Artykuł metodologiczny

TACI: Wtyczka ImageJ do analizy obrazowania 3D wapnia

DOI:

10.3791/64953

⸱

16 grudnia 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Neuroscience, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2CMU-Pitt Joint Computational Biology, School of Medicine, University of Pittsburgh, 3Eastern Virginia Medical School, 4Department of Physics, University of Miami

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) to wtyczka ImageJ o otwartym kodzie źródłowym do analizy obrazowania 3D wapnia, która bada ruch na osi z i identyfikuje maksymalną wartość każdego stosu z, aby reprezentować intensywność komórki w odpowiednim punkcie czasowym. Może rozdzielać neurony nakładające się na siebie w kierunku bocznym (x/y), ale na różnych płaszczyznach z.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania w neuronauce ewoluowały, aby wykorzystywać złożone narzędzia obrazowania i obliczeniowe do wydobywania wyczerpujących informacji z zestawów danych. Obrazowanie wapnia jest szeroko stosowaną techniką, która wymaga zaawansowanego oprogramowania w celu uzyskania wiarygodnych wyników, ale wiele laboratoriów ma trudności z przyjęciem metod obliczeniowych podczas aktualizacji protokołów w celu spełnienia nowoczesnych standardów. Trudności wynikają z braku wiedzy programistycznej i opłat za oprogramowanie. Ponadto interesujące komórki wykazują ruchy we wszystkich kierunkach podczas obrazowania wapnia. Opracowano wiele podejść do korygowania ruchu w kierunku bocznym (x/y).

Ten artykuł opisuje przepływ pracy przy użyciu nowej wtyczki ImageJ, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), do badania ruchu na osi Z w obrazowaniu 3D wapnia. To oprogramowanie identyfikuje maksymalną wartość fluorescencji ze wszystkich pozycji z, w których pojawia się neuron, i wykorzystuje ją do reprezentowania intensywności neuronu w odpowiedniej pozycji t. Dlatego to narzędzie może oddzielać neurony nakładające się na siebie w kierunku bocznym (x/y), ale pojawiające się na różnych płaszczyznach z. Jako wtyczka ImageJ, TACI jest przyjaznym dla użytkownika narzędziem obliczeniowym typu open source do analizy obrazowania 3D wapnia. Zweryfikowaliśmy ten przepływ pracy za pomocą termoczułych neuronów larw much, które wykazywały ruchy we wszystkich kierunkach podczas wahań temperatury, oraz zestawu danych do obrazowania 3D wapnia uzyskanego z mózgu muchy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poziom wewnątrzkomórkowego wapnia jest precyzyjnym markerem pobudliwości neuronalnej. Obrazowanie wapnia mierzy zmiany w wewnątrzkomórkowym wapniu, aby zrozumieć aktywność neuronalną1. W badaniach neurobiologicznych coraz częściej stosuje się tę metodę ze względu na rozwój technik pomiaru wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia, w tym genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GECI), takich jak GCaMP2,3, które mogą być nieinwazyjnie wyrażane w określonych zestawach neuronów za pomocą podejść genetycznych. Niższe koszty laserów i komponentów mikroskopów przyczyniły się również do zwiększenia wykorzystania obrazowania wapniowego4. Co ważne, obrazowanie wapnia pozwala na rejestrowanie i badanie pojedynczych neuronów, jak również dużych populacji neuronów jednocześnie u swobodnie poruszających się zwierząt5.

