Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar transportu ładunku aksonalnego w pierwotnych neuronach korowych myszy

745 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64999

⸱

24 lutego 2023

 , 
1Laboratory of Neuroscience, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University, 2Advanced Prevention and Research Laboratory for Dementia, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje całą procedurę analizy transportu aksonalnego. W szczególności przedstawiono tutaj obliczanie prędkości transportu bez pauzy, oraz metodę wizualizacji za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania "KYMOMAKER".

Streszczenie

Komórki neuronalne to wysoce spolaryzowane komórki, które stereotypowo zawierają kilka dendrytów i akson. Długość aksonu wymaga wydajnego dwukierunkowego transportu przez białka motoryczne. Różne doniesienia sugerują, że defekty transportu aksonalnego są związane z chorobami neurodegeneracyjnymi. Również mechanizm koordynacji wielu białek motorycznych jest atrakcyjnym tematem. Ponieważ akson ma jednokierunkowe mikrotubule, łatwiej jest określić, które białka motoryczne są zaangażowane w ruch. Dlatego zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw transportu ładunku aksonalnego ma kluczowe znaczenie dla odkrycia molekularnego mechanizmu chorób neurodegeneracyjnych i regulacji białek motorycznych. W tym miejscu przedstawiamy cały proces analizy transportu aksonalnego, w tym hodowlę pierwotnych neuronów korowych myszy, transfekcję plazmidów kodujących białka ładunku oraz analizy kierunkowe i prędkości bez efektu pauz. Ponadto wprowadzono ogólnodostępne oprogramowanie "KYMOMAKER", które umożliwia generowanie kimografu w celu podświetlenia śladów transportu zgodnie z ich kierunkiem i umożliwia łatwiejszą wizualizację transportu aksonalnego.

Wprowadzenie

Członkowie rodziny kinezyny i cytoplazmatyczna dyneina to białka motoryczne, które przemieszczają się wzdłuż mikrotubul w komórkach, aby transportować swój ładunek1. Większość kinezyn porusza się w kierunku końca dodatniego, podczas gdy dyneina porusza się w kierunku ujemnego końca mikrotubul. Funkcje i mechanizmy transportu ładunku w aksonie neuronalnym zostały szeroko zbadane. Ze względu na swoją długość, aksony wymagają stabilnego transportu na duże odległości, aby utrzymać zdrowie neuronów. Nieprawidłowości w transporcie mitochondriów, autofagosomów i pęcherzyków zawierających prekursor białka β amyloidu (APP) zostały zgłoszone jako przyczyny chorób neurodegeneracyjnych2,3. Liczne badania in vitro ujawniły mechanizmy leżące u podstaw skoordynowanego transportu przez białka motoryczne, a różne badania z użyciem oczyszczonych białek motorycznych i mikrotubul ujawniły, w jaki sposób cząsteczki motoryczne poruszają się wzdłuż mikrotubul4,5. Zazwyczaj wiele silników jest zaangażowanych w jeden cargo6. Istnieją jednak pewne modele pokazujące, w jaki sposób przeciwstawne silniki wyznaczają kierunek transportu ładunku. Jednym z nich jest "model asocjacji/dysocjacji"; W tym przypadku tylko silniki jednokierunkowe są związane z ładunkiem podczas transportu jednokierunkowego. W drugim, "modelu koordynacyjnym", oba silniki są przymocowane do tego samego ładunku i tylko jedna strona silnika jest aktywowana. W trzecim "modelu przeciągania liny" układ sił między kinezynami a dyneinami określa kierunek transportu7,8,9. Ponadto kilka raportów sugeruje, że równowaga i liczba aktywowanych białek motorycznych wpływa na prędkość transportu ładunków in vitro8,10.

