Artykuł metodologiczny

Dielektroforeza indukowana światłem w celu scharakteryzowania zachowania elektrycznego ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/64909

⸱

16 czerwca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Samueli School of Engineering, University of California, Irvine, 2Department of Biomedical Engineering, Samueli School of Engineering, University of California, Irvine, 3Department of Chemistry, School of Physical Sciences, University of California, Irvine, 4Sue & Bill Gross Stem Cell Research Center, University of California, Irvine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy dielektroforezę indukowaną światłem jako bezznacznikowe podejście do charakteryzowania heterogenicznych linii komórkowych, w szczególności ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (hMSC). W artykule opisano protokół wykorzystania i optymalizacji urządzenia mikroprzepływowego z warstwą fotoprzewodzącą w celu scharakteryzowania zachowania elektrycznego hMSC bez zmiany ich stanu natywnego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSC) stanowią źródło komórek pochodzących od pacjenta do prowadzenia mechanistycznych badań nad chorobami lub do wielu zastosowań terapeutycznych. Zrozumienie właściwości hMSC, takich jak ich zachowanie elektryczne na różnych etapach dojrzewania, stało się w ostatnich latach ważniejsze. Dielektroforeza (DEP) to metoda, która może manipulować komórkami w niejednorodnym polu elektrycznym, dzięki czemu można uzyskać informacje o właściwościach elektrycznych komórek, takich jak pojemność błony komórkowej i przenikalność. Tradycyjne tryby DEP wykorzystują elektrody metalowe, takie jak elektrody trójwymiarowe, do scharakteryzowania odpowiedzi komórek na DEP. W tym artykule przedstawiamy urządzenie mikroprzepływowe zbudowane z warstwy fotoprzewodzącej zdolnej do manipulowania komórkami za pomocą projekcji świetlnych, które działają jak wirtualne elektrody in situ o łatwo dopasowanej geometrii. Przedstawiono tutaj protokół, który demonstruje to zjawisko, zwane DEP indukowanym światłem (LiDEP), w celu scharakteryzowania hMSC. Pokazujemy, że odpowiedzi komórek indukowane przez LiDEP, mierzone jako prędkości komórek, można zoptymalizować za pomocą różnych parametrów, takich jak napięcie wejściowe, zakresy długości fal projekcji światła i intensywność źródła światła. Przewidujemy, że w przyszłości platforma ta może utorować drogę technologiom, które są wolne od znaczników i umożliwiają charakteryzację w czasie rzeczywistym heterogenicznych populacji hMSC lub innych linii komórek macierzystych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSC) są znane ze swoich właściwości immunosupresyjnych1, co doprowadziło do ich zastosowania w terapiach w leczeniu różnych chorób, takich jak cukrzyca typu II2, choroba przeszczep kontra gospodarz3, oraz choroby wątroby4. HMSC są niejednorodne, zawierają subpopulacje komórek, które różnicują się w adipocyty, chondrocyty i osteoblasty. HMSC pochodzą z tkanki tłuszczowej, tkanki pępowinowej i szpiku kostnego, a ich potencjał różnicowania zależy od tkanki pochodzenia i zastosowanego procesu hodowli komórek5. Na przykład, zgodnie z badaniem przeprowadzonym przez Sakaguchi i wsp., hMSC pochodzące z tkanki tłuszczowej są bardziej skłonne do różnicowania się w adipocyty, podczas gdy hMSC pochodzące ze szpiku kostnego są bardziej skłonne do różnicowania się w osteocyty6. Jednak wpływ pochodzenia tkankowego hMSC na ich potencjał różnicowania jest zjawiskiem, które nadal wymaga dalszego zrozumienia. Ponadto zróżnicowane potencjały różnicowania hMSC przyczyniają się do ich nieodłącznej heterogeniczności i stwarzają wyzwania w stosowaniu hMSC w celach terapeutycznych. W związku z tym charakterystyka, a także sortowanie heterogenicznych linii komórek macierzystych ma kluczowe znaczenie dla rozwoju in vitro i klinicznego zastosowania tych komórek. Cytometria przepływowa, złoty standard techniki badania różnic w fenotypach komórkowych, wykorzystuje antygeny powierzchniowe komórek i barwniki fluorescencyjne do znakowania komórek docelowych i charakteryzowania ich na podstawie rozpraszania światła lub charakterystyki fluorescencji specyficznej dla komórki6,7,8. Do wad tej metody należy ograniczona dostępność biomarkerów antygenów na powierzchni komórki, wysoki koszt sprzętu i operacji oraz fakt, że barwienie powierzchni komórki może potencjalnie uszkodzić błonę komórkową i wpłynąć na zastosowania terapeutyczne9,10,11. W związku z tym badanie nowych technik charakterystyki komórek bez naruszania natywnego stanu błony komórkowej może korzystnie wpłynąć na skuteczność kliniczną terapii komórkami macierzystymi.

Dielektroforeza (DEP), metoda charakteryzacji komórek, która nie używa etykiet powierzchniowych, jest przedmiotem obecnej pracy. DEP to bezznacznikowa lub niebarwiąca metoda stosowana na platformach mikroprzepływowych w celu scharakteryzowania heterogenicznych populacji komórek na podstawie ich właściwości elektrycznych. DEP wykorzystuje pole elektryczne prądu przemiennego (AC) w celu zastąpienia barwienia fluorescencyjnego (tj. metody opartej na znacznikach)7. Inne zalety stosowania urządzeń mikroprzepływowych opartych na DEP do charakteryzowania komórek obejmują wykorzystanie małych objętości (mikrolitrów), szybki czas analizy, minimalne wymagania dotyczące przygotowania próbki komórki, minimalne ryzyko zanieczyszczenia próbki, minimalną produkcję odpadów i niski koszt12,13. Kolejną zaletą funkcji DEP jest monitorowanie komórek w czasie rzeczywistym14,15,16. W przypadku DEP ogniwa w zawiesinie są wystawione na działanie niejednorodnego pola elektrycznego prądu przemiennego wytworzonego za pomocą elektrod i stają się spolaryzowane6. Ta polaryzacja powoduje ruch komórek i umożliwia manipulację komórkami w oparciu o częstotliwość i napięcie przyłożonego pola elektrycznego prądu przemiennego. Dostosowując częstotliwość, zwykle w zakresie od 5 kHz do 20 MHz, komórki mogą być przyciągane lub odpychane od elektrod, co odpowiada odpowiednio dodatniemu i ujemnemu zachowaniu DEP6.

