Ta praca rozwija test wychwytu przeciwciał do obrazowania wewnątrzliniowej sygnalizacji Notch/DeltaD w dzielących się radialnych progenitorach gleju embrionalnej mózgu danio pręgowanego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test wychwytu przeciwciał do śledzenia endocytozy Notch/Delta podczas asymetrycznego podziału radialnych progenitorów gleju danio pręgowanego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Asymetryczny podział komórek (ACD), który wytwarza dwie komórki potomne o różnych losach, ma fundamentalne znaczenie dla generowania różnorodności komórkowej. W rozwijających się narządach zarówno bezkręgowców, jak i kręgowców, asymetrycznie dzielący się przodkowie generują samoodnawiającą się i różnicującą się córkęNotch lo. W embrionalnym mózgu danio pręgowanego promieniste komórki progenitorowe gleju (RGP) - główne nerwowe komórki macierzyste kręgowców - w większości przechodzą ACD, aby urodzić jeden RGP i jeden różnicujący się neuron. Przejrzystość optyczna i łatwa dostępność zarodków danio pręgowanego sprawiają, że idealnie nadają się one do obrazowania poklatkowego in vivo, aby bezpośrednio wizualizować, jak i kiedy asymetria sygnalizacji Notch jest ustalana podczas ACD. Ostatnie badania wykazały, że dynamiczna endocytoza liganda Notch DeltaD odgrywa kluczową rolę w określaniu losu komórki podczas ACD, a proces ten jest regulowany przez ewolucyjnie konserwatywny regulator polarności Par-3 (znany również jako Pard3) i kompleks motoryczny dyneiny. Aby zobrazować wzorce transportu in vivo endosomów sygnalizacyjnych Notch w mitotycznych RGP, opracowaliśmy ten test wychwytu przeciwciał. Korzystając z testu, odkryliśmy dynamikę endosomów zawierających DeltaD podczas podziału RGP.
Wprowadzenie
Sygnalizacja Notch kontroluje decyzje dotyczące losu komórek i ich wzorce podczas rozwoju u metazoans1, a ostatnie badania wykazały, że sygnalizacja Notch w podziale komórek macierzystych zależy głównie od transportu endocytarnego2,3. Endocytozowany Notch/Delta może aktywować sygnalizację Notch w jądrze i wzmacniać transkrypcję docelowych genów Notch4,5,6. Kierunkowy transport endosomalny Notch/Delta został po raz pierwszy zaobserwowany w komórkach prekursorowych narządów zmysłów (SOP) Drosophila podczas asymetrycznego podziału komórkowego (ACD), co spowodowało wyższą aktywność sygnalizacyjną Notch w pIIa niż w pIIb7,8. Testy wychwytu przeciwciał z przeciwciałami anty-Delta i anty-Notch zastosowano do monitorowania procesu endocytarnego w mitotycznych komórkach SOP. Endosomy Notch/DeltaD przemieszczają się wraz z białkiem motorycznym kinezyny do wrzeciona centralnego podczas cytokinezy i są asymetrycznie translokowane do komórki pIIa z powodu antyrównoległego układu asymetrycznego wrzeciona centralnego w ostatnim momencie podziału komórki3,8. Badania te rzuciły światło na mechanizmy molekularne regulujące asymetryczny podział w komórkach SOP Drosophila, ale nie jest jasne, czy podobne procesy endocytarne występują w progenitorach promieniowych gleju kręgowców (RGP).
