TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) to wtyczka ImageJ o otwartym kodzie źródłowym do analizy obrazowania 3D wapnia, która bada ruch na osi z i identyfikuje maksymalną wartość każdego stosu z, aby reprezentować intensywność komórki w odpowiednim punkcie czasowym. Może rozdzielać neurony nakładające się na siebie w kierunku bocznym (x/y), ale na różnych płaszczyznach z.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
TACI: Wtyczka ImageJ do analizy obrazowania 3D wapnia
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badania w neuronauce ewoluowały, aby wykorzystywać złożone narzędzia obrazowania i obliczeniowe do wydobywania wyczerpujących informacji z zestawów danych. Obrazowanie wapnia jest szeroko stosowaną techniką, która wymaga zaawansowanego oprogramowania w celu uzyskania wiarygodnych wyników, ale wiele laboratoriów ma trudności z przyjęciem metod obliczeniowych podczas aktualizacji protokołów w celu spełnienia nowoczesnych standardów. Trudności wynikają z braku wiedzy programistycznej i opłat za oprogramowanie. Ponadto interesujące komórki wykazują ruchy we wszystkich kierunkach podczas obrazowania wapnia. Opracowano wiele podejść do korygowania ruchu w kierunku bocznym (x/y).
Ten artykuł opisuje przepływ pracy przy użyciu nowej wtyczki ImageJ, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), do badania ruchu na osi Z w obrazowaniu 3D wapnia. To oprogramowanie identyfikuje maksymalną wartość fluorescencji ze wszystkich pozycji z, w których pojawia się neuron, i wykorzystuje ją do reprezentowania intensywności neuronu w odpowiedniej pozycji t. Dlatego to narzędzie może oddzielać neurony nakładające się na siebie w kierunku bocznym (x/y), ale pojawiające się na różnych płaszczyznach z. Jako wtyczka ImageJ, TACI jest przyjaznym dla użytkownika narzędziem obliczeniowym typu open source do analizy obrazowania 3D wapnia. Zweryfikowaliśmy ten przepływ pracy za pomocą termoczułych neuronów larw much, które wykazywały ruchy we wszystkich kierunkach podczas wahań temperatury, oraz zestawu danych do obrazowania 3D wapnia uzyskanego z mózgu muchy.
Wprowadzenie
Poziom wewnątrzkomórkowego wapnia jest precyzyjnym markerem pobudliwości neuronalnej. Obrazowanie wapnia mierzy zmiany w wewnątrzkomórkowym wapniu, aby zrozumieć aktywność neuronalną1. W badaniach neurobiologicznych coraz częściej stosuje się tę metodę ze względu na rozwój technik pomiaru wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia, w tym genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GECI), takich jak GCaMP2,3, które mogą być nieinwazyjnie wyrażane w określonych zestawach neuronów za pomocą podejść genetycznych. Niższe koszty laserów i komponentów mikroskopów przyczyniły się również do zwiększenia wykorzystania obrazowania wapniowego4. Co ważne, obrazowanie wapnia pozwala na rejestrowanie i badanie pojedynczych neuronów, jak również dużych populacji neuronów jednocześnie u swobodnie poruszających się zwierząt5.
