Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zakrzepica tętnicza wywołana chlorkiem żelaza i pobieranie próbek do analizy pod mikroskopem elektronowym 3D

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64985

⸱

17 marca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biochemistry, University of Kentucky, 2Department of Physiology and Cell Biology, University of Arkansas for Medical Sciences, 3Laboratory of Cellular Imaging and Macromolecular Biophysics, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje, jak wykorzystać uraz za pośrednictwemFeCl 3 do wywołania zakrzepicy tętniczej, oraz jak zbierać i przygotowywać próbki uszkodzeń tętnic na różnych etapach zakrzepicy do analizy mikroskopowej elektronowej.

Streszczenie

Choroby układu krążenia są główną przyczyną śmiertelności i zachorowalności na całym świecie. Nieprawidłowa zakrzepica jest powszechną cechą stanów ogólnoustrojowych, takich jak cukrzyca i otyłość, oraz przewlekłych chorób zapalnych, takich jak miażdżyca, rak i choroby autoimmunologiczne. Po uszkodzeniu naczyniowym zwykle układ krzepnięcia, płytki krwi i śródbłonek działają w sposób zorganizowany, aby zapobiec krwawieniu, tworząc skrzep w miejscu urazu. Nieprawidłowości w tym procesie prowadzą albo do nadmiernego krwawienia, albo do niekontrolowanej zakrzepicy/niedostatecznej aktywności przeciwzakrzepowej, co przekłada się na niedrożność naczyń i jej następstwa. Model uszkodzenia tętnicy szyjnej indukowany przez FeCl3 jest cennym narzędziem w badaniu, w jaki sposób zakrzepica rozpoczyna się i postępuje in vivo. Model ten obejmuje uszkodzenie/denudację śródbłonka, a następnie tworzenie się skrzepów w uszkodzonym miejscu. Zapewnia bardzo czuły, ilościowy test do monitorowania uszkodzeń naczyń krwionośnych i tworzenia się skrzepów w odpowiedzi na różne stopnie uszkodzenia naczyń. Po zoptymalizowaniu, ta standardowa technika może być wykorzystana do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zakrzepicy, a także zmian ultrastrukturalnych w płytkach krwi w rosnącej skrzeplinie. Test ten jest również przydatny do badania skuteczności leków przeciwzakrzepowych i przeciwpłytkowych. W tym artykule wyjaśniono, jak inicjować i monitorować zakrzepicę tętniczą indukowaną FeCl3 oraz jak pobierać próbki do analizy za pomocą mikroskopii elektronowej.

Wprowadzenie

Zakrzepica to tworzenie się skrzepu krwi, który częściowo lub całkowicie blokuje naczynie krwionośne, utrudniając naturalny przepływ krwi. Prowadzi to do poważnych i śmiertelnych zdarzeń sercowo-naczyniowych, takich jak choroba niedokrwienna serca i udary. Choroby układu krążenia są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności oraz powodują co czwarty zgon na całym świecie1,2,3. Chociaż zakrzepica objawia się nieprawidłowym funkcjonowaniem układu naczyniowego, może być wynikiem podstawowej infekcji bakteryjnej lub wirusowej, zaburzenia immunologicznego, nowotworu złośliwego lub stanu metabolicznego. Przepływ krwi jest utrzymywany przez złożoną interakcję między różnymi składnikami układu naczyniowego, w tym komórkami śródbłonka, czerwonymi/białymi krwinkami, płytkami krwi i czynnikami krzepnięcia4. Po uszkodzeniu naczyniowym płytki krwi wchodzą w interakcję z białkami adhezyjnymi na macierzy podśródbłonkowej i uwalniają swoją ziarnistą zawartość, która rekrutuje więcej płytek krwi5. Jednocześnie aktywowana jest kaskada krzepnięcia, co prowadzi do tworzenia i odkładania się fibryny. Ostatecznie tworzy się skrzep zawierający płytki krwi i czerwone krwinki uwięzione w fibrynowej siatce6. Chociaż dostępne są leki przeciwpłytkowe i przeciwzakrzepowe w celu modulowania zakrzepicy, fałszywe krwawienie pozostaje poważnym problemem w przypadku tych terapii, wymagając precyzyjnego dostrojenia dawek i kombinacji tych leków. W związku z tym nadal istnieje pilna potrzeba odkrycia nowych leków przeciwzakrzepowych7.

Zakrzepica jest badana przy użyciu wielu metod do zadawania uszkodzeń naczyniowych: mechanicznych (podwiązanie naczyń), termicznych (uszkodzenie laserowe) i chemicznych (zastosowanie FeCl3/Rose Bengal). Charakter zakrzepicy różni się w zależności od lokalizacji (tętnicza lub żylna), metody lub rozległości urazu. Spośród wszystkich tych typów, uszkodzenie naczyniowe wywołane FeCl3 jest najczęściej stosowaną metodą. Zastosowano go u myszy, szczurów, królików, świnek morskich i psów8,9,10,11,12. Metoda jest stosunkowo prosta, łatwa w użyciu, a jeśli główne parametry są znormalizowane, jest czuła i powtarzalna w różnych układach naczyniowych (np. tętnicach [szyjnych i udowych], żyłach [szyjnych] i tętniczkach [krezkowych]) (tabela uzupełniająca 1).

