Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie funkcjonalnych endodermalnych organoidów wątroby

DOI:

10.3791/65027

⸱

2 maja 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Izmir Biomedicine and Genome Center, 2Department of Histology and Embryology, Health Science Institute, Dokuz Eylul University, 3Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Izmir Tinaztepe University, 4Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Dokuz Eylul University, 5Department of Pediatric Gastroenterology and Metabolism, Faculty of Medicine, Dokuz Eylul University, 6Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Koc University, 7Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Dokuz Eylul University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje wytwarzanie szybkich i powtarzalnych endodermalnych organoidów wątrobowych (eHEPO). Dzięki temu protokołowi eHEPO mogą być produkowane w ciągu 2 tygodni i rozwijać się w dłuższej perspektywie (ponad 1 rok) bez utraty swojego zróżnicowania i funkcjonalności.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologia organoidów pozwoliła nam wygenerować in vitro różnorodne mini struktury przypominające ludzkie narządy, takie jak wątroba, mózg i jelita. Niezwykłe postępy w modelach organoidowych otworzyły niedawno nową erę eksperymentalną dla różnych zastosowań w modelowaniu chorób, biologii rozwojowej i odkrywaniu leków. Dorosłe komórki macierzyste lub organoidy wątrobowe pochodzące z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) regulują wytwarzanie hepatocytów do wykorzystania w różnych zastosowaniach. W tym miejscu przedstawiamy solidny i powtarzalny protokół generowania organoidów wątrobowych z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Protokół ten ma zastosowanie do komórek zdrowych i pochodzących od pacjentów. Aby uzyskać organoidy wątrobowe 3D pochodzące z endodermy (eHEPO), iPSC najpierw bezpośrednio różnicowano w komórki endodermalne, a następnie wykorzystano komórki EpCAM (EpCAM+) wzbogacone w FACS do ustanowienia organoidów wątrobowych przy użyciu pożywki ekspansyjnej. Zapewniamy szybką i wydajną metodę generowania organoidów wątrobowych w ciągu 2 tygodni. Wygenerowane organoidy naśladują podstawowe właściwości i funkcje hepatocytów, takie jak wydzielanie albuminy, magazynowanie glikogenu i aktywność enzymu cytochromu P450. Oprócz podobieństw ekspresji genów specyficznych dla wątroby, eHEPO zawierają spolaryzowane komórki nabłonkowe z kanalikami żółciowymi pomiędzy nimi. Ponadto eHEPO mogą być ekspandowane i szeregowe pasaże długoterminowe (1 rok) bez utraty zdolności do różnicowania się w dojrzałe hepatocyty. W ten sposób eHEPO stanowią alternatywne źródło do produkcji funkcjonalnych hepatocytów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoidy to zminiaturyzowane struktury podobne do narządów hodowane w trójwymiarowych warunkach hodowli, które naśladują mikrośrodowisko narządu i obejmują wewnętrzne czynniki niezbędne do samoorganizacji i samoodnowy w samym rozwoju narządów. Organoidy mogą pochodzić zarówno z pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC), jak i dorosłych komórek pochodzących z tkanek (komórek macierzystych lub progenitorowych)1. Chociaż ich dokładna organizacja narządowa i funkcjonalne podobieństwo do konkretnego narządu sprawiają, że są one cennymi narzędziami do modelowania chorób, nadal wymagają dalszych ulepszeń w zakresie standaryzacji w hodowli. W szczególności opublikowano kilka protokołów wytwarzania organoidów wątrobowych, które różnią się złożonością i odtwarzalnością2. Na przykład organoidy pączków wątroby opracowane przez Takebe i wsp. mają postać gęstych, wielokomórkowych struktur zawierających następujące indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC): komórki progenitorowe endodermy wątroby, ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) i mezenchymalne komórki macierzyste (MSC). Organoidy te nie mają jednak długoterminowej zdolności do samoodnawianiasię 3,4.

Z perspektywy historycznej, Huch i in. po raz pierwszy opisali produkcję ludzkich organoidów nabłonka wątroby pochodzących z dorosłej tkanki, w której komórki polaryzują się i specjalizują w odtwarzaniu aspektów natywnego nabłonka5. Następnie Guan i in. wykorzystali organoidy wątrobowe pochodzące z iPSC do modelowania zespołu Alagille'a (ALGS), rzadkiego zaburzenia genetycznego związanego z redukcją dróg żółciowych w wątrobie6. Oba te organoidy mają zdolność samoodnawiania się i mogą uzyskiwać dojrzałe funkcje hepatocytów, takie jak wydzielanie żółci i albuminy, magazynowanie glikogenu i detoksykacja leków specyficzna dla wątroby. W niedawnym badaniu Ramli i in. wprowadzili model organoidu wątroby pochodzący z PSC zawierający funkcjonalne sieci kanalików żółciowych między spolaryzowanymi komórkami podobnymi do hepatocytów (HLC), które opróżniają leki cholesterolostatyczne do torbieli żółciowych złożonych z komórek podobnych do cholangiocytów (CLC)7.

W badaniu przedstawiono unikalną kulturę do generowania endodermalnych organoidów wątrobowych pochodzących z iPSC, zwanych eHEPOs. Opisano krok po kroku hodowlę iPSC i różnicowanie w endodermę, a także zademonstrowano wytwarzanie eHEPO ze wzbogaconych progenitorów EpCAM+. Na koniec opisano charakterystykę funkcjonalności i organizacji strukturalnej eHEPO, a także krioprezerwację organoidów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pozwolenia związane z etapami eksperymentalnymi uzyskano od lokalnej Komisji Etycznej ds. Badań Klinicznych Wydziału Medycznego Uniwersytetu Dokuz Eylul (2013/25-4, 12 maja 2013 r.; 2016/30-29, 24 listopada 2016 r.).

