Model nawrotu glejaka po resekcji do badań terapeutycznych hydrożelu

Podsumowanie

Obecny protokół ustanawia model nawrotu glejaka (GBM) po resekcji za pomocą mikroskopii w celu zbadania efektu terapeutycznego wstrzykiwanego, bioresponsywnego hydrożelu in vivo.

Streszczenie

Nawrót nowotworu jest ważnym czynnikiem wskazującym na złe rokowanie w glejaku wielopostaciowym (GBM). Wiele badań ma na celu zidentyfikowanie skutecznych strategii terapeutycznych zapobiegających nawrotom GBM po operacji. Bioresponsywne hydrożele terapeutyczne zdolne do podtrzymywania leków uwalnianych miejscowo są często stosowane w miejscowym leczeniu GBM po operacji. Badania są jednak ograniczone ze względu na brak odpowiedniego modelu nawrotu GBM po resekcji. W tym przypadku opracowano model nawrotu GBM po resekcji, który został zastosowany w badaniach nad terapeutycznym hydrożelem. Model ten został skonstruowany w oparciu o ortotopowy wewnątrzczaszkowy model GBM, który jest szeroko stosowany w badaniach nad GBM. Resekcję subtotalną przeprowadzono na ortotopowym wewnątrzczaszkowym modelu myszy GBM w celu naśladowania leczenia klinicznego. Szczątkowy guz wykorzystano do wskazania wielkości wzrostu guza. Model ten jest łatwy do zbudowania, może lepiej naśladować sytuację chirurgicznej resekcji GBM i może być stosowany w różnych badaniach nad miejscowym leczeniem nawrotu GBM po resekcji. W rezultacie, model nawrotu GBM po resekcji zapewnia unikalny model nawrotu GBM do skutecznych badań nad leczeniem miejscowym nawrotu po resekcji.

Wprowadzenie

Glejak wielopostaciowy (GBM) jest najczęstszym nowotworem złośliwym spośród wszystkich nowotworów ośrodkowego układu nerwowego^1,2. Chirurgia jest leczeniem pierwszego rzutu u pacjentów z GBM, a chemioradioterapia jest głównym leczeniem uzupełniającym po operacji. Jednak nawrót nowotworu często rozwija się w ciągu 3-6 miesięcy u większości pacjentów z GBM przy różnych zabiegach^3,4,5. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania skuteczniejszych strategii leczenia, aby zapobiec nawrotom GBM.

Ostatnie badania nad GBM skupiały się głównie na guzach pierwotnych, a nie na nowotworach nawracających⁶. Jednak najczęstszym problemem, który należy rozwiązać w klinice, jest to, jak zahamować nawroty GBM po operacji. Dlatego badania nad nawrotami GBM po operacji wymagają większej uwagi. Bioresponsywne hydrożele terapeutyczne są najczęstszym wektorem stosowanym w badaniach nad nawrotami nowotworów po zabiegach chirurgicznych^7,8. Jednak ze względu na specyficzną budowę ośrodkowego układu nerwowego trudno jest opracować odpowiedni model nawrotu GBM po resekcji⁹, co ma kluczowe znaczenie dla badania nawrotu GBM.

To badanie wygenerowało ulepszony model nawrotu GBM po resekcji, oparty na ortotopowym wewnątrzczaszkowym modelu GBM używanym w badaniach nad pierwotnym GBM. W tym modelu większość guzów jest usuwana chirurgicznie za pomocą mikroskopii, a pozostałość guza jest wykrywana za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo i barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E). Model ten naśladuje stan resekcji u pacjentów z guzem mózgu i może być stosowany w różnych badaniach nad nawrotem GBM.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone i nadzorowane przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną oraz Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Nankinie (IACUC-1904004). Do niniejszego badania wykorzystano samice myszy C57BL/6J w wieku 6-8 tygodni. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów).