Niemniej jednak, analiza danych obrazowania wapnia jest wyzwaniem, ponieważ (1) polega na śledzeniu zmian we fluorescencji poszczególnych komórek w czasie, (2) sygnał fluorescencyjny sporadycznie znika lub pojawia się ponownie z odpowiedziami neuronalnymi, oraz (3) neurony mogą poruszać się we wszystkich kierunkach, szczególnie wewnątrz i na zewnątrz płaszczyzny ogniskowej lub pojawiając się na wielu płaszczyznach4, 6. Ręczna analiza jest czasochłonna i staje się niepraktyczna wraz ze wzrostem długości nagrań i liczby neuronów. Opracowano różne programy komputerowe w celu przyspieszenia procesu analizy obrazowania wapnia. Wcześniej oprogramowanie było projektowane w ograniczonym kontekście eksperymentalnym, co utrudniało jego przyjęcie przez inne laboratoria. Niedawne wysiłki mające na celu spełnienie nowoczesnych standardów udostępniania oprogramowania doprowadziły do opracowania kilku narzędzi, które mogą konsekwentnie analizować dane obrazowania wapnia w różnych grupach7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19. Jednak większość z tych narzędzi wymaga wiedzy programistycznej i/lub jest zależna od oprogramowania komercyjnego. Brak wiedzy programistycznej i zapory płatne za oprogramowanie powstrzymują badaczy przed stosowaniem tych metod. Co więcej, wiele z tych narzędzi skupia się na korekcji ruchu x/y, chociaż ruch na osi z również musi być wyraźnie zdiagnozowany i skorygowany6. Istnieje zapotrzebowanie na narzędzie obliczeniowe do analizy obrazowania 3D wapnia, które koncentruje się na neuronach wykazujących dryf z i pojawiających się na wielu płaszczyznach z. Idealnie byłoby, gdyby to narzędzie korzystało z oprogramowania typu open source i nie wymagało wiedzy programistycznej, aby inne laboratoria mogły je łatwo przyjąć.
Tutaj opracowaliśmy nową wtyczkę ImageJ, TACI, do analizy danych obrazowania 3D wapnia. Po pierwsze, w razie potrzeby oprogramowanie zmienia nazwę i porządkuje dane obrazowania 3D wapnia według pozycji z. Interesujące komórki są śledzone w każdej pozycji z, a ich intensywność fluorescencji jest wyodrębniana przez TrackMate lub inne narzędzia obliczeniowe. TACI jest następnie stosowany do badania ruchu na osi z. Identyfikuje maksymalną wartość stosu z i używa jej do reprezentowania intensywności komórki w odpowiednim punkcie czasowym. Ten przepływ pracy jest odpowiedni do analizy obrazowania 3D wapnia z ruchem we wszystkich kierunkach i/lub z neuronami nakładającymi się w kierunku bocznym (x/y), ale pojawiającymi się w różnych pozycjach z. Aby zweryfikować ten przebieg pracy, wykorzystano zestawy danych obrazowania 3D wapnia z termowrażliwych neuronów larw much i neuronów grzybowych w mózgu. Warto zauważyć, że TACI jest wtyczką ImageJ o otwartym kodzie źródłowym i nie wymaga żadnej wiedzy programistycznej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Obrazowanie wapnia
- Przygotowanie larw much
UWAGA: Muchy i larwy są utrzymywane w temperaturze 25 °C w cyklu światło:ciemność 12 h:12 h.- Znieczulić muchy za pomocą CO2. Posortować od 20 do 45 samców i od 20 do 45 samic do każdej fiolki z muchami i pozostawić je na co najmniej 24 h do 48 h, aby doszły do siebie po ekspozycji na CO2 .
UWAGA: Ekspozycja much na CO2 powinna trwać jak najkrócej. - Aby zsynchronizować wiek larw, przenieść muchy do nowych fiolek zawierających granulki drożdży i pozostawić je na 4-8 h w celu zniesienia jaj. Usunąć muchy, przenosząc je do nowych fiolek.
- Zebrać larwy po 72 h, używając 10 mL 20% w/v roztworu sacharozy.
- Znieczulić muchy za pomocą CO2. Posortować od 20 do 45 samców i od 20 do 45 samic do każdej fiolki z muchami i pozostawić je na co najmniej 24 h do 48 h, aby doszły do siebie po ekspozycji na CO2 .
- Konfiguracja mikroskopu i kontroli temperatury
- Obrazowanie przeprowadzić na mikroskopie konfokalnym (patrz Tabela materiałów) z piezoelektrycznym stolikiem w osi z oraz wkładką do stolika, stosując następujące ustawienia: laser, Argon; tryb skanowania, ramka; rozmiar ramki, 512 x 512; prędkość, maksymalna; kanały/głębokość bitowa, 1/8 Bit; powiększenie, 1,5; z-stack, slice =15, Keep = slice; urządzenia i strategia ostrzenia, Definite focus; ostrzenie, Definite focus on.
