Artykuł metodologiczny

Metody badania optyki, fizjologii i biochemii oka złożonego muchy

24 marca 2023

 , 
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), Hebrew University

W tym artykule

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OMÓWIONE ARTYKUŁY:

Muñoz Arias, M., Douglass, J. K., Wehling M. F., Stavenga, D. G. Automatyczne tworzenie wykresów przestrzeni wizualnej oczu złożonych muchy domowej. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (181), E63643 (2022).

Wagner, K., Smylla, T. K., Zeger, M., Huber, A. Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila za pomocą białek znakowanych eGFP. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (179), E63375 (2022).

Gutorov, R., Katz, B., Minke, B. Elektrofizjologiczne metody pomiaru poziomu fotopigmentu w fotoreceptorach Drosophila. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (184), E63514 (2022).

Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. Oczyszczanie endogennych kanałów potencjału przejściowego receptora Drosophila. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (178), E63260 (2021).

Panda, A., Thakur, R., Kumari, A., Raghu, P. Analiza sygnalizacji lipidowej w fotoreceptorach Drosophila za pomocą spektrometrii mas. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (181), E63516 (2022).

Artykuł redakcyjny

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oko złożone muchy jest ważnym systemem modelu biologicznego do wyjaśniania podstawowych mechanizmów biologicznych. Niektóre z mechanizmów, które zostały zbadane przy użyciu tego systemu, obejmują: złożone widzenie oczu z prawie panoramicznym polem widzenia1; biofizyka, składanie białek i biogeneza światłoczułego receptora sprzężonego z białkiem G 2,3,4; system transdukcji sygnału za pośrednictwem fosfolipazy Cβ 5,6; Aktywacja i modulacja kanału TRP w tkance natywnej 5,6; montaż i funkcja wielobiałkowego kompleksu sygnalizacyjnego 7,8; struktura molekularna, biochemia i funkcja recyklingu inozytolowo-fosfolipidowego 9,10; oraz subkomórkowa translokacja białek sygnałowych za pośrednictwem sygnału11,12. Unikalna budowa anatomiczna i optyka oka ze złożonego muchy zostały szeroko zbadane, ujawniając podstawowe mechanizmy rozwojowe i zdolności widzenia.

Ten zbiór metod obejmuje prace czołowych naukowców, którzy opracowali i udoskonalili metody badania niektórych z powyższych mechanizmów w oku muchy. Muñoz i in. opisują metodę ilościowej analizy układu optycznego oka muchy, która zapewnia dokładny obraz oka złożonego i jego organizacji przestrzennej13. Metoda ta jest niezbędna do szczegółowego badania neuronalnego przetwarzania informacji wizualnych. Co ważne, podjęto wiele prób wyprodukowania sztucznych oczu inspirowanych biologią, które opierały się na badaniach ilościowych istniejących oczu złożonych. Wagner i in. wykorzystują głęboką pseudoźrenicę, unikalne zjawisko optyczne oka złożonego, oraz mikroskopię o wysokiej amplifikacji z optyczną neutralizacją rogówki do lokalizacji białek znakowanych eGFP w komórkach fotoreceptorów Drosophila 14. Metoda ta pozwala na wykrycie defektów strukturalnych w rabdomerach spowodowanych degeneracją fotoreceptorów oraz lokalizacją komórkową i transportem ważnych białek sygnałowych. Gutorov i wsp. wykorzystują pomiary elektrofizjologiczne z całego oka lub z pojedynczych komórek fotoreceptorów do pomiaru poziomu stanów fotopigmentu in vivo i ich modulacji przez określone mutacje w białkach sygnałowych15. Metoda ta wykorzystuje przemieszczenia ładunku w wizualnym stanie pigmentu (R) wywołane absorpcją fotonów, co skutkuje powstaniem drugiego stanu pigmentu, który jest stabilny w ciemności (M). Dodatkowa metoda wykorzystuje przedłużoną depolaryzację po wyłączeniu światła (PDA), która wykorzystuje ciemne bistabilne właściwości pigmentu wizualnego i różnice w widmach absorpcyjnych stanów R i M muchy. Ponieważ PDA zależy od konwersji dużej ilości fotopigmentu, nawet najmniejszy defekt w biogenezie fotopigmentu może prowadzić do łatwo wykrywalnego nieprawidłowego PDA. Rzeczywiście, mutanty Drosophila wykazujące nieprawidłowe PDA doprowadziły do odkrycia nowych białek sygnałowych. Znakomitym tego przykładem jest odkrycie nowego kompleksu białkowego składającego się z inaktywacji białka rusztowania, ale bez potencjału wtórnego D (INAD), specyficznej dla oka kinazy białkowej C (eyePKC), fosfolipazy Cβ (PLCβ) i kanału przejściowego potencjału receptora (TRP). Po raz pierwszy Liu i in. prezentują technikę oczyszczania kanału16 TRP Drosophila. Ta zmodyfikowana metoda oczyszczania powinowactwa wykorzystuje strategię konkurencji, która opiera się na mechanizmie składania kompleksu sygnalizacyjnego INAD. Strategia ta umożliwia oczyszczenie endogennego kanału TRP. Zgodnie z tą metodą, najpierw fragment PLCβ związany z kulkami Ni jest znakowany histydyną i używany do ściągania endogennego kompleksu białkowego INAD uzyskanego z homogenatów głowy Drosophila. Następnie fragmenty TRP, które są oznaczone nadmiernie oczyszczoną S-transferazą glutationową (GST), są dodawane do kulek Ni, aby konkurować z endogennym kanałem TRP związanym z INAD. Na koniec stosuje się chromatografię wykluczania wielkości w celu oddzielenia znakowanych fragmentów kanału TRP w supernatancie od endogennego kanału TRP. Panda i wsp. opisują czułą technikę identyfikacji i ilościowego oznaczania kilku klas lipidów w komórkach fotoreceptorów Drosophila przy użyciu spektrometrii mas17. Aktywacja PLCβ ma kluczowe znaczenie dla fototransdukcji, ponieważ prowadzi do hydrolizy bisfosforanu fosfatydyloinozytolu 4,5 (PI(4,5)P2) w błonie powierzchniowej. Ta reakcja ostatecznie prowadzi do aktywacji kanału TRP. Ponadto aktywność PLCβ powoduje powstawanie wielu gatunków lipidów. Zaproponowano, że kilka z tych gatunków lipidów może brać udział w aktywacji TRP i odgrywać kluczową rolę w funkcjonalnej organizacji fotoreceptorów w celu optymalizacji transdukcji sensorycznej. W badaniu przeprowadzonym przez Pandę i wsp.17 wyniki te oceniono poprzez wyizolowanie mutantów Drosophila zawierających wadliwe enzymy, które kontrolują poziomy określonych lipidów.