1. Przygotowanie zwierząt

1. Zważyć myszy i znieczulić je wstrzyknięciem dootrzewnowym 50 mg/kg pentobarbitalu sodu (patrz tabela materiałów). Podawać meloksykam (5 mg/kg mc.; i.p.) w celu znieczulenia okołooperacyjnego. Myszy należy trzymać w klatce w cyklu 12 godzin/12 godzin światło/ciemność, w temperaturze otoczenia 24 °C i wilgotności względnej 50%.
   UWAGA: W niniejszym badaniu początkowa waga myszy wynosiła około 22 g.
2. Usuń włosy z głowy myszy za pomocą golarki laboratoryjnej dla zwierząt i przymocuj głowę i kończyny do aparatu stereotaktycznego (patrz Tabela materiałów).
   UWAGA: Wysterylizuj cały sprzęt przed użyciem.
3. Zdezynfekuj głowę myszy za pomocą co najmniej trzech naprzemiennych rund peelingu chlorheksydynowego lub powidonowo-jodowego, a następnie alkoholu i przykryj mysz sterylnym serwetem chirurgicznym. Nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
4. Odetnij skórę głowy myszy około 1 cm wzdłuż linii środkowej na czubku prawego czoła nożyczkami okulistycznymi.
   UWAGA: Potwierdź chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia poprzez brak odruchu pedałowania przed wykonaniem nacięcia.
5. Dostrój aparat stereotaktyczny, aby upewnić się, że szew w jodełkę i przedni punkt ciemiączka znajdują się na tym samym poziomie.

2. Budowa ortotopowego wewnątrzczaszkowego modelu GBM

1. Zaznacz punkt 1 mm po przedniej stronie przedniego ciemiączka, 1,8 mm po prawej stronie przedniego ciemiączka i 3 mm w dół od przedniego ciemiączka za pomocą bawełnianego wacika nasączonego fioletem goryczkowym² (patrz tabela materiałów).
2. Wywierć punkt za pomocą mini wiertła czaszkowego o średnicy 1 mm (patrz Tabela materiałów), aby uzyskać pory o średnicy około 1 mm i głębokości 1 mm.
3. Usuń wysięk płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą sterylnego wacika.
4. Odessać 5 μl zawiesiny komórek nowotworowych (GL261-Luci, 5 × 10⁵ komórek zawieszonych w 5 μl PBS) za pomocą mikrostrzykawki.
   UWAGA: GL261-Luci został uzyskany ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów).
5. Wyrównać końcówkę igły mikrostrzykawki pionowo z otworem do wiercenia czaszki, włożyć, aż końcówka igły wejdzie w płaszczyznę czaszki na 3 mm i cofnąć igłę o 0,5 mm⁷.
6. Otworzyć mikrostrzykawkę i wstrzykiwać z prędkością 1 μl/min.
7. Zachować igłę przez 10 minut po wstrzyknięciu.
8. Powoli wyjąć mikrostrzykawkę i przycisnąć miejsce wstrzyknięcia sterylnym, suchym wacikiem.
9. Zszyj skórę głowy niewchłanialnym szwem chirurgicznym (10-0, patrz Tabela materiałów) i ponownie zdezynfekuj nacięcie.
10. Monitoruj stan zdrowia zwierzęcia i trzymaj je w ciepłych warunkach.
11. Przesuń mysz z powrotem do klatki obudowy po wybudzeniu myszy.
12. Wyobraź sobie mysz za pomocą systemu obrazowania bioluminescencyjnego in vivo (patrz tabela materiałów) w celu wykrycia przeszczepionego guza w 10 dniu po łożysku guza.
    UWAGA: Lucyferazy załadowanej do komórek GBM, GL261, użyto do obrazowania bioluminescencyjnego.
    1. Znieczulij mysz 1,5% izofluranem o natężeniu przepływu tlenu 0,6 l/min. Po potwierdzeniu głębokości znieczulenia poprzez brak odruchu pedałowania, wstrzyknij mysz dootrzewnowo fluoresceinę potasu (10 mg / ml, patrz tabela materiałów), a 11 s później wykonaj obrazowanie bioluminescencyjne in vivo. Gdy wartość fluorescencji osiągnie ~5 × 10⁵, procedura kończy się sukcesem.
       UWAGA: Znieczulić zwierzę przed obrazowaniem. Utrzymuj znieczulenie za pomocą stożka nosowego zasilanego odparowanym izofluranem.
13. Wybierz myszy z pomyślnym łożyskiem nowotworu, aby skonstruować model nawrotu GBM po resekcji.