- Przymocować moduł chłodzenia Peltiera do radiatora za pomocą pasty termoprzewodzącej, aby zbudować chłodnicę termoelektryczną. Moduł Peltiera jest zasilany z zasilacza 2 A.
- Podłączyć mikroprobę termopary do urządzenia do akwizycji danych w celu rejestracji temperatury.
- Obrazowanie wapnia
- Przepłukać larwy 3x w 1x roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS).
- Nanieść pipetą 75 μL 1x PBS na środek szkiełka przedmiotowego.
- Umieścić jedną lub dwie larwy w 1x PBS i umieścić mikroprobę termopary w pobliżu larw.
UWAGA: Odległość między larwami a mikroprobą powinna wynosić ~5 mm. Larwy mogą się poruszać, jeśli mikroproba zostanie umieszczona zbyt blisko nich. Zbyt duża odległość może skutkować niedokładnymi odczytami temperatury. - Przykryć larwy i mikroprobę termopary szkiełkiem nakrywką. Uszczelnić szkiełko nakrywkę lakierem do paznokci.
- Umieścić szkiełko na stoliku mikroskopu, ustawić ostrość za pomocą obiektywu 25x i umieścić chłodnicę termoelektryczną na szkiełku.
UWAGA: Moduł Peltiera jest umieszczany bezpośrednio na szkiełku w miejscu, w którym znajdują się larwy, aby dostarczać bodźce temperaturowe. - W oprogramowaniu konfokalnym ustawić ostrość na interesujące komórki fluorescencyjne. Dostosować moc lasera, aby uniknąć przesycenia. Ustawić pozycje pierwszego i ostatniego przekroju w ustawieniach z-stack.
UWAGA: Przed rejestracją stosować jak najniższą moc lasera, aby zapobiec fotobleachingowi. - Jednocześnie rozpocząć skanowanie z-stack i rejestrację temperatury.
- Kontrolować zasilacz zasilający moduł Peltiera, aby zmieniać temperaturę jego powierzchni. Włączyć zasilacz, aby obniżyć temperaturę, i wyłączyć go, aby temperaturę podnieść.
- Zatrzymać skanowanie z-stack i rejestrację temperatury.
2. Analiza danych z obrazowania wapnia 3D
- Wyeksportuj dane z obrazowania wapnia do plików TIFF i zapisz je w folderze o tej samej nazwie, co nazwa bazowa plików TIFF wewnątrz niego.
UWAGA: Nazwa pliku nie może zawierać żadnych przecinków.- Użyj następujących parametrów, aby wyeksportować dane z obrazowania wapnia z programu ZEN (black edition): typ pliku, TIFF; kompresja, LZW; kanały, 2; pozycja Z, wszystkie; czas, wszystkie; faza, 1; region, pełny.
- Instalacja
- Pobierz plik TACI-Calcium_Imaging.jar z serwisu Github (https://github.com/niflylab/TACI_CalciumImagingPlugin/releases).
- Zainstaluj wtyczkę w programie FIJI, klikając w Wtyczki w pasek menu a następnie kliknięcie w Instalacja w menu rozwijanym (Wtyczki | Instaluj). Następnie zrestartuj program FIJI.
UWAGA: Należy NIE użycie Wtyczki | Instaluj wtyczkę. - Uruchom wtyczkę, klikając w Wtyczki a następnie wybór Obrazowanie wapnia TACI (Wtyczki | Obrazowanie wapniowe TACI).
- Użyj ZMIANA NAZWY funkcja służąca do konwersji nazw plików TIFF na wymaganą strukturę.
