Artykuł metodologiczny

Charakterystyka funkcjonalna i wizualizacja fibroblastów przełyku przy użyciu kokultur organoidowych

3.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64905

⸱

6 stycznia 2023

 ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet

W tym artykule

Podsumowanie

Współhodowle organoidów i fibroblastów dostarczają modelu do badania niszy komórek macierzystych in vivo. W tym miejscu opisano protokół dla kokultur organoidów i fibroblastów przełyku. Dodatkowo obrazowanie całego mocowania służy do wizualizacji interakcji fibroblast-organoid.

Streszczenie

Nabłonkowe komórki macierzyste i progenitorowe przyczyniają się do tworzenia i utrzymywania bariery nabłonkowej przez całe życie. Większość populacji komórek macierzystych i progenitorowych jest ukryta w anatomicznie odrębnych miejscach, co umożliwia ekskluzywne interakcje z sygnałami niszowymi, które utrzymują łodygę. Podczas gdy rozwój nabłonkowych kultur organoidowych stanowi potężne narzędzie do zrozumienia roli komórek macierzystych i progenitorowych w homeostazie i chorobie, interakcja w środowisku niszowym jest w dużej mierze nieobecna, co utrudnia identyfikację czynników wpływających na zachowanie komórek macierzystych. Fibroblasty odgrywają kluczową rolę w kierowaniu losem pnia nabłonka i progenitorów. W artykule przedstawiono kompleksowy protokół kohodowli organoidów i fibroblastów, umożliwiający wyznaczenie subpopulacji fibroblastów w odnowie i różnicowaniu komórek progenitorowych przełyku. W tym protokole opisano metodę izolowania zarówno komórek nabłonkowych, jak i fibroblastów równolegle z przełyku. Przedstawiono odrębne strategie sortowania komórek aktywowane fluorescencją w celu wyizolowania zarówno komórek progenitorowych przełyku, jak i subpopulacji fibroblastów od transgenicznych myszy reporterowych lub dzikich myszy. Protokół ten zapewnia wszechstronne podejście, które można dostosować do izolacji określonych subpopulacji fibroblastów. Ustanawianie i pasażowanie monokultur organoidowych nabłonka przełyku jest zawarte w tym protokole, co umożliwia bezpośrednie porównanie z systemem kokultur. Ponadto opisano metodę oczyszczania 3D, która pozwala na szczegółową analizę obrazu interakcji nabłonek-fibroblasty. Podsumowując, protokół ten opisuje porównawczą i stosunkowo wysokoprzepustową metodę identyfikacji i zrozumienia niszowych składników komórek macierzystych przełyku in vitro.

Wprowadzenie

Organoidy są używane jako testy 3D in vitro do charakteryzowania komórek macierzystych i progenitorowych, a także do zrozumienia sygnałów sygnałowych pochodzących ze składników komórkowych niszy komórek macierzystych1,2,3,4. Organoidy przełyku myszy zostały po raz pierwszy opisane w 2014 roku, a w kilku artykułach zidentyfikowano czynniki wzrostu, takie jak R-Spondyna (RSPO), NOGGIN i naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), potrzebne do utrzymania i przejścia organoidów przełyku5,6,7, argumentując, że podobne sygnały sygnalizacyjne są wymagane w in vivo odnowa komórek progenitorowych. Jednak czynniki wzrostu są zwykle dodawane w stężeniach niefizjologicznych, co skutkuje warunkami wzrostu organoidów, które niekoniecznie odzwierciedlają środowisko sygnalizacyjne in vivo.

Fibroblasty to heterogeniczne populacje komórek zrębowych, które wspierają właściwości komórek progenitorowych w wielu niszach komórek macierzystych8. Połączenie nabłonkowych komórek progenitorowych i fibroblastów w tej samej kulturze organoidów umożliwia tworzenie organoidów w obniżonych stężeniach egzogennie suplementowanych czynników wzrostu. Opisano systemy kohodowli organoidów z nabłonka jelitowego i wątrobowego, ale protokół ustanawiający kokultury organoidów i fibroblastów przełyku jest nadal znany9,10,11.

W tym protokole przedstawiono dwie strategie sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) dla fibroblastów z przełyku, przy użyciu transgenicznych myszyPdgfrα H2BeGFP12 lub myszy typu dzikiego z klasycznym barwieniem przeciwciałami. Różne subpopulacje fibroblastów można izolować za pomocą wybranych markerów powierzchni komórek, zapewniając w ten sposób elastyczność protokołu. Ponadto do scharakteryzowania oddziaływań fibroblast-organoid stosuje się technikę obrazowania fluorescencyjnego 3D zachowującą morfologię organoidów. Oczyszczanie organoidów zapewnia szybką metodę zwiększania głębokości penetracji światła w organoidach, poprawiając wizualizację połączeń organoid-fibroblasty i umożliwiając rekapitulację struktury organoidu w całości. Protokół ten łączy kohodowlę organoidów przełyku z całą strategią obrazowania wierzchowca, umożliwiając funkcjonalną charakterystykę interakcji fibroblast-organoid

.

Protokół

Eksperymenty na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Stockholms Norra djurförsöksetiska nämnd (zezwolenie etyczne nr 14051-2019). Zwierzęta trzymano w warunkach wolnych od patogenów zgodnie z zaleceniami Federacji Europejskiego Stowarzyszenia Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych.

1. Przygotowanie

  1. Rozmrozić enzymatyczne roztwory podstawowe używane do dysocjacji (patrz tabela materiałów) na lodzie. Rozmrozić podwielokrotność matrycy (matrycy) błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu (GFR) w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotuj pożywkę hodowlaną. Należy użyć pożywki opisanej w Tabeli 1 dla kultur organoidowych i kokultur i przygotować ją przed rozpoczęciem protokołu.

2. Rozwarstwienie i oddzielenie nabłonka przełyku i zrębu

UWAGA: Upewnij się, że wszystkie narzędzia używane do preparowania i przetwarzania tkanek są sterylne. Przygotuj 2 ml roztworu dysocjacyjnego (patrz tabela materiałów) w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS) na trzy przełyki.