1. Przygotowanie roztworów do hodowli komórkowej

  1. Przygotować pożywkę różnicującą endodermę, mieszając następujące składniki w okapie z przepływem laminarnym: 1% B27, 100 ng/ml aktywiny A, Wnt3a lub 30% wnt3a-CM i R-spo1 lub 10% R-spo1-CM (patrz tabela materiałów).
  2. Przygotować aktywowany fluorescencją bufor do sortowania komórek (FACS) o następującym składzie: PBS, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, 1% FBS.
  3. Przygotuj pożywkę ekspandacyjną (EM): 1% N2, 1% B27, 1,25 mM N-acetylo-L-cysteiny, 50 ng/ml EGF, 10% pożywki kondycjonowanej R-spo1, 100 ng/ml FGF 10, 10 mM nikotynamidu, 5 μM A8301 i 10 μM forskoliny (FSK) w Advanced DMEM/F-12. Dodać 10 nM Y-27632 i 0,3 nM WNT3a (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Całe podłoże należy przechowywać maksymalnie przez 2 tygodnie w temperaturze 2-8 °C.
  4. Przygotować pożywkę różnicującą (DM): 1% N2, 1% B27, 10 nM gastryny, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml FGF 10, 25 ng/mL HGF, 500 nM A8301, 10 μM DAPT, 25 ng/ml BMP7 i 30 μM deksametazon w Ad-DMEM/F-12 (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Przechowywać całe podłoże przez 2 tygodnie w temperaturze 2-8 °C.

2. Rozmrażanie iPSC na płycie bez podajnika

  1. Pokryj płytkę hodowli komórkowej macierzą błony podstawnej (BMM).
    1. Rozmrozić jedną fiolkę podwielokrotności BMM przez noc na lodzie lub co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem powlekania. Dodaj 6 ml zimnego DMEM/F-12 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, natychmiast dodaj 80 μl rozmrożonego BMM i dobrze wymieszaj.
    2. Użyj płytek studzienkowych poddanych kulturom tkankowym, pokryj płytkę hodowlaną roztworem BMM i dozuj go, aby pokryć powierzchnię płytki studzienki. Inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę przed użyciem. Po upływie czasu inkubacji należy wyrzucić roztwór BMM i natychmiast dodać pożywkę specyficzną dla iPSC.
  2. Wyjąć jedną fiolkę iPSC z magazynu ciekłego azotu za pomocą rękawic kriogenicznych. Natychmiast umieścić fiolkę na pływającym stojaku na probówki i zanurzyć stojak w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do momentu stopienia się kryształków lodu.
    1. Wyjąć fiolkę z łaźni wodnej i dokładnie przetrzeć jej zewnętrzną powierzchnię 70% etanolem. Następnie umieść go w okapie laminarnym. Ważne jest, aby być szybkim na tym etapie.
    2. W warunkach aseptycznych, w kapturze laminarnym, przenieś rozmrożone komórki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml pożywki specyficznej dla iPSC.
      1. Odwirować komórki w temperaturze 200 × g (w temperaturze pokojowej) przez 3 minuty. Odrzucić sklarowany osad powoli, ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki specyficznej dla iPSC, kilkakrotnie delikatnie pipetując pipetą serologiczną o pojemności 5 ml i umieścić komórki w powlekanych studzienkach.
    3. Szybko przesuń płytkę, aby rozproszyć komórki na całej powierzchni studzienki. Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    4. Codziennie odświeżaj pożywkę hodowlaną.

3. Różnicowanie endodermy

  1. Pokryć nową płytkę dołka BMM przez 1 godzinę przed rozszczepieniem iPSC, jak wspomniano w sekcji 2.
  2. Kontroluj integralność i żywotność iPSC pod mikroskopem świetlnym. Niezróżnicowane iPSC to komórki z dużymi jądrami, małą cytoplazmą i zwartymi koloniami komórkowymi o wyraźnych krawędziach.
    UWAGA: Istnieją dwa enzymatyczne roztwory do rozszczepiania komórek. W przypadku stosowania dypazy (1 j./ml) należy usunąć obszary zróżnicowanych komórek. Jeśli używany jest określony enzym, nie ma potrzeby ręcznego różnicowania regionów za pomocą skrobania lub odsysania. Enzym należy przechowywać w temperaturze pokojowej.
  3. Podgrzej pożywkę iPSC do temperatury pokojowej. Zassać pożywkę i przepłukać płytkę iPSC za pomocą DMEM/F-12 lub D-PBS. Dodać 1 ml specyficznego enzymu do jednego dołka na płytce 6-dołkowej, inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, a następnie odessać specyficzny enzym i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 5-7 minut.
    UWAGA: Optymalny czas leczenia enzymami powinien być zoptymalizowany w oparciu o zastosowaną linię iPSC.
  4. Po czasie inkubacji dodać 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki iPSC i delikatnie postukać w bok płytki, aby oderwać niezróżnicowane agregaty kolonii od powierzchni płytki. Optymalna wielkość kruszyw to 50-200 μM.
    1. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml delikatnie wymieszaj zawiesinę, a następnie wysiew zawiesiny komórek o pożądanej gęstości na dołku pokrytym BMM. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 3-5 dni, aby osiągnąć zbieżność 70%.
  5. Przed rozpoczęciem różnicowania należy zastąpić pożywkę iPSC pożywką endodermą (krok 1.1). Odświeżaj podłoże każdego dnia. Kontroluj zmiany morfologiczne komórek podczas etapów różnicowania. Interakcje komórka-komórka zaczynają pojawiać się po różnicowaniu, a komórki nabierają kolczastego kształtu.