Niemniej jednak, analiza danych obrazowania wapnia jest wyzwaniem, ponieważ (1) polega na śledzeniu zmian we fluorescencji poszczególnych komórek w czasie, (2) sygnał fluorescencyjny sporadycznie znika lub pojawia się ponownie z odpowiedziami neuronalnymi, oraz (3) neurony mogą poruszać się we wszystkich kierunkach, szczególnie wewnątrz i na zewnątrz płaszczyzny ogniskowej lub pojawiając się na wielu płaszczyznach4, 6. Ręczna analiza jest czasochłonna i staje się niepraktyczna wraz ze wzrostem długości nagrań i liczby neuronów. Opracowano różne programy komputerowe w celu przyspieszenia procesu analizy obrazowania wapnia. Wcześniej oprogramowanie było projektowane w ograniczonym kontekście eksperymentalnym, co utrudniało jego przyjęcie przez inne laboratoria. Niedawne wysiłki mające na celu spełnienie nowoczesnych standardów udostępniania oprogramowania doprowadziły do opracowania kilku narzędzi, które mogą konsekwentnie analizować dane obrazowania wapnia w różnych grupach7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19. Jednak większość z tych narzędzi wymaga wiedzy programistycznej i/lub jest zależna od oprogramowania komercyjnego. Brak wiedzy programistycznej i zapory płatne za oprogramowanie powstrzymują badaczy przed stosowaniem tych metod. Co więcej, wiele z tych narzędzi skupia się na korekcji ruchu x/y, chociaż ruch na osi z również musi być wyraźnie zdiagnozowany i skorygowany6. Istnieje zapotrzebowanie na narzędzie obliczeniowe do analizy obrazowania 3D wapnia, które koncentruje się na neuronach wykazujących dryf z i pojawiających się na wielu płaszczyznach z. Idealnie byłoby, gdyby to narzędzie korzystało z oprogramowania typu open source i nie wymagało wiedzy programistycznej, aby inne laboratoria mogły je łatwo przyjąć.

Tutaj opracowaliśmy nową wtyczkę ImageJ, TACI, do analizy danych obrazowania 3D wapnia. Po pierwsze, w razie potrzeby oprogramowanie zmienia nazwę i porządkuje dane obrazowania 3D wapnia według pozycji z. Interesujące komórki są śledzone w każdej pozycji z, a ich intensywność fluorescencji jest wyodrębniana przez TrackMate lub inne narzędzia obliczeniowe. TACI jest następnie stosowany do badania ruchu na osi z. Identyfikuje maksymalną wartość stosu z i używa jej do reprezentowania intensywności komórki w odpowiednim punkcie czasowym. Ten przepływ pracy jest odpowiedni do analizy obrazowania 3D wapnia z ruchem we wszystkich kierunkach i/lub z neuronami nakładającymi się w kierunku bocznym (x/y), ale pojawiającymi się w różnych pozycjach z. Aby zweryfikować ten przebieg pracy, wykorzystano zestawy danych obrazowania 3D wapnia z termowrażliwych neuronów larw much i neuronów grzybowych w mózgu. Warto zauważyć, że TACI jest wtyczką ImageJ o otwartym kodzie źródłowym i nie wymaga żadnej wiedzy programistycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Obrazowanie wapnia

  1. Preparat na larwy much
    UWAGA: Muchy i larwy są utrzymywane w temperaturze 25 °C w cyklu 12 godzin: 12 godzin światło: ciemność.
    1. Znieczulić muchy CO2 . Do każdej fiolki na muchy należy umieścić 20-45 samców i 20-45 samic i dać im co najmniej 24 do 48 godzin na regenerację po >2 . UWAGA: Narażenie much na CO2 powinno trwać jak najkrócej.
    2. Aby zsynchronizować wiek larw, należy wklepać muchy do nowych fiolek zawierających granulki drożdży i pozostawić im 4-8 godzin na złożenie jaj. Usuń muchy, przerzucając je do nowych fiolek.