Pytaniem bez odpowiedzi jest to, jak te działania kinezyn lub dynein są regulowane w żywych komórkach. Poprzednie doniesienia wykazały acetylację mikrotubul w aksonach, a czynniki neurotroficzne zwiększają transport aksonów11,12. Ponadto różne typy adapterów ładunkowych i ładunkowych działają jako aktywatory silnika w odpowiedni sposób13,14. Wiele z nich jest związanych z błoną pęcherzyków transportowych, a ich funkcje są regulowane przez sygnały, takie jak modyfikacje potranslacyjne15. W związku z tym obserwacja kierunku i prędkości transportu w żywych komórkach dostarcza cennych informacji na temat molekularnej regulacji transportu ładunków w eksperymentach in vitro. Obserwacja transportu aksonalnego pozwala na rozróżnienie transportu opartego na kineinie i dyneinie. Ponieważ aksony zawierają jednokierunkowe mikrotubule na końcu plusa16, ładunek jest transportowany przednio (tj. z somy do terminala aksonu) przez kinezyny i wstecznie (tj. z terminala aksonu do somy) przez dyneiny.

W niniejszym badaniu opisana jest metoda obserwacji i analizy transportu aksonalnego w pierwotnych neuronach hodowlanych. Jako przykład opisano procedurę obserwacji transportu aksonalnego białek błonowych - APP, kalsyntenina-1 / alcadein α (Alcα) i pęcherzyków zawierających kalsynteninę-3 / alcadeinę β (Alcβ). Wiadomo, że transport następczy pęcherzyków zawierających APP jest znacznie szybszy niż pęcherzyków zawierających Alcα, chociaż oba są transportowane przez kinezynę-117,18,19. W poprzednich raportach do pomiaru prędkości użyto kilku metod. Najbardziej zmiennym krokiem jest obsługa przerw podczas transportu. W żywych komórkach transport jest czasami utrudniony przez przeszkody wzdłuż mikrotubul; Silniki mogą jednak omijać region z pauzą lub bez niej20. Przerwa może mieć wpływ na obliczanie prędkości w dłuższym czasie obserwacji, co może skutkować wolniejszym szacowaniem prędkości. W tym miejscu opisano metodę wykorzystującą ruch w okresie segmentowym (200 ms) w celu wykluczenia efektu fizycznej pauzy silników. Na koniec wprowadzono ogólnodostępny (tylko Windows) program o nazwie "KYMOMAKER"21. Kimografy są szeroko stosowane do wizualizacji transportu pęcherzykowego i są przydatne do wizualizacji kierunku transportu każdego ładunku bez konieczności oglądania filmu. Oprogramowanie generuje kimografy z filmów poklatkowych, stosując jednowymiarowy algorytm Watershed wielokrotnie podczas obracania obrazów. Dzięki temu powstały kimograf może skutecznie i łatwo pokazać drobne struktury. Ponadto KYMOMAKER automatycznie wykrywa i podświetla szlaki zgodnie z ich kierunkiem oraz umożliwia tworzenie łatwych do zrozumienia diagramów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitet Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu Hokkaido, zgodnie z wytycznymi ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments). W niniejszym badaniu wykorzystano samice myszy C57BL/6J (w ciąży, 15,5 dnia).