  1. Użyj wybranego szczepu myszy, takiego jak myszy C57BL/6J. Rozwój przełyku u myszy kończy się po dniu pourodzeniowym (p) 70, dlatego zaleca się używanie myszy starszych niż p7013. Użyj czterech lub pięciu myszy, ponieważ dostarczają one wystarczającego materiału do założenia 8-10 wspólnych kultur organoidów.
    UWAGA: Wydajność tworzenia organoidów zmniejsza się wraz z wiekiem myszy. Jeśli przedmiotem zainteresowania są określone subpopulacje fibroblastów, możliwe jest, że niska wydajność fibroblastów ogranicza liczbę możliwych do ustalenia kokultur organoidów.
  2. Użyj myszy zmodyfikowanych genetycznie (np.Pdgfrα H2BeGFP) lub dzikich (WT) do izolacji populacji fibroblastów. W przypadku korzystania z myszy WT należy wykonać barwienie przeciwciałami, aby wyizolować określone subpopulacje fibroblastów ze zrębu za pomocą FACS.
  3. Poddać myszy eutanazji przez uduszenie CO2 . Wypreparuj przełyk za pomocą kleszczy i nożyczek preparacyjnych. Aby usunąć cały przełyk, odetnij dystalny koniec przełyku bezpośrednio nad żołądkiem i bliższy koniec na początku tchawicy. Zanurz przełyk w PBS i umieść go na lodzie.
  4. Mechanicznie usuń mięsień zewnętrzny za pomocą mikroskopu preparacyjnego (całkowity zakres powiększenia 8x-40x) i kleszczy. Przytrzymaj dystalny koniec rozciętego przełyku za pomocą jednej pary kleszczy, a drugą kleszczami użyj do chwycenia i pociągnięcia mięśnia od dystalnego do bliższego końca rozciętego przełyku. Usuń i wyrzuć warstwę mięśni.
  5. Otwórz przełyk wzdłużnie. Działa to najlepiej przy użyciu nożyczek sprężynowych do mikrodysekcji z końcówką kulkową, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek. Przytrzymaj jeden koniec przełyku, aby włożyć kulkę nożyczek sprężynowych do światła przełyku i rozciąć przełyk, trzymając się końca.
  6. Umieść przełyk w mikroprobówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml lub na płytce 24-dołkowej. Inkubować otwarty przełyk w 0,5 mg/ml termolizyny w HBSS w temperaturze 37 °C na wytrząsarce kołyskowej przez 15 minut. Całkowicie zanurz przełyk w roztworze termolizyny.
    UWAGA: Objętość użytego roztworu termolizyny zależy od wielkości studzienki lub probówki. Kilka przełyków można umieścić i zanurzyć w tej samej studni lub rurze.
  7. Wyjmij przełyk z roztworu termolizyny. Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby ostrożnie oddzielić nabłonek przełyku od zrębu. Za pomocą cienkich kleszczy chwyć zarówno stronę nabłonkową, jak i stronę zrębu tkanki i powoli rozsuń je, aby oddzielić dwie warstwy.
    UWAGA: Zrąb można rozpoznać po jego białym i nieprzezroczystym wyglądzie, w przeciwieństwie do przezroczystego nabłonka. Zrąb zawiera blaszkę właściwą i warstwę podśluzówkową.
  8. Przenieść warstwę nabłonkową i zrębową do dwóch oddzielnych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml z 200 μl roztworu dysocjacyjnego w HBSS. Połóż na lodzie.

3. Izolacja komórek progenitorowych przełyku

UWAGA: Izolacja komórek progenitorowych przełyku (krok 2) i fibroblastów (krok 3) może być przeprowadzona równocześnie. Przygotuj probówkę o pojemności 50 ml z 1% FBS w HBSS (1% FBS).

  1. Przenieść oddzielony nabłonek przełyku z probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml (krok 2.8) na czystą szalkę Petriego i użyć ostrego skalpela do zmielenia. Zebrać zmieloną tkankę z płytki Petriego z 200 μl roztworu dysocjacyjnego i przenieść ją z powrotem do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Nabłonek jest odpowiednio rozdrobniony, gdy kawałki można umieścić z powrotem w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl.
  2. Dodać 800 μl świeżego roztworu dysocjacyjnego do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej do całkowitej objętości 1 ml.
    UWAGA: Ważne jest, aby dodać wystarczającą ilość roztworu dysocjacyjnego. Na jeden do trzech przełyków zaleca się 1 ml roztworu. Zwiększ skalę, gdy jednocześnie przetwarzanych jest więcej przełyku.
  3. Umieścić probówkę z rozdrobnioną warstwą nabłonka na wytrząsarce w temperaturze 37 °C na 60 minut. Pipetować roztwór w górę i w dół około 20 razy za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl co 15 minut, aby poprawić trawienie.
  4. Po 60 minutach pipetuj w górę i w dół kolejne 20 razy, używając końcówki do pipety o pojemności 200 μl. Przepuść roztwór przez sitko o wielkości 40 μm do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Zwilż sitko komórek 1% FBS przed odcedzeniem komórek, aby zminimalizować przyleganie komórek do filtra. Nabłonek nie zostanie całkowicie strawiony, a fragmenty tkanki będą nadal widoczne. Dłuższa inkubacja zmniejszy jednak przeżywalność komórek i nie spowoduje wyższej wydajności żywych komórek.
  5. Odrzucić supernatant, usuwając nadmiar cieczy za pomocą pipety o pojemności 1 ml i ponownie zawiesić osad w 1 ml 1% FBS. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    1. Podczas wirowania przygotuj sprzężoną mieszankę przeciwciał do FACS komórek progenitorowych przełyku.
    2. Wymieszaj 1 μl CD324-PE-Cy7 (ECADHERIN) i CD104-A647 (INTEGRIN-β4) w 200 μl 1% FBS na milion komórek.
      UWAGA: 1 μL przeciwciała (200 μL objętości końcowej) wystarcza na jeden lub dwa przełyki. Podczas przetwarzania większej ilości przełyku na raz zwiększ objętość roztworu barwiącego przeciwciała.
  6. Zawiesić osad w 200 μl mieszaniny przeciwciał i przenieść do probówki do cytometrii przepływowej. Po dodaniu przeciwciał fluorescencyjnych należy przechowywać zawiesiny komórek w ciemności, aby uniknąć blaknięcia sygnału. Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Dodać 3 ml 1% FBS i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie ponownie zawiesić komórki w minimum 200 μl 1% FBS.
    UWAGA: 500 μL 1% FBS stosuje się do czterech lub pięciu przełyków. Zwiększ objętość, gdy jednocześnie przetwarzanych jest więcej przełyku, aby można było osiągnąć natężenie przepływu FACS na poziomie 100-300 zdarzeń/s. Więcej zdarzeń zmniejszy wydajność sortowania, a wzrost natężenia przepływu zmniejszy przeżywalność komórek.
  7. Dodaj marker barwienia martwych komórek do końcowego stężenia 1:10 000 na 5 minut przed sortowaniem FACS, aby wyizolować żywe komórki. Posortuj komórki progenitorowe za pomocą maszyny FACS (patrz Rysunek 1 dla strategii bramkowania). Zebrać komórki do 1,5 ml probówek do mikrowirówek wypełnionych 200 μl podstawowej pożywki organoidowej (Tabela 1).

