Artykuł metodologiczny

Pomiar średnicy naczynia siatkówki na podstawie obrazów angiografii fluorescencyjnej myszy

DOI:

10.3791/64964

⸱

19 maja 2023

 ,  , 
1Department of Physiology, Biomedical Center, Faculty of Medicine, University of Iceland, 2Department of Ophthalmology, National University Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Unaczynienie siatkówki myszy jest szczególnie interesujące w zrozumieniu mechanizmów powstawania wzorców naczyniowych. Protokół ten automatycznie mierzy średnicę naczyń siatkówki myszy na podstawie obrazów dna oka angiografii fluorescencyjnej w stałej odległości od tarczy nerwu wzrokowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ważne jest zbadanie rozwoju unaczynienia siatkówki w retinopatiach, w których nieprawidłowy wzrost naczyń może ostatecznie doprowadzić do utraty wzroku. Mutacje w genie czynnika transkrypcyjnego związanego z mikroftalmią (Mitf) wskazują na hipopigmentację, mikroftalmię, zwyrodnienie siatkówki, a w niektórych przypadkach ślepotę. Obrazowanie in vivo siatkówki myszy za pomocą środków nieinwazyjnych jest niezbędne do badań okulistycznych. Jednak ze względu na niewielkie rozmiary obrazowanie dna oka myszy jest trudne i może wymagać specjalistycznych narzędzi, konserwacji i szkolenia. W tym badaniu opracowaliśmy unikalne oprogramowanie umożliwiające analizę średnicy naczynia siatkówki u myszy za pomocą zautomatyzowanego programu napisanego w MATLAB. Zdjęcia dna oka uzyskano za pomocą komercyjnego systemu kamer do badania dna oka po dootrzewnowym wstrzyknięciu roztworu soli fluoresceiny. Obrazy zostały zmienione w celu zwiększenia kontrastu, a program MATLAB pozwolił na automatyczne wyodrębnienie średniej średnicy naczynia w określonej odległości od tarczy optycznej. Zmiany naczyniowe badano u myszy typu dzikiego i myszy z różnymi mutacjami w genie Mitf, analizując średnicę naczynia siatkówki. Opracowany tutaj specjalnie napisany program MATLAB jest praktyczny, łatwy w użyciu i pozwala naukowcom wygodnie i niezawodnie analizować średnią średnicę i średnią średnicę całkowitą, a także liczbę naczyń z unaczynienia siatkówki myszy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prawdopodobnie najbardziej zbadanym łożyskiem naczyniowym w ciele jest unaczynienie siatkówki. Dzięki stale rosnącemu zaawansowaniu technicznemu, unaczynienie siatkówki jest łatwo fotografowane u żywych pacjentów i wykorzystywane w wielu dziedzinach badawczych1. Dodatkowo, unaczynienie siatkówki myszy podczas rozwoju okazało się bardzo skutecznym systemem modelowym do badań nad podstawową biologią wzrostu naczyń krwionośnych. Podstawowym celem unaczynienia siatkówki jest zapewnienie wewnętrznej części siatkówki wsparcia metabolicznego poprzez laminarną siatkę kapilarną, która przenika tkankę nerwową2. Niemniej jednak stan siatkówki, a w konsekwencji każda dysfunkcja lub atrofia, może mieć znaczący wpływ zarówno na rozwidlenia naczyń siatkówki, jak i na średnicę tętnic, wykazując wzajemne oddziaływanie między komórkami siatkówki a unaczynieniem3,4. Wiadomo, że liczne choroby oczu, w tym retinopatia wcześniaków (ROP), retinopatia cukrzycowa (DR), zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD), jaskra i neowaskularyzacja rogówki, mogą powodować nieprawidłową angiogenezę oka5. W przypadku unaczynienia siatkówki, mysie modele zwyrodnienia siatkówki często wykazują zmiany porównywalne do tych obserwowanych w chorobach naczyniowych u ludzi6,7. Rodzina supergenu Myc podstawowych czynników transkrypcyjnych helisa-pętla-helisa-zamek błyskawiczny obejmuje gen czynnika transkrypcyjnego związanego z mikroftalmią (Mitf) ulegający ekspresji w nabłonku barwnikowym siatkówki (RPE)8,9,10.