3. Budowa modelu po resekcji nawrotu GBM

1. Gdy rozmiar guza u ortotopowych wewnątrzczaszkowych myszy GBM osiągnie ~ 6,5 × 10⁵, wybierz myszy do modelu nawrotu pooperacyjnego
.
2. Zważyć ortotopowe wewnątrzczaszkowe myszy modelowe GBM i znieczulić myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym 50 mg/kg sodu pentobarbitalowego. Podawać meloksykam (5 mg/kg mc.; i.p.) w celu znieczulenia okołooperacyjnego.
3. Powtórz proces kroków 1.2−1.5.
4. Oddziel tkankę skóry głowy od czaszki i sprawdź otwór wywiercony do budowy ortotopowego wewnątrzczaszkowego modelu GBM. Jeśli się zagoiła, zidentyfikuj dziurę za pomocą aparatu stereotaktycznego i postępuj zgodnie z procedurą opisaną w krokach 2.1-2.3.
5. Zwiększ średnicę otworu do 5 mm za pomocą wiertła do czaszki i usuń wysięk płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą sterylnego bawełnianego wacika.
6. Ustaw ostroskop na główce myszy i dostosuj ustawienia, aby upewnić się, że wiercony otwór znajduje się w środku pola widzenia.
7. Przeciąć opony mózgowe mikronożyczkami i usunąć część tkanki nowotworowej za pomocą mikrokirety i mikroskalpela pod mikroskopem.
   UWAGA: Jeśli chodzi o opony mózgowe, gdy czaszka jest otwarta, cienka błona w pobliżu tkanki mózgowej to opony mózgowe.
8. Zatamować krwawienie sterylną gazą i przemyć nacięcie sterylną solą fizjologiczną.
9. Wstrzyknąć dostępny w handlu hydrożel (10 μl, patrz tabela materiałów) do jamy resekcyjnej za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml, zszyć skórę głowy niewchłanialnym szwem chirurgicznym (10-0) i ponownie zdezynfekować nacięcie (Ryc. 1).
10. Monitoruj stan zdrowia zwierzęcia i utrzymuj mysz w cieple.
11. Przesuń mysz z powrotem do klatki obudowy po wybudzeniu myszy.
12. Wykonaj obrazowanie bioluminescencyjne in vivo, aby wykryć przeszczepiony guz 1 dzień później, aby określić ilościowo rozmiar resztkowego guza (Rysunek 2 i Rycina 3).
13. Waż myszy co 2 dni, aż do końcowego punktu końcowego.
    UWAGA: W niniejszym badaniu końcowym punktem końcowym był dzień 30, a myszy zostały poddane eutanazji przez przedawkowanie pentobarbitalu sodu we wstrzyknięciu dootrzewnowym.

Wyniki

Proces budowy modelu nawrotu GBM po resekcji jest pokazany w Rysunek 1. Pokazano jamę resekcję po częściowym usunięciu guza pod mikroskopem. Hydrożel wstrzyknięto do jamy resekcji za pomocą strzykawki, aby zademonstrować efekt terapeutyczny. Harmonogram projektu eksperymentalnego jest pokazany w Rysunek 2A. Po wszczepieniu komórek GBM do mózgu myszy, wzrost guza przetestowano za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo w 10 dniu. Resekcję wykonano w 11 dobie, a następnie hydrożel wstrzyknięto do jamy resekcji. Badanie obrazowania bioluminescencyjnego in vivo przeprowadzono w 15, 20, 25 i 30 dniu w celu monitorowania resztkowego wzrostu guza. Jak pokazano w Rysunek 2B,C, rozmiar guzów w modelu nawrotu GBM po resekcji był znacznie mniejszy niż w ortotopowym wewnątrzczaszkowym modelu GBM, jak wykazano w badaniach obrazowania bioluminescencyjnego in vivo. W 25 dniu guzy znacznie powróciły po resekcji (Ryc. 2D). Barwienie H&E potwierdziło, że model nawrotu GBM po resekcji został pomyślnie skonstruowany i że resztkowe guzy znacznie powróciły po resekcji (Figura 3A,B).