4. Izolacja fibroblastów z warstwy zrębu

  1. Pokrój warstwę stomii na drobne kawałki w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 200 μl roztworu dysocjacyjnego (krok 2.8) za pomocą nożyczek do preparacji. Tkanka jest odpowiednio mielona, gdy roztwór można pipetować w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl.
  2. Dodać 800 μl świeżego roztworu dysocjacyjnego do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej do całkowitej objętości 1 ml.
    UWAGA: Ważne jest, aby dodać wystarczającą ilość roztworu dysocjacyjnego. Na jeden do trzech przełyków zaleca się 1 ml roztworu. Zwiększ skalę, gdy jednocześnie przetwarzanych jest więcej przełyku.
  3. Umieścić probówkę na wytrząsarce kołyskowej w temperaturze 37 °C na 30 minut. Po 15 minutach odpipetuj roztwór w górę i w dół około 20 razy, używając końcówki do pipety o pojemności 200 μl, aby poprawić trawienie.
  4. Po 30 minutach trawienia enzymatycznego pipetuj pipetą w górę i w dół kolejne 20 razy za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl. Przecedzić roztwór przez sitko o wielkości 70 μm do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Zwilż sitko komórek 1% FBS przed odcedzeniem komórek, aby zminimalizować przyleganie komórek do filtra.
  5. Odrzucić supernatant, usuwając nadmiar cieczy za pomocą pipety o pojemności 1 ml i ponownie zawiesić osad w 1 ml 1% FBS. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: W przypadku stosowania genetycznie zmodyfikowanego szczepu myszy zawierającego fibroblasty znakowane fluorescencyjnie, barwienie przeciwciałami jest opcjonalne. Jeśli barwienie przeciwciałami nie jest wymagane, należy przejść do kroku 3.7 i przenieść próbkę do probówki do cytometrii przepływowej.
    1. Podczas wirowania należy przygotować sprzężoną mieszaninę przeciwciał do izolacji fibroblastów metodą FACS. Wymieszaj 1 μl CD26-APC (DPP4) w 200 μl 1% FBS na milion komórek.
      UWAGA: 1 μL przeciwciała wystarcza na jeden lub dwa przełyki. Podczas przetwarzania większej ilości przełyku na raz zwiększ objętość roztworu barwiącego przeciwciała.
  6. Zawiesić osad w 200 μl mieszaniny sprzężonych przeciwciał w 1% FBS i przenieść do probówki do cytometrii przepływowej. Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Dodać 3 ml 1% FBS i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w co najmniej 200 μl 1% FBS.
    UWAGA: 500 μL 1% FBS stosuje się do czterech lub pięciu przełyków. Zwiększ objętość, gdy jednocześnie przetwarzanych jest więcej przełyku, aby można było osiągnąć natężenie przepływu 100-300 zdarzeń / s. Więcej zdarzeń zmniejszy wydajność sortowania, a zwiększenie natężenia przepływu zmniejszy przeżywalność komórek. Po dodaniu przeciwciał fluorescencyjnych zawiesiny komórek powinny być ciemne, aby uniknąć blaknięcia sygnału.
  8. Dodaj marker barwienia martwych komórek do końcowego stężenia 1:10 000 na 5 minut przed sortowaniem FACS, aby wyizolować żywe komórki. Posortuj komórki za pomocą maszyny FACS (zobacz Rysunek 1 dla strategii bramkowania). Zebrać komórki do 1,5 ml probówek do mikrowirówek wypełnionych 200 μl podstawowej pożywki organoidowej (Tabela 1).

5. Zakładanie i hodowla organoidów przełyku

UWAGA: Wstępnie podgrzej ERnisko (kokultura organoidowa), ENR (organoid) pożywka (patrz Tabela 1 dla opisu) i 48-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C. Umieść rozmrożoną matrycę (przygotowaną w kroku 1) podwielokrotność na lodzie. Zaleca się stosowanie dostarczonej tutaj matrycy (patrz Tabela materiałów) do hodowli organoidów przełyku myszy, ponieważ inne marki matryc negatywnie wpływają na wydajność tworzenia organoidów.

  1. W przypadku kohodowli organoidów wymieszaj posortowane komórki nabłonkowe i fibroblasty w stosunku 1:2 w probówce. Do każdej kopuły macierzy użyj 5 000 komórek nabłonka i 10 000 fibroblastów. Przygotowując się do większej liczby kopuł, dodaj wielokrotność 5 000 komórek nabłonka i 10 000 fibroblastów do jednej probówki. W przypadku kultur organoidowych bez fibroblastów należy użyć 5 000 komórek nabłonkowych na kopułę macierzy.
  2. Odwirować populację mieszanych komórek przy sile 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant, ostrożnie usuwając go pipetą o pojemności 200 μl.
  3. Umyj komórki raz, ponownie zawieszając osad w zimnym podstawowym podłożu organoidowym i wiruj przy 300 x g przez 5 minut. Umieść komórki na lodzie.
  4. Przygotuj mieszankę składającą się w 80% z matrycy i w 20% z zimnego zasadowego podłoża organoidowego. Umieść wszystko na lodzie, gdy matryca zestala się w temperaturze pokojowej (RT).
  5. Po odwirowaniu odrzucić sklarowany osad, ostrożnie usuwając go pipetą o pojemności 200 μl. Zawiesić komórki w 10 μl mieszanki matrycowej/kopuły i umieścić z powrotem na lodzie.
  6. Pobrać wstępnie ogrzaną 48-dołkową płytkę z inkubatora o temperaturze 37 °C i wykonać jedną kopułę matrycy na dołek za pomocą pipety o pojemności 20 μl. Każda kopuła zawiera 10 μl 80% matrycy, 5 000 komórek nabłonka i 10 000 fibroblastów. Przenieść płytkę do góry dnem do inkubatora i pozostawić kopuły do zestalenia się przez kolejne 20-30 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Zmniejszenie objętości kopuły matrycy i/lub wzrost liczby komórek wpłynie na wydajność tworzenia organoidów.
  7. Dodać 200 μl wstępnie podgrzanej pożywki oniskiej zawartości ER (tabela 1) do kopuł matrycy zawierających kokultury organoidów, a pożywki ENR (tabela 1) do odpowiednich kopuł matrycy zawierających tylko organoidy nabłonkowe i umieścić płytkę w inkubatorze.
  8. Hodować organoidy w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Przez pierwsze 2 dni należy uzupełnić podłoże 10 μM inhibitorem skał (Y-27623). Inhibitor skał zapobiega śmierci komórek wywołanej stresem i zwiększa szansę na pomyślne założenie kultur organoidowych.
  9. Odświeżaj podłoże co 2-3 dni. Upewnij się, że podłoże jest ciepłe, aby zapobiec dysocjacji matrycy wrażliwej na temperaturę.
  10. Analizy eksperymentu należy przeprowadzić 6 do 8 dni po posiewie. Organoidy można przechowywać w hodowli do 14 dni. Około 14 dnia obserwuje się utratę integralności kopuły.

6. Pasaż organoidów

UWAGA: Pasażowanie organoidów hodowanych w kokulturze powoduje utratę fibroblastów. Dlatego zaleca się stosowanie pożywki ENR dla wszystkich organoidów podczas pasażowania. Rozgrzej ENR, PBS i 48-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C.