Istnieje wiele trybów charakterystyki DEP, a mianowicie: tradycyjny, frakcjonowanie przepływu w polu i indukowany światłem, zgodnie z klasyfikacją konfiguracji elektrod i/lub strategią operacyjną17. Analizator 3DEP, tradycyjny tryb DEP, zawiera fizyczne elektrody metalowe i monitoruje odpowiedź komórkową na pole elektryczne prądu przemiennego. System ten wykorzystuje chip składający się z mikrostudzienek z wieloma trójwymiarowymi okrągłymi elektrodami i wykrywa zmiany natężenia światła, aby scharakteryzować zachowanie DEP komórki18,19,20,21. Dodatni DEP obserwuje się, gdy ogniwa poruszają się w kierunku krawędzi okrągłych elektrod wzdłuż ścianek mikrostudzienki, co powoduje zwiększenie natężenia światła w środku mikrodołka. Ujemny DEP obserwuje się, gdy komórki skupiają się w środku mikrostudzienki z dala od okrągłych elektrod, co powoduje zmniejszenie natężenia światła w środku mikrostudzienki. Te dwa zjawiska są reprezentowane w Rysunek 1. Tradycyjne metody DEP umożliwiają charakteryzowanie właściwości elektrycznych heterogenicznych populacji komórek18,20,21. Na przykład Mulhall i wsp. wykazali potencjał do rozróżnienia między normalnymi liniami komórkowymi keratynocytów jamy ustnej (HOK) a złośliwymi liniami komórkowymi keratynocytów jamy ustnej (H357) na podstawie różnic w pojemności błony21 przy użyciu analizatora 3DEP. Jednak jednym z ograniczeń tradycyjnych trybów DEP jest stała geometria elektrody. Ze względu na to, że hMSC są niejednorodne, korzystna jest możliwość łatwej modyfikacji geometrii elektrod podczas oceny DEP. Na przykład możliwość modyfikowania elektrod lub układów elektrod w czasie rzeczywistym w celu wychwytywania pojedynczych komórek pozwala na scharakteryzowanie komórek na podstawie prędkości i zachowania DEP. Zastosowanie modyfikacji elektrod w czasie rzeczywistym w ocenach DEP hMSC pozwala na jednokomórkową analizę hMSC zaraz po ich pozyskaniu z tkanki próbki w celu scharakteryzowania niejednorodności populacji próbki.

Aby przezwyciężyć ograniczenia tradycyjnych trybów DEP (tj. stałych elektrod fizycznych) i zbadać nowe możliwości modyfikacji konfiguracji elektrod w czasie rzeczywistym za pomocą zjawiska DEP, zbadano DEP indukowane światłem (LiDEP). LiDEP to nietradycyjny tryb DEP, który manipuluje komórkami za pomocą fotoprzewodzącego urządzenia mikroprzepływowego22,23 poprzez projekcje świetlne, zlokalizowane elektrody wytwarzają niejednorodne pole elektryczne, podobnie jak tradycyjna metoda DEP. Takie podejście pozwala również na elastyczność w geometrii elektrod i przesuwanie elektrod w urządzeniu mikroprzepływowym. Łagodzi to ograniczenia widoczne w przypadku elektrod stałych i daje możliwość uzyskania większej ilości informacji na temat heterogeniczności komórkowej. LiDEP został wykorzystany do wykrywania i analizowania różnych typów komórek w jednorodnych i heterogenicznych populacjach komórek22,23,24. Na przykład Liao i wsp. użyli LiDEP do oddzielenia krążących komórek nowotworowych (CTC) wyrażających moduł adhezji komórek nabłonka (EpCAM neg) od czerwonych krwinek, aby zbadać ich znaczenie w przerzutach raka22. Analiza pojedynczych komórek za pomocą LiDEP została z powodzeniem wykorzystana do scharakteryzowania i manipulowania komórkami nowotworowymi z stratyfikacją rakotwórczości trzustki23 oraz analizą CTC w próbkach przed i po przerzutach24.

Tutaj opisujemy, jak LiDEP może być wykorzystany do manipulowania hMSC za pomocą różnych geometrii elektrod (okrąg, diament, gwiazda i równoległe linie) oraz ustawień systemowych (przyłożone napięcie, natężenie światła i materiał urządzenia mikroprzepływowego), oferując w ten sposób podejście do charakteryzowania zachowania komórek macierzystych pochodzenia ludzkiego za pomocą wirtualnych elektrod.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja urządzeń mikroprzepływowych LiDEP

UWAGA: Proces produkcji polega na połączeniu trzech warstwowych komponentów: (i) warstwy fotoprzewodzącej z amorficznym krzemem (A:Si) i molibdenem osadzonym na podłożu ze szkła z tlenku indu i cyny (ITO); (ii) warstwa mikrokanalików wycięta z taśmy dwustronnej; oraz (iii) górne podłoże szklane ITO z wywierconymi otworami na wlot i wylot zawiesiny ogniwa.