Wykazano, że liczne narządy, w tym oko, ucho, układ odpornościowy, ośrodkowy układ nerwowy, nerki, kości i skóra, są regulowane przez Mitf9,11,12,13. Odkryliśmy, że struktura i funkcja RPE są zaburzone u myszy z różnymi mutacjami w genie Mitf, co skutkuje niektórymi przypadkami zwyrodnienia siatkówki i ostatecznie utratą wzroku10. Ostatnio wykazano, że liczba naczyń i średnica naczyń różnią się znacznie między myszami z mutacją Mitf a myszami typu dzikiego14. Naukowcy i lekarze mogą teraz precyzyjnie określić ilościowo unaczynienie siatkówki in vivo dzięki rozwojowi obrazowania siatkówki. Od 1800 roku naukowcy i lekarze korzystali z korzyści płynących z wizualizacji unaczynienia siatkówki, a angiografia fluoresceinowa (FA) wykazała zarówno przepływ krwi w siatkówce, jak i degradację bariery krew-siatkówka15.

Ten artykuł pokazuje, jak analizować średnicę naczynia siatkówkowego na podstawie obrazów FA myszy za pomocą niestandardowego kodu w oprogramowaniu MATLAB.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Islandzki Urząd ds. Żywności i Weterynarii (licencja MAST nr 2108002). Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. W tym badaniu wykorzystano samce i samice myszy C57BL/6J i Mitfmi-vga9/+. Myszy C57BL/6J (n = 7) użyto jako kontroli. Dzikie typy zostały pozyskane komercyjnie (patrz tabela materiałów), ale wszystkie zmutowane myszy (n = 7) zostały wyhodowane i wychowane w obiektach dla zwierząt w Centrum Biomedycznym na Uniwersytecie Islandzkim. W niniejszej pracy wykorzystano zwierzęta w wieku 3 miesięcy; Protokół dotyczy jednak nawet zwierząt w wieku 1 miesiąca i starszych.

1. Przygotowanie eksperymentalne

  1. Przygotuj mieszaninę znieczulającą. Pobrać jedną ampułkę z 2 ml roztworu podstawowego ketaminy (25 mg/ml) i 250 μl roztworu podstawowego ksylazyny (2%) w celu przygotowania roztworu roboczego mieszaniny ketaminy/ksylazyny (25 mg/ml ketaminy i 20 mg/ml ksylazyny) (patrz tabela materiałów).
  2. Znieczulić mysz za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia mieszaniny ketaminy i ksylazyny, z objętością płynu czterokrotnie większą od masy ciała myszy; na przykład mysz o wadze 20 g potrzebuje 35 μl roztworu roboczego ksylazyna/ketamina, aby uzyskać roboczą dawkę mieszaniny ksylazyny (4 mg/kg masy ciała) i ketaminy (40 mg/kg masy ciała).
  3. Natychmiast po znieczuleniu należy rozszerzyć źrenice za pomocą kropli zawierającej 10% chlorowodorek fenylefryny i 1% tropikamidu.
  4. Poczekaj, aż zwierzę zostanie w pełni znieczulone, a jego źrenice zostaną szeroko rozszerzone.
  5. Przygotuj roztwór soli fluoresceiny. Dodać 9 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; 1x) do 1 ml roztworu fluoresceiny (stężenie podstawowe 100 mg/mL) (patrz tabela materiałów). Końcowe stężenie roztworu roboczego wynosi 10 mg/ml.

2. Obrazowanie in vivo naczyń siatkówki za pomocą systemu obrazowania siatkówki u gryzoni

  1. Roztwór roboczy fluoresceiny podawać dootrzewnowo (5 μl/g masy ciała) znieczulonemu zwierzęciu.
  2. Nanieś kroplę 2% żelu metylocelulozowego na powierzchnię rogówki, a następnie umieść zwierzę na stoliku ustawiającym system obrazowania (patrz tabela materiałów).
  3. Ustaw soczewkę kamery do obrazowania dna siatkówki tak, aby bezpośrednio i delikatnie dotykała rogówki myszy. Aby umieścić głowę nerwu wzrokowego w środku pola widzenia, nieznacznie wyreguluj ustawienie.
  4. Przełącz się na zielony kanał fluorescencyjny w aparacie do badania dna oka.
  5. Skoncentruj się na naczyniach siatkówki, aby zrobić zdjęcia.
  6. Aby znaleźć idealny punkt czasowy, zrób kilka zdjęć w 1, 3, 5 i 10 minucie (ale nie dłużej niż 10 minut) po wstrzyknięciu fluoresceiny.
    UWAGA: Zabieg FA musi zostać zakończony w ciągu 10 minut, ponieważ po tym czasie fluoresceina może stać się zbyt rozproszona, a naczynia staną się niewykrywalne.
  7. Po zakończeniu obrazowania, gdy mysz jest jeszcze znieczulona, należy ją poddać eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.