4. Utworzenie eHEPO

  1. Wykonaj wzbogacenie komórek endodermy EpCAM+ za pomocą FACS.
    1. Rozmrozić jedną fiolkę BMM specyficznego dla organoidów (patrz Tabela materiałów) na lodzie przed eksperymentem sortowania komórek. Płytki do hodowli tkankowych należy wstępnie ogrzać w temperaturze 37 °C przez noc przed eksperymentem sortowania komórek.
    2. Wypłucz komórki endodermy 1x PBS. Dodać 300 μl trypsyny i inkubować przez 5 minut w inkubatorze. Dodać 3 ml zimnego DMEM-F12 i pipetować za pomocą końcówek filtrujących o pojemności 1 000 μl, aby uzyskać pojedyncze komórki.
    3. Zawiesinę komórkową należy zebrać do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki w temperaturze 300 x g (w temperaturze pokojowej) przez 5 minut. Odrzucić supernatant i przemyć osad 10 ml buforu FACS (krok 1.2).
    4. Aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową, należy najpierw przefiltrować komórki za pomocą sitka o oczkach 100 μm, a następnie sitka o oczkach 40 μm.
      UWAGA: Przed użyciem sitka spłucz powierzchnię sitka 1 ml buforu FACS.
    5. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g (w temperaturze pokojowej) przez 5 minut. Policz numer komórki za pomocą Trypan Blue8.
    6. Stosunek do barwienia wynosi 1:11. Na przykład, ponownie zawiesić 15 x 106 ogniw ze 105 μl buforu FACS i dodać 45 μl FcR i 15 μl EpCAM (patrz tabela materiałów). Inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze 40 °C i chronić probówkę przed światłem. Po inkubacji dodać 500 μl buforu FACS w celu przepłukania zawiesiny komórek. Odwirować komórki w temperaturze 300 x g (w temperaturze pokojowej) przez 5 minut.
    7. Zawiesić osad w 500 μl buforu FACS. Dodaj DAPI (0,5 μM/1 ml, stężenie końcowe) do zawiesiny komórek, aby określić ilościowo martwe komórki. Utrzymuj komórki na lodzie do momentu rozpoczęcia etapu sortowania komórek.
  2. Osadź EpCAM i posortowane komórki w BMM. Po posortowaniu komórek należy odwirować komórki o sile 300 x g przez 5 minut, aby usunąć bufor FACS. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić 3 000-5 000 komórek w 20 μl BMM.
    1. Zasiej komórki, dodając kroplę BMM do środka każdej 48-dołkowej płytki. Inkubować komórki przez 2 minuty w temperaturze 37 °C, aż do zestalenia się BMM. Ostrożnie odwróć płytkę i trzymaj ją w inkubatorze przez kolejne 10 minut. Nałożyć kroplę na podłoże rozprężne (250 μl na studzienkę dla płytki 48-dołkowej).
    2. Odświeżaj podłoże organoidowe co 3 dni. W dniach 10-11 rozmiar organoidu będzie większy niż 100 μm.
  3. Wykonaj mechaniczną dysocjację i różnicowanie eHEPO.
    1. Podziel każdą kropelkę organoidu w stosunku 1:4. Aby rozdzielić, wyrzuć podłoże organoidowe i dodaj 500 μl zimnego Ad-DMEM/F12. Za pomocą końcówek filtrujących o pojemności 1 000 μl energicznie pipetuj kropelki BMM.
    2. Zebrać maksymalnie 10 kropelek BMM do stożkowych probówek o pojemności 15 ml i dodać 5 ml zimnego Ad-DMEM/F12. Trzymaj probówkę na lodzie przez 3-5 minut.
    3. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant do momentu, aż pozostanie 1 ml. Energicznie odpipetować granulkę komórkową 30-40 razy za pomocą końcówek filtrujących o pojemności 200 μl. Sprawdź rozmiar organoidu pod mikroskopem świetlnym, ostrożnie unikając tworzenia się zawiesiny jednokomórkowej.
    4. Po dysocjacji mechanicznej dodać 5 ml zimnego Ad-DMEM/F12 i odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Odrzucić supernatant i trzymać zawiesinę na lodzie do momentu wysiewu komórek.
    6. Wysiewać kroplę BMM o wielkości 50 μl (zawierającą 35 μl BMM + 15 μl komórek i Ad-DMEM/F-12 na dołek dla płytki 24-dołkowej).
    7. Dodać BMP7 (25 ng/ml, patrz tabela materiałów) do pożywki EM i hodować przez 3 dni. W 4. dniu zastąp pożywkę pożywką różnicującą (krok 1.4). Odświeżaj pożywkę co 3 dni i hoduj komórki przez co najmniej 14 dni.