UWAGA: Narzędzie wykorzystuje strukturę filename_h#t#z#c#.tif jako domyślną (h# i c# są opcjonalne; #: liczba całkowita dodatnia). Jeśli nazwy plików obrazów nie są zgodne z domyślną strukturą, to ZMIANA NAZWY funkcja musi zostać wykonana.- Kliknij, aby wybrać folder, w którym obrazy TIFF wymagają zmiany nazwy Przeglądaj foldery.
- Wypełnij informacje dotyczące parametrów. Wymieniono pięć parametrów, w tym Nazwa pliku, Faza, Maksymalna pozycja T, Maksymalna pozycja osi Zi KanałKażdy parametr posiada trzy wartości: Tekst poprzedzający, wartość parametrui Kolejność.
UWAGA: Informacje są uwzględniający wielkość literJeśli nazwy plików obrazów zawierają fraza przed parametremuzupełnij frazę jako Poprzedni tekst odpowiadającego parametru. Jeśli nazwy plików obrazów zawierają fraza po wszystkich parametrach, uzupełnij frazę jako Tekst posta.- Należy upewnić się, aby wprowadzić Nazwa pliku, Maksymalna pozycja Ti Maksymalna pozycja Z oraz że wartości parametrów dla Maksymalna pozycja T i Maksymalna pozycja osi Z zawierać wszystkie cyfry.
- Odczekaj aż Nazwa pliku do automatycznego wypełnienia na podstawie nazwy folderu.
- Jeśli nazwy plików TIFF nie zawierają fazy i kanału, pozostaw wartość odpowiadającego im parametru pusta i wybierz Na w Kolejność.
- Kliknij Zmień nazwę aby utworzyć folder o tej samej nazwie z przyrostkiem _r. Należy zauważyć, że w folderze nazwy plików TIFF zostały zmienione tak, aby były zgodne z ORGANIZUJ funkcja
UWAGA: Do nazw plików obrazów TIFF dodano przyrostek _r.
- Użyj ORGANIZUJ funkcja służąca do zapisywania obrazów TIFF z tej samej pozycji z w jednym folderze.
UWAGA: Nazwa folderu musi zawierać ta sama nazwa jako nazwa bazowa plików TIFF wewnątrz oraz musi NIE posiadać żadnych przecinków.- Wybierz folder, w którym mają zostać zorganizowane obrazy TIFF, klikając Przeglądaj foldery.
- Jeśli istnieje plik CSV z parametrami (param.csv), należy poczekać na automatyczne uzupełnienie wartości parametrów.
UWAGA: Plik param.csv ma określony wymagany format. Parametry, w tym filename, phase, position_t, position_z, channel oraz is_gray, muszą zostać wpisane w pierwszym wierszu od lewej do prawej, zaczynając od kolumny A. Odpowiednie wartości dla każdego parametru muszą zostać wpisane w drugim wierszu. - Jeśli plik parametrów CSV (param.csv) nie istnieje, należy ręcznie wprowadzić wartości parametrów. Upewnij się, że wartości parametrów dla Faza i Kanał dołącz listy, podczas gdy wartości parametrów Pozycja T i Pozycja Z powinno być największe liczby pozycji t- i z. Jeśli nazwy plików obrazów nie zawierają informacji o fazie lub kanale, należy wprowadzić Na.
- W razie potrzeby należy utworzyć obrazy TIFF w skali szarości. Pozostaw pole Czy obrazy są w odcieniach szarości? odznacz opcję konwersji obrazów na skalę szarości.
- Kliknij Zorganizuj aby utworzyć folder o tej samej nazwie z przyrostkiem _gray_stacks oraz wygenerować w nim foldery o tej samej nazwie z przyrostkiem _# (#: pozycje z). Należy zauważyć, że pliki TIFF są sortowane do odpowiednich folderów według pozycji z oraz że generowany jest plik o nazwie param.csv, w którym znajdują się parametry i ich wartości.
- Użyj wtyczki TrackMate w programie FIJI, aby wyekstrahować intensywności fluorescencji wybranych komórek z każdej pozycji z.