1. Przygotowanie pierwotnych neuronów korowych myszy

  1. Dodać 0,1 mg / ml poli-L-lizyny w 0,1 M Tris (tris(hydroksymetylo)aminometan)-HCl (pH 8,5) do 8-dołkowej (nr 1,0) komory ze szklanym dnem (patrz tabela materiałów). Inkubować komorę w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę.
  2. Przepłukać komorę wysterylizowaną wodą co najmniej trzy razy i wysuszyć na powietrzu w kapturze do hodowli tkankowych.
  3. Uśmierc ciężarne myszy w wieku 15,5 dnia przez zwichnięcie szyjki macicy lub zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi przepisami.
  4. Ściśnij róg macicy zawierający zarodki, odizoluj całe rogi macicy za pomocą nożyczek i zanurz je w zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na lodzie.
  5. W zimnym PBS wyizoluj zarodki za pomocą ostrej pęsety i usuń wszystkie błony owodniowe z zarodków.
  6. Ponownie umyj zarodki świeżym, zimnym PBS.
    UWAGA: Podczas każdego etapu izolacji należy wypłukać jak najwięcej krwi i upewnić się, że nie uszkodzisz naczyń krwionośnych ani zarodków.
  7. Umieść zarodek na wysterylizowanej gazie na zimnej szalce Petriego pod mikroskopem świetlnym.
  8. Odizoluj mózg. Przetnij głowę, skórę i czaszkę zarodka za pomocą końcówki zakrzywionej ostrej pęsety. Usuń skórę i czaszkę, aby odsłonić górną i boczną część mózgu.
  9. Zgarnij cały mózg za pomocą zakrzywionej części pęsety i zanurz go na szalce Petriego zawierającej lodowaty 1x zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS; 10 mM HEPES [pH 7,6], 5,3 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 140 mM NaCl, 4,2 mM NaHCO3, 0,34 mM Na2HPO4, 39 mM D-glukoza, i 0,5 μg/ml gentamycyny; patrz tabela materiałów).
  10. Powtarzaj kroki 1.7-1.9, aż do uzyskania wymaganej liczby mózgów.
    UWAGA: Zazwyczaj można uzyskać 5 x 106 do 2 x 107 komórek na mózg.
  11. Oddziel korę22 od mózgu za pomocą pęsety w zimnym 1x HBSS i oderwij opony mózgowe od kory.
  12. Przenieś korę na nową szalkę Petriego zawierającą zimny 1x HBSS. Przetnij korę na pół lub na trzy części za pomocą ostrzy chirurgicznych.
  13. Przenieś korę do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą końcówek o pojemności 1 000 μl i usuń nadmiar 1x HBSS.
  14. Dodać 100 jednostek papainy i 200 μg dezoksyrybonukleazy I (DNazy I) rozcieńczonych 5 ml rozcieńczonego roztworu papainy (5 mg/ml D-glukozy, 0,2 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej i 0,2 mg/ml L-cysteiny w 1x PBS; patrz tabela materiałów) na zarodek i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 minut. Podczas inkubacji odwracać probówkę co 5 minut.
    UWAGA: Zalecana jest wstępna inkubacja papainy w rozcieńczonym roztworze papainy. Inkubować przez 5 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, a następnie dodać DNazę I.
  15. Wyrzuć roztwór. Dodaj 2 ml 20% inaktywowanej termicznie surowicy końskiej (patrz Tabela Materiałów) w 1x HBSS. Inkubować przez 1 minutę.
  16. Wyrzuć roztwór. Dwukrotnie przepłukać chusteczkę 4 ml 1x HBSS.
  17. Wyrzuć roztwór. Dodać 0,5 ml na zarodek pożywki galwacyjnej (pożywka neuropodstawowa zawierająca 2% suplementu B-27, 4 mM Glutamaxu, 5% inaktywowanej termicznie surowicy końskiej i 1x penicylina-streptomycyna; patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Podczas kroków 1.14-1.17 wirowanie nie jest potrzebne, ponieważ pocięte kawałki kory opadają na dno probówki bez niej. Nie używaj aspiratora i nie zasysaj kawałków.
  18. Zawiesić bardzo delikatnie za pomocą naciętej końcówki o pojemności 1 000 μl lub pipety o pojemności 10 ml od 5 do 10 razy.
  19. Zawiesić bardzo delikatnie za pomocą końcówki 1 000 μl 10 razy.
  20. Wirować przy 250 × g w temperaturze pokojowej (20-25 °C) przez 3 min.
  21. Usunąć supernatant i bardzo delikatnie zawiesić 0,5 ml na zarodek pożywki posiewowej za pomocą końcówki o pojemności 1 000 μl.
  22. Umieść sitko o pojemności 40 μm na probówce wirówkowej o pojemności 50 ml, a następnie przefiltruj zawiesinę komórek za pomocą przepływu grawitacyjnego. Zebrać przefiltrowaną zawiesinę komórkową do probówki.
  23. Policz komórki i płytkę w komorach o stężeniu 2 × 104 do 5 × 104 komórek/cm2, z odpowiednią objętością podłoża galwanicznego. Przykład gęstości przedstawiono na rysunku uzupełniającym 1.
  24. W dniu in vitro (Div.) 2 zastąp połowę pożywki pożywką hodowlaną (pożywka neuropodstawowa zawierająca 2% suplementu B-27, 4 mM Glutamax i 1x penicylina-streptomycyna) i dodaj 5 μM 5-fluoro-2-deoksyurydyny (patrz Tabela materiałów).
  25. Po sekcji 4 należy zastąpić połowę pożywki pożywką hodowlaną co 2 lub 3 dni.