5. Charakterystyka eHEPO

  1. Wykonaj badania histologiczne.
    1. Wykonaj zatapianie parafiny.
      1. Usuń pożywkę, dodaj 1-2 ml zimnego 1x PBS i delikatnie ponownie zawieś BMM w zimnym 1x PBS. Ostrożnie przenieść organoidy do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Pozwól organoidom osiąść pod wpływem grawitacji, a następnie ostrożnie zassaj PBS. Powtórz krok prania trzy razy.
      2. Dodać 10 ml świeżego utrwalacza (10% neutralnej buforowanej formaliny) do organoidów i inkubować przez 30 minut. Delikatnie usuń utrwalacz, dodaj 10 ml zimnego 1x PBS i inkubuj przez 10 minut. Ostrożnie zassać PBS.
      3. Wybarwić organoidy w 0,5% roztworze eozyny (patrz tabela materiałów) rozpuszczonym w 96% etanolu przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
        UWAGA: Jeśli ma być wykonane barwienie immunologiczne, nie barwić eozyną.
      4. Odwodnić organoidy, myjąc je serią alkoholi (70% etanolu, 80% etanolu i 96% etanolu) przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Namocz organoidy w 100% etanolu (etanolu absolutnym) przez 30 minut.
      5. Oczyścić organoidy za pomocą ksylenu (patrz tabela materiałów) trzy razy przez 20 minut za każdym razem9.
        UWAGA: Ksylen jest bardzo toksycznym i łatwopalnym związkiem, dlatego należy obchodzić się z nim przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego. Unikaj pracy w dużych ilościach.
      6. Delikatnie przenieś organoidy do wstępnie podgrzanej metalowej formy bazowej (patrz tabela materiałów) ze stopioną parafiną za pomocą plastikowej pipety. Trzymać organoidy w stopionej parafinie trzy razy przez 30 minut każdy w inkubatorze o temperaturze 65 °C (przy każdej zmianie zastępować je nową, świeżą stopioną parafiną).
      7. Następnie osadź organoidy w nowej świeżej parafinie. Delikatnie przenieś organoidy na środek metalowej formy podstawowej.
        UWAGA: Na tym etapie bardzo ważna jest szybka praca, ponieważ parafina krzepnie w temperaturze pokojowej.
      8. Przenieś metalową podstawę formy na zimną płytę na 10-20 s, aby ustabilizować organoidy. Następnie wlej stopioną parafinę, aby przykryć metalową formę podstawy i dodaj kasetę na chusteczki (patrz Tabela materiałów) na górze metalowej formy do etykietowania. Upewnij się, że w formie znajduje się wystarczająca ilość parafiny, a następnie pozwól im zestalić się na zimnej płycie. Usuń metalową podstawę formy.
      9. Ciąć odcinki o grubości 5-7 μm za pomocą standardowego mikrotomu (patrz Tabela materiałów). Umieść seryjne skrawki parafiny na samoprzylepnych szkiełkach mikroskopowych. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc.
    2. Wykonaj barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz kwasem okresowym Shiff (PAS).
      1. Umieścić szkiełka zatopione w parafinie w inkubatorze o temperaturze 63 °C na noc w celu odparafinowania. Następnego dnia umieść szkiełka w ksylenie trzy razy na 20 minut za każdym razem. Nie dopuścić do wyschnięcia szkiełek.
      2. Nawilżaj szkiełka za pomocą serii stopniowanych alkoholi (100% etanolu, 96% etanolu, 80% etanolu i 70% etanolu) przez 2 minuty. Następnie umieść szkiełka w wodzie destylowanej na 1 minutę.
      3. W przypadku barwienia H&E wykonaj następujące czynności.
      4. Umieść szkiełka w roztworze hematoksyliny na 5 minut. Opłucz szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut. Szkiełka należy barwić 1% roztworem eozyny Y (patrz tabela materiałów) przez 10 sekund.
      5. Odwodnić sekcje serią 80% etanolu, 96% etanolu i dwiema zmianami 100% etanolu przez 30 sekund każda.
      6. Włóż szkiełka do ksylenu w celu oczyszczenia trzy razy po 20 minut za każdym razem.
      7. Ostrożnie zamontować szkiełka nakrywkowe na sekcjach na szkiełkach za pomocą środka montażowego (patrz Tabela materiałów). Upewnij się, że nie pozostały żadne bąbelki.
      8. W przypadku barwienia PAS wykonaj kroki 5.1.2.4-5.1.2.6, a następnie procedury barwienia PAS opisane przez Akbari i wsp.10. Następnie ostrożnie zamontuj szkiełka nakrywkowe na sekcjach na szkiełkach za pomocą medium montażowego. Upewnij się, że nie pozostały żadne bąbelki.
    3. Wykonaj barwienie immunohistochemiczne (IHC).
      1. Wykonaj kroki 5.1.2.1 i 5.1.2.2 w protokole barwienia BHP.
      2. Podgrzewać szkiełka w 0,1 M buforze cytrynianowym (pH 6,0) w kuchence mikrofalowej przez 10 minut.
      3. Przytrzymaj, aż szkiełka ostygną do temperatury pokojowej (około 20 min) i spłucz je wodą destylowaną.
      4. Szkiełka wkładamy do świeżo przygotowanego 3%H2O2w metanolu na 10 min w temperaturze pokojowej. Następnie płucz szkiełka w wodzie destylowanej przez 1 minutę.
      5. Zablokować niespecyficzne wiązanie przeciwciał starterowych poprzez inkubację skrawków z roztworem blokującym (2% surowicy + 0,1% Triton X-100 + 0,1% BSA) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
      6. Delikatnie usunąć roztwór blokujący i dodać przeciwciała pierwszorzędowe (E-CAD, ALB, EpCAM, A1AT, CK19) (patrz tabela materiałów) rozcieńczone w roztworze blokującym w temperaturze 4 °C przez noc.
      7. Następnego dnia dokładnie spłukać szkiełka dwa razy przez 10 minut (.