  1. Usunąć pożywkę i umyć studzienkę zawierającą kopułę matrycy wstępnie podgrzanym PBS. Dodać 200 μl zimnego 0,25% roztworu trypsyny i pipetować w górę iw dół, aby rozbić kopułę matrycy.
    UWAGA: Zaleca się stosowanie zimnej 0,25% trypsyny, ponieważ matryca jest wrażliwa na temperaturę, co pomaga w rozbijaniu kopuł matrycy.
  2. Inkubować organoidy z trypsyną w temperaturze 37 °C przez ~20 min. Pipetować w górę i w dół po 10 minutach, aby zwiększyć dysocjację organoidów. Monitoruj proces dysocjacji za pomocą mikroskopu co 5-10 minut. Ponieważ trypsyna zmniejsza żywotność komórek, może to pomóc w określeniu idealnego czasu dysocjacji.
  3. Po 20 minutach pipetować organoidy w górę i w dół pipetą o pojemności 200 μl, aby oddzielić organoidy. Zebrać komórki do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, dodać 1 ml podstawowej pożywki organoidowej i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Opcjonalnie: Aby zapewnić najlepsze warunki wzrostu organoidów i aby nowe organoidy pochodziły z pojedynczych komórek, należy przecedzić komórki przez wstępnie zwilżone sitko o średnicy 40 μm. Filtrowanie zawiesiny komórkowej powoduje usunięcie rdzeni organoidów i grudek komórek, które są trudne do dysocjacji.
  5. Przygotować mieszankę matrycową składającą się w 80% z matrycy i w 20% z zimnej zasadowej pożywki organoidowej. Umieść wszystko na lodzie, gdy matryca zestala się w temperaturze pokojowej.
  6. Odrzucić supernatant ostrożnie usuwając go pipetą o pojemności 200 μl, ponownie zawiesić komórki w 10 μl mieszanki matrycowej/kopułki i umieścić mieszaninę z powrotem na lodzie.
    UWAGA: Organoidy można dzielić w stosunku 1:5 do 1:10, w zależności od gęstości kopuły. Komórki nabłonkowe można również liczyć i ponownie platerować z prędkością 5 000 komórek/kopułę.
  7. Pobrać wstępnie podgrzaną 48-dołkową płytkę z inkubatora o temperaturze 37 °C i wykonać jedną kopułę na każdy dołek. Przenieść płytkę do góry nogami do inkubatora i pozostawić kopuły do zestalenia się przez kolejne 20-30 minut w temperaturze 37 °C.
  8. Dodaj 200 μl wstępnie podgrzanej pożywki ENR do odpowiednich kopuł organoidowych. Uzupełnij pożywkę 10 μM inhibitorem skał (Y-27623) przez pierwsze 2 dni.
  9. Odświeżaj podłoże co 2-3 dni. Upewnij się, że podłoże jest ciepłe, aby zapobiec dysocjacji matrycy wrażliwej na temperaturę.

7. Przetwarzanie organoidów do barwienia całego wierzchowca

UWAGA: Przed użyciem pokryj końcówki i rurki 10% FBS w PBS, aby uniknąć przylegania organoidów do plastiku. W przypadku końcówek do pipet wystarczy raz lub dwa razy pipetować w górę i w dół w 10% roztworze FBS/PBS przed użyciem końcówki. W przypadku probówek napełnij probówkę 10% FBS/PBS, a następnie usuń roztwór.

  1. Usunąć pożywkę organoidową i dodać 200 μl lodowatego PBS do kopuł matrycy. Umieść talerz na lodzie na 5-10 minut.
  2. Pipetować w górę i w dół i przenieść roztwór do 0,6 ml nieprzywierających probówek do mikrowirówek. Wirować krótko przez 30-60 s przy 100 x g, aby organoidy osiadły na dnie.
    UWAGA: Nadmierne pipetowanie i długie wirowanie rozbija organoidy i zakłóca interakcję fibroblast-organoid.
  3. Usuń nadmiar płynu i dodaj lodowaty PBS. Wirować krótko przez 30-60 s przy 100 x g, aby organoidy mogły osiąść na dnie.
  4. Usuń nadmiar płynu i utrwal organoid za pomocą 200 μl zimnego 4% formaldehydu w roztworze PBS przez 30 minut na lodzie.
    UWAGA: Formaldehyd jest toksyczny i musi być zawsze stosowany w dygestoriach chemicznych. Należy zawsze nosić rękawice nitrylowe, okulary ochronne i fartuchy laboratoryjne.
  5. Utrwalenie organoidu powoduje ich opadanie, a wirowanie nie jest już potrzebne. Pozwól organoidom opaść, umieszczając rurkę pionowo i odczekaj 2-3 minuty, usuń formaldehyd i dodaj 500 μl zimnego PBS, aby zmyć formaldehyd.
  6. Pozwól organoidom zatonąć, usuń nadmiar PBS i dodaj 500 μl świeżego zimnego PBS. Pozwól organoidom zatonąć, usuń nadmiar PBS i dodaj 500 μl buforu blokującego (5% normalnej surowicy osła, 1% BSA i 0,5% Triton X-100 w PBS). Umieść rurkę na wytrząsarce kołyskowej na 60 minut przy RT.
    UWAGA: Blokowanie można również wykonać przez noc (O/N) w temperaturze 4 °C.
  7. Pozwól organoidom zatonąć, usuń bufor blokujący i ponownie zawieś organoidy w 200 μl buforu blokującego z przeciwciałami pierwszorzędowymi (patrz Tabela materiałów). Przechowywać organoidy na wytrząsarce kołyskowej O/N w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Aby poprawić barwienie białek jądrowych, białek o niskiej ekspresji lub przeciwciał, które wykazują niespecyficzne barwienie, czas inkubacji można wydłużyć o 1 lub 2 dni w temperaturze 4 °C. Umieszczenie organoidów na wytrząsarce jest niezbędne, ponieważ zapobiega zbrylaniu się organoidów i zwiększa wydajność barwienia.
  8. Pozwól organoidom zatonąć, usuń pierwotną mieszaninę przeciwciał i umyj organoidy za pomocą 500 μl 0,02% Triton X-100 w PBS (0,02% Tx) przez 60 minut w RT. Powtórz trzy razy.
    UWAGA: Gdy potrzebna jest dłuższa inkubacja przeciwciał pierwotnych, dodać etap przemywania z 0,02% Tx w PBS O/N w temperaturze 4 °C.
  9. Pozostawić organoidy do opadnięcia, usunąć bufor płuczący i dodać 200 μl sprzężonego z fluorescencją przeciwciała drugorzędowego w buforze blokującym O/N w temperaturze 4 °C. Po dodaniu fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych należy przechowywać organoidy w ciemności, aby uniknąć blaknięcia sygnału.
  10. Pozwól organoidom zatonąć, usuń wtórną mieszaninę przeciwciał i umyj organoidy za pomocą 500 μl 0,02% Tx przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz trzy razy.
  11. W razie potrzeby przeciwbarwić organoidy 200 μl roztworu DAPI (0,25 μg/ml) do barwienia jądrowego. Inkubować próbki przez 60 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce kołyskowej.
  12. Pozwól organoidom zatonąć, usuń roztwór DAPI i umyj organoidy w 500 μl PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz trzy razy.
  13. Pozwól organoidom opaść i usuń cały nadmiar płynu. Dodać 10 μl roztworu klarującego do organoidów i inkubować przez 15 minut w temperaturze RT.
    UWAGA: Roztwór czyszczący jest lepki, dlatego przed pipetowaniem roztworu czyszczącego należy odciąć zewnętrzną część końcówki pipety o pojemności 20 μl. Więcej rozwiązania czyszczącego można dodać, jeśli do obrazowania używana jest większa przekładka. Roztwór montażowy może być używany zamiast roztworu czyszczącego, gdy nie usuwa organoidów. Rozwiązanie czyszczące zmniejsza tło podczas obrazowania i zwiększa głębokość obrazowania.
  14. Umieść dwustronną, lepką 4-dołkową przekładkę o średnicy 0.05 mm na szkiełku mikroskopowym. Dodać 10 μl roztworu klarującego z organoidami do jednego dołka i umieścić szkiełko nakrywkowe na wierzchu przekładki.
    UWAGA: Organoidy można również montować bez użycia podkładki dystansowej. Przekładka utrzymuje kształt organoidu w stanie nienaruszonym i zapobiega spłaszczaniu się organoidów.
  15. Trzymaj szkiełko w pozycji RT O/N, aby usunąć organoidy. W przypadku długotrwałego przechowywania szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Obrazy należy uzyskiwać za pomocą systemu mikroskopii konfokalnej.