2. Transfekcja plazmidów do pierwotnego neuronu hodowlanego metodą fosforanu wapnia

UWAGA: Wspomniane objętości dotyczą studzienki o głębokości0,8 cm 2 w 8-dołkowej komorze ze szklanym dnem (patrz Tabela Materiałów).

  1. Przygotuj 50 μl roztworu DNA/CaCl2, mieszając 200 ng do 2 μg plazmidu (APP-EGFP w pCAGGS, Alcα-EGFP w pcDNA3.118, lub Alcβ-EGFP w pcDNA3.1; patrz Tabela uzupełniająca 1) kodującego białko znakowane fluorescencją, 6,2 μl 2 M CaCl2 i sterylizowaną wodę.
  2. Porcjować 50 μl 2x soli fizjologicznej buforowanej HEPS (HBS) do nowych probówek wirówkowych.
  3. Dodać 6,2 μl roztworu DNA/CaCl2 do 2x roztworu HBS. Delikatnie wymieszać, pipetując 10 razy.
  4. Powtarzać krok 2.3 aż do przeniesienia całego roztworu DNA/CaCl2.
  5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  6. Zebrać pożywkę hodowlaną w komorze ze szklanym dnem i zastąpić ją świeżą pożywką hodowlaną bez antybiotyków.
    UWAGA: Zebrane podłoże należy przechowywać w inkubatorze do hodowli komórkowych do kroku 2.10.
  7. Dodać kroplami do neuronów 50 μl mieszaniny DNA/CaCl2/HBS na studzienkę. Kultura przez 1 h.
  8. Podczas inkubacji przygotować zakwaszoną pożywkę, umieszczając szalkę Petriego zawierającą DMEM (zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Dulbecco)/Pożywkę F-12 szynki w inkubatorze o stężeniu 10% CO2 w temperaturze 37 °C.
  9. Po inkubacji przez 1 godzinę po transfekcji, przepłukać pierwotne neurony F-12 DMEM/Ham's F-12 (zakwaszone podłoże) 3 razy.
  10. Zastąp pożywkę mieszaniną pożywki w połowie zebranej i w połowie świeżej pożywki hodowlanej. Hodowla do momentu obserwacji pod mikroskopem w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .

3. Obserwacja transportu aksonalnego

  1. Wstępnie inkubować komorę wyposażoną w mikroskopię TIRF (całkowity wewnętrzny współczynnik odbicia) (patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C.
  2. Jeżeli kontroler CO2 jest wyposażony, pożywka hodowlana może być używana jako pożywka obserwacyjna poniżej 5% CO2 . Jeśli nie jest wyposażony, wymień pożywkę na pożywkę o stabilnym pH, taką jak Leibovitz L-15 (patrz tabela materiałów), dostarczaną z 4 mM Glutamax i 2% suplementem B-27.
  3. Znajdź transfekowaną komórkę, a następnie zidentyfikuj akson. Zwiększaj kąt padania lasera, aż laser zostanie całkowicie odbity. Następnie zmniejsz kąt, aż wszystkie pęcherzyki w aksonie zostaną uwidocznione (pseudo-TIRF). Rejestruj obrazy z czasem naświetlania 200 ms przez 150 klatek (30 s).
    UWAGA: W tym eksperymencie użyto oświetlenia pseud-TIRF do uchwycenia wszystkich pęcherzyków aksonów. Można stosować inne mikroskopy wyposażone w szybkie systemy przechwytywania.
    UWAGA: Zapisuj kierunek aksonu za każdym razem w nazwie pliku. W obserwacji pominięto obszar początkowego segmentu aksonu lub końcowego obszaru aksonu.

