Artykuł metodologiczny

Hodowla organoidów 3D jelit prosiąt z kriokonserwowanych krypt nabłonkowych i tworzenie monowarstw komórkowych

5.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64917

⸱

10 lutego 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1GenPhySE, Université de Toulouse, INRAE, ENVT, 2Lallemand Animal Nutrition, 3Institut NuMeCan, INRAE, INSERM, Université de Rennes, 4FG 16: Mycotic and Parasitic Agents and Mycobacteria, Robert Koch-Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół hodowli organoidów 3D jelit świń z kriokonserwowanych krypt nabłonkowych. Opisujemy również metodę tworzenia monowarstw komórkowych pochodzących z organoidów 3D, umożliwiających dostęp do wierzchołkowej strony komórek nabłonkowych.

Streszczenie

Organoidy jelitowe są coraz częściej wykorzystywane do badania nabłonka jelitowego do modelowania chorób trawiennych, lub do badania interakcji z lekami, składnikami odżywczymi, metabolitami, patogenami i mikrobiotą. Metody hodowli organoidów jelitowych są obecnie dostępne dla wielu gatunków, w tym dla świń, które są gatunkiem o dużym znaczeniu zarówno jako zwierzę hodowlane, jak i jako model translacyjny dla ludzi, na przykład do badania chorób odzwierzęcych. W tym miejscu podajemy szczegółowy opis procedury stosowanej do hodowli organoidów 3D jelit świni z zamrożonych krypt nabłonkowych. Protokół opisuje, w jaki sposób kriokonserwować krypty nabłonkowe z jelita świni i późniejsze procedury hodowli organoidów jelitowych 3D. Głównymi zaletami tej metody są (i) czasowa dysocjacja izolacji krypt od hodowli organoidów 3D, (ii) przygotowanie dużych zapasów kriokonserwowanych krypt pochodzących z wielu segmentów jelita i od kilku zwierząt jednocześnie, a co za tym idzie (iii) zmniejszenie potrzeby pobierania próbek świeżych tkanek od żywych zwierząt. Szczegółowo opisujemy również protokół tworzenia monowarstw komórkowych pochodzących z organoidów 3D, aby umożliwić dostęp do wierzchołkowej strony komórek nabłonka, która jest miejscem interakcji ze składnikami odżywczymi, drobnoustrojami lub lekami. Ogólnie rzecz biorąc, opisane tutaj protokoły są przydatnym źródłem do badania nabłonka jelitowego świni w badaniach weterynaryjnych i biomedycznych.

Wprowadzenie

Nabłonek jelitowy jest tworzony przez monowarstwę komórek pokrywających błonę śluzową przewodu pokarmowego na styku ze środowiskiem świetlnym. Ta pozycja jest związana z różnymi funkcjami, takimi jak wchłanianie składników odżywczych i funkcja barierowa, które są wspierane przez obecność komórek macierzystych i wielu zróżnicowanych typów komórek nabłonkowych (absorpcyjnych, enteroendokrynnych, Panetha i komórek kubkowych)1. Unieśmiertelnione linie komórkowe tradycyjnie używane do badania komórek nabłonkowych mają poważne ograniczenia, ponieważ nie odzwierciedlają złożoności komórkowej nabłonka jelitowego i prezentują nieprawidłowości genomowe2. Opracowanie trójwymiarowych (3D) organoidów przez Sato i wsp.3 dostarczyło nowego modelu do badania nabłonka jelitowego o zwiększonym znaczeniu fizjologicznym. Rzeczywiście, organoidy jelitowe pochodzą z nieprzekształconych komórek macierzystych, składają się z wielu typów komórek i podsumowują funkcjonalność nabłonka jelitowego. Organoidy jelitowe są coraz częściej wykorzystywane do zrozumienia rozwoju i funkcji nabłonka jelitowego oraz jego interakcji z patogenami, składnikami odżywczymi, toksynami, lekami, mikrobiotą i jej metabolitami2.

Początkowo opracowane dla ludzi i myszy, metody stosowane do hodowli organoidów jelitowych zostały ostatnio dostosowane do innych gatunków, w tym świń4. Gonzales et al.5 byli pierwszymi, którzy wyhodowali organoidy świń z jelita czczego; Od tego czasu organoidy świń zostały opisane dla innych segmentów jelit (dwunastnicy, jelita krętego i okrężnicy)6,7,8 i wykazano, że zachowują fenotyp specyficzny dla lokalizacji9,10,11. Organoidy 3D jelit świń są obecnie powszechnie używane do badania wpływu składników odżywczych12,13 lub infekcje jelitowe6,8,14.

Większość badań opisywała hodowlę organoidów jelitowych, zaczynając od świeżo wyizolowanych krypt nabłonkowych. Nie zawsze jest to jednak wykonalne ze względów logistycznych, zwłaszcza w przypadku pracy z dużymi zwierzętami, takimi jak świnie. Rzeczywiście, pomieszczenia dla zwierząt dla świń mogą znajdować się daleko od laboratorium, w którym hodowane są organoidy, co komplikuje organizację pracy. Co więcej, hodowla organoidów jest czasochłonna; W związku z tym nie jest praktyczne jednoczesne hodowanie wielu linii organoidów, na przykład z różnych segmentów jelit lub kilku zwierząt. Aby obejść te problemy, kilka badań na ludziach, koniach i świniach opisało metody hodowli organoidów z zamrożonych tkanek jelitowych (lub biopsji) lub z izolowanych krypt nabłonkowych4,15,16,17. Metody te pozwalają na krioprezerwację komórek macierzystych nabłonka jelitowego z wielu segmentów jelita jednego zwierzęcia, które w razie potrzeby można następnie wykorzystać do hodowli organoidów. Co więcej, pozwala to na znaczne zmniejszenie liczby żywych zwierząt wykorzystywanych jako dawcy komórek macierzystych, ponieważ można stworzyć duże zapasy kriokonserwowanych krypt (zasady 3R). Kolejną zaletą tej metody jest wzrost organoidów jelitowych tylko od interesujących zwierząt po uzyskaniu wyników fenotypowych lub genotypowych, co jest wysoce opłacalne.

In vivo, komórki nabłonka jelitowego są spolaryzowane, z wierzchołkową stroną skierowaną w stronę światła. In vitro, w organoidach 3D, wierzchołkowa strona komórek nabłonka jest również skierowana w stronę światła (tj. wewnątrz organoidów)4. Organizacja ta uniemożliwia dostęp do strony wierzchołkowej, co stanowi problem podczas badania wpływu składników luminalnych (np. składników odżywczych, drobnoustrojów, metabolitów) na komórki nabłonkowe. Aby obejść tę wadę, opracowano kilka metod, takich jak hodowla komórek organoidowych jako monowarstw 2D, mikroiniekcja i odwrócenie polaryzacji ("organoidy wierzchołkowe")18,19. Hodowla monowarstw komórek organoidowych staje się najbardziej wydajnym i elastycznym systemem. Zasada polega na dysocjacji organoidów 3D na pojedyncze komórki i wysiewaniu ich na naczyniu do hodowli komórkowej uprzednio pokrytym cienką warstwą macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)20. W tych warunkach hodowli wierzchołkowa strona komórek nabłonka jest skierowana do góry, a zatem jest dostępna dla eksperymentalnych metod leczenia20. Hodowla monowarstw komórek organoidowych została niedawno zaadaptowana dla jelita świni21,22; monowarstwy komórkowe pochodzące z organoidów 3D świń były wykorzystywane do wielu zastosowań, w tym do badania zakażeń jelitowych6,23,24,25, transport składników odżywczych9, oraz modelowanie chorób trawiennych26.