Rysunek 1: Śródoperacyjny widok resekcji guza i wstrzyknięcia hydrożelu. Część tkanki nowotworowej usunięto za pomocą mikrokirety i mikroskalpela pod mikroskopem, a następnie wstrzyknięto hydrożel do jamy resekcji. Podziałka skali: 50 μm. Ten rysunek został zmodyfikowany z Sun et al.¹⁰. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Harmonogram projektu eksperymentalnego i obrazowania bioluminescencyjnego in vivo myszy w wewnątrzczaszkowym i po resekcji modelu GBM. (A) Harmonogram projektu eksperymentalnego pokazujący, że resekcja została wykonana w dniu 11 i że obrazowanie bioluminescencyjne in vivo (IV) zostało wykonane w dniu 10, dniu 15, dniu 20, dniu 25 i dniu 30. (B) Wewnątrzczaszkowe myszy z modelem GBM wykazały duży rozmiar guza w dniu 10, (C) rozmiar guza został znacznie zmniejszony po resekcji w dniu 11 oraz (D) rozmiar guza zwiększył się po resekcji w dniu 25 w modelu GBM po resekcji. Grupę kontrolną stanowiły myszy z nawrotem GBM po resekcji, u których nie było leczono. W sumie w tym badaniu wykorzystano 42 myszy. Podziałka liniowa: 100 μm. Ten rysunek został zmodyfikowany z Sun et al.¹⁰. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Obraz barwienia tkanki mózgowej metodą H&E z modelu GBM po resekcji. (A) Obraz barwienia H&E pokazujący jamę resekcji, pozostałość guza i normalną tkankę mózgową. Tkanka mózgowa została pobrana 1 dzień po resekcji. (B) Obraz barwienia H&E pokazujący nawracający guz i normalną tkankę mózgową. Tkanka mózgowa została pobrana w 12 dniu po resekcji. Podziałka liniowa: 100 μm. Ten rysunek został zmodyfikowany z Sun et al.¹⁰. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Operacja pozostaje pierwszym wyborem dla większości pacjentów z GBM¹¹. Ze względu na charakterystykę inwazyjnego wzrostu GBM, niewielka liczba komórek nowotworowych nadal pozostaje po technikach mikroneurochirurgicznych, co prowadzi do ostatecznego nawrotu guza¹². Jak zahamować nawroty GBM po operacji, stało się przedmiotem badań związanych z GBM. Jednak ze względu na złożoną budowę anatomiczną tkanki mózgowej, podstawowym problemem do rozwiązania w tej dziedzinie stała się budowa odpowiedniego pooperacyjnego modelu GBM.

W tym badaniu opracowano model nawrotu GBM po resekcji. W procesie konstruowania tego modelu kluczowe znaczenie ma budowa ortotopowego wewnątrzczaszkowego modelu GBM. Po pomyślnym opracowaniu tego modelu, resekcja musi zostać wykonana we właściwym czasie. Zalecany czas to ten, w którym wartość fluorescencji wielkości guza wynosi około 6,5 × 10⁵. Aby zmniejszyć śmiertelność myszy, przeprowadzono resekcję w znieczuleniu z 40 mg/kg 1% pentobarbitalu sodu we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Jednak resekcja była trudna do wykonania, a myszy często poruszały się z powodu małej dawki środka znieczulającego. Na tej podstawie dawkę środka znieczulającego zwiększono do 50 mg/kg. Po zwiększeniu dawki środka znieczulającego odpowiedzi śródoperacyjne myszy zniknęły, a resekcja została przeprowadzona pomyślnie. W tym protokole można również stosować gaz izofluranowy.

W tym badaniu do opracowania modelu wykorzystano komórki GL261-Luci; w związku z tym do walidacji protokołu w przyszłości należy użyć więcej linii komórkowych GBM. Aby protokół był bardziej przekonujący, należy użyć różnych modeli myszy GBM, takich jak genetycznie modyfikowane modele myszy GBM. Ponadto rezonans magnetyczny może być najlepszym sposobem wykrywania nawrotu nowotworów po operacji.

Podsumowując, w niniejszej pracy opracowano model nawrotu GBM po resekcji. W tym modelu nawrót guza jest monitorowany poprzez ocenę resztkowego wzrostu guza po resekcji. Chociaż nie można uznać, że model ten całkowicie naśladuje nawrót guza, styl resekcji w tym modelu jest podobny do standardu maksymalnie bezpiecznej chirurgii w leczeniu klinicznym pacjentów z GBM. Praca ta stanowi wygodną i wykonalną metodę konstruowania modelu nawrotu GBM po resekcji i stanowi postęp w dziedzinie badań nad nawrotem GBM po resekcji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fiolet gencjanowy	Sigma	C6158
GL261-Luci	Shanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd.	ZQ0932
System obrazowania bioluminescencyjnego in vivo	Tanon	Tanon ABL X6
Laboratoryjna golarka dla zwierząt	Beyotime Biotechnology	FS600
Myszy	Pekin Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.
Mikro	łyżeczka Belevor Medical Co., Ltd.
Mikro skalpel	Belevor Medical Co., Ltd.
Mikroskop	Shanghai Xiangfan Instrument Co., Ltd	JSZ5A/B
Mikrostrzykawka	Hamilton	87943
Mini wiertarka czaszkowa	RWD	78001
Niewchłanialny szew chirurgiczny	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd.
Pentobarbital sodowy	ChemSrc	57-33-0
PVA-TSPBA hydrożel	Aladdin	9002-89-5
Aparat stereotaktyczny	RWD	68043