4. Przetwarzanie obrazu

  1. Otwórz pozyskane obrazy za pomocą oprogramowania MetaMorph (patrz Spis materiałów).
  2. Otwórz pasek narzędzi > Zmierz > Kalibruj odległość. Włącz opcję "zastosuj do wszystkich otwartych obrazów" i wprowadź rzeczywistą odległość piksela.
  3. Otwórz pasek narzędzi > Wyświetl > Obróć. Aktywuj pole wyboru dla "wszystkie płaszczyzny". Obróć tak, aby akson był poziomy, a kierunek w kierunku zakończenia aksonu był w prawo.
  4. Otwórz pasek narzędzi > Regiony > Utwórz regiony. Ustaw rozmiar regionu do przycinania i kliknij Utwórz. Umieść ramkę, która pojawia się na obrazie, w obszarze aksonu do analizy. Zapisz wygenerowaną sekwencję obrazów jako plik stosu.
    UWAGA: Wybierz obszary, które nie zawierają nieostrych aksonów lub zanieczyszczeń.
  5. Otwórz pasek narzędzi > Wyświetlanie > grafiki. Wybierz opcję Pasek kalibracji, aby stemplować podziałkę liniową. Wybierz opcję Data/Time, aby dodać sygnaturę czasową do obrazów. Włącz opcję "wszystkie płaszczyzny". Przenieś obiekty w odpowiednie miejsce i kliknij stempel.
  6. Otwórz pasek narzędzi > Stos > Utwórz film. Wprowadź odpowiednią liczbę klatek na sekundę i wybierz AVI. Zapisz go jako nowy plik.

5. Rysowanie kimografu i wykrywanie śladów za pomocą KYMOMAKER

  1. Pobierz aplikację KYMOMAKER (patrz tabela materiałów) i otwórz "Kymoanalysis.exe" w folderze KYMOMAKER.
  2. Otwórz "kymoAnalysis.exe", aby wyświetlić główne okna (Rysunek 1A). Wybierz File > Load i otwórz utworzony film AVI. Pojawi się okno "Podgląd" (Rysunek 1B).
  3. Na karcie Generuj kimograf > sekcji przycinania wprowadź numery pikseli do przycięcia. Przycinanie jest natychmiast odzwierciedlane w oknie "Podgląd", aby umożliwić łatwą regulację (Rysunek 1C). Upewnij się, że cała podziałka liniowa i znacznik czasu zostały usunięte.
  4. Kliknij na przycisk Generuj, aby wygenerować kimograf (Rysunek 1C). KYMOMAKER wykrywa najjaśniejszy piksel w obrębie każdej osi y w oknie "Podgląd". Zapisz kimograf za pomocą pliku > Zapisz > normalnym kimografie.
  5. Aby wykryć ślady o niskiej intensywności w kimografie, kliknij Kymograf rotacyjny. Dostosuj liczbę w sekcji "Kymograf rotacyjny" i wyświetl wynik, klikając na kymograf rotacyjny (Rysunek 1D).
    UWAGA: "Obrót (stopień)" to przedział stopnia dla algorytmu Rotational Watershed21. Na przykład 10° oznacza, że algorytm Watershed jest wykonywany co 10° 36 razy, a wyniki są następnie łączone w oknie "Rotational Watershed".
  6. Aby wykryć ślady następcze i wsteczne w kimografie, w zakładce Detekcja > sekcji Cel wybierz oryginał, jeśli Kimograf rotacyjny nie został wygenerowany. Upewnij się, że po wybraniu opcji Obrót utworzony dział wodny obrotu jest używany do wykrywania śladów. Wybierz zlewnię w "Metodzie wykrywania". Kliknij przycisk Wykryj, aby automatycznie wykryć ślady.
    UWAGA: Wykryte ślady są rysowane w oknie "Praca". Włączenie opcji "Maskowanie" powoduje narysowanie śladów na oryginalnym kimografie.
  7. Wykryj ślady następcze i wsteczne, wprowadzając liczbę w sekcji Wykrywanie > filtrowanie > prędkości (Rysunek 1E,F). Wykrywanie śladów następczych poprzez wprowadzenie wartości od 0,4 do 7,0 μm/s. Wykryj ślady wsteczne, wprowadzając od -0,4 do -7,0 μm/s,
    UWAGA: Ustawienie najniższej prędkości zależy od definicji stanu nieruchomego pęcherzyków. Patrz krok 6.7.
  8. Zapisz pliki.