Wyniki

Przełyk jest podzielony na różne warstwy: nabłonek, blaszka właściwa, błona podśluzowa oraz warstwa mięśniowa zewnętrzna (Ryc. 1A). Fibroblasty znajdują się w błonie podśluzowej i blaszce właściwej, które określa się mianem zrębu. W niniejszym protokole warstwa mięśniowa zewnętrzna jest usuwana mechanicznie (Ryc. 1B), co nie prowadzi do utraty fibroblastów (PdgfrαH2BeGFP+) znajdujących się w zrębie (Ryc. 1C). Przed dysocjacją nabłonek zostaje oddzielony od zrębu, co skutkuje powstaniem dwóch segmentów tkankowych (Ryc. 1B). Rozdzielenie tych dwóch warstw daje możliwość wydłużenia czasu dysocjacji dla bardziej odpornej warstwy nabłonkowej w porównaniu z kruchą warstwą zrębu. W ten sposób opracowano wydajny protokół izolacji, pozwalający na uzyskanie zarówno żywych komórek progenitorowych nabłonka, jak i fibroblastów zrębu (Ryc. 1B). Komórki progenitorowe przełyku są sortowane na podstawie wysokiej ekspresji INTEGRIN-β4 oraz E-CADHERIN (Ryc. 1C,D).

Subpopulacje fibroblastów można izolować, wykorzystując odmienne markery. W niniejszym protokole przedstawiono strategię izolacji fibroblastów opartą na powszechnie stosowanych markerach fibroblastów PDGFRα oraz DPP4 (CD26). Izolacja przeprowadzona za pomocą ekspresji reportera PdgfrαH2BeGFP lub przeciwciała DPP4 wykazuje, że około 50% izolowanych komórek to fibroblasty (Ryc. 1E,F). Dodatkowo 70% fibroblastów PDGFRα+ jest jednocześnie DPP4+, co wskazuje na uzyskanie w znacznym stopniu nakładającej się, lecz nie identycznej populacji fibroblastów. Po wyizolowaniu populacji komórek nabłonkowych i stromy, komórki progenitorowe przełyku są hodowane albo osobno, albo wspólnie z fibroblastami w kopule macierzy. Aby zbadać wkład fibroblastów w tworzenie organoidów, ko-kulturę utrzymuje się w pożywce o zredukowanej zawartości czynników wzrostu (Ryc. 1G).

Komórki progenitorowe przełyku tworzą organoidy w obecności EGF, NOGGIN i RSPO (ENR). Usunięcie NOGGIN oraz zmniejszenie ilości RSPO (25 ng/µL; ERlow) jest wystarczające, aby zapobiec tworzeniu organoidów (Rysunek 2A). Co ciekawe, dodanie fibroblastów DPP4+ lub PDGFRα+ do komórek progenitorowych przełyku w medium ERlow przywraca zdolność do tworzenia organoidów, co wykazuje funkcję wspomagającą obu populacji fibroblastów (Rysunek 2A-D). Wizualizacja transgenu PdgfrαH2BeGFP pokazuje, że fibroblasty pozostają w bliskim kontakcie z nabłonkowymi komórkami progenitorowymi podczas tworzenia organoidów (Rysunek 2A). W 6. dniu fibroblasty PdgfrαH2BeGFP+ są wciąż liczne w kokulturze. Fibroblasty występują w całej kopule, w pobliżu i stykając się z organoidami (pełna strzałka) lub są do nich przytwierdzone (grot strzałki; Rysunek 2D).

Barwienie całego preparatu ukazuje trójwymiarową reprezentację interakcji fibroblastów z organoidami (Rycina 3). Choć możliwe jest przeprowadzenie protokołu barwienia całego preparatu bez użycia roztworu do klarowania, zmniejsza to przezroczystość i penetrację lasera w organoidzie (Rycina 3B, widok z}$). Podczas montowania organoidów dystans pomagają zachować ich morfologię. W przeciwieństwie do tego, nałożenie szkiełka podstawowego bezpośrednio na organoidy (bez dystansu) spłaszcza je, co prowadzi do utraty struktury organoidu (Rycina 3A,B).

Stwierdzono, że zarówno fibroblasty DPP4+, jak i PDGFRα+ otaczają organoidy (Rycyna 3C, Wideo 1 oraz Wideo 2). Różnicowanie organoidów przełyku można oceniać za pomocą różnych markerów. Rycina 4 pokazuje, że opisany protokół barwienia jest odpowiedni zarówno dla keratyn łatwiejszych do barwienia (KRT14/13), jak i dla trudniejszych do barwienia czynników transkrypcyjnych (TRP63/KLF4). Protokół kokultury generuje organoidy o wzorcu różnicowania podobnym do tego, który wykazano in vivo13,14 oraz jaki obserwuje się w organoidach hodowanych w medium ENR; komórki progenitorowe KRT14+ lub TRP63+ tworzą warstwę zewnętrzną, a zróżnicowane komórki KRT13+ lub KLF4+ są skierowane do wewnątrz.