    3. Zebrać larwy po 72 godzinach, używając 10 ml 20% w/v roztworu sacharozy.
  2. Konfiguracja mikroskopu i kontroli temperatury
    1. Obrazowanie należy wykonać pod mikroskopem konfokalnym (patrz Tabela materiałów) i stolikiem piezoelektrycznym w osi z wkładką stolika przy użyciu następujących ustawień: laser, Argon; tryb skanowania, ramka; rozmiar ramki, 512 x 512; prędkość, maksimum; kanały/głębia bitowa, 1/8 bitu; zoom, 1,5; z-stack, slice = 15, Keep = slice; urządzenia i strategia ostrości, Definite focus; focus, Zdecydowany nacisk na.
    2. Podłącz moduł chłodzący Peltiera do radiatora za pomocą związku przenoszącego ciepło, aby zbudować chłodnicę termoelektryczną. Ogniwo Peltiera zasilane jest prądem o natężeniu 2 A.
    3. Podłącz mikrosondę termopary do urządzenia do akwizycji danych, aby zarejestrować temperaturę.
  3. Obrazowanie wapnia
    1. Opłucz larwy 3x w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    2. Odpipetować 75 μL 1x PBS na środek szklanego szkiełka.
    3. Umieść jedną lub dwie larwy w 1x PBS i umieść mikrosondę termopary w pobliżu larw.
      UWAGA: Odległość między larwami a mikrosondą powinna wynosić ~5 mm. Larwy mogą się poruszać, jeśli mikrosonda zostanie umieszczona zbyt blisko nich. Duża odległość może skutkować niedokładnymi odczytami temperatury.
    4. Przykryj larwy i mikrosondę termopary szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci.
    5. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu, znajdź ostrość za pomocą obiektywu 25x i umieść chłodnicę termoelektryczną na szkiełku.
      UWAGA: Peltier umieszcza się bezpośrednio na szkiełku, gdzie larwy mają dostarczać bodźce temperaturowe.
    6. W oprogramowaniu konfokalnym skup się na interesujących nas komórkach fluorescencyjnych. Dostosuj moc lasera, aby uniknąć przesycenia. Ustaw pierwszą i ostatnią pozycję plasterka w ustawieniu z-stack.
      UWAGA: Przed nagrywaniem użyj najniższej możliwej mocy lasera, aby zapobiec fotowybielaniu.
    7. Rozpocznij skanowanie z-stack i rejestrację temperatury w tym samym czasie.
    8. Kontroluj zasilanie, które zasila Peltiera, aby zmienić temperaturę powierzchni Peltiera. Włącz zasilanie, aby obniżyć temperaturę i wyłącz je, aby zwiększyć temperaturę.
    9. Zatrzymaj skanowanie stosu z i rejestrowanie temperatury.

2. Analiza danych obrazowania 3D wapnia

  1. Wyeksportuj dane obrazowania wapnia do plików TIFF i zapisz je w folderze o tej samej nazwie, co podstawowa nazwa plików TIFF w środku.
    UWAGA: Nazwa pliku nie może zawierać żadnych przecinków.
    1. Aby wyeksportować dane obrazowania wapnia z ZEN (black edition), należy użyć następujących parametrów: typ pliku, TIFF; kompresja, LZW; kanały, 2; Pozycja Z, wszystko; czas, wszystko; faza, 1; region, pełny.
  2. instalacja
    1. Pobierz TACI-Calcium_Imaging.jar z Github (https://github.com/niflylab/TACI_CalciumImagingPlugin/releases).
    2. Zainstaluj wtyczkę na FIDŻI, klikając Wtyczki na pasku menu, a następnie klikając Zainstaluj w menu rozwijanym (Wtyczki | zainstalować). Następnie uruchom ponownie FIJI.
      UWAGA: NIE używaj wtyczek | Zainstaluj wtyczkę.
    3. Uruchom wtyczkę, klikając Wtyczki, a następnie wybierając TACI-Calcium Imaging (Wtyczki | TACI-Obrazowanie wapnia).
  3. Użyj funkcji RENAME, aby przekonwertować nazwy plików TIFF na wymaganą strukturę.
    UWAGA: Narzędzie używa filename_h#t#z#c#.tif jako domyślnej struktury (h# i c# są opcjonalne; #: dodatnia liczba całkowita). Jeśli nazwy plików obrazów nie znajdują się w strukturze domyślnej, należy wykonać funkcję RENAME.