Oko muchy jest użytecznym systemem eksperymentalnym do wyjaśniania podstawowych mechanizmów w biologii. Potężna metodologia genetyczna opracowana u Drosophila może być wykorzystana do analizy i odkrycia białek sygnałowych zaangażowanych w fototransdukcję much. Zbiór ten szczegółowo przedstawia główne techniki badania podstawowych mechanizmów widzenia much, w tym anatomiczną i optyczną analizę złożonego oka oraz składników molekularnych i reakcji biochemicznych komórek fotoreceptorów. Artykuły wideo zawierają również ważne porady dotyczące nieodłącznych trudności związanych z tymi metodologiami. Taki zbiór metod powinien być również korzystny dla naukowców spoza tej dziedziny badań, ponieważ techniki te mogą być zaadaptowane do innych preparatów biologicznych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor nie ma żadnych podziękowań.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Douglass, J. K., Wehling, M. F. Rapid mapping of compound eye visual sampling parameters with FACETS, a highly automated wide-field goniometer. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 202 (12), 839-851 (2016).
  2. Xiong, L., et al. ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice. Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).
  3. Rosenbaum, E. E., et al. XPORT-dependent transport of TRP and rhodopsin. Neuron. 72 (4), 602-615 (2011).
  4. Vought, B. W., et al. Characterization of the primary photointermediates of Drosophila rhodopsin. Biochemistry. 39 (46), 14128-14137 (2000).
  5. Randall, A. S., et al. Speed and sensitivity of phototransduction in Drosophila depend on degree of saturation of membrane phospholipids. The Journal of Neuroscience. 35 (6), 2731-2746 (2015).
  6. Minke, B., Pak, W. L. The light-activated TRP channel: The founding member of the TRP channel superfamily. Journal of Neurogenetics. 36 (2-3), 55-64 (2022).
  7. Huber, A., et al. The transient receptor potential protein (Trp), a putative store-operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD. The EMBO Journal. 15 (24), 7036-7045 (1996).
  8. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  9. Raghu, P., Basak, B., Krishnan, H. Emerging perspectives on multidomain phosphatidylinositol transfer proteins. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (9), 158984(2021).
  10. Raghu, P., Yadav, S., Mallampati, N. B. Lipid signaling in Drosophila photoreceptors. Biochimica et Biophysica Acta. 1821 (8), 1154-1165 (2012).
  11. Bahner, M., et al. Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current. Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).
  12. Schopf, K., Huber, A. Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells. European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).
  13. Muñoz Arias, M., Douglass, J. K., Wehling, M. F., Stavenga, D. G. Automated charting of the visual space of housefly compound eyes. Journal of Visualized Experiments. (181), e63643(2022).
  14. Wagner, K., Smylla, T. K., Zeger, M., Huber, A. Studying membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells using eGFP-tagged proteins. Journal of Visualized Experiments. (179), e63375(2022).
  15. Gutorov, R., Katz, B., Minke, B. Electrophysiological methods for measuring photopigment levels in Drosophila photoreceptors. Journal of Visualized Experiments. (184), e63514(2022).
  16. Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. Purification of endogenous Drosophila Transient Receptor Potential channels. Journal of Visualized Experiments. (178), e63260(2021).
  17. Panda, A., Thakur, R., Kumari, A., Raghu, P. Analysis of lipid signaling in Drosophila photoreceptors using mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (181), e63516(2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

DrosophilaPhotoreceptor CellsMembrane Protein TraffickingPhotopigment LevelsElectrophysiological MethodsEndogenous ChannelsLipid SignalingMass SpectrometryVisualized Experiments

Powiązane artykuły