UWAGA: Ten etap można również zrealizować przy użyciu innego oprogramowania do obrazowania.- Otwórz obrazy TIFF z folderu z pozycjami z (z-position) w programie FIJI.
- Uruchom program TrackMate, klikając w Wtyczki | Śledzenie | TrackMatei w razie potrzeby dostosuj następujące parametry.
- Zastosowanie Różnica z rozmyciem Gaussa lub detektory LoG.
- Zmień średnica plamki, prógi filtr medianowyDostosuj średnica plamki powinno być zbliżone do średnicy komórek. Jeśli komórki są owalne, należy dostosować średnica plamki powinno być zbliżone do osi mniejszej.
UWAGA: Zwiększenie próg pomaga uniknąć rejestrowania szumów tła jako sygnałów, nie wpływając na intensywność sygnałów (Rycina uzupełniająca 1). Jednakże wzrost w próg może pominąć sygnały rzeczywiste (Rysunek uzupełniający 1). Jeśli sygnały są silne, należy użyć filtr medianowy w celu zmniejszenia szumu typu sól i pieprz. - Ustaw filtry tak, aby usunąć część lub wszystkie nieistotne sygnały. Filtry X i Y są filtrami przestrzennymi. Stosuje się filtry X i Y aby usunąć nieistotne sygnały oddalone od sygnałów rzeczywistych.
UWAGA: Po ustawieniu filtrów na jednym obrazie należy koniecznie sprawdzić wszystkie pozostałe obrazy, aby upewnić się, że sygnały rzeczywiste nie zostały usunięte. - Ustaw maksymalna odległość wiązania, maksymalna odległość zamykania lukii maksymalna przerwa między klatkami przy wypełnianiu lukUstawi lowercase maksymalna odległość wiązania i maksymalna odległość zamykania przerwy być 3x-5x średnicy plamkiszczególnie gdy próbki przemieszczają się w znacznym stopniu w czasie, aby pomóc zmniejszyć liczbę śladów. Ustaw domykanie luk maksymalna przerwa między klatkami do liczba obrazów w stosie.
- Wyeksportuj intensywności fluorescencji obszarów zainteresowania (ROI) do pliku CSV. W przypadku korzystania ze starszej wersji programu TrackMate wybierz Eksportuj statystyki wszystkich plamek w Wybierz działanie okna. Jeśli wersja programu TrackMate to 7.6.1 lub nowsza, należy wybrać Plamki w Opcje wyświetlania okno. Eksportuj lub zapisz interaktywne pliki jako pliki CSV.
UWAGA: Oba pliki są interaktywne z oknem obrazu; zaznaczenie obszaru zainteresowania (ROI) wyświetla odpowiadający mu ROI w oknie obrazu. Pliki te zawierają średnie intensywności (MEAN_INTENSITY lub MEAN_INTENSITY_CH1) analizowanych komórek w odpowiadających im punktach czasowych (POSITION_T). Te same identyfikatory TRACK_ID powinny reprezentować te same ROI w różnych punktach czasowych. Nie zawsze jednak tak jest i w razie potrzeby może być wymagana ręczna korekta. Jeśli TrackMate nie rozpozna ROI w niektórych punktach czasowych, punkty te nie są wyświetlane.
- Wyznacz intensywność fluorescencji tła i utwórz plik Background_list.csv.
UWAGA: W niniejszym badaniu intensywność tła dla każdej pozycji z szacowano, wykorzystując średnią wartość trzech do pięciu sąsiadujących obszarów (blobs) o tym samym rozmiarze, które nie zawierały sygnałów fluorescencyjnych i pochodziły z różnych punktów czasowych.- Plik Background_list.csv musi mieć określony format: każda kolumna zawiera informacje o jednym neuronie, zaczynając od Neuronu 0. W wierszu 1 należy wpisać numery neuronów, np. Neuron 0. Następnie należy podać intensywność tła dla każdej analizowanej pozycji z – jeśli dla Neuronu 0 analizowanych jest pięć pozycji z, pod Neuronem 0 należy wpisać pięć wartości intensywności tła.