Tutaj to badanie najpierw przedstawia szczegółowy protokół hodowli i utrzymania organoidów 3D jelit świń pochodzących z kriokonserwowanych krypt nabłonkowych (Rysunek 1). Następnie opisano protokół ustalania monowarstw komórek z organoidów 3D jelita świni. Opisane tutaj metody dostarczają narzędzi eksperymentalnych, które można wykorzystać do badania nabłonka jelitowego świni pod kątem transportu składników odżywczych, funkcji bariery i interakcji gospodarz-mikroorganizm.

Protokół

Ten protokół został zatwierdzony przez lokalną komisję etyki (N°TOXCOM/0136/PP) zgodnie z europejską dyrektywą w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych (2010/63/UE). Protokół ten jest opisany dla jelita czczego jako przykładu, ale można go stosować dla każdego odcinka jelita cienkiego i grubego (dwunastnica, jelito czcze, jelito kręte, okrężnica).

1. Izolacja krypt nabłonkowych z jelita prosiąt

UWAGA: Przygotuj zapas kompletnej modyfikowanej pożywki dla orła (DMEMc) firmy Dulbecco z dodatkiem DMEM uzupełnionego o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny (P/S). Przygotować 50 ml porcji i przechowywać je w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.

  1. Przygotowanie roztworów (do wykonania w dniu izolacji krypty)
    1. Przygotować roztwór dysocjacyjny zawierający sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), 3 mM ditiotreitol (DTT), 9 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 10 μM inhibitor ROCK Y27632 i 1% penicyliny-streptomycyny (P/S) i przechowywać na lodzie.
    2. Przygotować roztwór zamrażający zawierający DMEMc, 10% FBS, 10% dimetylosulfotlenku (DMSO) i 10 μM inhibitora Y27632 ROCK i przechowywać na lodzie (końcowe stężenie FBS wynosi 18%).
    3. Przygotować roztwór transportowy zawierający zimny PBS uzupełniony 1% P/S i przechowywać go na lodzie.
  2. Izolacja krypt nabłonkowych
    1. Ubój prosięcia przez elektronnarkozę, a następnie wykrwawienie.
    2. Natychmiast po uboju należy otworzyć brzuch prosiącia skalpelem i usunąć całe jelito.
    3. Zebrać około 2 cm odcinka jelita i przechowywać go w zimnym roztworze transportowym. Trzymaj segment na lodzie do momentu izolacji krypty (do 2 godzin).
    4. Umieść tkankę na szalce Petriego. Otwórz odcinek jelita wzdłużnie i ostrożnie umyj tkankę w zimnym PBS uzupełnionym 1% P/S w celu usunięcia treści jelitowej.
    5. Przenieś tkankę na nową szalkę Petriego wypełnioną 10 ml zimnego PBS uzupełnionego 1% P/S.
    6. Przytrzymaj tkankę pęsetą i usuń kosmki oraz pozostały śluz, zeskrobując szkiełkiem mikroskopowym.
      UWAGA: Usunięcie kosmków (struktury w kształcie języka) można sprawdzić poprzez obserwację mikroskopową supernatantu.
    7. Przenieść tkankę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml lodowatego roztworu dysocjacyjnego i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) na obracającej się wytrząsarce (15 obr./min).
    8. Przenieś tkankę na nową szalkę Petriego i dodaj 10 ml zimnego PBS uzupełnionego 1% P/S.
    9. Odizoluj krypty mechanicznie, mocno zeskrobując błonę śluzową szkiełkiem mikroskopowym.
      UWAGA: Pod mikroskopem sprawdź obecność krypt nabłonkowych w PBS (Rysunek 2A) .
    10. Odessać roztwór krypty pipetą serologiczną i przefiltrować przez sitko do komórek o wielkości 100 μm w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
    11. Odmierzyć pipetę 10 μl roztworu i sprawdzić obecność krypt pod mikroskopem. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    12. Pod sterylną szafką bezpieczeństwa biologicznego wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad z krypt w 10 ml zimnego DMEMc uzupełnionego inhibitorem 10 μM Y27632 ROCK.
    13. Odmierzyć pipetą 10 μl roztworu krypty do płytki 48-dołkowej. Ręcznie policz liczbę krypt pod mikroskopem z 10-krotnym powiększeniem i oblicz stężenie krypt na ml roztworu.
      UWAGA: Wyizolowane krypty mogą być używane bezpośrednio do hodowli organoidów jelitowych. Jednak często wygodniej jest kriokonserwować dużą partię krypt z każdego prosięcia i używać ich później do hodowli organoidów.
  3. Zamrożenie krypt nabłonkowych
    1. Przenieś objętość odpowiadającą 900 kryptom w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad z krypt w 1 ml roztworu zamrażającego. Przenieść do krioprobówki i umieścić fiolkę w pojemniku do zamrażania komórek.
    3. Przechowywać pojemnik do zamrażania komórek w temperaturze -80 °C przez 24 godziny, a następnie przenieść fiolki do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.

2. Tworzenie organoidów 3D jelit prosiąt z zamrożonych krypt nabłonkowych

UWAGA: Organoidy 3D z jelit prosiąt są hodowane w komercyjnej pożywce hodowlanej opracowanej do wzrostu ludzkich organoidów, uzupełnionej 1% P/S i 100 μg/ml środka przeciwbakteryjnego dla komórek pierwotnych i przechowywanej w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia. Macierz zewnątrzkomórkowa pochodząca z guza (ECM) jest używana do hodowli organoidów 3D. Wszystkie referencje produktów komercyjnych znajdują się w Tabeli Materiałów.

  1. Przygotowanie materiałów
    1. Umieścić końcówki pipet w temperaturze -20 °C (co najmniej przez noc).
    2. Zamrożone podwielokrotności ECM (500 μl) umieścić w temperaturze 4 °C co najmniej 1 godzinę wcześniej.
    3. Podgrzej 48-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    4. Umieścić pożywkę hodowlaną w temperaturze pokojowej.
    5. Podgrzej łaźnię wodną w temperaturze 37 °C.
    6. Umieść małe wiaderko na lód pod okapem w aseptycznych warunkach.
  2. Rozmrażanie zamarzniętych krypt nabłonkowych
    1. Fiolkę zawierającą 900 zamrożonych krypt należy szybko rozmrozić w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C (mniej niż 5 min).
    2. Przenieść roztwór krypty do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    3. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant
    4. Dodać 150 μL ECM ze schłodzonymi końcówkami, aby uzyskać końcowe stężenie 150 krypt na 25 μL ECM. Pibułuj w górę i w dół 10 razy, aby uzyskać jednorodne zawieszenie krypt w ECM.
      UWAGA: Zawsze trzymaj ECM na lodzie, aby uniknąć polimeryzacji. Do manipulowania ECM należy zawsze używać wstępnie schłodzonych końcówek pipet w temperaturze -20 °C. Pipetować powoli, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza w module ECM. Na tym etapie stosuje się nierozcieńczony ECM, aby zapobiec zapadaniu się małych kropli.
    5. Wysiewaj sześć dołków z kroplą 25 μl na studzienkę ze schłodzonymi końcówkami we wstępnie podgrzanej 48-dołkowej płytce.
      UWAGA: Trzymaj końcówkę pionowo, na środku studzienki i pipetuj powoli, nie wprowadzając powietrza, aby uzyskać kopułę. W tym przypadku stosuje się płytki 48-dołkowe, ponieważ liczba organoidów jest zwykle niska, gdy zaczynasz od zamrożonych krypt.
    6. Inkubować przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 w celu polimeryzacji ECM.
    7. Dodać 250 μl na studzienkę pożywki hodowlanej w temperaturze pokojowej. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i zmieniać pożywkę co 2-3 dni
      UWAGA: Krypty zwykle nie są widoczne po procedurze rozmrażania, a większość komórek jest zdysocjowana w ECM (Rysunek 2B).