Ten model może być również wykorzystany do lepszego zrozumienia mechaniki i morfologii powstawania skrzepów. Technika ta w wyjątkowy sposób ma tę zaletę, że zatrzymuje zakrzepicę w różnych punktach natężenia przepływu, aby zbadać pośrednie etapy procesu, zanim stanie się on okluzyjny. Ostatnie postępy w badaniach nad zakrzepicą wykorzystały ten model do zwrócenia uwagi na niefarmakologiczne metody trombolizy13 lub nieinwazyjne dostarczanie leków przeciwzakrzepowych i/lub fibrynolitycznych14,15. Kilka grup wykazało, że gdy błony płytkowe są pokryte tymi środkami terapeutycznymi, leki mogą być aktywowane po stymulacji termicznej w celu celowania w skrzepy16. Opisane tutaj techniki mogą być przydatne w takich badaniach, jak walidacja ich wyników na poziomie pojedynczej płytki krwi. W tym manuskrypcie Protokół 1 opisuje podstawową procedurę uszkodzenia naczyń krwionośnych za pośrednictwem FeCl3, podczas gdy Protokół 2 opisuje metodę pobierania i utrwalania próbki uszkodzenia naczyniowego do dalszej analizy za pomocą mikroskopii elektronowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie omawiane tutaj eksperymenty zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Kentucky.

UWAGA: Narzędzia chirurgiczne są wymienione w Rysunek 1 i Tabela materiałów. Użyto myszy C57BL/6J, w wieku 8-10 tygodni, męskie/żeńskie lub odpowiednie szczepy zmodyfikowane genetycznie (Knockout lub Knockin).