      8. Dodać przeciwciała drugorzędowe (Koza Anty-Królik, Koza Anty-Mysz) (patrz Tabela Materiałów) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i płukać szkiełka w wodzie destylowanej przez 5 minut (trzy razy).
      9. Przygotować roztwór tetrachlorowodorku 3'3 diaminobenzydyny (DAB, patrz tabela materiałów) (należy go przygotować 30 minut przed użyciem).
      10. Nałóż roztwór DAB na szkiełka na 1-5 minut i płucz szkiełka w wodzie destylowanej przez 5 minut (trzy razy).
      11. Skrawki należy przeciwbarwić hematoksyliną przez 1 minutę i płukać szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 1 minutę.
      12. Odwodnić sekcje serią 80% etanolu, 96% etanolu i dwiema zmianami 100% etanolu przez 30 sekund każda.
      13. Włóż szkiełka do ksylenu na 20 minut (trzy razy).
      14. Ostrożnie zamontuj szkiełko nakrywkowe na części szkiełka za pomocą medium montażowego. Upewnij się, że nie pozostały żadne bąbelki.
    4. Wykonaj osadzanie OCT.
      1. Utrwalić organoidy za pomocą świeżo przygotowanego zimnego 4% PFA przez noc w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć utrwalacz i myć 1x PBS przez 15 minut (trzy razy).
      2. Przygotuj 30% roztwór sacharozy (w/v) używając wody destylowanej. Usuń 1x PBS i dodaj 30% sacharozy, aby odwodnić organoidy.
      3. Inkubować organoidy w temperaturze 4 °C przez noc. Początkowo większość tkanek unosi się w 30% sacharozy i opada po zakończeniu przenikania. W tym momencie krioochronę można uznać za kompletną.
      4. Przygotuj suchy lód lub ciekły azot do procesu zatapiania.
      5. Umieść dwie do trzech kropli OCT (patrz Tabela Materiałów) do plastikowych krioform. Umieść organoidy na wierzchu w odpowiedniej orientacji do cięcia.
      6. Powoli i ostrożnie wylej OCT na organoidy. Uważaj, aby uniknąć bąbelków. Pozwól organoidom osiąść pod wpływem grawitacji przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej.
      7. Oznacz krioformy przed etapem zamrażania. Umieść foremki na suchym lodzie lub ciekłym azocie w celu szybkiego zamrożenia. Przenieść krioformy do temperatury -80 °C i przechowywać je tam do czasu procesu cięcia.
    5. Wykonaj barwienie immunofluorescencyjne (IF).
      1. Wykonaj barwienie zamrożonych sekcji.
        1. Suszyć kriosekcje na powietrzu przez 20-30 minut w temperaturze pokojowej. Nawadniaj szkiełka wodą destylowaną przez 5 minut (trzy razy). Otocz tkankę barierą hydrofobową za pomocą pisaka (patrz Tabela Materiałów).
        2. Dodać 200-300 μl 0,2% Triton X-100 na sekcję. Ostrożnie myj szkiełka przez 5 minut (trzy razy). Upewnij się, że sekcje nie spadają z szkiełek podczas etapów mycia.
        3. Dodaj roztwór blokujący (2% surowicy + 0,1% Triton X-100 + 0,1% BSA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
        4. Delikatnie usunąć roztwór blokujący, dodać przeciwciała pierwszorzędowe (E-CAD, A1AT, HNF4α) rozcieńczone w roztworze blokującym (patrz Tabela materiałów) i inkubować szkiełka przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia ostrożnie płukać szkiełka przez 10 minut (dwa razy).
        5. Dodać odpowiednie przeciwciała drugorzędowe (Alexa Fluor 488 [Mysz], Alexa Fluor 594 [Mysz], Alexa Fluor 594 [Królik]) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (patrz Tabela Materiałów) i płukać szkiełka w wodzie destylowanej przez 5 minut (trzy razy).
        6. Dodaj 100-200 μl barwnika jądrowego Hoechst lub DAPI na sekcję przez 3 minuty, umyj szkiełka 1x PBS i powtórz krok mycia trzy razy.
        7. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na sekcjach na szkiełkach za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu. Preparaty należy przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C i chronić je przed światłem do czasu zakończenia procesu obrazowania.
      2. Wykonaj barwienie całego mocowania.
        1. Wykonaj kroki 5.1.1.1 i 5.1.1.2 w procedurze zatapiania parafiny.
        2. Dodać roztwór blokujący (0,1%-1% Triton X-100, 1% DMSO, 1% BSA i 1% surowicy koziej w 1x PBS, patrz Tabela Materiałów) i inkubować organoidy z roztworem blokującym przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej.
        3. Delikatnie usunąć roztwór blokujący i dodać przeciwciała pierwszorzędowe (CK19, CK18, ZO-1, ALB) rozcieńczone w roztworze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C (patrz tabela materiałów).
        4. Następnego dnia delikatnie usuń roztwór i dodaj 1x PBS. Pozwól organoidom osiąść pod wpływem grawitacji do 10 minut. Ostrożnie usuń roztwór i powtórz krok mycia trzy razy.
        5. Inkubować organoidy z przeciwciałami drugorzędowymi (Alexa Fluor 594 [Mysz], Alexa Fluor 488 [Królik], Alexa Fluor 488 [Mysz]) przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usuń roztwór i powtórz etap mycia cztery razy.
        6. W przypadku barwienia jądrowego inkubować organoidy z barwnikiem jądrowym Hoechst lub DAPI przez 10 minut. Umyj organoidy, dodając 1x PBS i powtórz krok mycia trzy razy. Niech organoidy osiądą na dnie probówki.