UWAGA: Do analizy TACI wymagany jest plik Background_list.csv EKSTRAKT funkcja. Jeśli tło jest pomijalne, należy dostarczyć plik Background_list.csv zawierający intensywność tła zerowego dla każdego neuronu.
- Plik Background_list.csv musi mieć określony format: każda kolumna zawiera informacje o jednym neuronie, zaczynając od Neuronu 0. W wierszu 1 należy wpisać numery neuronów, np. Neuron 0. Następnie należy podać intensywność tła dla każdej analizowanej pozycji z – jeśli dla Neuronu 0 analizowanych jest pięć pozycji z, pod Neuronem 0 należy wpisać pięć wartości intensywności tła.
- Użyj EKSTRAKT funkcja służąca do identyfikacji maksymalnych intensywności fluorescencji dla każdej pozycji t oraz obliczania ΔF/F0 jak pokazano w równaniu (1).
(1)
- Utwórz folder i nazwij go zgodnie z numerem neuronu, zaczynając od Neuron 0. W folderze zapisz pliki CSV zawierające informacje o fluorescencji odpowiadającego im neuronu. Każdy plik CSV zawiera informacje dla jednej pozycji z, zatem liczba plików CSV odpowiada liczbie analizowanych pozycji z. Nazwij pliki CSV jako Mean_Intensity#.csv (# oznacza pozycję z); każdy plik CSV musi zawierać co najmniej dwie kolumny: POSITION_T oraz MEAN_INTENSITY lub MEAN_INTENSITY_CH1.
UWAGA: Należy utworzyć folder dla każdej analizowanej komórki. - Zapisz plik Background_list.csv oraz foldery utworzone w kroku 2.7.1 w jednym folderze. Wybierz ten folder, klikając w Przeglądaj pliki.
UWAGA: Liczba wartości tła w pliku Background_list.csv musi odpowiadać liczbie plików Mean_Intensity#.csv dla każdego neuronu. - Plik tła jest wypełniany automatycznie. Wypełnij jak największą liczbę pozycji t dla Liczba pozycji T.
- Kliknij Ekstrakt w celu utworzenia folderu z wynikami, zawierającego pliki CSV oraz wykresy dla każdego neuronu. Pliki CSV zawierają informacje o maksymalnej intensywności fluorescencji oraz ΔF/F0 w każdym punkcie t. Wykresy przedstawiają przebiegi zmian ΔF/F w formie wykresów liniowych0 w pozycjach t.
UWAGA: W niniejszym badaniu ΔF/F0 obliczono za pomocą równania (1). Pierwszą wartość dla każdej pozycji z wykorzystano jako F0. Jeśli ten F0 jest niewłaściwe20Wtyczka udostępnia pliki, w tym surowe dane dla każdego neuronu, znajdujące się w folderze python_files.
- Utwórz folder i nazwij go zgodnie z numerem neuronu, zaczynając od Neuron 0. W folderze zapisz pliki CSV zawierające informacje o fluorescencji odpowiadającego im neuronu. Każdy plik CSV zawiera informacje dla jednej pozycji z, zatem liczba plików CSV odpowiada liczbie analizowanych pozycji z. Nazwij pliki CSV jako Mean_Intensity#.csv (# oznacza pozycję z); każdy plik CSV musi zawierać co najmniej dwie kolumny: POSITION_T oraz MEAN_INTENSITY lub MEAN_INTENSITY_CH1.
- Użyj ŁĄCZENIE funkcja do wyznaczania średniej wartości ΔF/F dla każdego neuronu0, oblicz błąd standardowy średniej (SEM) i przedstaw na wykresie średnią wartość ΔF/F0 w pozycjach t.
- Wybierz folder z wynikami utworzony przez EKSTRAKT funkcja poprzez kliknięcie w Przeglądaj pliki.