Niniejszy protokół dostarcza narzędzi do badania niszy komórek macierzystych przełyku in vitro oraz wizualizacji interakcji między organoidami a fibroblastami. Dzięki zastosowaniu protokołu izolacji fibroblastów z wykorzystaniem przeciwciał, metoda ta jest adaptowalna i może być używana do badania subpopulacji fibroblastów bez konieczności stosowania myszy transgenicznych.

Schemat przekroju przełyku z analizą komórek nabłonkowych i zrębu za pomocą cytometrii przepływowej.
Rysunek 1: Izolacja komórek progenitorowych i subpopulacji fibroblastów z przełyku. (A) Schematyczny przegląd różnych warstw przełyku. Zrąb obejmuje błonę właściwą (lamina propria) i błonę podśluzową. (B) Schematyczny przegląd protokołu izolacji. Mięśnie (muscularis externa) są usuwane mechanicznie za pomocą pęsety; pozostała część przełyku jest rozcinana i inkubowana w termolizynie w celu oddzielenia warstwy nabłonkowej od zrębu. Nabłonek i zrąb są rozdzielane, rozdrabniane mechanicznie i trawione enzymatycznie do postaci zawiesin pojedynczych komórek. Rozdzielone komórki są następnie barwione i przygotowywane do FACS. (C) Przekrój przełyku pozbawionego muscularis externa, wykazujący fibroblasty PdgfrαH2BeGFP+ w zrębie. Komórki podwójnie dodatnie dla INTEGRIN-β4 (ITGβ4) i E-KADHERYNY (ECAD) to komórki progenitorowe nabłonka przełyku. Pasek skali = 100 µm. (D) Reprezentatywny wykres cytometrii przepływowej z izolacji komórek nabłonkowych, pokazujący odsetek żywych komórek (panel górny) spośród wszystkich pojedynczych komórek. Panel dolny pokazuje odsetek wyizolowanych progenitorowych (Prog.) komórek ITGβ4+ ECAD+ spośród wszystkich żywych komórek. (E) Reprezentatywny wykres cytometrii przepływowej z izolacji komórek zrębu, pokazujący odsetek żywych komórek (panel górny lewy). Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej pokazujące odsetek wyizolowanych fibroblastów DPP4+ (Fibr.; panel górny prawy) i fibroblastów Pdgfrα+ (panel dolny lewy) spośród wszystkich żywych komórek. 70% fibroblastów Pdgfrα+ jest również DPP4+ (panel dolny prawy). (F) Reprezentatywny wykres cytometrii przepływowej zrębu, pokazujący komórki tylko DPP4+ (2,5%), komórki DPP4+ PDGFRα+ (37,5%) oraz komórki tylko PDGFRα+ (17,7%). Procenty odnoszą się do wszystkich żywych komórek. (G) Same komórki nabłonkowe są wysiewane na kopułkę macierzy w obecności 50 ng/µL EGF, 100 ng/µL NOGGIN i 250 ng/µL RSPO (ENR), lub wspólnie z fibroblastami w obecności EGF i niskiego stężenia RSPO (25 ng/µL). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tworzenie organoidów, ekspresja eGFP, wpływ fibroblastów; mikroskopia, wykres, analiza procesu.
Rycina 2: Reprezentatywne wyniki kokultur organoidów. (A) Obrazy w polu jasnym ukazujące wzrost organoidów od dnia 1. do dnia 6. Obrazy w polu jasnym organoidów w kokulturze z fibroblastami PdgfrαH2BeGFP+ wykazują również jądrowy sygnał eGFP. Pasek skali = 25 µm. (B) Obrazy w polu jasnym całych kopułek macierzy w dniu 6. Lewa kolumna przedstawia kokultury organoidów hodowane w obecności fibroblastów Pdgfrα+ w pożywce ERlow lub ElowRlow. Środkowa kolumna przedstawia kokultury organoidów hodowane w obecności fibroblastów DPP4+ w pożywce ERlow lub ElowRlow. Prawa kolumna przedstawia monokultury organoidów hodowane w pożywce ENR. Pożywka ENR = EGF (50 ng/µL), NOGGIN (100 ng/µL) i RSPO (250 ng/µL). ERlow = EGF i 25 ng/µL RSPO. ElowRlow = 5 ng/µL EGF i 25 ng/µL RSPO. Pasek skali = 500 µm. (C) Wykres przedstawiający wydajność tworzenia organoidów (%) (tj. procent komórek tworzących organoidy w różnych warunkach hodowli). Każda kropka reprezentuje kopułkę macierzy, a słupek reprezentuje średnią wszystkich kropek dla danej warunki. (D) Obraz w polu jasnym i fluorescencyjny organoidów w dniu 6 w kokulturze z fibroblastami PdgfrαH2BeGFP+. Fibroblasty PdgfrαH2BeGFP+ są obecne w całej kopułce, przyczepione do organoidów (grot strzałki) oraz nieprzyczepione, ale w kontakcie z organoidami (pełna strzałka). Pasek skali = 250 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat metody barwienia komórkowego; wyniki przejaśniania trójwymiarowych sferoidów nowotworowych; obrazowanie mikroskopowe.
Rysunek 3: Protokół barwienia całego preparatu (whole mount) w badaniu oddziaływań między fibroblastami a organoidami. (A) Schematyczny przegląd protokołu immunofluorescencji całego preparatu. AB = przeciwciało. (B) Obraz immunofluorescencyjny barwienia całego preparatu bez przejaśniania, wykazujący zmniejszoną przejrzystość i penetrację światła laserowego w porównaniu do organoidów przejaśnionych. Brak dystansera skutkuje spłaszczeniem organoidu i utratą jego morfologii. (C) Obrazy całego preparatu z kokulturowanych organoidów pokazują powierzchnie 3D organoidów z fibroblastami VIMENTIN+ (Fibr.) owiniętymi wokół organoidu i w bliskim kontakcie z nim. Przekroje 3D i obrazy w płaszczyźnie 2D pokazują światło organoidu. Pasek skali = 50 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat hodowli komórkowej 3D przedstawiający monokulturę i kokulturę; analiza ekspresji białek w 3D i 2D.
Rysunek 4: Obrazy całych preparatów wykazują odrębne populacje komórek warstwy podstawnej i nadpodstawnej. (A) Barwienie całych preparatów organoidów w monokulturze i kokulturze z fibroblastami PdgfrαH2BeGFP+ wykazujące komórki warstwy podstawnej KRT14+ w warstwie zewnętrznej oraz zróżnicowane komórki nadpodstawne KRT13+. Pasek skali = 50 μm. (B) Barwienie całych preparatów organoidów w monokulturze i kokulturze z fibroblastami PdgfrαH2BeGFP+ wykazujące komórki warstwy podstawnej TRP63+ w warstwie zewnętrznej oraz zróżnicowane komórki nadpodstawne KLF4+. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1: Tabela opisująca składniki pożywek do hodowli organoidów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Wideo 1: PdgfrαH2BeGFP+ fibroblast owinięty wokół organoidu i pozostający z nim w bliskim kontakcie. Film towarzyszy górnemu panelowi Rycina 3CPasek skali w Rycina 3C jest 50 µm, a organoid jest ~120 µm średnicy. VIMENTIN zaznaczono kolorem białym, E-KADHERYNĘ kolorem czerwonym, PdgfrαH2BeGFP w kolorze zielonym, a DAPI w kolorze niebieskim. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo 2: Fibroblast DPP4+ owinięty wokół organoidu i w bliskim kontakcie z nim.Wideo to stanowi uzupełnienie dolnego panelu Rysunku 3C. Pasek skali na Rysunku 3C wynosi 50 µm, a średnica organoidu to ok. 120 µm. VIMENTIN pokazano w kolorze białym, E-CADHERIN w czerwonym, a DAPI w niebieskim. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół ustanawia model in vitro do badania funkcjonalnych interakcji nabłonek przełyku i fibroblasty.