        7. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura usuń organoidy z probówki i umieść je na szkiełkach podstawowych. Upewnij się, że robisz to przy minimalnym uszkodzeniu organoidów.
        8. Usuń nadmiar PBS i dodaj pewną ilość (jedną do dwóch kropli) podłoża montażowego. Ostrożnie zamontować szkiełka nakrywkowe na organoidach na szkiełkach podstawowych za pomocą medium mocującego. Szkiełka należy utrzymywać w temperaturze 4 °C i chronić je przed światłem aż do zakończenia procesu obrazowania.
  2. Wykonaj mikroskopię elektronową.
    1. Utrwalić organoidy roztworem Karnovsky'ego (2,5% buforowanego aldehydu glutarowego + 2% paraformaldehydu w 0,1 M buforze fosforanu sodu [bufor Sorensena], pH 7,4, patrz tabela materiałów) przez noc w temperaturze 4 °C.
    2. Przemyć organoidy 0,1 M buforem Sorensona + 0,1 M sacharozą (1:1) przez 15 minut (trzy razy). Następnie umieścić organoidy w 2% tetratlenku osmu buforowanym fosforanem sodu (patrz tabela materiałów) przez 90 minut.
    3. Osadź organoidy w 2% ciepłym agarze . Odetnij nadmiar agaru wokół organoidów za pomocą lancetu. Myć organoidy w buforze Sorensena przez 15 minut (trzy razy).
    4. Odwodnić za pomocą 50% acetonu przez 15 minut (dwa razy).
    5. Porównać przez noc, stosując 70% acetonu + 1% kwasu fosfowolframowego + 0,5% octanu uranylu (patrz tabela materiałów) w temperaturze 4 °C.
    6. Następnego dnia odwodnić organoidy za pomocą serii acetonu (80% acetonu, 90% acetonu, 96% acetonu i 100% acetonu) przez 15 minut (dwa razy).
    7. Oczyścić organoidy za pomocą tlenku propylenu przez 10 minut (dwa razy), a następnie umieścić organoidy w mieszaninie epon:tlenek propylenu (patrz tabela materiałów) na 30 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Dodać nowy roztwór epon do organoidów i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    9. Następnego dnia wlej nowy świeży roztwór epon do formy podstawowej, a następnie osadź organoidy. Umieścić w inkubatorze na 48 godzin w temperaturze 65 °C w celu polimeryzacji.
    10. Wyciąć bloki eponów organoidowych za pomocą ultramikrotomu ustawionego na grubość przekroju 50-100 nm. Ułóż sekcje w formowane siatki pokryte.
  3. Zmierz aktywność enzymu CYP3A4.
    1. Zmierz aktywność CYP za pomocą dostępnego w handlu zestawu (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Enzymy CYP przekształcają substrat w wykrywalny produkt pośredni 11,12,13. Istnieją dwie opcje (lityczna i nielityczna komórkowa) pomiaru aktywności enzymu CYP. Zestaw zawiera aplikację do analizy podstawowej aktywności CYP i indukowanej aktywności CYP po leczeniu związkiem.
    2. Uruchom eksperyment w trzech egzemplarzach. Odczytaj luminescencję za pomocą luminometru i oblicz sygnał. W celu normalizacji trypsynizuj organoidy i policz liczbę komórek.
  4. Przeprowadzić kwantyfikację albuminy ludzkiej.
    1. Zastąp pożywkę do hodowli komórkowej świeżą pożywką na 24 godziny przed testem ELISA. Po 24 godzinach inkubacji zebrać pożywkę do hodowli komórkowych (300-500 μl) i odwirować przy 500 x g (w temperaturze 4 °C) przez 2 minuty w celu usunięcia resztek komórek i cząstek. Podwielokrotnić supernatant i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C (do 3 miesięcy).
    2. Uruchom standard i próbkę w dwóch egzemplarzach. Dojrzałe organoidy wydzielają albuminę do pożywki hodowlanej; określić ilościowo tę albuminę za pomocą zestawu do oznaczania ilościowego ELISA (patrz tabela materiałów). Zmierzyć absorbancję za pomocą czytnika płytek ELISA przy długości fali 450 nm w ciągu 30 minut po zatrzymaniu dodawania roztworu. Trypsynizuj organoidy i policz liczbę komórek do normalizacji.
  5. Wykonać test eliminacji amoniaku.
    1. Przeprowadzić test eliminacji amoniaku zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). Na krótko dodać 1,5 mM NH4Cl do pożywki hodowlanej i inkubować przez 24 godziny.
    2. Po inkubacji oznaczyć stężenie amoniaku za pomocą zestawu do oznaczania amoniaku (patrz tabela materiałów). Oblicz pomiary za pomocą wielomodowego czytnika wielopłytkowego i znormalizuj wartości do numerów komórek.
  6. Wykonać test choliloglicylamamidofluoresceiny (CLF).
    1. Krótko mówiąc, potraktować organoidy 10 μmol/l CLF (patrz tabela materiałów) i inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Po inkubacji przemyć organoidy 1x PBS. Wykonaj obrazowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
  7. Wykonaj analizę ekspresji genów.
    1. Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu RNeasy (patrz tabela materiałów), aby wyizolować całkowite RNA z eHEPOs.
    2. Przygotować reakcję PCR przy użyciu dostępnej w handlu mieszanki wzorcowej (patrz tabela materiałów), postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Po przygotowaniu mieszanki PCR dla każdego zestawu starterów, umieścić 10 μl każdej próbki w 96-dołkowych płytkach qPCR (Tabela 1).
    3. Uszczelnij płytki klejem uszczelniającym, a następnie odwiruj płytki o sile 1 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Załaduj płytki do maszyny do PCR. Znormalizować względną ekspresję genów do kontroli wewnętrznej (RPL41, Tabela 1) i przeanalizować przy użyciu metody 2−ΔΔCt 14.