    1. Wybierz folder, w którym należy zmienić nazwę obrazów TIFF, klikając przycisk Przeglądaj foldery.
    2. Wypełnij informacje o parametrach. Na liście znajduje się pięć parametrów, w tym nazwa pliku, faza, maksymalna pozycja T, maksymalna pozycja Z i kanał. Każdy parametr ma trzy wartości: Previous Text, Parameter Value i Order.
      UWAGA: W informacjach rozróżniana jest wielkość liter. Jeśli nazwy plików obrazów zawierają frazę przed parametrem, wypełnij frazę jako tekst poprzedzający odpowiedniego parametru. Jeśli nazwy plików obrazów zawierają frazę po wszystkich parametrach, wypełnij frazę jako tekst posta.
      1. Upewnij się, że wprowadziłeś nazwę pliku, maksymalną pozycję T i maksymalną pozycję Z oraz że wartości parametrów maksymalnej pozycji T i maksymalnej pozycji Z zawierają wszystkie cyfry.
      2. Poczekaj, aż nazwa pliku zostanie automatycznie wypełniona przy użyciu nazwy folderu.
      3. Jeśli nazwy plików TIFF nie zawierają fazy i kanału, pozostaw odpowiednią wartość parametru pustą i wybierz opcję Na w kolejności.
    3. Kliknij przycisk Zmień nazwę, aby utworzyć folder o tej samej nazwie i _r. Zwróć uwagę, że nazwy plików TIFF w folderze zostały zrestrukturyzowane tak, aby były zgodne z funkcją ORGANIZUJ.
      UWAGA: _r została dodana do nazw plików obrazów TIFF.
  4. Użyj funkcji ORGANIZUJ, aby zapisać obrazy TIFF z tej samej pozycji z w jednym folderze.
    UWAGA: Nazwa folderu musi być taka sama jak nazwa podstawowa plików TIFF w środku i NIE może zawierać żadnych przecinków.
    1. Wybierz folder, w którym obrazy TIFF mają zostać uporządkowane, klikając przycisk Przeglądaj foldery.
    2. Jeśli plik CSV z parametrami (param.csv) istnieje, poczekaj, aż wartości parametrów zostaną wypełnione automatycznie.
      UWAGA: Plik param.csv ma wymagany format. Parametry, w tym nazwa pliku, faza, position_t, position_z, kanał i is_gray, należy wypełnić w wierszu 1 od lewej do prawej, zaczynając od kolumny A. Odpowiednie wartości dla każdego parametru należy wypełnić w wierszu 2.
    3. Jeśli plik CSV z parametrami (param.csv) nie istnieje, należy ręcznie wypełnić wartości parametrów. Upewnij się, że wartości parametrów Faza i Kanał zawierają litery, podczas gdy wartości parametrów Pozycja T i Pozycja Z powinny być największymi liczbami pozycji t i z. Jeśli nazwy plików obrazów nie zawierają fazy lub kanału, wprowadź Na.
    4. W razie potrzeby twórz obrazy TIFF w skali szarości. Pozostaw pole wyboru Czy obrazy są szare? niezaznaczone, aby obrazy były skalowane szaro.
    5. Kliknij przycisk Organizuj, aby utworzyć folder o tej samej nazwie i _gray_stacks oraz wygenerować foldery o tej samej nazwie i _# (#: pozycjach z) w folderze. Zwróć uwagę, że pliki TIFF są posortowane w odpowiednich folderach według pozycji Z i że generowany jest plik o nazwie param.csv, w którym można znaleźć parametry i ich wartości.
  5. Użyj TrackMate na FIDŻI, aby wyodrębnić intensywność fluorescencji interesujących komórek z każdej pozycji z.
    UWAGA: Ten krok można również wykonać za pomocą innego oprogramowania do obrazowania.