  1. Powłoka szklana z fotoprzewodzącego tlenku indu i cyny (ITO)
    1. Podłoże szklane pokryte powłoką ITO (opór 15-20 Ω) należy oczyścić, przepływając po powierzchni azot (N2) z natężeniem przepływu wystarczającym do przemieszczania widocznych cząstek kurzu. Po tym kroku spłucz podłoże acetonem.
    2. Przenieś szkiełko szklane pokryte ITO do kąpieli w alkoholu izopropylowym, aby zmyć pozostałości acetonu, spłukać wodą DI i ponownie przepuścić gazN2, aż podłoże całkowicie wyschnie.
    3. Umieść szkiełko szkiełkowe stroną pokrytą powłoką ITO do góry w systemie napylania próżniowego.
    4. Napylić warstwę molibdenu o grubości 10 nm na podłoże szklane pokryte powłoką ITO (tarcza molibdenowa) z szybkością osadzania 0,7 A/s i czasem osadzania 140 s.
    5. Dodaj maskę cienia po jednej stronie szklanego podłoża, aby pozostawić 2 mm od krawędzi szklanego podłoża odsłonięte na połączenia elektryczne. Zdeponuj 1 μm A:Si przy użyciu indukcyjnie sprzężonego plazmowo-plazmowego chemicznego osadzania z fazy gazowej (ICP-PECVD), jak opisano w Medjdoub et al.25.
    6. Wyczyść szkiełko gazemN2, aby usunąć kurz i inne zanieczyszczenia. W przypadku każdego A:Si osadzonego pod maską cienia, zanurz krawędź do znaku 2 mm w 25% w/v roztworze wodorotlenku potasu, aby wytrawić A:Si.
  2. Produkcja urządzeń z chipem LiDEP
    1. Aby uformować mikrokanalik, należy zaopatrzyć się w taśmę dwustronną (52 mm x 25 mm) i przebić otwory (średnica = 4 mm) w odległości 5-6 mm od krawędzi krótszego wymiaru i wyśrodkowane między dłuższymi bokami taśmy. Użyj skalpela, aby przeciąć dwie proste linie (w odległości 3 mm od siebie) w poprzek otworów. Upewnij się, że arkusze ochronne po obu stronach taśmy dwustronnej są założone podczas całego etapu cięcia mikrokanałów.
    2. Wywierć dwa otwory o średnicy 3 mm w górnym szkiełku ITO. Taśmę można wyrównać na wierzchu szkła pokrytego ITO, przy czym długa krawędź taśmy wyrównuje się z długą krawędzią szkła. Zaznacz położenie otworu zmywalnym markerem. Upewnij się, że wywiercone otwory pokrywają się z otworami wybitymi w taśmie dwustronnej. Te dwa otwory będą działać jako otwory wlotowe i wylotowe urządzenia mikroprzepływowego.
    3. Usuń jedną stronę folii ochronnej z taśmy dwustronnej, wyrównaj otwory w taśmie i górnym szkiełku szklanym ITO i dociśnij je do siebie. Delikatnie dociśnij, aby usunąć kieszenie powietrzne, szczególnie w pobliżu mikrokanału. Kieszenie powietrzne mogą pozwalać na przedostawanie się medium lub innych roztworów pod taśmę, co może uszkodzić lub spowodować pleśń w urządzeniu mikroprzepływowym.
    4. Usuń drugą folię ochronną z taśmy dwustronnej i dociśnij do strony ze szkła ITO pokrytego molibdenem i A: Si. Dopasuj krawędź szkiełka światłoprzewodzącego, która jest przeciwna do strony odstępu 2 mm, do krawędzi taśmy dwustronnej, która jest skierowana w stronę środka górnego szkiełka ITO. Pojawi się kac po górnym szkiełku ITO i szkiełku ITO pokrytym materiałem fotoprzewodzącym.
    5. Dociśnij płaską powierzchnię, aby zapewnić dobrą przyczepność. Schemat podłoża szklanego i warstw taśmy dwustronnej jest zilustrowany na rysunku Rysunek 1A. Odetnij nadmiar taśmy z boku.
    6. Nałóż taśmę miedzianą na krawędzie warstwy A i warstwy C, aby połączyć generator funkcyjny. Należy w tym celu owinąć taśmę po stronie ITO lub materiału fotoprzewodzącego, w zależności od tego, czy jest to warstwa A, czy warstwa C, od krawędzi taśmy dwustronnej do około 3 cm na niepowlekaną stronę podłoża szklanego.
    7. Aby zapewnić pomyślne wykonanie urządzenia, użyj multimetru do przetestowania odczytu rezystancji między powlekanymi szkiełkami obu szklanych podłoży a miedzianą taśmą, która była przymocowana do szkła.
  3. Przygotowanie buforu funkcji DEP
    1. Odmierz 4,25 g sacharozy i umieść ją w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Następnie odmierz 0,15 g glukozy i umieść ją w tej samej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
    2. Napełnij stożkową rurkę 25 ml ultraczystej wody, zamknij pokrywkę i wymieszaj. Gdy około połowa sacharozy i glukozy się rozpuszczy, napełnij stożkową rurkę ultraczystą wodą do linii 50 ml. Mieszaj energicznie, aż cała sacharoza i glukoza się rozpuszczą. Roztwór buforowy DEP zawiera 8,5% (m/v) sacharozy i 0,3% (w/v) glukozy.
    3. Uzyskać 20 ml przygotowanego roztworu sacharozy i glukozy i umieścić go w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Następnie odmierzyć 0,1 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i umieścić ją w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej sacharozę i roztwór glukozy. Wirować, aż BSA się rozpuści. Końcowy roztwór buforowy DEP zawiera 0,5% (w/v) BSA.
  4. Przygotowanie komórek
    1. Uzyskać co najmniej 1 x 106 komórek (hMSCs lub HEK 293) zawieszonych w 1 ml pożywki wzrostowej, korzystając z protokołu hodowli komórkowej opisanego w poprzednich badaniach26,27. Umieścić zawiesinę komórek w probówce wirówkowej o pojemności 10 ml.
    2. Odwirować komórki HEK 293 przy 201 x g przez 5 minut, a hMSC przy 290 x g przez 10 minut. Po odwirowaniu odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml roztworu buforowego DEP z 0,5% BSA. Należy pamiętać, aby nie dodawać roztworu buforowego zbyt szybko, ponieważ mogą tworzyć się pęcherzyki.
    3. Powtórz proces wirowania jeszcze dwa razy, a następnie ponownie zawieś komórki w buforze DEP z 0,5% BSA w celu scharakteryzowania LiDEP. Podany protokół przygotowania komórek wystarcza na 10 przebiegów. Na przykład jeden test częstotliwości wymaga co najmniej 15 przebiegów, a zatem należy wykonać 2 ml komórek o stężeniu 1 x 106 komórek/ml.