6. Kriokonserwacja eHEPO

  1. Oznacz kriowiale markerem odpornym na działanie azotu. Sprawdź poziom izopropanolu w pojemniku do zamrażania i utrzymuj go w temperaturze 4 °C przez 15-30 minut przed rozpoczęciem eksperymentu.
  2. Zamrozić jedną kroplę BMM o pojemności 50 μl w jednym kriowiale. Postępuj z mechaniczną dysocjacją organoidów zgodnie z opisem w kroku 4.3. Po dysocjacji ponownie zawiesić agregat komórkowy w 500 μl zimnego podłoża do zamrażania, a następnie delikatnie przenieść zawiesinę do kriowiali i przechowywać je w pojemniku do zamrażania.
  3. Przenieść pojemnik do zamrażania komórek do temperatury -80 °C, a po 24 godzinach przenieść kriowiale do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.

7. Rozmrażanie eHEPO

  1. Podgrzej łaźnię wodną i Ad-DMEM/F12 do temperatury 37 °C.
  2. Wyjąć jedną fiolkę eHEPO z magazynu ciekłego azotu za pomocą rękawic kriogenicznych. Umieścić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do momentu, aż kryształki lodu się stopią. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C.
  3. Odessać supernatant i przystąpić do wysiewu eHEPOs zgodnie z opisem w sekcji 4. Na kroplę BMM nałożyć podłoże rozprężne uzupełnione o 10 μM Y-27632 (patrz Tabela Materiałów). Odświeżaj podłoże co 3 dni, a inhibitor ROCK usuwaj po 3 dniach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po pierwsze, ludzkie komórki fibroblastów lub komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) zostały wyhodowane i przekształcone w iPSC poprzez przeprogramowanie episomalne. Świeża surowica nokautująca była niezbędna do uzyskania zdrowych iPSC. Następnie iPSC wysiewano na płytkach hodowlanych pokrytych BMM z konfluencją 50%-60%. Posiadanie kolonii iPSC o małych/średnich rozmiarach poprawiło skuteczność różnicowania. Następnie iPSC różnicowano w ostateczną endodermę z pożywką zawierającą czynniki Activin A, Wnt3a i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy protokół opisuje kompleksową metodę wytwarzania, namnażania i zamrażania/rozmrażania organoidów wątrobowych, zaczynając od iPSC. Protokół ten obejmuje wszystkie etapy, w tym hodowlę iPSC na paszy i hodowli bezkarmowej, 2-wymiarowe różnicowanie endodermy, wzbogacanie komórek progenitorowych w FACS i tworzenie organoidów oraz generowanie organoidów zyskujących funkcję. Ponadto znajdują się tam również szczegółowe instrukcje dotyczące walidacji i charakterystyki organoidów. Główną przeszkodą w szerokim zastosowani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia. Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów. Esra Erdal jest współzałożycielką firmy biotechnologicznej ORGANO-ID.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania te były wspierane przez Turecką Radę Badań Naukowych i Technologicznych (TÜBİTAK) w ramach projektów SBAG-115S465 i SBAG-213S182. Rysunek 1 został wygenerowany przy użyciu BioRender.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stożkowe probówki wirówkowe 15 mlCorning430052
37 &stopnie; C Łaźnia wodnaNü Ve210.NB9
37 &stopnie; C, inkubator 5 % CO2Memmert powiedział:INCO 153 powiedział:
Stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 mlCorning430290
70 &mikro; m oraz 40 i mikro; m Sitko komórkoweSokół352350/ 352340
70% etanoluSigma1009832511
A1ATKsięga Abcamab166610 powiedział:Rozcieńczenie: 1/500 (IF), 1/50 (IHC)
A-83.01 (inhibitor TGF-&beta)Tocris Biosciene2939
AcetonIsolab (Laboratorium Isolab)9,01,026
Samoprzylepne szkiełko mikroskopoweWiązanie histobondemC981040
Zaawansowany aparat DMEM-F12Gibco (firma Gibco)12634-010
AFPKsięga Abcamab3980 powiedział:Rozcieńczenie: 1/25 (IHC)
AgarEMS10200
ALBKsięga Abcamab10241 powiedział:Rozcieńczenie: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Mąka Alexa 488 (mysz)InvitrogenA11001Rozcieńczenie: 1/1000 (IF)
Mąka Alexa 488 (Królik)InvitrogenA110034Rozcieńczenie: 1/1000 (IF)
Mąka Alexa 594 (mysz)InvitrogenA11005Rozcieńczenie: 1/1000 (IF)
Mąka Alexa 594 (Królik) InvitrogenNr kat. A11037Rozcieńczenie: 1/1000 (IF)
Zestaw do oznaczania amoniakuSigma-AldrichMAK-310
Kloryd amonuSanta CruzSC-202936 powiedział:
B27 Suplement 50xGibco (firma Gibco)12587010
Forma bazowaSakura Sakura4216
b-FGF (Fundusz Finansowy)Peprotech100-18 mld
Bezpieczeństwo biologiczne, KLASA II, SZAFA BEZPIECZEŃSTWAThermoBEZPIECZNY 2020
Pipety kalibrowaneGilsonF167380
WirówkaEppendorf powiedział:5702
CholiglicylamamidofluoresceinaCorning451041
Bufor cytrynianowy pH 6,0Bio-optica (biooptyka)Zobacz materiał 15-M103
CK-18 powiedział:Santa CruzSC-51582Rozcieńczenie: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
CK-19 powiedział:Santa CruzSC-6278 powiedział:Rozcieńczenie: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Mikroskop konfokalnyZeissZobacz materiał LSM880
Rękawice kriogeniczne i ochrona oczuKriokit5274
KriostatKsięga LeicaCM 1950
Probówki kriowialneCorning430659
DABRoche11718096001
DAPT (Język angielski)Sigma-AldrichA5942 powiedział:
DeksametazonSigma-AldrichZobacz materiał D4902
Usuwać Technologie komórek macierzystych7923
DMEM F12Gibco (firma Gibco)31330038
Oprogramowanie E-CADSanta CruzSC-8426 powiedział:Rozcieńczenie: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
EDTAInvitrogen15575-020
Mikroskop elektronowyZeissSigma500 powiedział:
Zestaw ELISAFortis nauki przyrodnicze bethylE88-129
Zestaw do osadzania Embed 812EMS14121
Entellan (Entellan)Merck107961
Eozyna Y %1Sigma-AldrichHT110332
EpCAM (Protokół EpCAM)Miltenyi Biotec130-059-901Rozcieńczenie: 1/11 (FACS)
EtanolMerck1,00,98,32,511
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco (firma Gibco)26010066
Forskolina (FSK)Tocris Biosciene1099
Pojemnik do zamrażania (Mr. Frosty)Thermo5100-0001
Zamrażanie podłożaGibco (firma Gibco)12648010
Szklana pipeta PasteuraIsolab (Laboratorium Isolab)084.01.001
Glutamax 100xGibco (firma Gibco)35050-068
Aldehyd gluterowy %25, klasa EMEMS16210-1L
Kozioł Anty-Myszy HRPRybak termiczny62-6520Rozcieńczenie: 1/1000 (IHC)
Kozioł anty-królik HRPRybak termiczny31460Rozcieńczenie: 1/1000 (IHC)
Kozia surowicaGibco (firma Gibco)162-10-072
H2O2Merck107209
HematoksylinąMiliporyHX86017674
HEPES, 1 MGibco (firma Gibco)15630-056
HNF-4&alfa;Księga Abcamab55223 powiedział:Rozcieńczenie: 1/50 (IHC)
Lód i suchy lóddomowej robotydomowej roboty
Inkubator (65 ° C)Nü VeNorma EN 400
IzopropanolSigma-Aldrich24137
Leu15 Gastrin I człowiekSigma-AldrichZobacz materiał G9145
LuminometrTechnika BertholdaLB 960
Mistrz mieszanki Biosystemy stosowane43676659
Matryca Matrigel, kwalifikowana do badania klinicznego zaleceń macierzystych ESCCorning354277
Matryca Matrigel, wolna od czerwieni fenolowejCorning356231
MetanolMerck179337
Probówki do mikrowirówekAxygen (Axigen)321-02-501
MikroskopZeissAXIO VERT A1
Ostrze mikrotomuPióroS35, C35
mTeSR1 powiedział:Technologie komórek macierzystychSC-05850 powiedział:
Wielodołkowe płytki do hodowli zawiesinySarstedt powiedział:83,39,21,500
Suplement N2 100xGibco (firma Gibco)17502048
N-acetylocysteinaSigma-AldrichA9165 (wersja angielska)
Neutralna buforowana formalina %10TekkimTK.60161.05001
NikotynamidSigma-AldrichN0636 powiedział:
Aminokwasy endogenne (NEAA)Gibco (firma Gibco)11140050
PAŹTka tkankowa4583
Tetrtlenek osmuEMS19110
Zestaw do testów P450-Glo Preparat PromegaZobacz materiał V9001
Pióro papkoweSigmaZ377821-1EA
ParafinaTekkimTK.200661.01002
Zestaw plam PASKsięga Abcamab150680 powiedział:
PBSLonzabe17-516 powiedział:
Penicylina/StreptomycynaGibco (firma Gibco)15630-056
Kwas fosfotungustynowyTeda Pella19402
Przystawka do pipetAxygen (Axigen)Motopet-1
Czytnik płytek varioskan flash Thermo5250040
Przedłuż mocowanie zapobiegające blaknięciuInvitrogenZobacz materiał P36980 powiedział:
Tlenek propylenu, klasa EMEMS20401
System Real Time PCRBiosystemy stosowane7500 Szybki 
Rekombinowana ludzka aktywina AR& D338-AC-050
Rekombinowany ludzki BMP7Peprotech120-03
Rekombinowany ludzki EGFPeprotechAF-100-15
Rekombinowany ludzki FGF10Peprotech100-26
Rekombinowany ludzki FGF19Peprotech100-32
Rekombinowany ludzki HGFPeprotech100-39
Inhibitor kinazy Rho, dichlorowodorek Y-27632Sigma-AldrichY0503 powiedział:
Probówka 1,5 ml wolna od RNaz/DNazAxygen (Axigen)31108101
Końcówki filtrów wolne od RNaz/DNazSarstedt powiedział:703031255
Mikrotom obrotowyKsięga LeicaZobacz materiał RM 2245
RPMI 1640 ŚredniGibco (firma Gibco)61870010
Pożywka kondycjonowana Rspo1Domowej roboty
Wzorzec slajdówBio-optica (biooptyka)15-MEQ001 powiedział:
Sorenson' s Bufor fosforanowyEMS11600-10
SpinnerThermoMÓJ SPIN 6
Sterylne pipety serologiczneSokół357543
Kaseta na tkankiKsięga Leica3802240
TrymerKsięga LeicaEM TRIM2
Tryton X-100Thermo Scientific28314
Enzym ekspresowy TrypLEGibco (firma Gibco)12605010
Trypsyna-EDTAGibco (firma Gibco)25200-056
UltramikrotomKsięga LeicaEM UC7
Octan uranyoctanuEMS22400
WirThermo88880018
Białko fuzyjne Wnt Surrogate-FcOdporność immunologicznaN001 powiedział:
KsylenSigma 16446
ZO-1Invitrogen40-2200Rozcieńczenie: 1/400 (IF)