    1. Otwórz obrazy TIFF w folderze z pozycją Z według FIDŻI.
    2. Uruchom TrackMate, klikając Wtyczki | Śledzenie | TrackMate i w razie potrzeby dostosuj następujące parametry.
      1. Użyj detektorów DoG lub LoG.
      2. Zmień średnicę plamki, próg i filtr mediany. Dostosuj średnicę plamki tak, aby była zbliżona do średnicy komórek. Jeśli komórki są owalne, dostosuj średnicę plamki tak, aby była podobna do osi mniejszej.
        UWAGA: Zwiększenie progu pomaga uniknąć odbierania szumów tła jako sygnałów bez wpływu na intensywność sygnału (rysunek uzupełniający 1). Jednak zwiększenie progu może spowodować pominięcie prawdziwych sygnałów (rysunek uzupełniający 1). Jeśli sygnały są silne, użyj filtra mediany, aby zmniejszyć szum soli i pieprzu.
      3. Ustaw filtry, aby usunąć niektóre, jeśli nie wszystkie, nieistotne sygnały. Filtry X i Y są filtrami przestrzennymi. Użyj filtrów X i Y, aby usunąć nieistotne sygnały, które są odległe od rzeczywistych sygnałów.
        UWAGA: Gdy filtry są ustawione na jednym obrazie, ważne jest, aby sprawdzić wszystkie inne obrazy, aby upewnić się, że rzeczywiste sygnały nie zostały usunięte.
      4. Ustawia maksymalną odległość łączenia, maksymalną odległość zamykania odstępów i maksymalny odstęp zamykania odstępów. Ustaw maksymalną odległość łączenia i maksymalną odległość zamykania przerwy na 3x-5x średnicę plamy, zwłaszcza gdy próbki poruszają się znacznie w czasie, aby zmniejszyć liczbę ścieżek. Ustaw maksymalny odstęp między ramkami zamykający się na liczbę obrazów w stosie.
      5. Eksportuj intensywności fluorescencji obszarów zainteresowania (ROI) do pliku CSV. Jeśli używana jest stara wersja TrackMate, wybierz opcję Eksportuj wszystkie statystyki spotów w oknie Wybierz akcję. Jeśli wersja TrackMate to 7.6.1 lub nowsza, wybierz opcję Spots (Miejsca) w oknie Display options (Opcje wyświetlania). Eksportuj lub zapisz jako pliki interaktywne do plików CSV.
        UWAGA: Oba pliki są interaktywne z oknem obrazu; podświetlenie ROI powoduje wyświetlenie odpowiadającego mu ROI w oknie obrazu. Pliki te zawierają średnie intensywności (MEAN_INTENSITY lub MEAN_INTENSITY_CH1) komórek będących przedmiotem zainteresowania w odpowiednich punktach czasowych (POSITION_T). Te same TRACK_IDs powinny reprezentować te same zwroty z inwestycji w różnych punktach czasowych. Jednak nie zawsze jest to prawdą i w razie potrzeby może być konieczne ręczne poprawienie. Jeśli TrackMate nie rozpoznaje ROI w niektórych punktach czasowych, te punkty czasowe nie są wyświetlane.
  6. Wyodrębnij intensywność fluorescencji tła i utwórz plik Background_list.csv.
    UWAGA: W tym badaniu intensywność tła dla każdej pozycji z oszacowano przy użyciu średniej wartości od trzech do pięciu sąsiednich plam tej samej wielkości, które nie zawierały sygnałów fluorescencyjnych i pochodziły z różnych punktów czasowych.
