Od czasu pojawienia się bezpośrednich detektorów elektronów oraz ulepszenia oprogramowania i sprzętu, mikroskopia krioelektronowa (cryo-EM) stała się techniką, która rutynowo pozwala naukowcom określać strukturę makrocząsteczek z dokładnością bliską atomowi 1,2. Przyspieszenie to zostało skatalizowane przez niezwykle szybką serię nowych rozwiązań, od przygotowania próbek po gromadzenie i przetwarzanie danych. Aby umożliwić szeroką demokratyzację tej techniki dla osób niebędących ekspertami, stworzono bardziej wydajne i dostępne rurociągi. Uderzające jest to, że niecałe 10 lat po "rewolucji rozdzielczościowej" krio-EM stał się podstawową techniką charakteryzacji białek, zarówno w środowisku akademickim, jak i w przemyśle 3,4.
Jednym z najbardziej niezwykłych aspektów społeczności badawczej zajmującej się krio-EM jest gotowość do otwartego dzielenia się protokołami, strategiami i oprogramowaniem5. Ta otwartość technologii i wiedzy specjalistycznej w znacznym stopniu przyczyniła się do bardzo szybkiego tempa rozwoju, ale niektóre wąskie gardła nadal uniemożliwiają jej pełną dostępność. W tym zbiorze metod staramy się opisać niektóre z najnowszych osiągnięć w zakresie przygotowania siatek odpowiednich do analizy statyczno-wytrzymałościowej za pomocą cryo-EM, co wraz z dostępem do sprzętu do analizy danych stanowi główne wąskie gardło dla wielu projektów. Omawiamy również nowe protokoły, które są obecnie opracowywane w tej dziedzinie, dla nowych podejść w analizach krio-EM.
Jak wspomniano powyżej, jednym z obecnych wąskich gardeł w rutynowym stosowaniu krio-EM w laboratorium jest przygotowanie próbek. Na poziomie aplikacji próbki do siatek można napotkać kilka problemów: najczęściej preferowaną orientację próbki w lodzie oraz jej denaturację na granicy faz powietrze-woda. Jednym z rozwiązań tego problemu jest osłona próbki przed powierzchnią międzypowietrzno-wodną, polegającą na zastosowaniu warstw nośnych z węgla lub grafenu, które fizycznie zapobiegają kontaktowi próbki z powietrzem. Aby ułatwić nakładanie cienkich warstw na siatki, de Martin Garrido i wsp.6 opracowali nośny blok pływający wytwarzany przez drukarkę 3D, który umożliwia kontrolowane nakładanie małych kropel wody i próbki. Za pomocą tego bloku warstwy grafenu i węgla są osadzane w niedrogi i przyjazny dla użytkownika sposób.
Innym sposobem zapobiegania uszkodzeniom na granicy faz powietrze-woda jest ograniczenie czasu, w którym białko jest wystawione na działanie atmosfery. W tym celu dwa różne instrumenty, opracowane przez Klebsa i wsp.7 oraz Budella i wsp.8, wykorzystują nowatorskie podejścia do szybkiego (już 10 ms) przygotowania siatki, zmniejszając prawdopodobieństwo wystąpienia problemów z orientacją cząstek. Kolejną zaletą tych urządzeń jest możliwość przeprowadzania eksperymentów z rozdzielczością czasową, co stanowi nową, ekscytującą granicę dla badań strukturalnych.
W przeciwieństwie do tego, Nguyen i wsp.9 opisują metodę zamrażania siatek do analizy krio-EM w przypadku braku komercyjnych lub niestandardowych urządzeń, które są albo bardzo kosztowne, albo trudne do zbudowania. Pokazują one, w jaki sposób można uzyskać siatki o podobnej jakości za pomocą taniego, domowego urządzenia, które nie wymaga drogiego oprzyrządowania, przyczyniając się do demokratyzacji krio-EM.
W cryo-EM próbka będąca przedmiotem zainteresowania nie zawsze jest białkiem, ale może być małą cząsteczką lub dużym systemem biologicznym, takim jak cała komórka. Przygotowanie takich próbek jest wyjątkowe i wymaga określonych kroków, a także różnych strategii gromadzenia danych.
W przypadku dyfrakcji elektronów mikrokrystalicznych (MicroED) próbka, która ma być badana, jest małą substancją chemiczną, która zwykle występuje w postaci proszku. Proszek nakłada się bezpośrednio na siatkę EM w celu utrzymania krystalicznej formy. Zbieranie danych odbywa się następnie w trybie dyfrakcji, jak pokazują Martynowycz i Gonen10. W przeciwieństwie do tego, całe komórki są zbyt grube do analizy krio-EM. Aby rozwiązać ten problem, Bisson i in. opisują metodę wykorzystania SEM do fizycznego wiercenia w takiej próbce, w celu uzyskania cienkich przekrojów odpowiednich do badań strukturalnych11.
Od próbki do struktury, ważne jest, aby prowadzić rejestr dla każdego etapu procesu, ponieważ dla każdej próbki białka zmienia się wiele parametrów, od stężenia białka po ustawienia mikroskopu i analizę danych. W tym celu Wypych i wsp.12 opracowali internetowe narzędzie do zarządzania informacjami, które pozwala użytkownikom organizować przepływ pracy i śledzić wszystkie szczegóły potrzebne do przyszłych publikacji. Jest to szczególnie ważne, ponieważ automatyzacja staje się coraz bardziej powszechna w krio-EM, szczególnie w warunkach przemysłowych.
W ciągu ostatniej dekady technologia Cryo-EM rozwijała się w znakomitym tempie, zarówno na froncie sprzętu, jak i oprogramowania. Aby zapewnić szerokie rozpowszechnienie najlepszych praktyk i szerokie przyjęcie nowych metod, niezbędny jest przejrzysty zestaw protokołów. Niniejsze wydanie specjalne przyczyni się do tych wysiłków.