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huch, M., Koo, B. K. Modeling mouse and human development using organoid cultures. Development. 142 (18), 3113-3125 (2015).
  2. Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
  3. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  4. Takebe, T., et al. Massive and reproducible production of liver buds entirely from human pluripotent stem cells. Cell Reports. 21 (10), 2661-2670 (2017).
  5. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  6. Guan, Y., et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954(2017).
  7. Ramli, M. N. B., et al. Human pluripotent stem cell-derived organoids as models of liver disease. Gastroenterology. 159 (4), 1471-1486 (2020).
  8. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21 (1), 3(1997).
  9. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Histopathology: Methods and Protocols. 1180, 31-43 (2014).
  10. Akbari, S., et al. long-term culture of endoderm-derived hepatic organoids for disease modeling. Stem Cell Reports. 13 (4), 627-641 (2019).
  11. Meisenheimer, P. L., et al. Proluciferin acetals as bioluminogenic substrates for cytochrome P450 activity and probes for CYP3A inhibition. Drug Metabolism and Disposition. 39 (12), 2403-2410 (2011).
  12. Cali, J. J., Ma, D., Wood, M. G., Meisenheimer, P. L., Klaubert, D. H. Bioluminescent assays for ADME evaluation: dialing in CYP selectivity with luminogenic substrates. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (9), 1115-1130 (2012).
  13. Cali, J. J., et al. Luminogenic cytochrome P450 assays. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (4), 629-645 (2006).
  14. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  15. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  16. Rowe, R. G., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).
  17. Akbari, S., Arslan, N., Senturk, S., Erdal, E. Next-generation liver medicine using organoid models. Frontiers in Cell Development and Biology. 7, 345(2019).
  18. Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mule, K., Stolz, D. B. Histological organization in hepatocyte organoid cultures. American Journal of Pathology. 159 (5), 1877-1887 (2001).
  19. Shinozawa, T., et al. High-fidelity drug-induced liver injury screen using human pluripotent stem cell-derived organoids. Gastroenterology. 160 (3), 831-846 (2021).
  20. Wu, F., et al. Generation of hepatobiliary organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Hepatology. 70 (6), 1145-1158 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Organoidy endodermalnepluripotencjalne kom rki macierzystetechnologia organoid wmodelowanie chor br nicowanie hepatocyt wwzbogacanie metod FACSkom rki EpCAM dodatniesekrecja albuminyaktywno cytochromu P450

Powiązane artykuły