    1. Plik Background_list.csv ma wymagany format: każda kolumna zawiera informacje o jednym neuronie, zaczynając od Neuron 0. Wypełnij numery neuronów, takie jak Neuron 0, w wierszu 1. Następnie podaj intensywność tła dla każdej analizowanej pozycji Z - jeśli pięć pozycji Z jest analizowanych dla Neuron 0, wypełnij pięć wartości intensywności tła poniżej Neuron 0,
      UWAGA: Plik Background_list.csv jest wymagany dla funkcji TACI EXTRACT. Jeśli tło jest pomijalne, należy podać Background_list.csv z zerową intensywnością tła każdego neuronu.
  7. Użyj funkcji EXTRACT, aby określić maksymalne intensywności fluorescencji w każdej pozycji t i obliczyć ΔF/F0, jak pokazano w równaniu (1).
    figure-protocol-1 (1)
    1. Utwórz folder i nazwij go za pomocą numeru neuronu, zaczynając od Neuron 0. Zapisz pliki CSV zawierające informacje o fluorescencji odpowiedniego neuronu w folderze. Każdy plik CSV zawiera informacje o jednej pozycji z, więc liczba plików CSV jest równa liczbie przeanalizowanych pozycji z. Nazwij pliki CSV jako Mean_Intensity#.csv (# oznacza pozycję z), a każdy plik CSV będzie zawierał co najmniej dwie kolumny: POSITION_T i MEAN_INTENSITY lub MEAN_INTENSITY_CH1.
      UWAGA: Utwórz folder dla każdej interesującej Cię komórki.
    2. Zapisz plik Background_list.csv i foldery utworzone w kroku 2.7.1 w jednym folderze. Wybierz ten folder, klikając Przeglądaj pliki.
      UWAGA: Liczba wartości tła w pliku Background_list.csv musi być zgodna z liczbą plików Mean_Intensity#.csv dla każdego neuronu.
    3. Plik tła jest wypełniany automatycznie. Wypełnij największą liczbę pozycji t dla liczby pozycji t.
    4. Kliknij przycisk Wyodrębnij, aby utworzyć folder wyników, zawierający pliki CSV i wykresy dla każdego neuronu. Pliki CSV zawierają informacje o maksymalnej intensywności fluorescencji i ΔF/F0 dla każdej pozycji t. Wykresy są wykresami liniowymi ΔF/F0 nad pozycjami t.
      UWAGA: W tym badaniu ΔF/F0 obliczono za pomocą równania (1). Pierwsza wartość każdej pozycji z została użyta jako F0. Jeśli to F0 nie jest odpowiednie20, wtyczka dostarcza pliki zawierające surowe dane dla każdego neuronu w folderze python_files.