3. Pasaż organoidów 3D jelit prosiąt pochodzących z zamrożonych krypt

UWAGA: Czas na uzyskanie organoidów z zamrożonych krypt jest zazwyczaj dłuższy niż w przypadku startu z nowych krypt. Organoidy są zwykle gotowe do rozszczepienia 10 dni po rozmrożeniu (Ryc. 2B).

  1. Przygotowanie materiałów
    1. Umieścić zamrożone podwielokrotności ECM (500 μl) w temperaturze 4 °C na co najmniej 1 godzinę.
    2. Podgrzej 24-dołkowe płytki w temperaturze 37 °C.
    3. Podgrzać PBS i odczynnik do dysocjacji enzymów uzupełniony 10 μM inhibitorem ROCK Y27632 w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
    4. Umieścić pożywkę hodowlaną w temperaturze pokojowej.
    5. Umieść małe wiaderko na lód pod okapem w aseptycznych warunkach.
  2. Przejście organoidów 3D pochodzących z zamrożonych krypt
    1. Usunąć pożywkę hodowlaną i przemyć 250 μl wstępnie podgrzanego PBS w temperaturze 37 °C.
    2. Dodać 250 μl wstępnie podgrzanego odczynnika do dysocjacji enzymów uzupełnionego 10 μM inhibitorem ROCK Y27632 w temperaturze 37 °C do każdego dołka.
      UWAGA: Ze względu na małą liczbę organoidów, dysocjacja organoidów odbywa się bezpośrednio w każdym dołku.
    3. Odłączyć organoidy w ECM przez zeskrobanie pipetą P1000 i ostrożnie homogenizować, pipetując pięć razy.
    4. Inkubować przez 5 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Oddziel komórki, pipetując 10 razy w górę i w dół za pomocą pipety P1000.
      UWAGA: Celem jest uzyskanie izolowanych komórek lub małych klastrów komórek (<10 komórek). Sprawdź dysocjację pod mikroskopem. Jeżeli nadal obserwuje się duże fragmenty organoidów, należy powtórzyć krok 3.2.4.
    5. Dodaj 500 μl DMEMc do każdej studzienki zawierającej zdysocjowane komórki i zbierz do 12 dołków w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml zimnego DMEMc.
    6. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml zimnego DMEMc.
    7. Policz komórki w rozcieńczeniu 1:2 w błękitu trypanowym za pomocą licznika komórek.
      UWAGA: Automatyczny licznik komórek może zliczać komórki w małych klastrach, jeśli są obecne.
    8. Odwirować niezbędną objętość roztworu komórkowego, aby uzyskać 3 000 żywych komórek na kopułę (jedna kopuła na studzienkę 24-dołkowej płytki) przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    9. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 17 μl zimnego DMEMc na 3,000 żywych komórek na lodzie. Dostosuj głośność do wymaganej liczby dołków.
    10. Powoli dodawaj 33 μl zimnego ECM ze schłodzonymi końcówkami na 3 000 żywych komórek i homogenizuj na lodzie bez tworzenia pęcherzyków. Dostosuj głośność do wymaganej liczby dołków.
      UWAGA: Komórki są ponownie zawieszane w roztworze zawierającym 1/3 DMEMc i 2/3 ECM. Na każdą kopułę potrzeba 50 μl tego roztworu. Rozcieńczony ECM jest tańszy i łatwiejszy do pipetowania.
    11. Zasiej studzienki 50 μl zawiesiny komórek ECM na studzienkę ze schłodzonymi końcówkami we wstępnie podgrzanej płytce 24-dołkowej.
    12. Inkubować przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 w celu polimeryzacji ECM.
    13. Dodać 500 μl pożywki do dołka. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i zmieniać pożywkę co 2-3 dni
      UWAGA: Organoidy mogą być używane bezpośrednio do i) eksperymentów, ii) utrzymania hodowli organoidów 3D, iii) zamrażania lub iv) wysiewania monowarstw komórek organoidów (Rysunek 1). Codziennie sprawdzaj wzrost organoidów pod mikroskopem, aby wybrać optymalny czas na podział organoidów. Organoidy muszą mieć wyraźne i puste światło oraz dobrze zaznaczone krawędzie. Dojrzałe organoidy z czarnymi szczątkami w świetle nie powinny być używane do rozszczepienia (Rysunek 3).

4. Utrzymanie hodowli organoidów w 3D

UWAGA: W przypadku pasażu, organoidy powinny być czyste z pustym światłem. Czarne zanieczyszczenia pojawiają się w świetle około 5 dni po rozszczepieniu i wskazują na obecność martwych komórek. Ograniczenie liczby martwych komórek w czasie pasażowania jest preferowane dla optymalnego utrzymania hodowli. W związku z tym harmonogram powinien zostać dostosowany, aby uniknąć osiągnięcia tego etapu dojrzałości.

  1. Przygotowanie materiału
    1. Umieścić podwielokrotności ECM (500 μl) w temperaturze 4 °C w celu rozmrożenia przez co najmniej 1 godzinę.
    2. Podgrzej 24-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C.
    3. Odczynnik do dysocjacji enzymów uzupełniony 10 μM inhibitorem ROCK Y27632 należy wstępnie rozgrzać w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
    4. Umieścić pożywkę hodowlaną w temperaturze pokojowej.
    5. Umieść małe wiaderko na lód pod okapem w aseptycznych warunkach.
  2. Pasaż organoidów jelitowych 3D
    1. Odłączyć organoidy za pomocą ECM, zeskrobując je pipetą P1000. Ostrożnie homogenizować przez pipetowanie pożywki hodowlanej i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml zimnego DMEMc na lodzie.
      UWAGA: Jedna stożkowa probówka o pojemności 15 ml jest wymagana do basenu z 12 dołkami organoidów hodowanych w kopułach o pojemności 50 μl na płytkach 24-dołkowych.
    2. Odwirować zebrane organoidy w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Organoidy tworzą białą osadkę na dnie probówki. Jeżeli po odwirowaniu organoidy nadal znajdują się w zawiesinie w ECM, ostrożnie zassać górny supernatant (nie dotykając warstwy ECM), homogenizować przez pipetowanie 10 razy pipetą P1000 i powtórzyć etap wirowania. Po tej procedurze warstwa ECM nie powinna być widoczna.
    3. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml wstępnie podgrzanego odczynnika do dysocjacji enzymów uzupełnionego inhibitorem 10 μM Y27632 ROCK. Pipetować w górę i w dół 10 razy, aby zainicjować dysocjację organoidów.
    4. Inkubować przez 5 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C w celu mineralizacji enzymatycznej.
    5. Mechanicznie rozerwać organoidy, pipetując 10 razy pipetą P1000. Sprawdź zawiesinę komórek pod mikroskopem.
      UWAGA: Celem jest uzyskanie izolowanych komórek lub małych klastrów komórek. Jeżeli nadal obserwuje się duże fragmenty organoidów, należy powtórzyć inkubację (etap 4.2.4) i mechaniczne rozerwanie (etap 4.2.5).
    6. Dodaj 4 ml lodowatego DMEMc. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C
    7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek organoidowych w 1 ml DMEMc.
    8. Postępować zgodnie z powyższym opisem (kroki 3.2.7 do 3.2.13) w celu policzenia komórek i wysiewu komórek organoidowych w 50 μl kopuł ECM zawierających 3000 żywych komórek na wstępnie ogrzanych płytkach 24-dołkowych.