- Wypełnij Liczba pozycji T z największą liczbą pozycji t.
- Kliknij Scalanie w celu utworzenia folderu merged_data, zawierającego plik merged_data.csv oraz wykres Average_dF_F0.png. Plik CSV zawiera informacje o średniej i błędzie standardowym średniej (SEM) dla ΔF/F00 w każdej pozycji t. Wykresem jest wykres liniowy średniej wartości ΔF/F0 w pozycjach t.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przebieg analizy 3D obrazowania wapnia
W niniejszym badaniu opracowaliśmy nowy plugin do programu ImageJ o nazwie TACI oraz opisaliśmy procedurę śledzenia dryftu w osi z i analizy 3D obrazowania wapnia, która pozwala precyzyjnie określić odpowiedzi poszczególnych komórek pojawiających się w wielu pozycjach z (Rycina 1). Narzędzie to posiada cztery funkcje: RENAME, ORGANIZE, EXTRACT oraz MERGE. Po pierwsz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym badaniu opracowano nową wtyczkę ImageJ, TACI, i opisano przepływ pracy analizujący obrazowanie 3D wapnia. Wiele obecnie dostępnych narzędzi koncentruje się na korekcji ruchu x/y, chociaż ruch na osi z również musi być wyraźnie zdiagnozowany lub skorygowany6. Podczas akwizycji obrazu w żywym organizmie ruch na osi Z jest nieunikniony nawet wtedy, gdy organizm jest unieruchomiony, a niektóre bodźce, takie jak zmiana temperatury, często powodują znaczny dryft z. Zwiększenie wysokości stosów z p...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
A Zeiss LSM 880 w Centrum Obrazowania Fralin został użyty do zebrania danych obrazowania wapnia. Dziękujemy dr Michelle L Olsen i Yuhang Pan za ich pomoc w pracy z oprogramowaniem IMARIS. Dziękujemy dr Lenwoodowi S. Heathowi za konstruktywne komentarze do manuskryptu oraz Stevenowi Giavasisowi za komentarze do pliku README na GitHubie. Praca ta była wspierana przez NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) i NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) do L.N. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ani przygotowaniu manuskryptu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| igła do napełniania | BD | 303129 | |
| Dwuwodny chlorek wapnia | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Składnik pokarmu dla much |
| Dwutlenek węgla | Airgas | UN1013 | Rozmiar 200 Stalowy cylinder wysokociśnieniowy |
| Zestaw bełkotki CO2 | Genesee | 59-180 | |
| LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | Odwrócony Axio Observer Z1, wyposażony w 5 laserów, 2 standardowe detektory PMT, 32-kanałowe detektory GaAsP, detektor Airyscan i Definite Ostrość.2. |
| Oprogramowanie DAQami | Pomiar Obliczenia | ||
| Dekstroza | Genesee | 62-113 | Składnik pokarmu dla much |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Składnik pokarmu dla much |
| Etanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Składnik pokarmu dla much |
| Linia muchowa: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | Miły prezent | |
| Linia muchowa: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Linia muchowa: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | Miły prezent | |
| Linia lotnicza: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | Miły prezent | |
| Linia muchowa: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| Uniwersalny regulator z kutego mosiądzu | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7,4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Zielona rurka Drosophila | Genesee | 59-124 | |
| Związek przenoszący ciepło | MG Chemicals | 860-60G | |
| Radiator | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Zmień rozmiar na 12,9 x 5,5 cm |
| Oświetlacz | AmScope | LED-6W | |
| Nieaktywne suche drożdże | Genesee | 62-108 | Inkubator do składników pokarmu dla much |
| Pervical | DR-41VL | Światło: ciemny cykl: 12h:12h; Temperatura: 25 & Deg; C; wilgotność: 40-50% wilgotności względnej. | |
| Methyl-4-hydroxybenzoesan | Thermo Scientific | 126965000 | Pokarm dla much ingrediete |
| Szkło z mikro pokrywą | VWR& | nbsp; 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1,0 mm | |
| Lakier do paznokci | Kleancolor | ||
| Wąskie fiolki Drosophila | Genesee | 32-113RL | |
| Cel pracy | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Corr DIC M27 |