6. Określanie prędkości

  1. Otwórz oprogramowanie MetaMorph.
    UWAGA: Wtyczka "ręczne śledzenie" w ImageJ może również obliczać prędkości w ten sam sposób.
  2. Otwórz plik utworzony w kroku 4.4. Upewnij się, że kalibracja jest dostosowana do obrazów.
  3. Otwórz pasek narzędzi > Aplikacje > Punkty trasy. Kliknij Dodaj ścieżkę. Znajdź poruszający się pęcherzyk, który był transportowany w kierunku następczym lub wstecznym. Następnie śledź pęcherzyk, klikając, aż transport się zakończy. Kliknij Gotowe.
  4. Powtarzaj krok 6.3, aż wszystkie pęcherzyki zostaną wyśledzone.
  5. Kliknij otwórz dziennik, aby otworzyć plik CSV. Następnie kliknij plik dziennika, aby wyświetlić dane w pliku CSV.
  6. Zapisz plik CSV.
  7. Aby obliczyć prędkość segmentową, na którą pauza nie ma wpływu, usuń obliczone prędkości 0,37 μm/s lub mniejsze w kolumnie "prędkość".
    UWAGA: Pęcherzyki mogą poruszać się bardzo krótko przez anomalną dyfuzję i nie są przetwarzane przez białka motoryczne23. Aby uniknąć uwzględniania tych ruchów w obliczeniach prędkości napędzanych silnikiem, najniższa prędkość (1 piksel/200 ms) w tym protokole jest usuwana z obliczeń.
  8. Oblicz średnią prędkość segmentową co pięć klatek (łącznie 1 s). Odrzuć ostatnią część prędkości, jeśli pozostało mniej niż pięć klatek.
  9. Połącz wszystkie średnie prędkości z jednego warunku. Generuj histogramy, aby pomóc w wizualizacji rozkładu prędkości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pierwotne hodowle neuronów z kory mózgu myszy w wieku zarodkowym E15.5 prowadzono w naczyniach z szklanym dnem zgodnie z opisem. Przykładowo, w pierwotnych neuronach korowych wykazano ekspresję APP-EGFP, Alcα-EGFP lub Alcβ-EGFP. Znane jest, że APP i Alcα są transportowane w aksonie przez kinezynę-1.2,17APP wiąże się z kinezyną-1 poprzez białko adapterowe JIP1 (JNK-interacting protein 1), podczas gdy Alcα wiąże się bezpośrednio poprzez jego podwó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisano metodę analizy transportu aksonalnego, która obejmuje obliczanie prędkości segmentowej i generowanie kimografów. Kluczowym krokiem na etapie transfekcji jest utrzymanie zdrowia hodowanych neuronów. Metoda transfekcji opisana przez Jianga i Chena29 była stosowana z niewielkimi modyfikacjami. Delikatne zmieszanie roztworu DNA/CaCl2 i 2x HBS zwiększyło skuteczność transfekcji poprzez zmniejszenie wielkości wytrąceń. Aby zapobiec uszkodzeniu komórek przez wytrącenia, komórki przepłu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez KAKENHI (22K15270, Grant-in-Aid dla Młodych