5. Zamrażanie organoidów 3D

  1. Przygotować niezbędną objętość (1 ml na basen składający się z dwóch kopuł) roztworu zamrażającego zawierającego DMEMc uzupełnionego 10% FBS, 10% DMSO i 10 μM inhibitorem Y27632 ROCK i przechowywać na lodzie (końcowe stężenie FBS wynosi 18%).
  2. Usuń pożywkę hodowlaną z dołków, które mają zostać zamrożone.
  3. Dodać 1 ml roztworu zamrażającego do pierwszego dołka, który ma zostać zamrożony, odłączyć ECM przez skrobanie i homogenizować za pomocą końcówki pipety.
  4. Przenieść zawiesinę organoidu z pierwszego dołka do drugiego dołka, który ma zostać zamrożony.
  5. Przenieś kałużę z dwóch studzienek do krioprobówki i umieść fiolkę w pojemniku do zamrażania komórek.
  6. Przechowywać pojemnik do zamrażania komórek w temperaturze -80 °C przez 24 godziny, a następnie przenieść fiolki do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.

6. Hodowla monowarstw komórkowych pochodzących z organoidów 3D

UWAGA: Monowarstwy komórek organoidowych świni są hodowane na pożywce 2D złożonej z pożywki używanej do organoidów 3D uzupełnionej 20% FBS.

  1. Przygotowanie materiałów
    1. Przygotuj podłoże 2D i utrzymuj je w temperaturze RT.
    2. Odczynnik do dysocjacji enzymów uzupełniony 10 μM inhibitorem ROCK Y27632 należy wstępnie rozgrzać w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
  2. Powłoka wkładki hodowlanej
    1. Wysterylizuj pęsetę i przenieś ją do szafki bezpieczeństwa biologicznego.
    2. Umieść wkładki do hodowli komórkowych (0,33 cm2) na 24-dołkowej płytce za pomocą pęsety.
    3. Przygotować roztwór powlekający zawierający kolagen dożylnie rozcieńczony w stężeniu 50 μg/ml w zimnym PBS. Pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać
    4. Dodać 150 μl rozcieńczonego roztworu kolagenu dożylnego do każdej wkładki do hodowli komórkowej, co odpowiada 22,7 μg/cm2,
      UWAGA: Ostrożnie ustawić pipetę pionowo w środku przepuszczalnej membrany i sprawdzić, czy roztwór kolagenu pokrywa całą membranę.
    5. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i pozostawić na noc (lub na minimum 3 godziny).
  3. Wysiewanie komórek organoidowych 3D do wkładek do hodowli komórkowych
    1. Przygotować zawiesinę komórkową z organoidów 3D, jak opisano w krokach 4.2.1–4.2.7.
    2. Policz komórki w rozcieńczeniu 1:2 w błękit trypanowy za pomocą licznika komórek i oblicz objętość niezbędną do wysiewu 2,5 x 105 komórek na wkładkę hodowlaną, co odpowiada 7,6 x 105 komórek/cm2.
    3. Odwirować niezbędną objętość zawiesiny komórek przy stężeniu 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Podczas wirowania ostrożnie odessać roztwór powlekający z wkładek hodowlanych i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej pod kapturem bez pokrywki na 5 minut.
    5. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w niezbędnej objętości pożywki 2D uzupełnionej inhibitorem 10 μM Y27632 ROCK. Do każdej wkładki potrzebna jest objętość 200 μl pożywki 2D zawierającej komórki.
    6. Wysiewaj 200 μL zawiesiny komórkowej (2,5 x 105 komórek) na powlekaną przepuszczalną membranę (strona wierzchołkowa) (Rysunek 4A).
      UWAGA: Powoli pipetować w środek membrany i trzymać końcówkę pionowo.
    7. Dodać 500 μl pożywki 2D uzupełnionej inhibitorem 10 μM Y27632 ROCK do dolnej komory (strona podstawowa). Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    8. Jednego dnia po wysiewie należy zastąpić pożywkę wierzchołkową i podstawową świeżą pożywką 2D bez inhibitora Y27632 ROCK.
    9. Zmieniaj nośnik 2D każdego dnia. Monowarstwa zlewa się 1 dzień po wysianiu, a następnie może być używana do eksperymentów.
      UWAGA: Wartość transepitelialnego oporu elektrycznego (TEER) powyżej ślepej próby (wkładka bez komórek) potwierdza, że osiągnięto konfluencję (Rysunek 4B).