  8. Użyj funkcji MERGE, aby uśrednić ΔF/F0 każdego neuronu, obliczyć SEM i wykreślić średnią ΔF/F0 na pozycjach t.
    1. Wybierz folder wyników utworzony przez funkcję EXTRACT, klikając Przeglądaj pliki.
    2. Wypełnij liczbę pozycji T największą liczbą pozycji t.
    3. Kliknij przycisk Scal, aby utworzyć folder merged_data, zawierający plik merged_data.csv i Average_dF_F0.png wykres. Plik CSV zawiera informacje o średniej i SEM ΔF/F0 dla każdej pozycji t. Wykres jest wykresem liniowym średniej ΔF/F0 nad pozycjami t.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przebieg pracy w analizie obrazowania 3D wapnia
W tym badaniu opracowaliśmy nową wtyczkę ImageJ, TACI, i opisaliśmy przepływ pracy do śledzenia dryfu z i analizy obrazowania 3D wapnia, które wskazuje odpowiedzi poszczególnych komórek pojawiających się w wielu pozycjach z (Rysunek 1). To narzędzie ma cztery funkcje: RENAME, ORGANIZE, EXTRACT i MERGE. Po pierwsze, jeśli nazwy obrazów nie są zgodne z funkcją ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu opracowano nową wtyczkę ImageJ, TACI, i opisano przepływ pracy analizujący obrazowanie 3D wapnia. Wiele obecnie dostępnych narzędzi koncentruje się na korekcji ruchu x/y, chociaż ruch na osi z również musi być wyraźnie zdiagnozowany lub skorygowany6. Podczas akwizycji obrazu w żywym organizmie ruch na osi Z jest nieunikniony nawet wtedy, gdy organizm jest unieruchomiony, a niektóre bodźce, takie jak zmiana temperatury, często powodują znaczny dryft z. Zwiększenie wysokości stosów z p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A Zeiss LSM 880 w Centrum Obrazowania Fralin został użyty do zebrania danych obrazowania wapnia. Dziękujemy dr Michelle L Olsen i Yuhang Pan za ich pomoc w pracy z oprogramowaniem IMARIS. Dziękujemy dr Lenwoodowi S. Heathowi za konstruktywne komentarze do manuskryptu oraz Stevenowi Giavasisowi za komentarze do pliku README na GitHubie. Praca ta była wspierana przez NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) i NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) do L.N. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ani przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
igła do napełnianiaBD303129
Dwuwodny chlorek wapniaFisher Scientific 10035-04-8Składnik pokarmu dla much
Dwutlenek węglaAirgasUN1013Rozmiar 200 Stalowy cylinder wysokociśnieniowy
Zestaw bełkotki CO2Genesee59-180
LSM880Zeiss4109002107876000Odwrócony Axio Observer Z1, wyposażony w 5 laserów, 2 standardowe detektory PMT, 32-kanałowe detektory GaAsP, detektor Airyscan i Definite Ostrość.2.
Oprogramowanie DAQamiPomiar Obliczenia
DekstrozaGenesee62-113Składnik pokarmu dla much
Drosophila AgarGenesee66-111Składnik pokarmu dla much
EtanolDecon Labs, Inc.64-17-5Składnik pokarmu dla much
Linia muchowa: Ir21a-Gal4Dr. Paul Garrity labMiły prezent
Linia muchowa: Ir21a-Gal80Dr. Lina Ni lab
Linia muchowa: Ir68a-Gal4Dr. Aravinthan DT Samuel labMiły prezent
Linia lotnicza: Ir93a-Gal4Dr. Paul Garrity labMiły prezent
Linia muchowa: UAS-GCaMP6Bloomington Drosophila Stock Center42750
FlypadGenesee59-114
Uniwersalny regulator z kutego mosiądzuGentecG152
Gibco PBS pH 7,4 (1x)Thermo Fisher Scientific10010-031
Zielona rurka DrosophilaGenesee59-124
Związek przenoszący ciepłoMG Chemicals860-60G
RadiatorDigi-Key ElectronicsATS2193-NDZmień rozmiar na 12,9 x 5,5 cm
OświetlaczAmScopeLED-6W
Nieaktywne suche drożdżeGenesee62-108Inkubator do składników pokarmu dla much
PervicalDR-41VLŚwiatło: ciemny cykl: 12h:12h; Temperatura: 25 & Deg; C; wilgotność: 40-50% wilgotności względnej.