1. Uszkodzenie tętnicy szyjnej wywołane FeCl3

  1. Indukcja znieczulenia myszy
    1. Zważ mysz.
    2. Znieczulić mysz, wstrzykując dootrzewnowo roztwór tribromoetanolu (i.p.) 0,2 g/kg mu. Przed wstrzyknięciem należy upewnić się, że roztwór znieczulający ma temperaturę pokojową (RT). Taka dawka wystarcza na uspokojenie myszy przez około 1 godzinę.
    3. Sprawdź odruch u nogi, ściskając palec u nogi 5 minut po wstrzyknięciu, aby upewnić się, że mysz jest uspokojona. Jeśli mysz nie jest pod wpływem środków uspokajających, odciągnie palec u nogi. Jeśli tak się stanie, odczekaj 5 minut i sprawdź ponownie.
    4. Jeśli mysz nadal nie jest całkowicie uspokojona, należy podać 1/4 dawki początkowej i odczekać 5 minut.
    5. Przez cały czas trwania zabiegu należy okresowo monitorować płaszczyznę znieczulenia myszy za pomocą uszczypnięcia palca u nogi. Dodatkowo można również monitorować częstość oddechów i temperaturę ciała w celu utrzymania optymalnego znieczulenia.
  2. Unieruchamienie myszy
    1. Połóż mysz na poduszce grzewczej (37 °C) w pozycji leżącej na plecach i użyj taśmy klejącej, aby unieruchomić kończyny.
    2. Użyj nici chirurgicznej (0,1 mm), aby delikatnie pociągnąć górne przednie zęby myszy, aby przedłużyć obszar szyjki macicy/szyi. Jest to ważne dla lepszej wizualizacji obszaru operacyjnego i stabilności sondy Dopplera. Rozmiar nici nie jest ważny, ponieważ służy ona tylko do ciągnięcia przednich zębów zwierzęcia w celu przedłużenia szyi.
  3. cięcie
    1. Spryskaj obszar operacyjny 70% etanolem lub przetrzyj go wacikiem nasączonym alkoholem.
    2. Za pomocą bawełnianego wacika nałóż niewielką ilość kremu do depilacji na obszar operacyjny. Odczekaj 1-2 minuty, a następnie użyj mokrego ręcznika papierowego lub chusteczki do usunięcia kremu.
      UWAGA: Ten krok jest ważny dla czystego obszaru operacyjnego.
    3. Za pomocą nożyczek i kleszczy (Rysunek 1B11,1B13), wykonaj nacięcie linii środkowej od żuchwy do wcięcia nadmostkowego. Cofnij skórę, aby uzyskać lepszą wizualizację obszaru (Rysunek 2A).
  4. Ekspozycja tętnicy szyjnej
    1. Za pomocą kleszczy chirurgicznych i mikrokleszczy preparacyjnych tępo rozetnij nakładającą się powięź powierzchowną i usuń ją, aby odsłonić lewą tętnicę szyjną (Rysunek 1B12,1B13). Na tym etapie upewnij się, że nie używasz nożyczek, aby uniknąć uszkodzenia innych naczyń krwionośnych w tym obszarze.
    2. Usuń dodatkową tkankę otaczającą tętnicę szyjną. Unikaj nadmiernego rozwarstwiania otaczającej tkanki, ponieważ w tym obszarze znajduje się nerw błędny i tętnica kręgowa.
    3. Oddziel tętnicę szyjną od otaczającej tkanki, wycinając ją kleszczami chirurgicznymi i do wiązania szwów (Rysunek 1B12,1B15,2C). Upewnij się, że nie przedłużasz ani nie ciągniesz tętnicy, aby uniknąć mechanicznego uszkodzenia tętnicy lub otaczającego naczynia krwionośnego.
    4. Umieść kawałek plastiku pod tętnicą, aby zaznaczyć miejsce urazu (Rysunek 2D). Użyj kolorowego arkusza przezroczystości, aby ułatwić widzenie w polu operacyjnym.
  5. Umiejscowienie sondy przepływu
    1. Umieścić sondę przepływu transsonicznego Dopplera w roztworze soli fizjologicznej (0,9% NaCl wdH2O) na około 10 minut przed zabiegiem. Włóż drugi koniec sondy do nasadki w przepływomierzu, aby ułatwić odczyt przepływu. Podłącz przepływomierz do komputera.
      UWAGA: Pomiędzy operacjami sonda przepływu transsonicznego Dopplera powinna być w soli fizjologicznej. Upewnij się, że sonda jest wilgotna i czysta przez cały czas trwania procedury.
    2. Umieść ultradźwiękową sondę przepływu dopplerowskiego wokół tętnicy przed tworzywem sztucznym ( Rysunek 2D). Upewnij się, że obszar uchwytu naczynia sondy nie jest zbyt wysunięty (Rysunek 1C, czerwona strzałka).
      UWAGA: W razie potrzeby podeprzyj sondę gazikami (Rysunek 1B1), aby uzyskać odpowiednią wysokość sondy, ułatwiając optymalną pozycję do odczytu.
    3. Jeśli obszar operacyjny jest już suchy, dodaj kilka kropli soli fizjologicznej RT, aby obszar był wilgotny. Monitoruj odczyt sondy przepływu. Optymalny odczyt różni się dla każdego zwierzęcia i może wynosić od 0,6 do 1,2 ml/min. Jeśli jest mniejszy lub niestabilny, zmień pozycję sondy przepływu, aby uzyskać optymalny odczyt.