Warstwa nabłonkowa jest oddzielona od zrębu, co pozwala na zoptymalizowany protokół dysocjacji zarówno dla przedziału nabłonkowego, jak i zrębu. Pomimo optymalizacji protokołu dysocjacji nabłonka, grudki tkanek pozostają widoczne. Energiczne pipetowanie w górę i w dół co 15 minut znacznie zmniejsza liczbę i rozmiar grudek. Inne protokoły wykorzystują trypsynę do dalszej dysocjacji warstwy nabłonkowej 5,6. W tym przypadku stosowanie trypsyny lub dalsze wydłużanie czasu dysocjacji nie jest zalecane, ponieważ prowadzi to do zmniejszenia żywotności komórek nabłonka i wydajności tworzenia organoidów. W przeciwieństwie do nabłonka, zrąb łatwo ulega dysocjacji, a 30 minut w roztworze dysocjacyjnym powoduje powstanie zawiesiny jednokomórkowej o żywotności fibroblastów ~90% (ryc. 1E). Wykluczenie w protokole etapu separacji nabłonkowo-stomijnej znacznie wydłuża czas dysocjacji, co skutkuje zmniejszoną żywotnością fibroblastów i niższą wydajnością komórek nabłonkowych. Dodatkowo, oddzielenie nabłonka od zrębu daje możliwość określenia liczby komórek w każdej populacji i wymieszania komórek nabłonkowych i fibroblastów z różnych linii myszy podczas zakładania kokultur.

Badanie funkcji fibroblastów na wzroście organoidów jest powszechnie stosowaną metodą w biologii komórek macierzystych 9,10,11,15,16. Ustalone pożywki do współhodowli są albo uzupełnione DMEM 10% płodową surowicą cielęcą (FCS)9,15, albo pożywką o zredukowanym czynniku wzrostu10,16. W tym protokole pożywka o zredukowanym czynniku wzrostu jest używana do naśladowania warunków panujących w niszy komórek macierzystych in vivo, w której fibroblasty są w dużej mierze w stanie spoczynku. FCS jest surowicą bogatą w czynnik wzrostu, która powoduje aktywację i proliferację fibroblastów w kokulturach, prawdopodobnie odpowiadając stanowi komórki fibroblastów odmiennemu od stanu in vivo. Poprzez wykluczenie FCS i zmniejszenie czynników wzrostu, tak aby sama pożywka (ERlow) nie wspierała wzrostu organoidów i nie stymulowała proliferacji fibroblastów, możliwe jest wyizolowanie wpływu fibroblastów na wzrost organoidów. W tym podłożu NOGGIN jest usuwany, a RSPO redukowane do minimum (10% RPSO). Wykazano, że zarówno NOGGIN, jak i RSPO są niezbędne do wzrostu organoidów przełyku6. EGF został zachowany w pożywce do kohodowli, ponieważ sam w sobie nie wspomaga wzrostu organoidów. Jednak fibroblasty są również zdolne do wspierania wzrostu organoidów w pożywce o obniżonej EGF (ElowRlow; Rysunek 2B,D).

Kokultury organoidów nie mogą być podtrzymywane przez pasażowanie, ponieważ fibroblasty są tracone podczas trypsynizacji. Jednak pasażowanie organoidów zostało uwzględnione w protokole, ponieważ organoidy przełyku mogą być utrzymywane, rozwijane i wykorzystywane do dalszych eksperymentów jako monokultury. Pasażowane organoidy z monokultur mogą być używane do tworzenia kokultur ze świeżo wyizolowanymi fibroblastami. Wadą stosowania komórek pierwotnych jest liczba myszy potrzebnych do założenia wielu kokultur organoidowych. Koncentrując się na małych subpopulacjach fibroblastów, liczba uzyskanych kokultur jest ograniczona. W innych protokołach fibroblasty są najpierw namnażane w hodowli przed użyciem ich do tworzenia kokultur organoidowych10. Jednak fibroblasty zmieniają morfologię i tożsamość podczas pasażu, co wykazano przy użyciu pierwotnych fibroblastów skóry i serca17,18. Konwencjonalne pasażowanie 2D fibroblastów przełyku powoduje zarówno zmiany morfologii, jak i fenotypu, co pokazuje, że wzbogacanie fibroblastów in vitro nie jest odpowiednie dla kokultur mających na celu fenokopię niszy endogennych komórek macierzystych.

Barwienie całego mocowania zapewnia narzędzie do utrzymania i wizualizacji interakcji fibroblast-organoid. Należy zauważyć, że chociaż nie wszystkie organoidy będą miały bezpośrednio przyłączone do nich fibroblasty, większość organoidów ma kontakt z fibroblastami (patrz ryc. 2C). Aby utrzymać interakcje nabłonkowo-fibroblastowe, ważne jest, aby obchodzić się z organoidami ostrożnie i unikać energicznego pipetowania, wirowania i wirowania z dużą prędkością. Optymalna fiksacja jest ważna dla utrzymania architektury tkanki 3D, a także utrzymania endogennej fluorescencji. 30-minutowa fiksacja wystarcza do zachowania sygnału H2BeGFP i jest optymalna dla przeciwciał stosowanych w tym protokole, jednak może się to różnić w zależności od zastosowanych fluoroforów i przeciwciał. Oczyszczanie organoidów zmniejsza rozpraszanie światła i znacznie poprawia wizualizację całej struktury 3D. Ponieważ organoidy są małe, oczyszczanie jest łatwe i szybkie; jednak obrazowanie całych organoidów za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej może być czasochłonne, ponieważ konieczne jest wykonanie wielu stosów Z. Mikroskopy konfokalne, takie jak obracający się dysk, mogą być używane do skrócenia czasu obrazowania.