2. Charakterystyka LiDEP

  1. Konfiguracja eksperymentalna
    1. Zbierz następujący sprzęt do zestawu eksperymentalnego do ilościowego określania odpowiedzi komórkowych na LiDEP: laptop, projektor, obiektyw, mikroskop cyfrowy i generator funkcyjny. Użyj laptopa, aby zaprojektować projekcje świetlne (gwiazda, romb, trzy linie i owal) i podłącz go do projektora.
    2. Użyj projektora jako źródła światła, aby wyświetlić projekcje świetlne na powierzchni fotoprzewodzącej (warstwa C) układu LiDEP. Ustaw go tak, aby światło ze źródła światła (projektora) przepływało przez soczewkę obiektywu 10x do obszaru mikrokanału układu LiDEP. Soczewka obiektywu 10x znajduje się na górze obiektywu projektora. Rysunek uzupełniający 1 przedstawia integrację projektora z systemem LiDEP.
    3. Podłącz układ LiDEP do generatora funkcyjnego, aby zastosować pole elektryczne prądu przemiennego. Obserwuj komórki doświadczające siły LiDEP, używając mikroskopu cyfrowego do obrazowania i nagrywania wideo. Rysunek 1B przedstawia schemat aparatury eksperymentalnej. Postępuj zgodnie ze standardowymi protokołami hodowli komórkowych26,27 dla wszystkich testowanych komórek.
  2. Procedury eksperymentalne
    1. Przepłucz mikrokanał 70% etanolem, a następnie 0,5% roztworem BSA. Ponownie przepłucz mikrokanał 0,5% roztworem BSA jeszcze dwa razy, aby upewnić się, że etanol i poprzednie komórki zostały całkowicie wypłukane. Komórki, które zostały już wystawione na działanie pola DEP, będą reagować inaczej niż świeże komórki i mogą zakłócać gromadzenie danych.
    2. Usunąć 0,5% roztwór BSA za pomocą pipety i umieścić urządzenie mikroprzepływowe w uchwycie urządzenia.
    3. Przymocuj zaciski krokodylkowe do każdego z połączeń taśmy miedzianej w urządzeniu. Ustaw generator funkcyjny na żądane napięcie (napięcie od szczytu do szczytu, Vpp) i częstotliwość (Hz). Badany tutaj zakres częstotliwości wynosił od 30 kHz do 20 MHz.
    4. Dodać 70 μl zawiesiny komórkowej (komórki + roztwór buforowy DEP z 0,5% BSA) do mikrokanału urządzenia. Ze względu na cienkość mikrokanalika (~0,05 mm) może dojść do rozlania z otworów wlotowych i wylotowych. Aby zmniejszyć ilość rozlanego płynu, użyj mniejszej końcówki do pipety i lekko przechyl końcówkę w otworze w kierunku mikrokanału. Każdy roztwór dostępowy (0,5% BSA lub komórki w roztworze) można zetrzeć jednorazowymi chusteczkami papierowymi i wyrzucić do odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne.
    5. Rzutuj żądaną wirtualną geometrię elektrody (w tym przypadku okręgi, romby, gwiazdy i/lub linie równoległe) na chip LiDEP.
    6. W oprogramowaniu mikroskopu cyfrowego ustaw długość filmu na 3 min. Ustaw minutnik laboratoryjny na 2 min 30 s. Gdy komórki są nieruchome w mikrokanale układu LiDEP, naciśnij Start w oprogramowaniu mikroskopu cyfrowego, aby rozpocząć proces nagrywania wideo.
    7. Odczekaj 10 sekund, a następnie naciśnij przycisk ON na wyjściu kanału generatora funkcyjnego, aby zastosować pole elektryczne prądu przemiennego, a następnie naciśnij Start, aby włączyć timer. Monitoruj zachowanie funkcji DEP komórki za pomocą mikroskopu cyfrowego i zapobiegaj drganiom lub ruchom wokół instalacji.
    8. Gdy timer się wyłączy, naciśnij przycisk ON na wyjściu kanału generatora funkcji. Powoduje to wyłączenie wyjścia kanału generatora funkcyjnego, a pole elektryczne prądu przemiennego nie jest już dostarczane przez elektrody. Zatrzymaj nagrywanie wideo po 3 minutach i zapisz je w mikroskopie cyfrowym do przyszłej analizy.
    9. Odpipetuj komórki z końcówki wylotowej chipa LiDEP, powoli wpychając 60 μl buforu DEP z 0,5% BSA do mikrokanału i jednocześnie zbierając na wylocie. Kontynuuj, aż w mikrokanale będzie mało komórek lub nie będzie ich wcale.
    10. Powtarzać kroki 2.2.3-2.2.9, aż wszystkie częstotliwości zostaną przetestowane.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy napięcia i koloru elektrod zostały zakończone przy użyciu powyższej procedury z niewielkimi zmianami w kroku 2.2.3 i kroku 2.2.10. Do próby napięciowej kolor i częstotliwość elektrody pozostały stałe, a następnie zastosowano 5 Vpp, 10 Vpp i 20 Vpp. W teście koloru elektrody przyłożone napięcie i częstotliwość utrzymywano na stałym poziomie 30 kHz i 20 Vpp, a następnie badano niebieskie, czerwone, białe i żółte (do których odnosiły się kody kolorów HEX odpowiednio #4472C4, #FF0000, #FFFFFF i #FFFF00) projekcyjne elektrody. Żywotność komórek badano poprzez barwienie komórek błękitem trypanowym i liczenie liczby żywych i martwych komórek za pomocą hemocytometru.

Dzięki ustawieniu LiDEP byliśmy w stanie manipulować hMSC i generować krzywe odpowiedzi DEP w odpowiedzi na częstotliwość wejściową, co jest jednym ze sposobów na scharakteryzowanie zachowania elektrycznego komórek. Przeprowadzono szereg eksperymentów w celu znalezienia optymalnych warunków pracy poprzez manipulowanie parametrami, takimi jak przyłożone napięcie i rzutowany kolor elektrody (tj. kształty o wyraźnych kolorach utworzone za pomocą edytora graficznego) w celu zaobserwowania spójnego zachowania ogniwa w stosunku do niejednorodnego pola elektrycznego prądu przemiennego generowanego przez wirtualne elektrody. Dane zebrane dla odpowiedzi komórek przy użyciu LiDEP, nietradycyjnego DEP, porównano z wynikami z analizatora 3DEP, tradycyjnego DEP.

Pierwszy test optymalizacyjny skupiał się na pozytywnej odpowiedzi DEP hMSC (tj. komórek poruszających się w kierunku wirtualnej elektrody) w chipie LiDEP. Ogniwa, które nie wykazywały pozytywnej odpowiedzi DEP, albo wykazywały negatywną odpowiedź DEP, oddalając się od elektrody wirtualnej, były nieruchome i obracały się, albo nie reagowały na pole elektryczne. Odpowiedź komórek określono ilościowo, śledząc ich prędkości (μm/s) w ImageJ w okresie 2 min 30 s. Dla elektrody wirtualnej zastosowano projekcję żółtego owalu, a przyłożone napięcia 5 Vpp, 10 Vpp i 20 Vpp badano przy ustawionej częstotliwości 30 kHz. Skupiliśmy się na ogniwach, które znajdowały się w odległości do 50 μm od elektrody wirtualnej, podczas gdy pole elektryczne prądu przemiennego było włączone, aby zapewnić spójność i zminimalizować wartości odstające. Napięcie 20 Vpp skutkowało najszybszym ruchem komórek HEK 293, ze średnią prędkością 0,035 μm/s, a następnie 0,032 μm/s przy 10 Vpp i 0,020 μm/s przy 5 Vpp, co oznacza, że ogniwa te reprezentują stosunkowo jednorodną kontrolę. Podobny trend zaobserwowano w przypadku hMSC, które miały średnią prędkość 0,051 μm/s przy 20 Vpp, 0,036 μm/s przy 10 Vpp i 0,025 μm/s przy 5 Vpp, jak w Rysunek 2A (tutaj * oznacza p < 0,05). Przy napięciu 20 Vpp zaobserwowano, że hMSC doświadczyły jednocześnie dodatniego i ujemnego DEP. Nie zaobserwowano tego przy napięciu 10 Vpp i 5 Vpp. Wyniki żywotności hMSC po doświadczeniu siły DEP wykazały, że wyższe napięcia na ogół powodowały niższą żywotność ogniw, przy czym 66% ogniw było żywotnych przy napięciu 5 Vpp, 58% ogniw o żywotności 10 Vpp i 57% ogniw o żywotności przy 20 Vpp, jak w Rysunek 2B (tutaj ** oznacza p < 0,01).