      UWAGA: Upewnij się, że szyjka myszy nie jest zbyt rozciągnięta, a obszar operacyjny jest czysty.
  6. Rejestrowanie linii bazowej przepływu
    1. Po umieszczeniu sondy monitoruj przepływ krwi przez 2 minuty, aby upewnić się, że przepływ jest stały. Następnie rejestruj przepływ przez 2 minuty (Rysunek 3B) jako linię bazową. Szczegółowy opis przepływomierza można znaleźć w Subramaniam et al.17.
    2. Aby zarejestrować przepływ krwi, uruchom oprogramowanie WinDAQ. Kliknij opcję Plik, a następnie kliknij Nagraj. Utwórz nowy folder i plik, a następnie rozpocznij nagrywanie. Aby zatrzymać nagrywanie, kliknij Zatrzymaj w sekcji plików.
      UWAGA: Oprogramowanie WinDAQ jest dostępne bezpłatnie u wydawcy: https://www.dataq.com/products/windaq/.
  7. Szkody
    1. Zatrzymaj rejestrowanie przepływu. Upewnij się, że nie zmieniasz pozycji sondy, aby odczyty pozostały spójne po urazie.
    2. Dokładnie osusz obszar chusteczką/ręcznikiem papierowym.
      UWAGA: Nawet niewielka objętość pozostałej cieczy może zmienić stężenie roztworu FeCl3 stosowanego do uszkodzenia naczyń krwionośnych. Prowadzi to do zmiennych wyników i wpływa na odtwarzalność. Gdy obszar jest całkowicie suchy, sonda nie jest w stanie zmierzyć przepływu.
    3. W plastikowej łódce do ważenia umieść okrągłą bibułę filtracyjną (o średnicy 1 mm, przeciętą dziurkaczem do uszu o średnicy 1 mm). Dodać 1 μl 6% roztworu FeCl3 (wykonanego z dH2O) na bibułę filtracyjną.
      UWAGA: Pamiętaj, aby dodać roztwór FeCl3 tuż przed użyciem bibuły filtracyjnej. Zbyt wczesne namoczenie papieru może doprowadzić do odparowania roztworu FeCl3 i zmienić nasilenie urazu.
    4. Za pomocą cienkich kleszczyków podnieś bibułę filtracyjną i umieść ją na tętnicy przed sondą, w części tętnicy oznaczonej plastikiem (Rysunek 2D, E). Ten plastik działa jak marker i przekładka. Znakuje uszkodzony obszar i zapobiega przypadkowemu rozcieńczeniu FeCl3, unikając kontaktu z otaczającym wilgotnym obszarem.
      UWAGA: Upewnij się, że bibuła filtracyjna jest prosta, nie jest ściśnięta ani w żaden inny sposób zagięta. Po umieszczeniu na tętnicy nie zmieniaj położenia bibuły filtracyjnej; Zmienia to zakres urazu.
    5. Po umieszczeniu bibuły filtracyjnej uruchom minutnik i zapisz przepływ krwi. Po 3 minutach usuń papier i dodaj sól fizjologiczną w miejscu urazu, aby usunąć FeCl3 i zatrzymać proces urazu. Sprawia również, że obszar jest wilgotny. Na tym etapie przepływ krwi powinien powrócić do poziomu wyjściowego, zarejestrowanego przed urazem.
    6. Monitoruj i rejestruj przepływ, aż zmniejszy się do 10% oryginalnego nagrania lub osiągnie zero. Następuje stały spadek, gdy skrzeplina zaczyna tworzyć się w miejscu urazu (ryc. 3C). Zwróć uwagę na wszelkie znaczące wahania przepływu w tym czasie.
    7. Aby zbadać stabilność skrzepliny, zapisuj szybki wzrost przepływu krwi po każdym znaczącym i stałym spadku. Zdarzenia te są klasyfikowane jako embolizacja z powodu niestabilnej zakrzepicy (Rysunek 4D). Po konsekwentnym zmniejszaniu przepływu, operator jest w stanie zobaczyć uraz na tętnicy pod koniec eksperymentu (Rysunek 2F, niebieska strzałka / przerywany owal).
    8. Czas zamknięcia naczynia definiuje się jako całkowite ustanie przepływu krwi na co najmniej 1 minutę. Zapisz czas, w którym tworzy się skrzeplina okluzyjna, na co wskazuje odczyt zerowy lub znaczny spadek przepływu.
    9. Zakończ eksperyment po 30 minutach. Jeśli skrzeplina nie utworzy się w ciągu 30 minut od monitorowania, zarejestruj przepływ, zatrzymaj zapis i wyjmij sondę.
    10. Wyczyść sondę 70% etanolem i szczotką, aby usunąć wszelkie resztki tkanki/włosów lub zanieczyszczeń. Całkowicie wysusz sondę przed umieszczeniem jej w pudełku do przechowywania. Całkowicie wysusz sondę przed umieszczeniem jej w pudełku do przechowywania w celu długotrwałego przechowywania.
    11. Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy. Umieścić tuszę w worku na tusze, oznaczonym nazwą laboratorium i datą.