Ogólnie rzecz biorąc, organoidy przełyku hodowane w obecności fibroblastów stanowią cenne narzędzie do zrozumienia aspektów niszy komórek macierzystych przełyku. Ponadto oczyszczanie całego mocowania zapewnia dostępną metodę wizualizacji interakcji między fibroblastami a organoidami.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez ERC StG TroyCAN (851241). E.E. jest doktorem habilitowanym Cancerfonden. M.G. jest stypendystą Ragnara Söderberga i młodszym badaczem Cancerfonden. Jesteśmy wdzięczni za pomoc techniczną ze strony głównych placówek Karolinska Institutet, w tym Biomedicum Flow Cytometry Core Facility, Biomedicum Imaging Core (BIC) oraz Comparative Medicine Biomedicum (KMB) animal facility. Dziękujemy członkom laboratorium Genander za uważne przeczytanie i skomentowanie protokołu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Suplement B-27 (50X), bez surowicyThermo Fisher (Gibco)17504001
Corning  Matrigel  Matryca błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu (GFRFisher Scientific356231
DimetylosulfotlenekSigma-Aldrich276855-100ML
DMEM/F-12Thermo Fisher (Gibco)11320074
DPBSThermo Fisher (Gibco)14190250
Surowica bydlęcapłodu Sigma-AldrichF7524
GlutaMAX SuplementThermo Fisher (Gibco)35050061
HBSS, bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowejThermo Fisher (Gibco)14175-129
Normalna surowica osłaJackson Immuno017-000-121
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Thermo Fisher (Gibco)15140122
Triton X-100 roztwórMerck93443-100ML
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaThermo Fisher (Gibco)25200-056
Chemikalia, peptydy i białka rekombinowane
DAPI RoztwórThermo Fisher62248
Roztwór dysocjacyjny: 0,25 mg/ml Liberase TM, 0,25 mg/ml Dnazy w HBSS
Dnaza ISigma-Aldrich
Formaldehyd, 37%, z 10-15% metanolemSigma-Aldrich252549-1L
LiberaseSigma-Aldrich5401127001
N-acetylo-cysteinaSigma-AldrichA9165-25G
Mysi NogginPeprotech250-38
RapiClear 1.47SunJin Lab#RC147001
Rekombinowane białko EGF myszy, CFR& Systemy D2028-EG-200
R-spondin-1 mysiPeprotech315-32
SYTOX Niebieski barwnik martwych komórekThermo FisherS34857
ThermolysinSigma-AldrichT7902-25MG
Y-27632 dichlorowodorekSigma-AldrichY0503-5MG
strong>Plastic & Wyroby szklane
Corning Sitka do komórek sterylnych 40umVWR15360801
Sitka do komórek sterylnych Corning 70umVWR431751
Menzel Deckglä ser/ szkiełka nakrywkoweThermo FisherQ10143263NR15
Probówka reakcyjna SafeSeal, 1,5 mL, PPSarstedt72.706
Probówki mikrowirówkowe o niskiej retencji zatrzaskowe 0,6 mlThermo Fisher3446
VWR631-9483
Tools
0,05 mm 4 okrągłe studzienki iSpacerSunJin Lab#IS204
Dumont #5 kleszcze, końcówka biologicznaFST11252-20
ImmEdge PenVectorLaboratoriesH-4000
Nożyczki sprężynowe kątowe na bok końcówka kulowa 8mm Krawędź tnącaFST15033-09
Instruments
Mikroskop konfokalny Stellaris 5 Leica
ZEISS Stemi 305Zeiss
FACS ARIA IIIBD Biosciences
Conjugated Przeciwciała dla FACS
Alexa Fluor 647 Przeciwciało anty-mysie CD104
Klon: 346-11A		123608 123608
Przeciwciało anty-mysie CD26 (DPP-4) APCH194-112H194-112
PE/Cy7 przeciwciało przeciw myszy/ludzkiemu CD324 (E-kadherynie)147310147310
Przeciwciała immunofluorescencyjne
CD104 (ß-integryna 4)
Klon: 346-11A		BioLegend553745
Cytokeratin 14(AbD Serotec)BP5009
Cytokeratin13
Klon: EPR3671		abcamab92551
E-kadheryna (CD324)
Klon: 2.40E+11		Technologia sygnalizacji komórkowej3195
Keratyna 5 Poliklonalne przeciwciało kurczaka, oczyszczone
Klon: Poly9059		BioLegend905901
p63
Klon: 4a4		abcamab735
Rekombinowany anty-KLF4 antybod
Klon: EPR20753-25		abcamab214666
VimentinSigma-AldrichAB5733
Przeciwciała drugorzędowe
Donkey anti-species* z wybranym fluoroforemJackson Immuno
) 11284932001< Szkiełka SuperFrost Mikroskop separacyjny Przeciwciała Acris

Bibliografia

  1. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).
  2. Lohmussaar, K., et al. Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer. Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).
  3. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  4. Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).
  5. Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440(2021).
  6. DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).
  7. Kasagi, Y., et al. The esophageal organoid system reveals functional interplay between notch and cytokines in reactive epithelial changes. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (3), 333-352 (2018).
  8. Plikus, M. V., et al. Fibroblasts: Origins, definitions, and functions in health and disease. Cell. 184 (15), 3852-3872 (2021).
  9. McCarthy, N., et al. Distinct mesenchymal cell populations generate the essential intestinal BMP signaling gradient. Cell Stem Cell. 26 (3), 391-402 (2020).
  10. Cordero-Espinoza, L., et al. Dynamic cell contacts between periportal mesenchyme and ductal epithelium act as a rheostat for liver cell proliferation. Cell Stem Cell. 28 (11), 1907-1921 (2021).
  11. Pastula, A., et al. Three-dimensional gastrointestinal organoid culture in combination with nerves or fibroblasts: a method to characterize the gastrointestinal stem cell niche. Stem Cells International. 2016, 3710836(2016).
  12. Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
  13. McGinn, J., et al. A biomechanical switch regulates the transition towards homeostasis in oesophageal epithelium. Nature Cell Biology. 23 (5), 511-525 (2021).
  14. Zhang, Y., Bailey, D., Yang, P., Kim, E., Que, J. The development and stem cells of the esophagus. Development. 148 (6), (2021).
  15. Ohlund, D., et al. Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer. The Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).
  16. Pentinmikko, N., et al. Notum produced by Paneth cells attenuates regeneration of aged intestinal epithelium. Nature. 571 (7765), 398-402 (2019).
  17. Janson, D., Rietveld, M., Willemze, R., El Ghalbzouri, A. Effects of serially passaged fibroblasts on dermal and epidermal morphogenesis in human skin equivalents. Biogerontology. 14 (2), 131-140 (2013).
  18. Landry, N. M., Rattan, S. G., Dixon, I. M. C. An improved method of maintaining primary murine cardiac fibroblasts in two-dimensional cell culture. Scientific Reports. 9 (1), 12889(2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Współhodowla organoidówkomórki progenitorowe nabłonkasubpopulacje fibroblastówcytometria przepływowaizolacja komórekmikroskopia konfokalnafibroblasty związane z nowotworemprzejaśnianie organoidóworganoidy nabłonkowe
Charakterystyka funkcjonalna i wizualizacja fibroblastów przełyku przy użyciu kokultur organoidowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.