Methyl-4-hydroxybenzoesanThermo Scientific126965000Pokarm dla much ingrediete
Szkło z mikro pokrywąVWR  48382-12622 x 40 mm
Fisher Scientific 12-544-225 x 75 x 1,0 mm
Lakier do paznokciKleancolor
Wąskie fiolki DrosophilaGenesee32-113RL
Cel pracy Zeiss420852-9871-000LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Corr DIC M27
Moduł chłodzący PeltieraTE TechnologyTE-127-1.0-0,830 x 30 mm
WtyczkiGenesee49-102
SpecjaliściobwodówCSI1802Xliniowy zasilacz laboratoryjny 10 V DC 2.0 Amp
Princeton Artist Brush NepturePrinceton Artist Brush Co.Seria 4750, rozmiar 2
Tetrahydrat L-winianu sodowo-potasowegoThermo Scientific033241-36Składnik pokarmu na muchy
Wkładka sceniczna Wienecke i Sinske432339-9030-000
Mikroskop stereoskopowyOlympusSZ61Każdy mikroskop stereoskopowy działa
T-FittingGenesee59-123
Urządzenie do akwizycji danych termoparyPomiar ObliczeniaUSB-2001-TCJednokanałowa
mikrosonda termoparowaPhysitempIT-24P 
Żółta mąka kukurydzianaGenesee62-101Składnik pokarmu dla much
Etap piezoelektryczny osi ZWienecke i Sinske432339-9000-000
Mikroskop konfokalny Szkiełka mikroskopowe od zasilania

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  2. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  3. Zhang, Y., et al. jGCaMP8 fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
  4. Robbins, M., Christensen, C. N., Kaminski, C. F., Zlatic, M. Calcium imaging analysis - How far have we come. F1000Research. 10, 258(2021).
  5. Oh, J., Lee, C., Kaang, B. K. Imaging and analysis of genetically encoded calcium indicators linking neural circuits and behaviors. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 23 (4), 237-249 (2019).
  6. Stringer, C., Pachitariu, M. Computational processing of neural recordings from calcium imaging data. Current Opinion in Neurobiology. 55, 22-31 (2019).
  7. Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
  8. Nguyen, J. P., Linder, A. N., Plummer, G. S., Shaevitz, J. W., Leifer, A. M. Automatically tracking neurons in a moving and deforming brain. PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005517(2017).
  9. Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. EMC2: A versatile algorithm for robust tracking of calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. bioRxiv. , (2021).
  10. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173(2019).
  11. Delestro, F., et al. In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata. Scientific Reports. 10, 7153(2020).
  12. Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25(2020).
  13. Eglen, S. J., et al. Toward standard practices for sharing computer code and programs in neuroscience. Nature Neuroscience. 20 (6), 770-773 (2017).
  14. Pachitariu, M., et al. Suite2p: Beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. bioRxiv. , (2017).
  15. Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
  16. Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. Tracking calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. PLoS Computational Biology. 17 (10), 1009432(2021).
  17. Kolar, K., Dondorp, D., Zwiggelaar, J. C., Høyer, J., Chatzigeorgiou, M. Mesmerize is a dynamically adaptable user-friendly analysis platform for 2D and 3D calcium imaging data. Nature Communications. 12, 6569(2021).
  18. Moein, M., et al. CaSiAn: A Calcium Signaling Analyzer tool. Bioinformatics. 34 (17), 3052-3054 (2018).
  19. Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728(2018).
  20. Neugornet, A., O'Donovan, B., Ortinski, P. I. Comparative effects of event detection methods on the analysis and interpretation of Ca(2+) imaging data. Frontiers in Neuroscience. 15, 620869(2021).
  21. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  22. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Fazeli, E., et al. Automated cell tracking using StarDist and TrackMate. F1000Research. 9, 1279(2020).
  24. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  25. Ni, L., et al. The ionotropic receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254(2016).
  26. Omelchenko, A. A., et al. Cool and warm ionotropic receptors control multiple thermotaxes in Drosophila larvae. Frontiers in Molecular Neuroscience. , (2022).
  27. Sanchez-Alcaniz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nature Communications. 9 (1), 4252(2018).
  28. Hernandez-Nunez, L., et al. Synchronous and opponent thermosensors use flexible cross-inhibition to orchestrate thermal homeostasis. Science Advances. 7 (35), (2021).
  29. Klein, M., et al. Sensory determinants of behavioral dynamics in Drosophila thermotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (2), 220-229 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tr jwymiarowe obrazowanie wapniaruch w osi Zekstrakcja intensywno ci fluorescencjianaliza TrackMateneurony larw muchymikroskopia konfokalnaprzetwarzanie obraz w TIFFotwarte oprogramowanie do obrazowania

Powiązane artykuły