2. Pobieranie i przygotowanie próbek do badań seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej (SBF-SEM) po urazie wywołanym FeCl3

UWAGA: Prezentowany protokół EM jest odpowiedni do przygotowania próbki dla SBF-SEM. Ta technika obrazowania oferuje niespotykaną dotąd możliwość badania trójwymiarowej struktury płytek krwi w skrzepie. Dzięki tej technice próbka jest wizualizowana jako seria sekwencyjnych obrazów blokowych SEM, generowanych w miarę postępów w próbce. Kluczowymi punktami tego przygotowania są: 1) próbka musi być zabarwiona metalami ciężkimi wstępnie zatopionymi; oraz 2) próbka osadzona w plastiku musi być odpowiednio przycięta do montażu w SEM (patrz Rysunek 6 dla wizualizacji przyciętych próbek). Barwienie po osadzeniu nie jest możliwe w SEM. Podczas pobierania próbki z uszkodzenia naczynia wywołanego FeCl3 do analizy EM, podczas wykonywania operacji należy wprowadzić następujące zmiany. Przedstawione modyfikacje w protokole chirurgicznym FeCl3 mają również zastosowanie do każdej formy mikroskopii elektronowej. Warunki znieczulenia oraz etapy wykonywania nacięcia i odsłaniania tętnicy szyjnej są takie same jak w Protokole 1.