Ponadto, mechanizmy molekularne, które regulują asymetryczną sygnalizację Notch/DeltaD podczas podziału RGP kręgowców, nie są dobrze poznane. U danio pręgowanego doniesiono, że interakcja Notch i Delta ułatwia endocytozę ligandu DeltaD9. Nie wiadomo, czy endocytoza DeltaD może wpływać na wybór losu komórek potomnych w rozwijającym się mózgu kręgowców. Ostatnie badania pokazują, że wstrzyknięcie fluorescencyjnie sprzężonych przeciwciał anty-DeltaD do cewy nerwowej może oznaczać endosomy Sara specyficznie w komórkach neuronabłonkowych, a endosomy anty-DeltaD zawierające Sara preferencyjnie segregują się w proliferujące komórki potomne10. Sugeruje się, że sygnalizacja Notch z endosomów może regulować los komórek potomnych. Poprzednie wyniki wykazały, że większość komórek RGP danio pręgowanego w rozwijającym się przodomózgowiu przechodzi ACD, a determinacja losu komórek potomnych zależy od wewnątrzliniowej sygnalizacji Notch/DeltaD11. Aby wyjaśnić naturę wewnątrzliniowej sygnalizacji Notch/DeltaD w RGP danio pręgowanego, opracowaliśmy test wychwytu przeciwciał anty-DeltaD w rozwijającym się mózgu danio pręgowanego. Korzystając z tego protokołu, z powodzeniem przeprowadziliśmy znakowanie na żywo i obrazowanie transportu endocytarnego DeltaD w mitotycznych RGP.
Fluorescencyjnie znakowane przeciwciało anty-DeltaD jest skutecznie internalizowane do RGP wzdłuż komory przodomózgowia. Znacznie ułatwiło to odkrycie kierunkowego transportu endosomów DeltaD w asymetrycznie dzielących się RGPs12,13. W porównaniu z poprzednimi protokołami wychwytu przeciwciał opracowanymi dla kultur Drosophila notum i rdzenia kręgowego danio pręgowanego10, protokół ten osiągnął długotrwałe i wysoce skuteczne znakowanie anty-DeltaD w warstwie komórek komory mózgu, w szczególności przy użyciu mniej niż 10 nL mieszaniny przeciwciał z mikrowstrzyknięciami. Wstrzyknięcie do komory tyłomózgowia jest bardzo wygodne do stosowania testu wychwytu przeciwciał w rozwijającym się mózgu, ponieważ komora tylnomózgowia jest dobrze rozszerzona w zarodkach danio pręgowanego i wypełniona płynem mózgowo-rdzeniowym we wczesnym stadium rozwoju14. Poprzez wstrzyknięcie mieszaniny przeciwciał do komory tyłomózgowia bez uszkodzenia jakichkolwiek kluczowych rozwijających się tkanek, protokół zminimalizował możliwe uszkodzenia strefy obrazowania w przodomózgowiu tak bardzo, jak to możliwe. Zmniejszona dawka wstrzykniętego przeciwciała pierwotnego pozwoliła również uniknąć potencjalnych skutków ubocznych zakłócania endogennej sygnalizacji Delta-Notch in vivo. Protokół ten można łatwo połączyć z innymi zaburzeniami farmakologicznymi lub genetycznymi, stosowanymi na różnych etapach rozwoju i prawdopodobnie dostosowanymi do dorosłego mózgu, a także ludzkich organoidów mózgowych 2D / 3D pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Podsumowując, protokół umożliwił zrozumienie, w jaki sposób i kiedy podczas ACD powstaje asymetria sygnalizacji Notch. Głównym wyzwaniem dla pomyślnego wdrożenia tego protokołu jest osiągnięcie precyzyjnego dostarczania odpowiednich stężeń przeciwciała w oparciu o określone warunki eksperymentalne.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Do badania użyliśmy linii AB typu dzikiego i linii transgenicznej Tg [ef1a:Myr-Tdtomato]. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco w USA (numer zatwierdzenia: AN179000).
1. Przygotowanie zarodków danio pręgowanego
-
Po
- południu przed godziną 17:00 należy ustawić zbiorniki do przechodzenia przez ryby z jedną samicą ryby typu dzikiego i jednym samcem Tg [ef1a:Myr-Tdtomato], używając przegród do oddzielenia ich w każdym zbiorniku.
- Następnego dnia rano należy usunąć przegrody ze wszystkich przejeżdżających zbiorników przed godziną 11:00. Zachowaj ciszę i nie przeszkadzaj rybom podczas krycia. Tarło następuje zwykle w ciągu 30 minut po usunięciu przegród. Zapłodnione jaja pozostają na dnie zbiornika.
- Zbieraj zapłodnione jaja ze zbiorników za pomocą filtra siatkowego. Przenieś jaja, zmywając je na szalkę Petriego pełną wody jajecznej i zbadaj zarodki pod mikroskopem preparacyjnym w powiększeniu od 10 do 20 razy.