3. Analiza średnicy naczynia siatkówkowego

  1. Otwórz program MATLAB (patrz Spis materiałów).
  2. Pobierz i zapisz kod "fundusDiameter.m" (patrz Dodatkowy plik kodowania 1, Uzupełniający plik kodowania 2 i Uzupełniający plik kodowania 3).
  3. Otwórz folder, w którym został zapisany kod. Przeciągnij kod i upuść go na bieżący folder w programie MATLAB.
  4. Przeciągnij i upuść obraz FFA (obraz angiografii fluorescencji dna oka) lub obrazy, które chcesz przeanalizować w bieżącym folderze w MATLAB.
  5. Naciśnij narzędzie Uruchom na pasku narzędzi MATLAB.
  6. Pojawi się wyskakujące okienko. Wpisz nazwę pliku interesującego Cię obrazu w polu Wprowadź nazwę pliku i naciśnij OK.
    UWAGA: Nie zmieniaj ani nie modyfikuj pozostałych parametrów.
  7. Wybierz środek tarczy nerwu wzrokowego, a następnie wybierz krawędź tarczy nerwu wzrokowego. Oprogramowanie oblicza teraz intensywność pikseli na obrazach dna oka myszy w okręgu o promieniu dwukrotnie większym niż promień tarczy optycznej, zgodnie z ruchem wskazówek zegara od środka dysku optycznego (Rysunek 1).
  8. Następnie upewnij się, że oprogramowanie wykreśla średnią średnicę naczynia (w pikselach) każdego naczynia w dnie oka w funkcji numeru naczynia (Rysunek 2).
  9. Następnie upewnij się, że oprogramowanie przesyła dane pomiarowe dla każdego zbiornika do dokumentu Excel, w którym obliczana jest średnia, mediana i odchylenie standardowe tych wartości (Tabela 1 i Tabela 2).
  10. Przenieś wartości z tabeli wyników do programu arkusza kalkulacyjnego, zaznaczając wszystkie wartości w tabeli. Wklej wartości do arkusza kalkulacyjnego.
  11. Narysuj wykresy i przeprowadź analizę statystyczną, korzystając z danych wklejonych do wybranego programu arkusza kalkulacyjnego (patrz Tabela materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 pokazuje proces używany do analizy unaczynienia siatkówki, który jest stosowany do obrazów FFA myszy od wszystkich badanych myszy. Promień, który jest dwa razy większy niż tarcza nerwu wzrokowego, służy do pomiaru intensywności pikseli w kierunku kołowym, zgodnym z ruchem wskazówek zegara od środka tarczy nerwu wzrokowego. Oznacza piksele punktem początkowym lub końcowym, gdy natkną się na punkty odpowiednio powyżej i poniżej progu określonego przez użytkownika. Powtarza się to 30 ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy artykuł jest pierwszym, w którym przedstawiono metodę analizy średnicy naczynia siatkówki i unaczynienia siatkówki na podstawie obrazów FA myszy. Ponieważ do uchwycenia obrazów naczyń krwionośnych siatkówki wykorzystano tylko obrazowanie dna oka, metoda ta ma kilka wad, z których jedną jest to, że można wywnioskować zmiany tylko w powierzchownych warstwach unaczynienia siatkówki u myszy badanych w tym badaniu; Jakiekolwiek różnice w głębszych warstwach nie są jeszcze znane.

Zaprezen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie istnieją konkurencyjne interesy.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta grantem na stypendium podoktoranckie z Islandzkiego Funduszu Badawczego (217796-052) (A.G.L.) oraz Funduszu Pamięci Helga Jónsdóttir i Sigurlidi Kristjánsson (A.G.L i T.E.). Autorzy dziękują prof. Eiríkurowi Steingrímssonowi za udostępnienie myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1% Tropicamid (Mydriacyl)Alcon Inc LaboratoriesŚrodek przeciwpowodziowy
2% MethocelOmniVision Eye CareŻel hydroksypropylometylocelulozowy
C57BL/6JJackson Laboratory000664Myszy typu dzikiego
Excel dla Microsoft 365Pakiet oprogramowaniaMicrosoft Inc
Sólsodowa fluoresceinySigma-Aldrich28803-100GAngiografia fluorescencyjna
Matlab 8.0The MathWorks, Inc.Pakiet oprogramowania
Micron IV kamera do dna oka gryzoniPhoenix-Micron40-2200Fotografia dna oka
Fenylefryna 10% w/vBausch & LombŚrodek mydriatyczny
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami - 100 tabletekGibco18912-014Rozcieńczenie
Sigmaplot 13Jandel Scientific SoftwarePakiet oprogramowania
S-Ketamina, 25 mg / mlPfizer Inc.PAA104470Anestezjologia IP