Ze względu na to, że LiDEP jest systemem optycznym, intensywność światła i kolor elektrody są parametrami, które można łatwo dostroić, aby kontrolować wydajność układu LiDEP. W tym przypadku oceniano różne kolory elektrod (biały, żółty, czerwony i niebieski) wygenerowane na podstawie rzutowanego kształtu w celu określenia wpływu na odpowiedzi DEP komórek. Komórki HEK 293 i hMSC oceniano przy napięciu 20 Vpp i 30 kHz. Wybrano elektrody w kolorze białym, żółtym, czerwonym i niebieskim, ale na oświetlenie przez chip LiDEP miała wpływ warstwa fotoprzewodząca, która miała czerwono-pomarańczowy kolor. W ten sposób rzutowana biała elektroda wydawała się żółta z białym wnętrzem, czerwona elektroda wydawała się pomarańczowa z czerwonym konturem, a niebieska elektroda wydawała się jasnozielona (Rysunek 3A-D). Moc wyjściowa dla tych czterech kolorów była następująca: 77,7 μW ± 0,7 μW, 92,7 μW ± 1,3 μW, 21,9 μW ± 0,2 μW oraz 56,7 μW ± 0,9 μW odpowiednio dla białego, żółtego, czerwonego i niebieskiego. Sugeruje to, że żółty i biały miały najsilniejsze pole DEP, podczas gdy niebieski i czerwony były słabsze, jak w Rysunek 3E (tutaj *** oznacza p < 0,001 dla komórek HEK 293, a ** oznacza p < 0,01 dla hMSC). Zaobserwowano również stacjonarną rotację ogniw na krawędziach żółto-białych elektrod wirtualnych podczas przykładania siły DEP. Dla wszystkich wariantów koloru elektrod wystąpiły jednocześnie ujemne i dodatnie odpowiedzi DEP, korelujące z tym, co wykazano przy 20 Vpp w teście napięciowym. Dodatkowo, podczas gdy prędkość ogniw różniła się w zależności od koloru elektrody, prawie wszystkie ogniwa w granicach 50 μm zareagowały na LiDEP. Wielkość hMSC zmierzono jako 19,2 μm ± 5,8 μm.

Aby ocenić możliwości LiDEP w porównaniu do DEP z konwencjonalnymi elektrodami, oceniliśmy różnice między zachowaniem DEP komórek korzystających z LiDEP a zachowaniem komórek analizowanych przez analizator 3DEP. Odpowiedź DEP hMSC mierzono w roztworze buforowym DEP o niskiej przewodności z 0,5% BSA (~100 μS/cm). Aby naśladować analizator 3DEP, pojedynczą owalną żółtą elektrodę wirtualną rzutowano na 10 Vna pp. Zachowanie DEP hMSC scharakteryzowano w zakresie od 30 kHz do 20 MHz. Przy częstotliwościach niższych niż 25 kHz zaobserwowaliśmy elektrolizę, która spowodowała powstawanie pęcherzyków na powierzchni warstwy metalu w urządzeniu mikroprzepływowym. W przypadku LiDEP, przy niższych częstotliwościach, hMSC doświadczyły dodatniej siły DEP, jak w Rysunek 4A, reprezentowany jako procent komórek przyciąganych do wirtualnej elektrody. Ogniwa zaczynały z silną dodatnią siłą DEP, która słabła wraz ze wzrostem częstotliwości. Ogniwa doświadczyły najsilniejszej dodatniej siły DEP od 30 kHz do 97 kHz. Po zastosowaniu pola elektrycznego prądu przemiennego o tych częstotliwościach, niektóre komórki przestały reagować, podczas gdy inne komórki wykazywały negatywne zachowanie DEP. Tendencja ta odbiega od zaobserwowanej odpowiedzi określonej ilościowo za pomocą analizatora 3DEP; komórki wzrosły w dodatnim DEP z 37 kHz do 255 kHz i zmniejszyły się w dodatnim DEP z 1,772 kHz do 20 MHz, jak w Rysunek 4B.