7. Barwienie immunologiczne monowarstw komórek organoidowych

  1. Przygotowanie roztworów
    UWAGA: Dostosuj objętość roztworów w zależności od liczby dołków do zabarwienia; Na jeden studzienkę potrzeba 200 μl roztworu na każdym etapie. Odniesienia do wszystkich produktów komercyjnych znajdują się w Tabeli materiałów.
    1. Przygotuj 4% roztwór paraformaldehydu (PFA) pod kapturem chemicznym, dodając 5 ml 32% PFA do 35 ml PBS. Przygotować 10 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Zawsze manipuluj PFA pod maską chemiczną, nosząc rękawice nitrylowe.
    2. Przygotować roztwór 0,2% Triton X100-PBS, dodając 2 μl Triton X100 do 1 ml PBS bezpośrednio przed użyciem. Trzymaj się RT.
    3. Przygotować 10% roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA)-PBS, dodając 100 mg BSA do 1 ml PBS. Trzymaj się RT.
    4. Przygotować 1% roztwór BSA-PBS, dodając 10 mg BSA do 1 ml PBS. Trzymaj się RT.
    5. Przygotować roztwór pierwszorzędowego przeciwciała okludyny rozcieńczony w stosunku 1:200, dodając 5 μl przeciwciała pierwszorzędowego do 995 μl 1% PBS BSA. Utrzymuj roztwór na lodzie.
    6. Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w stosunku 1:1 000, dodając 1 μl przeciwciała drugorzędowego do 999 μl 1% BSA-PBS. Roztwór należy przechowywać na lodzie, chronić przed światłem.
    7. Przygotować roztwór falloidyny TRITC w stężeniu 10 μg/ml, dodając 10 μl TRITC w stężeniu 1 mg/ml do 990 μl PBS. Przechowywać na lodzie, chronić przed światłem.
  2. Barwienie immunologiczne
    UWAGA: O ile nie wskazano inaczej, wszystkie inkubacje wykonuje się w temperaturze pokojowej, przy powolnym mieszaniu na platformie kołyszącej (30 obr./min). Barwienie immunologiczne przeprowadza się bezpośrednio we wkładce do hodowli komórkowej.
    1. Usuń podłoże podstawowe i wierzchołkowe. Umieść płytkę pod maską chemiczną.
    2. Przemyć monowarstwy dwukrotnie 200 μl PBS w temperaturze pokojowej i inkubować przez 5 minut.
    3. Utrwalić monowarstwy komórek za pomocą 200 μl 4% PFA w temperaturze pokojowej i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Przemyć monowarstwy dwukrotnie 200 μl PBS w temperaturze pokojowej i inkubować przez 5 min.
      UWAGA: Po etapie utrwalania i mycia, monowarstwę można przechowywać w temperaturze 4 °C w PBS przez 1 tydzień.
    5. Usunąć PBS, przepuścić 200 μl 0,2% Triton X100-PBS i inkubować przez 20 minut.
    6. Przemyć monowarstwy dwukrotnie 200 μl PBS w temperaturze pokojowej i inkubować przez 5 minut.
    7. Dodać 200 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego w 1% BSA-PBS i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, przy powolnym mieszaniu na platformie kołyszącej. Uwzględnij studzienkę kontroli ujemnej, dodając tylko 1% BSA-PBS bez przeciwciała pierwszorzędowego.
    8. Przemyć monowarstwy trzykrotnie 200 μl PBS w temperaturze pokojowej i inkubować przez 5 minut.
    9. Dodać 200 μl przeciwciała drugorzędowego w 1% BSA-PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, chroniąc przed światłem.
    10. Przemyć monowarstwy trzykrotnie 200 μl PBS w temperaturze pokojowej i inkubować przez 5 minut.
    11. Dodać 200 μl falloidyny TRITC w stężeniu 10 μg/ml i inkubować przez 10 min.
    12. Przemyć monowarstwy dwukrotnie 200 μl PBS w temperaturze pokojowej i inkubować przez 5 minut.
    13. Usuń PBS i przetnij membranę skalpelem.
    14. Odzyskaj membranę za pomocą pęsety i umieść ją na szkiełku mikroskopowym, stroną wierzchołkową skierowaną do góry.
    15. Dodać 15 μl podłoża montażowego uzupełnionego DAPI w stosunku 1:1 000 bezpośrednio na membranę. Umieść szkiełko nakrywkowe i zapieczęć.
    16. Przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem, do czasu wykonania badania obrazowego.

Wyniki

Zgodnie z opisanym powyżej protokołem, krypty nabłonkowe są pozyskiwane z jelita świni i krio konserwowane do długotrwałego przechowywania w ciekłym azocie (Rycina 1 i Rycina 2A). Po rozmrożeniu komórki macierzyste krypt są wysiewane w ECM (Rycina 2B). Na tym etapie zazwyczaj dochodzi do utraty struktury krypty z powodu dezintegracji struktury krypty w ECM. Organoidy można zaobserwować w ciągu 3-4 dni, po czym szybko rosną i rozwijają struktury pączkujące (Rycina 2B). Pomyślnie uzyskano organoidy po rozmrożeniu zamrożonych krypt w >80% prób. Około 10 dni po rozmrożeniu (zależnie od tempa wzrostu organoidów) przeprowadza się pasażowanie organoidów w celu powiększenia hodowli (Rycina 3). Organoidy rosną szybciej po rozdzieleniu i wykazują zróżnicowaną morfologię, przy czym niektóre są torbielowate, a większość pączkująca. Dla optymalnego utrzymania hodowli, organoidy wykorzystywane do pasażowania muszą mieć wyraźne i puste światło oraz dobrze zdefiniowane krawędzie (przykłady wskazane zielonymi strzałkami), bez czarnych zanieczyszczeń w świetle (wskazanych czerwonymi strzałkami), co obserwuje się w dojrzałych organoidach (Rycina 3). Stwierdzono, że czarne szczątki komórkowe zaczynają gromadzić się około 6. dnia po pasażowaniu. Dlatego zaleca się rozdzielenie lub zamrożenie organoidów w 4-5. dniu po pasażowaniu.

Stopień dojrzałości organoidów jest również istotnym czynnikiem przy uzyskiwaniu monowarstw komórkowych. Organoidy o zaawansowanej dojrzałości (wskazanej przez obecność czarnych szczątków komórkowych w świetle) nie są optymalne do wysiewu monowarstw. Zazwyczaj dysocjujemy organoidy 3D 4 dni po pasażowaniu, aby zebrać komórki do hodowli 2D. Do wysiania jednego insertu hodowlanego z 2,5 x 105 komórkami potrzeba około jednego do trzech dołków z organoidami 3D hodowanymi w zagęszczeniu 3 000 komórek na 50 µL kopułki ECM. Komórki przywierają i tworzą w pełni konfluentną monowarstwę w ciągu 1 dnia (Ryc. 4A), co potwierdzają wysokie wartości TEER wynoszące około 700 Ω·cm2 (Ryc. 4B). Jednakże, na tym wczesnym etapie brzegi komórek są trudne do wizualizacji w mikroskopii w świetle przechodzącym, prawdopodobnie ze względu na niski poziom zróżnicowania. Wartości TEER pozostają wysokie przez 3 dni (Ryc. 4B).

Barwienie aktyny wskazuje, że strona apikalna komórek nabłonkowych jest skierowana w stronę światła w organoidach 3D (Rysunek 5A). Komórki organoidów wysiane w insertach hodowlanych tworzą konfluentną pojedynczą warstwę komórek nabłonkowych, z powierzchnią apikalną skierowaną w stronę górnej komory (Rysunek 4B,C). Barwienie okludyny ujawnia obecność połączeń ścisłych po stronie apikalnej komórek nabłonkowych w organoidach 3D oraz w monowarstwach komórkowych (Rysunek 5A-C).