Naukowców) oraz Akiyama Life Science Foundation dla YS. Chcielibyśmy wyrazić naszą wdzięczność dr Masataka Kinjo i dr Akirze Kitamura z Laboratorium Molekularnej Dynamiki Komórek na Wydziale Zaawansowanych Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu Hokkaido za dostarczenie krytycznego wkładu i wiedzy specjalistycznej, które znacznie pomogły w badaniach. Obserwację za pomocą mikroskopii TIRF przeprowadzono przy użyciu przyrządu zainstalowanego w Laboratorium Molekularnej Dynamiki Komórek na Wydziale Zaawansowanych Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu Hokkaido. Instrument jest zarejestrowany w systemie Open Facility zarządzanym przez Global Facility Center, Creative Research Institution, Hokkaido University (AP-100138). Dziękujemy dr Seiichi Uchida, Human Interface Laboratory, Department of Advanced Information Technology, Faculty of Information Sciences and Electrical Engineering, Kyushu University, Fukuoka Japan, za montaż z aplikacją Kymomaker. Laboratorium Zaawansowanej Prewencji i Badań nad Demencją, Podyplomowa Szkoła Nauk Farmaceutycznych, Uniwersytet Hokkaido jest wspierane przez Japan Medical Leaf co., Ltd.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5-Fluoro-2-deoksyurydynaSigma-AldrichF0503
Apo TIRF 100x/1.49 OILNikon
B-27 Suplement (50x), bez surowicyThermo fischer scientific17504044
Albumina surowicy bydlęcejWako013-25773
Zestaw do transfekcji ssaków CalPhosTakara631312
Sitko do komórek  40 i mikro; m NylonFalcon352340
CoolSNAP HQFotometria
Deoksyrybonukleaza ISigma-AldrichDN-25
D-GlucoseWako041-00595
DMEM/Szynka' s F-12Wako042-30555
Dumont No. 7 kleszczeDumont No.7
Ostrze chirurgiczne z pióra FeatherNo.11
Rękojeść ostrza chirurgicznego z pióra Pióronr 3
GentamycynaWako079-02973
Siarczan gentamycynyWako075-04913
GlutaMAX SuplementThermo fischer scientific35050061
HEPESDOJINDO342-01375
Surowica dla koni, inaktywowana termicznieThermo fischer scientific26050088
KClWako163-03545
KH2PO4Wako169-04245
KYMOMAKERhttp://www.pharm.hokudai.ac.jp/shinkei/Kymomaker.html
L-15 Medium (Leibovitz)Sigma-AldrichL5520
MetaMorph wersja 6.2r1 Metamorph
Na2HPO4Wako197-02865
NaClWako197-01667
NaHCO3Wako191-01305
Neurobasal MediumThermo fischer naukowy21103049
Nikon ECLIPSE TE 2000-ENikon
Nunc Lab-Tek  8-studniowa komorowa szklana nakrywkaThermo fischer scientific155411
PapainaWorthingtonLS003126
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Bromowodorek poli-L-lizynySigma-AldrichP2636-500MG
Baza TrizmaMerckT1194-10PAKrozpuszczony z wodą w celu uzyskania 0,1 M Tris-HCl (pH 8,5)

