całego mocowania zapewnia narzędzie do utrzymania i wizualizacji interakcji fibroblast-organoid. Należy zauważyć, że chociaż nie wszystkie organoidy będą miały bezpośrednio przyłączone do nich fibroblasty, większość organoidów ma kontakt z fibroblastami (patrz ryc. 2C). Aby utrzymać interakcje nabłonkowo-fibroblastowe, ważne jest, aby obchodzić się z organoidami ostrożnie i unikać energicznego pipetowania, wirowania i wirowania z dużą prędkością. Optymalna fiksacja jest ważna dla utrzymania architektury tkanki 3D, a także utrzymania endogennej fluorescencji. 30-minutowa fiksacja wystarcza do zachowania sygnału H2BeGFP i jest optymalna dla przeciwciał stosowanych w tym protokole, jednak może się to różnić w zależności od zastosowanych fluoroforów i przeciwciał. Oczyszczanie organoidów zmniejsza rozpraszanie światła i znacznie poprawia wizualizację całej struktury 3D. Ponieważ organoidy są małe, oczyszczanie jest łatwe i szybkie; jednak obrazowanie całych organoidów za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej może być czasochłonne, ponieważ konieczne jest wykonanie wielu stosów Z. Mikroskopy konfokalne, takie jak obracający się dysk, mogą być używane do skrócenia czasu obrazowania.

Ogólnie rzecz biorąc, organoidy przełyku hodowane w obecności fibroblastów stanowią cenne narzędzie do zrozumienia aspektów niszy komórek macierzystych przełyku. Ponadto oczyszczanie całego mocowania zapewnia dostępną metodę wizualizacji interakcji między fibroblastami a organoidami.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Suplement B-27 (50X), bez surowicy	Thermo Fisher (Gibco)	17504001
Corning  Matrigel  Matryca błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu (GFR	Fisher Scientific	356231
Dimetylosulfotlenek	Sigma-Aldrich	276855-100ML
DMEM/F-12	Thermo Fisher (Gibco)	11320074
DPBS	Thermo Fisher (Gibco)	14190250
Surowica bydlęca	płodu Sigma-Aldrich	F7524
GlutaMAX Suplement	Thermo Fisher (Gibco)	35050061
HBSS, bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej	Thermo Fisher (Gibco)	14175-129
Normalna surowica osła	Jackson Immuno	017-000-121
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)	Thermo Fisher (Gibco)	15140122
Triton X-100 roztwór	Merck	93443-100ML
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa	Thermo Fisher (Gibco)	25200-056
Chemikalia, peptydy i białka rekombinowane
DAPI Roztwór	Thermo Fisher	62248
Roztwór dysocjacyjny: 0,25 mg/ml Liberase TM, 0,25 mg/ml Dnazy w HBSS
Dnaza I	Sigma-Aldrich
Formaldehyd, 37%, z 10-15% metanolem	Sigma-Aldrich	252549-1L
Liberase	Sigma-Aldrich	5401127001
N-acetylo-cysteina	Sigma-Aldrich	A9165-25G
Mysi Noggin	Peprotech	250-38
RapiClear 1.47	SunJin Lab	#RC147001
Rekombinowane białko EGF myszy, CF	R& Systemy D	2028-EG-200
R-spondin-1 mysi	Peprotech	315-32
SYTOX Niebieski barwnik martwych komórek	Thermo Fisher	S34857
Thermolysin	Sigma-Aldrich	T7902-25MG
Y-27632 dichlorowodorek	Sigma-Aldrich	Y0503-5MG
strong>Plastic & Wyroby szklane
Corning Sitka do komórek sterylnych 40um	VWR	15360801
Sitka do komórek sterylnych Corning 70um	VWR	431751
Menzel Deckglä ser/ szkiełka nakrywkowe	Thermo Fisher	Q10143263NR15
Probówka reakcyjna SafeSeal, 1,5 mL, PP	Sarstedt	72.706
Probówki mikrowirówkowe o niskiej retencji zatrzaskowe 0,6 ml	Thermo Fisher	3446
VWR		631-9483
Tools
0,05 mm 4 okrągłe studzienki iSpacer	SunJin Lab	#IS204
Dumont #5 kleszcze, końcówka biologiczna	FST	11252-20
ImmEdge Pen	VectorLaboratories	H-4000
Nożyczki sprężynowe kątowe na bok końcówka kulowa 8mm Krawędź tnąca	FST	15033-09
Instruments
Mikroskop konfokalny Stellaris 5	Leica
ZEISS Stemi 305	Zeiss
FACS ARIA III	BD Biosciences
Conjugated Przeciwciała dla FACS
Alexa Fluor 647 Przeciwciało anty-mysie CD104 Klon: 346-11A		123608 123608
Przeciwciało anty-mysie CD26 (DPP-4) APC	H194-112	H194-112
PE/Cy7 przeciwciało przeciw myszy/ludzkiemu CD324 (E-kadherynie)	147310	147310
Przeciwciała immunofluorescencyjne
CD104 (ß-integryna 4) Klon: 346-11A	BioLegend	553745
Cytokeratin 14	(AbD Serotec)	BP5009
Cytokeratin13 Klon: EPR3671	abcam	ab92551
E-kadheryna (CD324) Klon: 2.40E+11	Technologia sygnalizacji komórkowej	3195
Keratyna 5 Poliklonalne przeciwciało kurczaka, oczyszczone Klon: Poly9059	BioLegend	905901
p63 Klon: 4a4	abcam	ab735
Rekombinowany anty-KLF4 antybod Klon: EPR20753-25	abcam	ab214666
Vimentin	Sigma-Aldrich	AB5733
Przeciwciała drugorzędowe
Donkey anti-species* z wybranym fluoroforem	Jackson Immuno