| Moduł chłodzący Peltiera | TE Technology | TE-127-1.0-0,8 | 30 x 30 mm |
| Wtyczki | Genesee | 49-102 | |
| Specjaliści | obwodów | CSI1802X | liniowy zasilacz laboratoryjny 10 V DC 2.0 Amp |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Seria 4750, rozmiar 2 | |
| Tetrahydrat L-winianu sodowo-potasowego | Thermo Scientific | 033241-36 | Składnik pokarmu na muchy |
| Wkładka sceniczna | Wienecke i Sinske | 432339-9030-000 | |
| Mikroskop stereoskopowy | Olympus | SZ61 | Każdy mikroskop stereoskopowy działa |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Urządzenie do akwizycji danych termopary | Pomiar Obliczenia | USB-2001-TC | Jednokanałowa |
| mikrosonda termoparowa | Physitemp | IT-24P | |
| Żółta mąka kukurydziana | Genesee | 62-101 | Składnik pokarmu dla much |
| Etap piezoelektryczny osi Z | Wienecke i Sinske | 432339-9000-000 |
Bibliografia
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Zhang, Y., et al. jGCaMP8 fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
- Robbins, M., Christensen, C. N., Kaminski, C. F., Zlatic, M. Calcium imaging analysis - How far have we come. F1000Research. 10, 258(2021).
- Oh, J., Lee, C., Kaang, B. K. Imaging and analysis of genetically encoded calcium indicators linking neural circuits and behaviors. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 23 (4), 237-249 (2019).
- Stringer, C., Pachitariu, M. Computational processing of neural recordings from calcium imaging data. Current Opinion in Neurobiology. 55, 22-31 (2019).
- Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
- Nguyen, J. P., Linder, A. N., Plummer, G. S., Shaevitz, J. W., Leifer, A. M. Automatically tracking neurons in a moving and deforming brain. PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005517(2017).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. EMC2: A versatile algorithm for robust tracking of calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. bioRxiv. , (2021).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173(2019).
- Delestro, F., et al. In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata. Scientific Reports. 10, 7153(2020).
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25(2020).
- Eglen, S. J., et al. Toward standard practices for sharing computer code and programs in neuroscience. Nature Neuroscience. 20 (6), 770-773 (2017).
- Pachitariu, M., et al. Suite2p: Beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. bioRxiv. , (2017).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. Tracking calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. PLoS Computational Biology. 17 (10), 1009432(2021).
- Kolar, K., Dondorp, D., Zwiggelaar, J. C., Høyer, J., Chatzigeorgiou, M. Mesmerize is a dynamically adaptable user-friendly analysis platform for 2D and 3D calcium imaging data. Nature Communications. 12, 6569(2021).
- Moein, M., et al. CaSiAn: A Calcium Signaling Analyzer tool. Bioinformatics. 34 (17), 3052-3054 (2018).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728(2018).
- Neugornet, A., O'Donovan, B., Ortinski, P. I. Comparative effects of event detection methods on the analysis and interpretation of Ca(2+) imaging data. Frontiers in Neuroscience. 15, 620869(2021).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Fazeli, E., et al. Automated cell tracking using StarDist and TrackMate. F1000Research. 9, 1279(2020).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Ni, L., et al. The ionotropic receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254(2016).
- Omelchenko, A. A., et al. Cool and warm ionotropic receptors control multiple thermotaxes in Drosophila larvae. Frontiers in Molecular Neuroscience. , (2022).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nature Communications. 9 (1), 4252(2018).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Synchronous and opponent thermosensors use flexible cross-inhibition to orchestrate thermal homeostasis. Science Advances. 7 (35), (2021).
- Klein, M., et al. Sensory determinants of behavioral dynamics in Drosophila thermotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (2), 220-229 (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