Schemat 3D organoidów jelita świni: izolacja, hodowla, krio konserwacja, przygotowanie monowarstw komórkowych.
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie metod stosowanych do hodowli 3D organoidów oraz monowarstw komórkowych pochodzących z organoidów. Krypty nabłonkowe są izolowane z jelita prosięcia. Krypty te mogą zostać i) niezwłocznie wykorzystane do hodowli 3D organoidów lub ii) zamrożone i przechowywane w biobanku w ciekłym azocie. Kriokonserwowane krypty mogą zostać rozmrożone i wykorzystane do hodowli 3D organoidów. Hodowlę 3D organoidów można utrzymywać poprzez sukcesywne pasażowanie lub zamrozić i przechowywać w biobanku. Z hodowli 3D organoidów można uzyskać monowarstwy komórkowe, co umożliwia dostęp do strony apikalnej komórek i badanie funkcji bariery nabłonkowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Progresja wzrostu organoidów krypt; obrazy mikroskopowe; wyizolowane krypty; obserwacja w dniach 4-10.
Rycina 2: Hodowla trójwymiarowych (3D) organoidów jelit świni z krio konserwowanych krypt nabłonkowych. (A) Reprezentatywny obraz mikroskopowy świeżo wyizolowanych krypt jelita czczego. (B) Reprezentatywne obrazy mikroskopowe organoidów 3D uzyskanych po rozmrożeniu krypt jelita czczego. Organoidy hodowano w 25 µL kopułce ECM na płytce 48-dołkowej. Na rycinie przedstawiono obrazy organoidów 3D w 4, 7, 8, 9 i 10 dniu po wysianiu. Pasek skali oznacza 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Fazy wzrostu komórek w ciągu 4 dni; obrazy mikroskopowe; badanie morfologii komórek, porównanie osi czasu hodowli.
Rycina 3: Morfologia 3D organoidów jelitowych świni pochodzących z kriozachowanych krypt nabłonkowych po pierwszym pasażu. Reprezentatywne obrazy mikroskopowe przedstawiające rozwój organoidów pochodzących z kriozachowanych krypt jelita czczego po pierwszym pasażu od 4. do 7. dnia. Zielone strzałki wskazują przejrzyste organoidy odpowiednie do pasażowania lub wysiewania monowarstw. Czerwone strzałki wskazują dojrzałe organoidy nieprzydatne do rozdzielania lub wysiewania monowarstw; w związku z tym należy wykorzystać studzienki przed pojawieniem się takiej morfologii. Pasek skali reprezentuje 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza wzrostu komórek z wynikami TEER; obrazy mikroskopowe z 4 dni; wykres przedstawia TEER w funkcji czasu.
Rycina 4: Charakterystyka monowarstw komórkowych pochodzących z 3D organoidów jelita świni. (A) Reprezentatywne obrazy mikroskopowe morfologii monowarstwy w ciągu 3 dni. Komórki organoidów jelita czczego wysiano w liczbie 2.5 x 105 komórek do insertów do hodowli komórkowej o powierzchni 0.33 cm2 pokrytych kolagenem IV w stężeniu 50 ng/mL. Pasek skali oznacza 500 µm. (B) Transepitelialna oporność elektryczna (TEER) monowarstw komórek organoidów w ciągu 3 dni. Punkty połączone linią odpowiadają tej samej studzience w różnych odstępach czasu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazy z mikroskopii konfokalnej DNA, aktyny i okludyny w komórkach nabłonkowych do badania lokalizacji białek.
Rycina 5: Obrazowanie organoidów jelita czczego świni hodowanych w 3D lub 2D. Obrazowanie z mikroskopii konfokalnej (A) organoidów 3D 5 dni po podziale oraz (B,C) monowarstw komórek organoidowych 3 dni po wysianiu (B: przekrój XZ; C: przekrój XY). DNA (niebieski) zabarwiono DAPI. Aktynę (czerwony) zabarwiono falloidyną. Okludynę (zielony) zabarwiono przeciwciałem poliklonalnym. Białe strzałki wskazują okludynę zlokalizowaną w złączach ścisłych. Pasek skali odpowiada 20 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Protokół ten opisuje metodę stosowaną do kriokonserwacji krypt nabłonkowych z jelita prosiąt w celu długotrwałego przechowywania, a następnie hodowli organoidów 3D. W protokole tym wykorzystuje się roztwór zamrażający zawierający DMSO, FBS, inhibitor Y27632 ROCK, DMEM i antybiotyki. W innym badaniu na świniach uzyskano organoidy z krypt kriokonserwowanych w podobnym roztworze do zamrażania, ale bez inhibitora ROCK15. Inhibitor Y27632 ROCK został włączony w celu zapobiegania apoptozie i utrzymania puli komórek macierzystych, ponieważ po rozmrożeniu komórki krypty nabłonka ulegają dysocjacji, co może prowadzić do śmierci komórki ("anoikis")27,28. Co ciekawe, enteroidy koni uzyskano z krypt nabłonkowych zamrożonych w pożywce hodowlanej zawierającej tylko DMEM i DMSO16; Ta prosta metoda nie została jeszcze przetestowana pod kątem krypt nabłonka świń. Opublikowano inne metody hodowli organoidów ludzkich i świń z zamrożonych tkanek lub biopsji zamiast krypt nabłonkowych 4,17. Zaletą tej metody jest możliwość bezpośredniej kriokonserwacji tkanek jelitowych bez konieczności wykonywania procedury izolacji krypty, która wymaga czasu i sprzętu laboratoryjnego. Może to być wygodne, gdy tkanki muszą być pobierane z dala od laboratorium. Jednak w przypadku izolowania krypt bezpośrednio po uboju, duże segmenty jelita mogą być przetwarzane w celu uzyskania bardzo dużej liczby krypt, co nie ma miejsca w przypadku rozpoczynania od małych zamrożonych fragmentów tkanek. Po rozmrożeniu krypt nabłonkowych organoidy obserwowano od 3-4 dni po wysiewie i pękały po 10 dniach. Jest to wolniejsze tempo wzrostu niż w przypadku rozpoczynania hodowli ze świeżych krypt nabłonkowych, dla których organoidy uzyskano od 1 dnia po wysiewie i zwykle można je podzielić około 5 dnia11. Khalil i in. stwierdzili również opóźniony wzrost enteroidów świń podczas rozpoczynania od zamrożonych krypt15, co sugeruje, że komórki macierzyste mogą potrzebować czasu, aby odzyskać swoją zdolność proliferacyjną. Uzyskaliśmy również mniejszą liczbę organoidów, zaczynając od zamrożonych krypt w porównaniu ze świeżymi kryptami, co może być spowodowane śmiercią komórek macierzystych podczas procesu zamrażania. W niektórych próbach rozmrażania krypt (<20%) nie uzyskano organoidów z zamrożonych krypt, prawdopodobnie z powodu nieoptymalnej procedury kriokonserwacji (np. opóźnione zamrażanie po izolacji krypt prawdopodobnie powyżej 1 godziny). Dlatego zalecamy trzymanie krypt na lodzie do czasu liczenia i zamrażanie ich tak szybko, jak to możliwe.

W przypadku organoidów 3D zdecydowaliśmy się użyć komercyjnej pożywki do hodowli organoidów opracowanej dla ludzi. Rzeczywiście, poprzednie doniesienia wykazały, że organoidy jelitowe świń rosną wydajnie z tym podłożem 8,11,14,19,25,26,29,30. Interesujące jest, aby ta pożywka hodowlana była gotowa do użycia i miała znormalizowane stężenie czynników wzrostu w partii. Jednak ta pożywka hodowlana jest kosztowna, jej skład jest nieujawniony, a zatem nie jest możliwe modulowanie jej składu. W przeciwieństwie do tego, inne badania wykazały hodowlę organoidów jelitowych świń w niestandardowych pożywkach zawierających inhibitory farmakologiczne, rekombinowany czynnik wzrostu i / lub kondycjonowane podłoża 5,6,7,21. Chociaż metoda ta jest bardzo elastyczna i tańsza, jest czasochłonna w produkcji kondycjonowanych pożywek i może nie być odtwarzalna ze względu na potencjalną zmienność stężenia czynników wzrostu w kondycjonowanych pożywkach. W związku z tym jakość każdej partii kondycjonowanych pożywek powinna być zwalidowana poprzez pomiar wzrostu organoidów lub ekspresji genów markerowych31.