Bibliografia

  1. Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 682-696 (2009).
  2. Stokin, G. B., et al. Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer's diseases. Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).
  3. Guo, W., Stoklund Dittlau, K., vanden Bosch, L. Axonal transport defects and neurodegeneration: Molecular mechanisms and therapeutic implications. Seminars in Cell & Developmental Biology. 99, 133-150 (2020).
  4. Svoboda, K., Schmidt, C. F., Schnapp, B. J., Block, S. M. Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry. Nature. 365 (6448), 721-727 (1993).
  5. Carter, N. J., Cross, R. A. Mechanics of the kinesin step. Nature. 435 (7040), 308-312 (2005).
  6. Welte, M. A. Bidirectional transport along microtubules. Current Biology. 14 (13), R525-R537 (2004).
  7. Hendricks, A. G., et al. Motor coordination via a tug-of-war mechanism drives bidirectional vesicle transport. Current Biology. 20 (8), 697-702 (2010).
  8. Rezaul, K., et al. Engineered tug-of-war between kinesin and dynein controls direction of microtubule based transport in vivo. Traffic. 17 (5), 475-486 (2016).
  9. Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. Biophysical challenges to axonal transport: motor-cargo deficiencies and neurodegeneration. Annual Review of Biophysics. 43, 141-169 (2014).
  10. Monzon, G. A., et al. Stable tug-of-war between kinesin-1 and cytoplasmic dynein upon different ATP and roadblock concentrations. Journal of Cell Science. 133 (22), 226248(2020).
  11. Guo, W., et al. HDAC6 inhibition reverses axonal transport defects in motor neurons derived from FUS-ALS patients. Nature Communications. 8 (1), 861(2017).
  12. Tosolini, A. P., et al. BDNF-dependent modulation of axonal transport is selectively impaired in ALS. Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 121(2022).
  13. Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (11), 765-777 (2009).
  14. Fu, M. M., Holzbaur, E. L. F. Integrated regulation of motor-driven organelle transport by scaffolding proteins. Trends in Cell Biology. 24 (10), 564-574 (2014).
  15. Kumari, D., Ray, K. Phosphoregulation of kinesins involved in long-range intracellular transport. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 873164(2022).
  16. Wai Yau, K., et al. Cellular/molecular dendrites in vitro and in vivo contain microtubules of opposite polarity and axon formation correlates with uniform plus-end-out microtubule orientation. The Journal of Neuroscience. 36 (4), 1071-1085 (2016).
  17. Araki, Y., et al. The novel cargo Alcadein induces vesicle association of kinesin-1 motor components and activates axonal transport. The EMBO Journal. 26 (6), 1475-1486 (2007).
  18. Sobu, Y., et al. Phosphorylation of multiple sites within an acidic region of Alcadein α is required for kinesin-1 association and Golgi exit of Alcadein α cargo. Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3844-3856 (2017).
  19. Tsukamoto, M., et al. The cytoplasmic region of the amyloid β-protein precursor (APP) is necessary and sufficient for the enhanced fast velocity of APP transport by kinesin-1. FEBS Letters. 592 (16), 2716-2724 (2018).
  20. Ferro, L. S., Can, S., Turner, M. A., Elshenawy, M. M., Yildiz, A. Kinesin and dynein use distinct mechanisms to bypass obstacles. eLife. 8, e48629(2019).
  21. Chiba, K., Shimada, Y., Kinjo, M., Suzuki, T., Uchida, S. Simple and direct assembly of kymographs from movies using KYMOMAKER. Traffic. 15 (1), 1-11 (2014).
  22. Xu, S. -Y., Wu, Y. -M., Ji, Z., Gao, X. -Y., Pan, S. -Y. A modified technique for culturing primary fetal rat cortical neurons. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 803930(2012).
  23. Han, D., et al. Deciphering anomalous heterogeneous intracellular transport with neural networks. eLife. 9, e52224(2020).
  24. Araki, Y., et al. Novel cadherin-related membrane proteins, Alcadeins, enhance the X11-like protein-mediated stabilization of amyloid beta-protein precursor metabolism. The Journal of Biological Chemistry. 278 (49), 49448-49458 (2003).
  25. Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nature Protocols. 1 (2), 695-700 (2006).
  26. Tosolini, A. P., Villarroel-Campos, D., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Expanding the toolkit for in vivo imaging of axonal transport. Journal of Visualized Experiments. (178), e63471(2021).
  27. Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (33), 10515-10520 (2015).
  28. Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
  29. Basu, H., Ding, L., Pekkurnaz, G., Cronin, M., Kymolyzer Schwarz, T. L. a semi-autonomous kymography tool to analyze intracellular motility. Current Protocols in Cell Biology. 87 (1), 107(2020).
  30. Dixit, R., Ross, J. L., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. F. Differential regulation of dynein and kinesin motor proteins by tau. Science. 319 (5866), 1086-1089 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Neurony kory m zgu myszyanaliza transportu aksonalnegobia ka motorycznechoroby neurodegeneracyjnegenerowanie kymograf wtransport dwukierunkowytransfekcja bia ek adunkowychanaliza pr dko ci kierunkowejpolarno mikrotubul
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.