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheung, C. Y., Ikram, M. K., Chen, C., Wong, T. Y. Imaging retina to study dementia and stroke. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 89-107 (2017).
  2. Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
  3. Ma, Y., et al. Quantitative analysis of retinal vessel attenuation in eyes with retinitis pigmentosa. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 4306-4314 (2012).
  4. Eysteinsson, T., Hardarson, S. H., Bragason, D., Stefansson, E. Retinal vessel oxygen saturation and vessel diameter in retinitis pigmentosa. Acta Ophthalmologica. 92 (5), 449-453 (2014).
  5. Al-Latayfeh, M., Silva, P. S., Sun, J. K., Aiello, L. P. Antiangiogenic therapy for ischemic retinopathies. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (6), 006411(2012).
  6. Wang, S., Villegas-Perez, M. P., Vidal-Sanz, M., Lund, R. D. Progressive optic axon dystrophy and vacuslar changes in rd mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (2), 537-545 (2000).
  7. Liu, H., et al. Photoreceptor cells influence retinal vascular degeneration in mouse models of retinal degeneration and diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4272-4281 (2016).
  8. Steingrimsson, E., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Melanocytes and the microphthalmia transcription factor network. Annual Review of Genetics. 38, 365-411 (2004).
  9. Arnheiter, H. The discovery of the microphthalmia locus and its gene. Mitf. Pigment Cell & Melanoma Research. 23 (6), 729-735 (2010).
  10. Garcia-Llorca, A., Aspelund, S. G., Ogmundsdottir, M. H., Steingrimsson, E., Eysteinsson, T. The microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) gene and its role in regulating eye function. Scientific Reports. 9 (1), 15386(2019).
  11. Bharti, K., Liu, W., Csermely, T., Bertuzzi, S., Arnheiter, H. Alternative promoter use in eye development: the complex role and regulation of the transcription factor MITF. Development. 135 (6), 1169-1178 (2008).
  12. Lu, S. Y., Li, M., Lin, Y. L. Mitf induction by RANKL is critical for osteoclastogenesis. Molecular Biology of the Cell. 21 (10), 1763-1771 (2010).
  13. Pillaiyar, T., Manickam, M., Jung, S. H. Recent development of signaling pathways inhibitors of melanogenesis. Cellular Signalling. 40, 99-115 (2017).
  14. Danielsson, S. B., Garcia-Llorca, A., Reynisson, H., Eysteinsson, T. Mouse microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) mutations affect the structure of the retinal vasculature. Acta Ophthalmologica. 100 (8), 911-918 (2022).
  15. Burns, S. A., Elsner, A. E., Gast, T. J. Imaging the retinal vasculature. Annual Review of Vision Science. 7, 129-153 (2021).
  16. Wei, W., et al. Automated vessel diameter quantification and vessel tracing for OCT angiography. Journal of Biophotonics. 13 (12), e202000248(2020).
  17. Salas, M., et al. Compact akinetic swept source optical coherence tomography angiography at 1060 nm supporting a wide field of view and adaptive optics imaging modes of the posterior eye. Biomedical Optics Express. 9 (4), 1871-1892 (2018).
  18. Albanna, W., et al. Non-invasive evaluation of neurovascular coupling in the murine retina by dynamic retinal vessel analysis. PLoS One. 13 (10), e0204689(2018).
  19. Moult, E. M., et al. Evaluating anesthetic protocols for functional blood flow imaging in the rat eye. Journal of Biomedical Optics. 22 (1), 16005(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie dna okaunaczynienie siatk wkianaliza w programie MATLABwstrzykni cie fluoresceinytarcza nerwu wzrokowegomodele chor b siatk wkipomiar rednicy naczykamera do dna oka

Powiązane artykuły