figure-results-1
Rysunek 1: Eksperymentalna konfiguracja dla protokołu LiDEP opisanego tutaj dla hMSC. (A) Schematyczny i rzeczywisty obraz układu LiDEP z warstwą fotoprzewodzącą i układem eksperymentalnym. (B) Reprezentatywne obrazy dodatnich i ujemnych odpowiedzi DEP komórek w analizatorze 3DEP (przy użyciu konwencjonalnych elektrod DEP, na górze) oraz schematyczne przedstawienie dodatnich i ujemnych odpowiedzi DEP komórek przy użyciu LiDEP (przy użyciu projekcji świetlnych jako elektrod wirtualnych, na dole). (C) Przykłady odmiennych kształtów które mogą być rzutowane na urządzenie jako wirtualne elektrody. Figura utworzona za pomocą BioRender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Charakterystyka reakcji (prędkości) DEP hMSC i ich żywotności w danych warunkach. (A) Zmierzone prędkości dodatnich odpowiedzi DEP hMSC na 5 Vpp, 10 Vpp i 20 Vpp. hMSC poruszały się z prędkością 0,051 μm/s przy 20 Vpp, 0,036 μm/s przy 10 Vpp i 0,025 μm/s przy 5 Vpp. (B) Żywotność hMSC po doświadczeniu dodatniej siły DEP generowanej przez elektrody wirtualne. Żywotność wynosiła odpowiednio 57%, 58% i 66% dla 20 Vpp, 10 Vpp i 5 Vpp. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe (SD). Analiza statystyczna przeprowadzona na zbiorczych zbiorach danych przy użyciu testów t (*p < 0,05 i **p < 0,01). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Porównanie odpowiedzi DEP między jednorodnymi (HEK 293) i heterogenicznymi (hMSCs) liniami komórkowymi. Dodatnia odpowiedź DEP komórek hMSCs na (A) białe, (B) żółte, (C) czerwone i (D) niebieskie elektrody przy 20 Vpp i 30 kHz. (E) Odpowiedzi szybkościowe komórek HEK 293 i hMSC na elektrody o różnych kolorach. Ogniwa HEK 293 wykazywały największe prędkości z żółtymi i czerwonymi elektrodami odpowiednio 0,035 μm/s i 0,033 μm/s. Ogniwa HEK 293 wykazywały najniższą prędkość z niebieskimi elektrodami na poziomie 0,027 μm/s. Największe prędkości wykazały hMSC z żółtymi i białymi elektrodami, odpowiednio 0,068 μm/s i 0,049 μm/s. Detektory hMSC doświadczyły najniższej prędkości z czerwonymi elektrodami na poziomie 0,039 μm/s. Słupki błędów reprezentują liczbę SD. Analiza statystyczna przeprowadzona na zbiorczych zestawach danych przy użyciu testów t (*p < 0,05, **p < 0,01 i ***p < 0,001). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Porównanie odpowiedzi DEP hMSC przy użyciu LiDEP i 3DEP. Odpowiedzi DEP hMSC mierzone za pomocą (A) LiDEP i (B) analizatora 3DEP przy 10 Vpp. W przypadku LiDEP nastąpił zanik dodatniej odpowiedzi DEP hMSC z 30 kHz do 20 MHz. Z analizatora 3DEP komórki zwiększyły dodatnią DEP z 37 kHz do 255 kHz i zmniejszyły się z dodatniej DEP z 1,772 kHz do 20 MHz. Słupki błędów reprezentują SD. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Reprezentatywne obrazy konfiguracji LiDEP użyte do eksperymentów w tym protokole. Powiększony obraz systemu LiDEP przedstawiający integrację projektora. Światło przemieszcza się ze źródła (projektora) przez soczewkę obiektywu o powiększeniu 10x do mikrokanału układu LiDEP. Obiektyw o powiększeniu 10x znajduje się na górze obiektywu projektora. Każdy element jest ponumerowany na zdjęciach i wymieniony z boku. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowe wideo 1: Reprezentatywne wideo hMSC reagujących na białe, żółte, czerwone i niebieskie wirtualne elektrody. Ogniwa są wizualizowane jako doświadczające dodatniego DEP (poruszającego się w kierunku wirtualnej elektrody), doświadczającego ujemnego DEP (oddalającego się od wirtualnej elektrody), nieruchomego i obracającego się lub niereagującego na pole elektryczne. hMSC zostały przetestowane przy 37 kHz i 20 Vpp, a wideo zostało przyspieszone 20x. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie heterogeniczności hMSC jest ważne dla ich postępu w terapiach. Prace te stanowią pierwszy krok w kierunku wykorzystania LiDEP jako narzędzia analitycznego do oceny komórek zamieszkania i tłuszczu (hMSC). Zbadaliśmy zależność napięcia od dodatniej odpowiedzi DEP komórek w LiDEP poprzez ilościowe określenie prędkości. Oczekuje się, że wyższe napięcia powinny wytwarzać silniejszą dodatnią siłę DEP i zaobserwowaliśmy ten wzorzec przy zmierzonych prędkościach. Napięcia 10 Vpp i 20 Vpp były wystarczające do manipulowania hMSC za pomocą LiDEP. Niższe napięcia (tj. 5 Vpp) skutkowały wolniejszymi reakcjami ogniw; chociaż nie jest to optymalne rozwiązanie dla komórek hMSC, może być korzystne dla innych typów komórek. Nastąpił zależny od napięcia spadek żywotności hMSC o około 9%. Różni się to nieznacznie od poprzedniej literatury 6,12,28,29, w której zastosowanie tradycyjnych DEP i LiDEP w badaniu komórek biologicznych nie zmniejszyło żywotności komórek. Jednak cel eksperymentalny w każdym badaniu był różny. Glasser i Fuhr monitorowali wzrost adherentnych mysich fibroblastów L929 na metalowych elektrodach w pożywce do hodowli komórkowej28. I odwrotnie, Lu i in. zbadali żywotność nerwowych komórek macierzystych wystawionych na działanie pól elektrycznych prądu przemiennego przez różne okresy czasu12. Adams i wsp. scharakteryzowali właściwości dielektryczne hMSC za pomocą elektrod metalowych12, a Li i wsp. manipulowali komórkami białaczkowymi za pomocą LiDEP29. Różnica między tymi badaniami a naszymi polegała na zastosowaniu BSA, co może być przyczyną obserwowanego przez nas spadku żywotności. Jednak niższa ogólna żywotność może być również spowodowana czasem ekspozycji (2 min 30 s) zastosowanym w ustanowionym tutaj protokole. Czas ten został wybrany, aby zapewnić wystarczająco dużo czasu na wizualizację manipulacji komórkami podczas ekspozycji na niejednorodne pole elektryczne prądu przemiennego.

Metody charakteryzacji ogniw zostały przetestowane za pomocą koloru elektrody w celu określenia możliwości i ograniczeń naszego systemu LiDEP zbudowanego zgodnie z opisem w protokole. W tym konkretnym protokole kolor elektrody może być kontrolowany na podstawie koloru kształtu rzutowanego za pomocą pliku edytora graficznego. Użyliśmy czterech kolorów: białego, żółtego, czerwonego i niebieskiego. Na podstawie odczytów mocy wyjściowej dla każdego koloru, zmierzono, że rzutowane elektrody żółte (#FFFF00) i białe (#FFFFFF) mają wyższą intensywność, co było podstawą do tego, dlaczego kolory te były korzystniejsze do wykorzystania w kolejnych eksperymentach. Dodatkowo, ze względu na ustaloną zależność materiałów fotoprzewodzącychod natężenia światła 30,31, wyniki sugerują, że wydajność urządzeń LiDEP zależy od fotoprzewodzącego A:Si i może być dostrojona poprzez wybór projektowanego koloru elektrody. Kombinację pozytywnych i negatywnych odpowiedzi hMSC w ramach programu DEP zaobserwowano również przy użyciu LiDEP, co jest podobne do zjawiska obserwowanego w tradycyjnych metodach DEP. Przy każdym kolorze elektrody hMSC doświadczały ujemnej siły DEP, dodatniej siły DEP i rotacji komórek, co wskazuje, że próbka komórki była niejednorodna przy jednej częstotliwości (Dodatkowe wideo 1). Zgadza się to z ustaleniami Adamsa i wsp.6, że hMSC wykazują zarówno negatywne, jak i pozytywne zachowanie DEP przy jednej częstotliwości. Warunki te (kolor elektrody, kształt elektrody i materiał fotoprzewodzący) mogą dostarczyć dodatkowych parametrów do wykrywania poziomu niejednorodności w próbkach hMSC.