  1. Po odsłonięciu tętnicy szyjnej zaznacz miejsce urazu, luźno otaczając obszar między dwoma gwintami chirurgicznymi (rozmiar: 0,1 mm) (Rysunek 5A,B).
  2. Umieść sondę pod tętnicą, dystalnie od dolnego gwintu (Rysunek 5C).
  3. Włóż plastikowy element pod tętnicę między dwoma gwintami, aby oznaczyć miejsce urazu FeCl3 (Rysunek 5C).
  4. Wykonaj pomiary przepływu przed wykonaniem urazu, aby zanotować przepływ podstawowy. Pomiary te służą do podjęcia decyzji, na jakim etapie zostanie pobrana próbka.
    UWAGA: Upewnij się, że utrwalacz (3% paraformaldehydu/PFA + 0,1% aldehydu glutarowego, oba wykonane w 1x PBS) jest gotowy i w temperaturze RT. Alternatywnie można również zastosować utrwalanie 2,5% aldehydu glutarowego na tle soli.
    UWAGA: Zarówno paraformaldehyd, jak i aldehyd glutarowy są wysoce toksyczne i drażniące. Podczas obchodzenia się z nimi należy używać rękawiczek, osłony oczu i masek w celu ochrony przed narażeniem. Wszystkie roztwory utrwalające są toksyczne, a etapy utrwalania należy przeprowadzać w dygestorium.
  5. Wykonaj uraz, umieszczając na tętnicy bibułę filtracyjną nasączoną FeCl3 (stosuje się 8% FeCl3) na 3 minuty (ten czas również może się różnić). Po 3 minutach usuń bibułę filtracyjną i dodaj sól fizjologiczną w miejscu urazu, aby usunąć nadmiar pozostałości FeCl3. Ten krok jest konieczny, aby zapobiec zmiennemu zakresowi urazu i ułatwić zliczanie przepływu przez sondę (Rysunek 5D).
  6. Monitoruj odczyt przepływu. Gdy przepływ spadnie poniżej 50% wartości początkowej, wyjmij sondę. Szybko osusz obszar i dodaj utrwalacz w tym obszarze, aby zewnętrznie naprawić obszar urazu.
  7. Natychmiast przytrzymaj tętnicę w pobliżu obszaru urazu za pomocą kleszczy i przetnij poniżej dolnej nici i przed górną nitką. W razie potrzeby poproś inną osobę o pomoc w odcięciu jednego końca. Umieść tkankę na plastikowym naczyniu do hodowli tkanek w tej samej orientacji, w jakiej została pobrana, i dodaj kilka kropli utrwalacza.
    UWAGA: Przecięcie tętnicy powoduje natychmiastowe rozległe krwawienie, więc upewnij się, że trzymasz tętnicę przed przecięciem jej po raz pierwszy. W tym scenariuszu mysz jest wykrwawiona. Mysz zostaje poddana eutanazji przez wykrwawienie i zwichnięcie szyjki macicy.
  8. Za pomocą skalpela oczyść dodatkową tkankę wokół tętnicy. Należy pamiętać, aby zapisać orientację przepływu krwi. Aby to zaznaczyć, przytnij jeden koniec poziomo, a drugi zwężając się/ukośnie (Rysunek 5E).
  9. Próbkę należy przechowywać w utrwalaczu (3% PFA i 0,1% aldehydu glutarowego) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie należy przechowywać próbkę w 1% PFA w temperaturze 4 °C do momentu wysłania jej na mokrym lodzie do laboratorium przetwarzania próbek w celu analizy EM.
    UWAGA: Próbek nie należy zamrażać. Wyzwania związane z tą metodą pobierania próbek to:
    1. Początkowy odczyt może nie być optymalny lub może ulegać wahaniom po urazie. Może to mieć wpływ na zakres obrażeń, które są wybierane do zatrzymania do analizy EM. Aby rozwiązać ten problem, pamiętaj, aby nagrywać odczyt linii bazowej przez kilka minut, po wypróbowaniu różnych pozycji umieszczenia sondy, aby zdecydować, która pozycja jest optymalna.
    2. Czas do zatrzymania urazu poprzez dodanie zewnętrznego utrwalacza i rzeczywiste przecięcie odcinka tętniczego do analizy może zwiększyć zmienność w zakresie zakrzepicy. Zachowaj szybkość podczas pobierania próbki po zamocowaniu zewnętrznym.
  10. Otrzymaj próbki do przetworzenia do analizy EM w 1% PFA na mokrym lodzie. Przepłukać próbki przez 3 minuty na lodzie 0,1 M buforem kakodylowym w celu rozpoczęcia dalszego przetwarzania.
  11. Utrwalić próbki przez 1 godzinę na lodzie w 0,1 M buforze kakodylowym + 2,5% aldehydu glutarowego + 2 mM CaCl2.
  12. Odrzucić utrwalacz i przemyć próbki zimnym 0,1 M buforem kakodylanu sodu zawierającym 2 mM CaCl2 (5 x 3 min) (Rysunek 6A).
  13. Utrwalić próbki roztworem osmu (3% żelazocyjanek potasu [K4C6N6Fe] + 0,3 M bufor kakodylowy + 4 mM CaCl2 zmieszany z równą objętością 4% wodnego tetratlenku osmu [OsO4; w ddH2O]) przez 1 godzinę na lodzie.
  14. Podczas utrwalania próbek przygotować świeży 1% roztwór hydratu aldehydu trichlorooctowego (TCH) w ddH2O. Inkubować roztwór w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę, delikatnie mieszając.
  15. Po utrwaleniu przemyć próbki ddH2O w temperaturze pokojowej przez 5 x 3 min.
  16. Próbki inkubować w przefiltrowanym 1% roztworze TCH (sporządzonym w ddH2O) przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  17. Przemyć próbki za pomocą ddH2O w temperaturze pokojowej (5 x 3 min).
  18. Utrwalić próbki w 2% tetratlenku osmu w ddH2O przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  19. Przemywać próbki za pomocą ddH2O w temperaturze pokojowej przez 5 x 3 minuty każda.
  20. Umieścić próbki w 1% octanie uranylu (wodnym) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  21. Przemyć próbki za pomocą ddH2O w temperaturze pokojowej przez 5 x 3 minuty każda i przetworzyć je za pomocą barwienia en bloc asparaginianem ołowiu Waltona.
  22. En bloc barwienie asparaginianu ołowiu Waltona3:
    1. Przygotować 30 mM roztworu kwasu L-asparaginowego w ddH2O.
      UWAGA: Kwas asparaginowy rozpuszcza się szybciej, jeśli pH zostanie podniesione do 3,8. Ten roztwór podstawowy jest stabilny przez 1-2 miesiące, jeśli jest przechowywany w lodówce.
    2. Przygotować 20 mM roztworu azotanu ołowiu w 10 ml bulionu z kwasem asparaginowym i dostosować pH do 5,5 za pomocą 1 N KOH.
    3. Umieścić próbki w roztworze asparaginianu ołowiu w temperaturze 60 °C na 30 minut, po pięciu przemyciachddH 2O w temperaturze pokojowej temperatury, każde przez 3 minuty.
  23. Odwodnić próbki za pomocą serii stopniowanego etanolu. Użyj chemicznego odwodnienia według protokołu Valdivia18.
    1. Umyj próbki w każdym z poniższych roztworów, aby stopniowo odwodnić próbkę (Rysunek 6B):
      25% alkoholu etylowego przez 3 min
      50% alkoholu etylowego przez 3 min
      75% alkoholu etylowego przez 3 min
      95% alkoholu etylowego przez 3 min
      100% alkohol etylowy przez 10 minut i powtórz krok dwukrotnie (w sumie trzy prania).
  24. Umyć próbki w 100% tlenku propylenu (PO) przez 10 minut i powtórzyć ten krok dwukrotnie (w sumie trzy płukania).
  25. Inkubować w żywicy 50%/50% PO z aktywatorem DMP 30 przez noc w RT i zatopić w 100% Araldite 502/zatopić w aktywatorze DMP30 przez 48 godzin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dane są zazwyczaj przedstawiane jako czas do okluzji, czyli czas wymagany do powstania całkowicie zamykającego naczynie zakrzepu. Dane te można przedstawić w formie krzywej przeżycia Kaplana-Meiera (Rysunek 4A)19, wykresu punktowego z paskami obrazującymi końcowy przepływ krwi w momencie przerwania przepływu lub zakończenia eksperymentu (Rysunek 4B) lub w formie wykresu liniowego (Rysunek 4C). Za pomocą tej t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Miejscowe stosowanie FeCl3 do układu krwionośnego w celu wywołania zakrzepicy jest szeroko stosowaną techniką i odegrało zasadniczą rolę w ustaleniu ról dla różnych receptorów płytkowych, szlaków sygnałowych ligandów i ich inhibitorów 20,21,22,23. Mechanizm, za pomocą którego FeCl3 powoduje zakrzepicę, jest wieloaspektowy; Wcześniej obnażenie śródbłonka było uważane za prz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konfliktu interesów związanego z tym badaniem.