Badanie wykazało, że organoidy jelita czczego świń hodowane w tym samym komercyjnym pożywce do hodowli organoidów, które są tutaj stosowane, rosły szybciej i wydawały się mniej zróżnicowane w porównaniu z enteroidami hodowanymi z pożywkami zawierającymi rekombinowany czynnik wzrostu i / lub kondycjonowanymi pożywkami23. Wysoki stan proliferacyjny ułatwia hodowlę organoidów 3D, ale może wymagać indukowania różnicowania, aby był bardziej reprezentatywny dla cech fizjologicznych jelit. W tym protokole, w celu przejścia organoidów 3D, komórki są w pełni dysocjowane do liczenia, co pozwala kontrolować liczbę komórek wysianych w ECM. Zwiększa to odtwarzalność fenotypu organoidów, na co duży wpływ ma ich gęstość. Co więcej, liczenie komórek pozwala uniknąć uzyskania zbyt niskiej lub przepełnionej hodowli, co wymaga dostosowania harmonogramu hodowli. W większości innych badań przygotowywano fragmenty organoidów, które nie są w pełni zdysocjowane na pojedyncze komórki, i stosowano współczynnik rozcieńczenia do pasażowania. Ta metoda jest prostsza, ale może powodować zmienność w zależności od gęstości organoidów w kulturze.

W przypadku hodowli w monowarstwach, komórki organoidowe są wysiewane we wkładkach hodowlanych wstępnie pokrytych cienką warstwą ECM, co umożliwia przyłączanie komórek, ale pozwala uniknąć wzrostu organoidów w 3D. W protokole tym wykorzystano kolagen typu IV jako białko ECM, jak opisano wcześniej u świń23. W innych badaniach z monowarstwami organoidów świń wykorzystano ten sam ECM pochodzący z guza, który zastosowano tutaj do hodowli organoidów 3D 6,8,9,21,25,30. Zaletą stosowania kolagenu jest możliwość standaryzacji stężenia białka o w pełni określonym składzie, co nie ma miejsca w ECM pochodzącym z nowotworu. Kluczowym krokiem dla powodzenia hodowli monowarstw komórkowych jest zwrócenie uwagi na wygląd prekursorowych organoidów 3D, które powinny mieć dobrze zdefiniowane krawędzie i puste światło bez czarnych zanieczyszczeń. Rzeczywiście, organoidy o wysokim poziomie dojrzewania i niskim tempie proliferacji nie są odpowiednim źródłem komórek do hodowli 2D. W związku z tym czas dysocjacji organoidów 3D na pojedyncze komórki ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego etapu.

Hodowla monowarstw 2D z pojedynczych komórek pozwala na standaryzację liczby wysiewanych komórek, co jest trudniejsze w przypadku zaczynania od fragmentów organoidów, jak to ma miejsce w przypadku niektórych innych metod. Wysialiśmy 7,6 x 105 komórek na cm2, co jest wysoką wartością w porównaniu z większością innych badań 21,22,23 u świń, które używały niższej gęstości komórek, w zakresie od 0,25 x 105 komórek na cm 2 do 1,78 x 105 komórek na cm2. Wymóg dużej liczby komórek organoidowych stanowi ograniczenie tego protokołu, ale pozwolił nam szybko uzyskać zlewającą się monowarstwę, w pełni pokrywającą wkładkę hodowlaną po 1 dniu. Natomiast Vermeire i wsp.23 uzyskali konfluencję po 4-7 dniach przy mniejszej gęstości wysianych komórek (od 0,25 x 105 komórek/cm2 do 0,4 x 105 komórek/cm2). W niektórych badaniach wykorzystano również monowarstwy komórek organoidowych świni, które nie pokrywały w pełni powierzchni hodowli w przypadku zakażeń wirusami 8,30. W tych warunkach wierzchołkowa strona komórek nabłonka jest dostępna do leczenia, ale jeśli celem jest badanie wchłaniania składników odżywczych lub przepuszczalności nabłonka, wymagane są w pełni zlewające się monowarstwy.

W przypadku monowarstw komórek organoidowych zastosowano komercyjne podłoże do hodowli organoidów uzupełnione 20% FBS, w oparciu o niedawne badanie monowarstw pochodzących z enteroidów bydlęcych32. W naszych testach suplementacja 20% FBS była konieczna do uzyskania w pełni zlewających się monowarstw, prawdopodobnie ze względu na wysokie zapotrzebowanie na czynnik wzrostu. Wręcz przeciwnie, inne badania wykorzystujące to samo podłoże komercyjne ustaliły monowarstwy bez dodatkowego FBS 8,25,30, ale bez osiągnięcia pełnej konfluencji. W innych badaniach stosowano również suplementację 20% FBS w dostosowanej pożywce do hodowli monowarstw komórek organoidów świń21,22. W naszych eksperymentach TEER jest wysoki 1 dzień po wysiewie (około 700 Ω·cm2) i utrzymuje się na wysokim poziomie do 3 dnia (około 1500 Ω·cm2; jest to zgodne z tworzeniem ścisłych połączeń, na co wskazuje ekspresja okludyny. Van der Hee i wsp. uzyskali podobne wartości TEER w ciągu 72 godzin dla monowarstw komórek organoidów jelita czczego21. Wykazali również, że monowarstwy mogą być utrzymywane do 12-15 dnia przy codziennych zmianach pożywki. W przeciwieństwie do tego, inne badania wykazały znacznie niższe wartości TEER (około 200 Ω·cm2) dla monowarstw komórek organoidowych świni 6,22. Te różnice między badaniami mogą być związane z badanym segmentem jelita lub z używanymi pożywkami, które wpływają na różnicowanie nabłonka.