Na koniec wyniki oceny LiDEP porównano z wynikami analizatora 3DEP jako punkt odniesienia zachowania funkcji DEP hMSC. Zaobserwowano różnicę w zakresie częstości dodatniej odpowiedzi DEP hMSC, ale trendy w danych zebranych za pomocą LiDEP i analizatora 3DEP były ogólnie podobne (tj. dodatnia odpowiedź DEP zmniejszała się wraz ze wzrostem częstości). Kiedy pole elektryczne prądu przemiennego zostało dostarczone do chipa LiDEP i zostało na niego rzucone światło, przewodność w obszarze projekcji światła spadła, tworząc niejednorodne pole elektryczne. W związku z tym charakterystyka źródła światła (tj. natężenie i długość fali) wpływa na oczekiwaną odpowiedź komórek w chipie LiDEP, co widać na podstawie wyników testów napięcia i zmienności koloru elektrody. Inne parametry, które można modyfikować, to materiał warstwy fotoprzewodzącej i przewodność roztworu buforowego DEP. W związku z tym warunki używane do oceny zachowania komórek w trybie DEP muszą być oceniane w oparciu o konfigurację systemu LiDEP. I odwrotnie, w przypadku analizatora 3DEP lub innych metod, które wykorzystują elektrody metalowe do przykładania siły DEP, charakterystyka elektrody jest stała i nie można jej natychmiast zmienić, aby dostosować się do tego, co jest potrzebne dla badanych komórek. Ta zmienność pozytywnego zachowania DEP może być korzystna dla przyszłych badań nad charakterystyką różnych typów komórek w próbkach hMSC, analizą pojedynczych komórek lub sortowaniem komórek. Ponadto, w miarę oddalania się ogniw od wirtualnych elektrod, pole elektryczne prądu przemiennego staje się słabsze. Jednak w przypadku analizatora 3DEP lub innych tradycyjnych trybów DEP, które wykorzystują elektrody metalowe, można zastosować większy obszar pola elektrycznego, co pozwala na manipulowanie większą liczbą komórek. W związku z tym mniej komórek w eksperymencie LiDEP doświadczyło wpływu pola elektrycznego prądu przemiennego w mikrokanaliku chipa LiDEP. Dalsze rozbieżności mogą być spowodowane zmianami wydajności urządzenia w czasie (tj. 2 godziny lub 3 godziny), co jest nadal badane. Stały przepływ wody, etanolu i roztworu buforowego DEP może rozbić powierzchnię warstwy mikrokanalików (tj. materiału fotoprzewodzącego) i należy go wziąć pod uwagę. W przypadku przedłużonego użytkowania jednego układu LiDEP należy również wziąć pod uwagę wydajność urządzenia w czasie w celu charakteryzacji komórek. Modyfikacje parametrów eksperymentalnych w czasie rzeczywistym trwały od kilku sekund do minut. Kolor i geometria elektrody zostały natychmiast dostosowane za pomocą ustawień w oprogramowaniu edytora graficznego.

Podsumowując, w artykule przedstawiono możliwości LiDEP w zakresie manipulowania i charakteryzowania linii komórkowej z heterogenicznymi populacjami komórek, takimi jak hMSC. Korzystając z tej konfiguracji i opisanego protokołu, byliśmy w stanie osiągnąć pomyślną charakterystykę hMSC w warunkach 20 Vpp i projekcji wirtualnych żółtych elektrod. Przyszłe badania powinny koncentrować się na dostosowaniu czasu ekspozycji hMSC na pole elektryczne prądu przemiennego wytwarzane przez LiDEP, zwiększeniu natężenia światła wirtualnych elektrod oraz ocenie różnych źródeł hMSC (lub innych populacji komórek macierzystych) w celu opracowania katalogu LiDEP sygnatur elektrycznych heterogenicznych populacji komórek macierzystych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta przez National Science Foundation CAREER award (2048221) za pośrednictwem CBET. Chcielibyśmy podziękować Mo Kebaili z Integrated Nanosystems Research Facility (INRF) UCI. Dodatkowo chcielibyśmy podziękować dr Devinowi Keckowi za pomoc w rozwoju systemu LiDEP.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% Trypsyna-EDTAGibco25300054
10x obiektywAmScope---
Krzem amorficzny (A:Si)Millipore SigmaS5130
Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy (100X)Gibco15240-062
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)FisherBP9706-100
Taśma miedzianaZehheBF4964
Dekstroza (glukoza)FisherD16-1
Mikroskop cyfrowyKeyenceVHX-7000
Taśma dwustronnaInsulectroFLX000484
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)Gibco14190-144
Surowica bydlęca Fetel (FBS)Corning35-011-CV
Generator funkcjiTektronixAFG 31102
Oprogramowanie do edycji graficznejMicrosoft Office Powerpoint---
Szkiełka szklane powlekane tlenkiem indu i cynyMSE DostarczoneGL0333
L-alanylo-L-glutaminaATCCPCS-999-034
LaptopDellInspiron 14, 2-w-1
Mezenchymalna bazowa komórka macierzysta MediumATCCPCS-500-030
Mezenchymalny zestaw do wzrostu komórek macierzystych do MSC pochodzących z pępowiny i sznura tłuszczowegoATCCPCS-500-040
Minimum niezbędne mediaum alfa (MEM a, 1X)GibloA10490-01
Molibden, 99,95%Kurt J. LeskerEJTMOXX352A4Cel rozpylania
Phenol RedSigmaP5530
Miernik mocyThor LabsS130VC/PM400
ProjektorVecupoi---
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 MediaGibco11875-093Ten nośnik zawiera L-glutaminę i czerwień fenolową.
SacharozaFisherBP220-1
Trypan Blue StainGibco15250-0610,40%
Neutralizator trypsynyGibcoR002100
System napylania próżniowegoDentonDV-502M