Profile ORCID: S.J.: 0000-0001-6925-2116; S.W.W.: 00000-0001-5577-0473.

Podziękowania

Autorzy dziękują członkom Laboratorium Whiteheart za uważne zapoznanie się z tym manuskryptem. Prace były wspierane przez granty z NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 i HL150818) oraz nagrodę Departamentu ds. Weteranów za zasługi dla S.W.W., R01 HL 155519 dla B.S. oraz grant na program stacjonarny NIBIB dla RDL.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% sól fizjologiczna Fisher Naukowy BP358-212NaCl służy do sporządzania roztworu 0,9% soli fizjologicznej 
Strzykawka 1 ml Becton, Dickinson i Spółka 
190 Proof Etanol KOPTECV1101 Służy do wytwarzania 70% roztworu etanolu do użycia w przygotowaniu myszy do operacji 
2,2,2 TribromoetanolSigma Aldrich48402
25 Yard pleciony jedwabny szew (5-0)DEKNATEL136082-1204
Igła 26G x 3/8 Becton, Dickinson i Spółka 305110
2-metylo-2-butanolSigma Aldrich240486
7,5 ml pipet transferowy, z podziałką do 3 mlGlobe Scientific Inc.135010
Podkładki nasączone alkoholem (70% alkoholu izopropylowego)MedlineMDS090735
Araldite GY 502 Usługi w zakresie mikroskopii elektronowej 10900
Naczynie do hodowli komórkowych 35mm x 10mm Corning Incorporated 
Waga kompaktowa Nauka Warda 470314-390
Nożyczki preparacyjne, 12,5 cm długości WorldPrecision Instrument15922-G
DMP-30 aktywator Usługi w zakresie mikroskopii elektronowej 13600
Bezwodnik dodenylobursztynowy/ DDSAMikroskopia elektronowa Usługi 13700
Worki na psie odchody/worek na tusze zwierzątProdukty koronowe PP-RB-200
Dopplerowska sonda przepływowaTransonic Systems Inc.Żywica MA0.5PSB
EMBED 812 Usługi w zakresie mikroskopii elektronowej 14900
Alkohol etylowy, bezwodny 200 proof Usługi w zakresie mikroskopii elektronowej 15055
Kleszczyki do opatrunków do oczu, 4" w pełni zakrzywione, standardowe, końcówki o szerokości 0,8 mmBibuła filtracyjna Integra Miltex18-784
 VWR28310-106
Cienkie nożyczki - Ostre-narzędzia naukowe 14028-10
Dziurkacze do uszu z pętlą na palec Narzędzia naukowe 24212-01
Gąbki z gazy 2" x 2" – 12 warstw Dukal Corporation2128
Aldehyd glutarowy (10% roztwór)Usługi mikroskopii elektronowej 16120
Ostrze chirurgiczne ze stali węglowej Integra Miltex #10Integra® Miltex®4110
Chlorek żelaza (III) SIGMA-ALDRICH157740-100G
Rękojeść noża Miltex® Bardzo delikatna stal nierdzewna rozmiar 3Integra Lifesciences 157510
Kwas L-asparaginowySigma  Rybacy  A93100
Kwas L-asparaginowyFisher Scientific BP374-100
Azotan ołowiu Fisher Naukowy Mikroskop L-62
LEICA S8AP0LEICANie jest już dostępnyjest już dostępny w ofercie firmy
Stojak do mikroskopu LEICA S8AP0 LEICA10447255Produkt nie jest już dostępny w ofercie firmy
Light-Duty Tissue Wipers VWR82003-822
Kleszcze mikropreparacyjne; 1x2 zęby, pełna krzywa; 0,8 mm Szerokość końcówki; Długość 4"Roboz Instrument chirurgiczny FirmaRS-5157
Tetratlenek osmu 4% roztwór wodny Usługi w zakresie mikroskopii elektronowej 19150
Paraformaldehyd (16% roztwór)Usługi mikroskopii elektronowej 15710
Żelazocyjanek potasuSIGMA-ALDRICHP-8131
Tlenek propylenu, odczynnik ACS Usługi w zakresie mikroskopii elektronowej 20401
Klasyczna pipeta Rainin PR-10
 Systemy transsoniczne Inc.T402B01481Model: T402
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", przezroczysta 
Podgrzewana podkładka dla małych zwierzątK& H Manufacturing Inc.Model: HM10
Bufor kakodylanu sodu 0,2 m, pH7,4Usługi mikroskopii elektronowej 11623
Sterylne aplikatory z bawełnianą końcówką Purytańskie produkty medyczne 25-806 Oświetlacz 1WC
Steromaster Fisher Naukowy 12-562-21Niedostępny już w ofercie firmy
Kleszcze chirurgiczne Dumont #7 Narzędzia naukowe 11271-30
Tiokarbohydrazyd (TCH)SIGMA-ALDRICH88535
Uniwersalne przeładowania końcówek do pipet o niskiej retencji (0,1-10 &mikro; L)VWR76323-394
z octanem uranylu 22400
Veet Gel Krem do usuwania włosówReckitt Benckiser3116875
Białe antystatyczne sześciokątne łodzie wagowe, średnie, 64 x 15 x 19 mmFisher Scientific Oprogramowanie S38975
WinDAQ/100 dla systemu WindowsDATAQ Instruments, Inc.Wersja 3.38Dostępna bezpłatnie do pobrania. https://www.dataq.com/products/windaq/
ZEISS AxioCam Icc 1ZEISS57615
309659430165 Nie Przepływomierz badawczy Rainin 17008649305289Usługi mikroskopii elektronowej