Podsumowując, powyższy protokół hodowli organoidów 3D jelit świń z zamrożonych krypt nabłonkowych ułatwia organizację pracy hodowlanej. Zmniejsza to zapotrzebowanie na świeże tkanki pozyskiwane od żywych zwierząt. Wyjaśniamy również, jak stworzyć w pełni zlewające się monowarstwy komórek pochodzące z organoidów świń w czasie krótszym niż 3 dni. W związku z tym nasze protokoły mogą być użytecznymi zasobami dla naukowców badających nabłonek jelit świń do badań weterynaryjnych lub biomedycznych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Institut Carnot France Futur Elevage (projekt "OrganoPig") oraz przez INRAE HOLOFLUX (projekt "Holopig"). Autorzy są wdzięczni obiektom Genotoul Core Facilities (TRI). Dziękujemy Christelle Knudsen (GenPhySE, INRAE, Tuluza) za staranną korektę.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher Scientific AM9260GPrzechowywać w temperaturze pokojowej.
Probówka stożkowa 15 mlSarstedt62.554.502
24-dołkowa płytka do hodowli komórkowych Corning003526
48-dołkowa płytka do hodowli komórkowych Corning003548
50 ml polipropylenowa probówka stożkowaFalcon352070
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)EuromedexA6003Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Wirówka Universal 320 RHettich1406
Kolagen typu IV z ludzkiego łożyskaSigmaC5533Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml w kwasie octowym zgodnie z zaleceniami producenta. Podwielokrotność (500 &mikro; L) i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Pojemnik do zamrażania komórek CoolCell LXCorning432003Służy do krioprezerwacji krypt i organoidów.
Countess 3 Automatyczny licznik komórekThermo Fisher Scientific16842556
Szkiełka nakrywkowe, 22 mm x 50 mmVWR630-1845
Cryotube ClearLine 1 mLClear line 390706Służy do krioprezerwacji krypt i organoidów.
DAPIInvitrogenD1306Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 5 mg/ml w wodzie zgodnie z zaleceniami producenta s rekomendacja. Podwielokrotność (20 &mikro; L) i przechowywać w temperaturze -20 ° C
Ditiothreitol (DTT) Merck10197777001Sklep pod adresem 4 °C.
DMEM, suplement o wysokiej zawartości glukozy, pirogronianThermo Fisher Scientific31966047Przechowywać w temperaturze 4 stopni C.
DMSO (Dimethyl Suloxidide)Corning25-950-CQCPrzechowywać w temperaturze pokojowej.
Szkiełko mikroskopowe Epredia Superfrost Plus AdhezjaVWR631-9483
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Thermo Fisher Scientific10270-106Przechowywać 5 ml porcji w temperaturze -20 °C.
Sterylne sitka komórkowe FisherbrandThermo Fisher Scientific22363549Służy do izolacji krypt.
Stały rotator platformy 3D Tilt VWR 97025-564 Używany do inkubacji w protokole barwienia immunologicznego.
Gibco PBS, pH 7,4Thermo Fisher Scientific 10010015Przechowywać w temperaturze 4 & st. C.
Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), czerwień fenolowaThermo Fisher Scientific12605-010Odczynnik do dysocjacji enzymów. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
Kozia anty-królicza IgG, Alexa fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11008Przeciwciało wtórne. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Rozcieńczenie robocze 1:1000.
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)Stem Cell Technology6010Pożywka do hodowli organoidów. Przechowywać w temperaturze -20 stopni C. Rozmrozić podłoże podstawowe i suplement organoidowy w temperaturze pokojowej i wymieszać (1:1). Przechowuj mieszankę w temperaturze 4 stopni; C przez okres do 1 tygodnia.
Wkładka z membraną PET przezroczysta Falcon na płytkę 24 dołkiCorning353095
Mikroskop odwróconyNikon Eclipse TS2
Matrigel Basement Membrane MatrixCorning354234Macierz zewnątrzkomórkowa pochodząca z nowotworu stosowana do hodowli 3D organoidów. Matrigel polimeryzuje w temperaturze pokojowej. Do pipetowania Matrigelu używać schłodzonych końcówek. Przygotuj 500 &mikro; L i przechowywać w temperaturze -20 °C.
Podłoże montażowe do fluorescencji z DAPIVectashieldH1250 Przechowywać w temperaturze 4 °C.
Przeciwciało poliklonalne okludynyThermo Fisher Scientific71-1500Przeciwciało pierwotne. Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozcieńczenie robocze 1:200.
Paraformaldehyd 32%Mikroskopia elektronowa nauka15714Przygotuj 4% roztwór paraformaldehydu (PFA) pod kapturem chemicznym, dodając 5 ml 32% PFA do 35 ml PBS. Porcję przez 10 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
Penicylina-StreptomycynaSigmaP4333Przeciwbakteryjny. Przechowywać 5 ml porcji w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Phalloidin TRITCSigmaP1951Sonda do barwienia aktyny. 1 mg/ml roztwór podstawowy. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
PrimocinInvivoGenant-pm-05Środek przeciwdrobnoustrojowy do komórek pierwotnych działających na bakterie, mykoplazmy i grzyby. Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Inhibitor ROCK (Y27632)ATCCACS-3030Służy do utrzymania komórek macierzystych. Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 10 mM w sterylnej wodzie zgodnie z zaleceniami producenta i przechowywać porcje (50  ��; L) przy -20 &st. C.
Wytrząsarka obrotowa XLClear line 062646CLSłuży do izolacji krypty.
Pipety serologiczne pasiaste 10 mlCorning4488
Naczynie do hodowli tkankowych TPP93100
Triton X100Sigma8787Przechowywać w temperaturze pokojowej.
Trypan Blue stain, 0,4% Thermo Fisher ScientificT10282Przechowywać w temperaturze pokojowej.
System próżniowy VacusipIntegra159000Służy do usuwania podłoża ze studzienek organoidowych.

Bibliografia

  1. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 141-153 (2014).
  2. In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).
  3. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  4. Beaumont, M., et al. Intestinal organoids in farm animals. Veterinary Research. 52 (1), 33(2021).
  5. Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration. PLoS One. 8 (6), 66465(2013).
  6. Holthaus, D., Delgado-Betancourt, E., Aebischer, T., Seeber, F., Klotz, C. Harmonization of protocols for multi-species organoid platforms to study the intestinal biology of toxoplasma gondii and other protozoan infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 610368(2021).
  7. Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
  8. Li, L., et al. Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response. Journal of Virology. 93 (5), 01682(2019).
  9. vander Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 375(2020).
  10. Barnett, A. M., et al. Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (5), 794-805 (2021).
  11. Mussard, E., et al. The phenotype of the gut region is more stably retained than developmental stage in piglet intestinal organoids. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983031(2022).
  12. Zhu, M., Qin, Y. -C., Gao, C. -Q., Yan, H. -C., Wang, X. -Q. l-Glutamate drives porcine intestinal epithelial renewal by increasing stem cell activity via upregulation of the EGFR-ERK-mTORC1 pathway. Food & Function. 11 (3), 2714-2724 (2020).
  13. Wang, Z., et al. Dietary vitamin A affects growth performance, intestinal development, and functions in weaned piglets by affecting intestinal stem cells. Journal of Animal Science. 98 (2), (2020).
  14. Derricott, H., et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).
  15. Khalil, H. A., et al. A novel culture system for adult porcine intestinal crypts. Cell and Tissue Research. 365 (1), 123-134 (2016).
  16. Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells. Equine Veterinary Journal. 50 (2), 241-248 (2018).
  17. Tsai, Y. -H., et al. A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).
  18. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).
  19. Li, Y., et al. Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations. Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).
  20. Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).
  21. vander Hee, B., et al. Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids. Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).
  22. Hoffmann, P., et al. Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine. PLoS One. 16 (8), 0256143(2021).
  23. Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. Porcine small intestinal organoids as a model to explore ETEC-host interactions in the gut. Veterinary Research. 52 (1), 94(2021).
  24. Luo, H., et al. Utility evaluation of porcine enteroids as PDCoV infection model in vitro. Frontiers in Microbiology. 11, 821(2020).
  25. Resende, T. P., Medida, R. L., Vannucci, F. A., Saqui-Salces, M., Gebhart, C. Evaluation of swine enteroids as in vitro models for Lawsonia intracellularis infection1,2. Journal of Animal Science. 98 (2), 011(2020).
  26. Engevik, A. C., et al. Editing myosin VB gene to create porcine model of microvillus inclusion disease, with microvillus-lined inclusions and alterations in sodium transporters. Gastroenterology. 158 (8), 2236-2249 (2020).
  27. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  28. Gracz, A. D., Puthoff, B. J., Magness, S. T. Identification, isolation, and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine. Somatic Stem Cells: Methods and Protocols. 879, 89-107 (2012).
  29. Ferrandis Vila, M., et al. Dietary fiber sources and non-starch polysaccharide-degrading enzymes modify mucin expression and the immune profile of the swine ileum. PloS One. 13 (11), 0207196(2018).
  30. Li, L., et al. IFN-lambda 3 mediates antiviral protection against porcine epidemic diarrhea virus by inducing a distinct antiviral transcript profile in porcine intestinal epithelia. Frontiers in Immunology. 10, 2394(2019).
  31. VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430(2019).
  32. Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers. Veterinary Research. 53 (1), 15(2022).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

jelitowe organoidy świńskiekriokonserwacja organoidówfunkcja barierowainterakcje gospodarz-mikrobtransepitelialna oporność elektrycznapołączenia ścisłetransport składników odżywczychpasażowanie organoidów
Hodowla organoidów 3D jelit prosiąt z kriokonserwowanych krypt nabłonkowych i tworzenie monowarstw komórkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.