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mahla, S. R. Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics. International Journal of Cell Biology. 2016, (2016).
  2. Bhansali, A. Efficacy of autologous bone marrow-derived stem cell transplantation in patients with type 2 diabetes mellitus. Stem Cells and Development. 18 (10), 1407-1416 (2009).
  3. Bouchlaka, M. N. Human mesenchymal stem cell-educated macrophages are a distinct high IL-6-producing subset that confer protection in graft-versus-host-disease and radiation injury models. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 23 (6), 897-905 (2017).
  4. Alfaifi, M., Eom, Y. W., Newsome, P. N., Baik, S. K. Mesenchymal stromal cell therapy for liver diseases. Journal of Hepatology. 68 (6), 1272-1285 (2018).
  5. Oswald, J. Mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro. Stem Cells. 22 (3), 377-384 (2004).
  6. Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: superiority of synovium as a cell source. Arthritis and rheumatism. 52 (8), 2521-2529 (2005).
  7. Poirier, J. T. Chapter 5 - Genetic profiling of tumors in PDX models. In Patient Derived Tumor Xenograft Models: Promise, Potential and Practice. Uthamanthil, R., Tinkey, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 149-159 (2017).
  8. Sino Biological. Fluorescence-activated cell sorting (FACS). , Available from: https://www.sinobiological.com/category/fcm-facs-facs (2023).
  9. González-González, M., Vázquez-Villegas, P., García-Salinas, C., Rito-Palomares, M. Current strategies and challenges for the purification of Stem Cells. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 87 (1), 2-10 (2011).
  10. Flanagan, A. L. Unique dielectric properties distinguish stem cells and their differentiated progeny. Stem Cells. 23 (3), 656-665 (2007).
  11. Vykoukal, J., Vykoukal, D. M., Freyberg, S., Alt, E. U., Gascoyne, P. R. C. Enrichment of putative stem cells from adipose tissue using dielectrophoretic field-flow fractionation. Lab on a Chip. 8 (8), 1386-1393 (2008).
  12. Adams, T. N. G., Turner, P. A., Janorkar, A. V., Zhao, F., Minerick, A. R. Characterizing the dielectric properties of human mesenchymal stem cells and the effects of charged elastin-like polypeptide copolymer treatment. Biomicrofluidics. 8 (5), (2014).
  13. Wu, H. W., Lin, C. C., Lee, G. B. Stem cells in microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (1), (2011).
  14. Adams, T. N. G. Label-free enrichment of fate-biased human neural stem and progenitor cells. Biosensors and Bioelectronics. 152, 111982(2020).
  15. Zhao, K., Larasati,, Duncker, B. P., Li, D. Continuous cell characterization and separation by microfluidic alternating current dielectrophoresis. Analytical Chemistry. 91 (9), 6304-6314 (2019).
  16. Song, H. Continuous-flow sorting o stem cells and differentiation products based on dielectrophoresis. Lab on a Chip. 15, 1320-1328 (2015).
  17. Khoshmanesh, K., Nahavandi, S., Baratchi, S., Mitchell, A., Kalantar-Zadeh, K. Dielectrophoretic platforms for bio-microfluidic systems. Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 1800-1814 (2010).
  18. Hoettges, K. F. Ten-second electrophysiology: Evaluation of the 3DEP platform for high-speed, high-accuracy cell analysis. Scientific Reports. 9, 19153(2019).
  19. Hubner, Y., Hoettges, K. F., Kass, G. E. N., Ogin, S. L., Hughes, M. P. Parallel measurements of drug actions on Erythrocytes by dielectrophoresis, using a three-dimensional electrode design. IEE Proceedings - Nanobiotechnology. 152 (4), 150-154 (2005).
  20. Hoettges, K. F. Dielectrophoresis-activated multiwell plate for label-free high-throughput drug assessment. Analytical Chemistry. 80 (9), 2063-2068 (2008).
  21. Mulhall, H. J. Cancer, pre-cancer and normal oral cells distinguished by dielectrophoresis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (8), 2455-2463 (2011).
  22. Liao, C. -J. An optically induced dielectrophoresis (ODEP)-based microfluidic system for the isolation of high-purity CD45neg/EPCAMNEG cells from the blood samples of cancer patients-Demonstration and initial exploration of the clinical significance of these cells. Micromachines. 9 (11), 563(2018).
  23. McGrath, J. S. Electrophysiology-based stratification of pancreatic tumorigenicity by label-free single-cell impedance cytometry. Analytica Chimica Acta. 1101, 90-98 (2019).
  24. Chiu, T. K. Optically-induced-dielectrophoresis (ODEP)-based cell manipulation in a microfluidic system for high-purity isolation of integral circulating tumor cell (CTC) clusters based on their size characteristics. Sensors and Actuators, B: Chemical. 258, 1161-1173 (2018).
  25. Medjdoub, M., Courant, J. L., Maher, H., Post, G. Inductively coupled plasma - plasma enhanced chemical vapor deposition silicon nitride for passivation of InP based high electron mobility transistors (HEMTs). Material Science and Engineering: B. 80 (1-3), 252-256 (2001).
  26. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells; Normal, human. , ATCC. Available from: https://www.atcc.org/products/pcs-500-010 (2023).
  27. 293 [HEK-293]. , ATCC. Available from: https://www.atcc.org/products/crl-1573 (2023).
  28. Glasser, H., Fuhr, G. Cultivation of cells under strong ac-electric field-differentiation between heating and trans-membrane potential effects. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 47 (2), 301-310 (1998).
  29. Li, B. Implementation of flexible virtual microchannels based on optically induced dielectrophoresis. Nanotechnology. 33, 295102(2022).
  30. Schellenberg, J. J., Kao, K. C. On the relationship between photoconductivity and light intensity in solids. Journal of Physics D: Applied Physics. 21, 1764-1768 (1988).
  31. Aoyagi, Y., Masuda, K., Namba, S. Explaination of light-intensity dependence of photoconductivity in zinc phthalocyanine. Journal of Applied Physics. 43, 249-251 (1972).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Metoda dielektroforezyurz dzenie mikrofluidyczneelektrody wirtualneelektryczne zachowanie kom rekpojemno b ony kom rkowejpomiar ywotno ci kom rekelektrorotacjacharakteryzacja kom rek w czasie rzeczywistym

Powiązane artykuły