Bibliografia

  1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
  2. Raskob, G. E., et al. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (11), 2363-2371 (2014).
  3. Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
  4. Palta, S., Saroa, R., Palta, A. Overview of the coagulation system. Indian Journal of Anaesthesia. 58 (5), 515-523 (2014).
  5. Joshi, S., Whiteheart, S. W. The nuts and bolts of the platelet release reaction. Platelets. 28 (2), 129-137 (2017).
  6. Periayah, M. H., Halim, A. S., Mat Saad, A. Z. Mechanism action of platelets and crucial blood coagulation pathways in hemostasis. International Journal of Hematology-Oncology and Stem Cell Research. 11 (4), 319-327 (2017).
  7. Alexopoulos, D., Katogiannis, K., Sfantou, D., Lekakis, J. Combination antiplatelet treatment in coronary artery disease patients: A necessary evil or an overzealous practice. Platelets. 29 (3), 228-237 (2018).
  8. Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
  9. Denis, C. V., et al. Towards standardization of in vivo thrombosis studies in mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1641-1644 (2011).
  10. Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thrombosis and Haemostasis. 79 (3), 656-662 (1998).
  11. Kato, Y., et al. Inhibition of arterial thrombosis by a protease-activated receptor 1 antagonist, FR171113, in the guinea pig. European Journal of Pharmacology. 473 (2-3), 163-169 (2003).
  12. Huttinger, A. L., et al. Ferric chloride-induced canine carotid artery thrombosis: a large animal model of vascular injury. Journal of Visualized Experiments. (139), e57981(2018).
  13. Zhang, W., et al. Antithrombotic therapy by regulating the ROS-mediated thrombosis microenvironment and specific nonpharmaceutical thrombolysis Using Prussian blue nanodroplets. Small. 18 (15), 2106252(2022).
  14. Liu, B., et al. Platelet membrane cloaked nanotubes to accelerate thrombolysis by thrombus clot-targeting and penetration. Small. , 2205260(2022).
  15. Refaat, A., et al. Near-infrared light-responsive liposomes for protein delivery: Towards bleeding-free photothermally-assisted thrombolysis. Journal of Controlled Release. 337, 212-223 (2021).
  16. Li, S., et al. Biomimetic nanoplatelets to target delivery hirudin for site-specific photothermal/photodynamic thrombolysis and preventing venous thrombus formation. Small. 18 (51), 2203184(2022).
  17. Subramaniam, S., Kanse, S. M. Ferric chloride-induced arterial thrombosis in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 4 (4), 151-164 (2014).
  18. Cocchiaro, J. L., Kumar, Y., Fischer, E. R., Hackstadt, T., Valdivia, R. H. Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (27), 9379-9384 (2008).
  19. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric-estimation from incomplete observations. Journal of the American Statistical Association. 53 (282), 457-481 (1958).
  20. Chauhan, A. K., Kisucka, J., Lamb, C. B., Bergmeier, W., Wagner, D. D. von Willebrand factor and factor VIII are independently required to form stable occlusive thrombi in injured veins. Blood. 109 (6), 2424-2429 (2007).
  21. Andre, P., et al. CD40L stabilizes arterial thrombi by a beta3 integrin--dependent mechanism. Nature Medicine. 8 (3), 247-252 (2002).
  22. Ni, H., et al. Persistence of platelet thrombus formation in arterioles of mice lacking both von Willebrand factor and fibrinogen. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 385-392 (2000).
  23. Bergmeier, W., et al. The role of platelet adhesion receptor GPIbalpha far exceeds that of its main ligand, von Willebrand factor, in arterial thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16900-16905 (2006).
  24. Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126 (6), 817-824 (2015).
  25. Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (4), 779-789 (2011).
  26. Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P. F., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. Journal of Biological Chemistry. 284 (19), 13110-13118 (2009).
  27. Shim, Y., et al. Characterization of ferric chloride-induced arterial thrombosis model of mice and the role of red blood cells in thrombosis acceleration. Yonsei Medical Journal. 62 (11), 1032-1041 (2021).
  28. Ghosh, S., et al. Evaluation of the prothrombotic potential of four-factor prothrombin complex concentrate (4F-PCC) in animal models. PLoS One. 16 (10), 0258192(2021).
  29. Wilbs, J., et al. Cyclic peptide FXII inhibitor provides safe anticoagulation in a thrombosis model and in artificial lungs. Nature Communications. 11 (1), 3890(2020).
  30. Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection. Neuroscience Letters. 662, 205-212 (2018).
  31. Jacob-Ferreira, A. L., et al. Antithrombotic activity of Batroxase, a metalloprotease from Bothrops atrox venom, in a model of venous thrombosis. International Journal of Biological Macromolecules. 95, 263-267 (2017).
  32. Zhou, X., et al. A rabbit model of cerebral microembolic signals for translational research: preclinical validation for aspirin and clopidogrel. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (9), 1855-1866 (2016).
  33. Yang, X., et al. Effect of evodiamine on collagen-induced platelet activation and thrombosis. BioMed Research International. 2022, 4893859(2022).
  34. Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
  35. Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric chloride-induced murine thrombosis models. Journal of Visualized Experiments. (115), e54479(2016).
  36. Holly, S. P., et al. Ether lipid metabolism by AADACL1 regulates platelet function and thrombosis. Blood Advances. 3 (22), 3818-3828 (2019).
  37. Bird, J. E., et al. Prediction of the therapeutic index of marketed anti-coagulants and anti-platelet agents by guinea pig models of thrombosis and hemostasis. Thrombosis Research. 123 (1), 146-158 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Uszkodzenie chlorkiem elaza IIIt tnica szyjnapowstawanie zakrzepuultrastruktura p ytek krwimodel uszkodzenia naczyniowegoleki przeciwzakrzepowepomiar przep ywu krwimorfologia zakrzepu
Zakrzepica tętnicza wywołana chlorkiem żelaza i pobieranie próbek do analizy pod mikroskopem elektronowym 3D
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.