- Przenieść zapłodnione zarodki na czystą szalkę Petriego zawierającą około 20 ml pożywki zarodkowej (100 ml 1000 x roztworu podstawowego zawiera 29,4 g NaCl, 1,27 g KCl, 4,85 g CaCl 2,2H2O i 8,13 gMgSO4,7H2O) za pomocą szklanych pipet Pasteura o dużej średnicy. Przechowywać zarodki w temperaturze 28 °C. Przechowywać 50 zapłodnionych zarodków na szalce Petriego w 30 ml pożywki dla zarodków w temperaturze 28,5 °C.
UWAGA: Jedna para ryb zwykle produkuje 100-300 zarodków, a wskaźnik zapłodnienia i przeżywalności zdrowych zarodków wynosi ponad 95% dla każdego krycia. - Następnego dnia rano wyjmij zarodki z inkubatora o godzinie 8:00, kiedy zarodki osiągną etap rozwojowy ~18-20 godzin po zapłodnieniu (hpf). Obserwuj je pod mikroskopem epifluorescencyjnym w 20-krotnym powiększeniu, początkowo używając światła białego. W tym czasie zarodki danio pręgowanego znajdują się w stadium 20 somitów.
- Wyrzuć martwe zarodki, które są mętne lub pęknięte pod mikroskopem, za pomocą szklanej pipety.
- Włącz świetlówkę i wybierz ustawienie filtra RFP mikroskopu. Następnie wybierz zarodki o silnej czerwonej fluorescencji i przenieś je do nowego naczynia z wodą jajeczną.
- Odkorówkę zarodków należy usunąć ręcznie za pomocą dwóch cienkich kleszczyków (końcówki kleszczy powinny być ostre i nieuszkodzone) w białym świetle (tabela materiałów).
- Przytrzymaj kosmówkę jedną parą kleszczy i rozerwij kosmówkę drugą parą kleszczy. Ostrożnie otwórz rozdarcie za pomocą kleszczy i spraw, aby była wystarczająco duża, aby zarodek mógł przez nią przejść, delikatnie popychając zarodek końcówkami innych kleszczy.
- Przenieść zdekorionowane zarodki na nową szalkę Petriego ze świeżą pożywką embrionalną w celu szybkiego spłukania przed mikrowstrzyknięciem.
2. Przygotowanie mikroiniekcji
- Użyj kapilar (1,2 mm średnicy, 0,9 mm średnicy, z filamentem) do wyciągania cienkich igieł iniekcyjnych na ściągaczu. Zaprojektuj i zoptymalizuj program ciągnięcia zgodnie z instrukcją.
- Otwórz końcówkę igły za pomocą kleszczy pod mikroskopem stereoskopowym. Średnica końcówki powinna wynosić około 10 μm, a kąt stożka około 30°.
- Przed wstrzyknięciem należy skoniugować mysie przeciwciało monoklonalne anty-Dld z przeciwciałem anty-Mysiem-IgG-Atto647N.
- W każdym eksperymencie iniekcyjnym należy zmieszać 0,5 μl przeciwciała anty-Dld (0,5 mg/ml) z 2 μl przeciwciała anty-mysiego IgG-Atto647N (1 mg / ml), pipetując 5-10 razy. Następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut (lub na lodzie przez 2-3 godziny).
- Po inkubacji dodać 2,5 μl buforu blokującego (10 mg/ml mysiej IgG) i 0,5 μl 0,5% czerwieni fenolowej do mieszaniny przeciwciał i pipetować 10x, aby dokładnie wymieszać, aby zablokować wszelkie niesprzężone przeciwciała pozostające w mieszaninie.
UWAGA: Do każdej próby należy przygotować jedną dodatkową mieszaninę bez przeciwciała anty-Dld i użyć jej jako kontroli.
- Przygotować 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w pożywce zarodkowej. Podgrzewać mieszaninę zawierającą agarozę w temperaturze 70 °C, aż mieszanina stanie się przezroczysta.
- Podwielokrotność roztworu agarozy rozmieścić w probówkach do mikrowirówek o objętości 2 ml. Przechowywać podwielokrotności w bloku grzewczym w temperaturze ~40 °C.
- Opłucz zarodek w probówce zawierającej 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia przez 3 s.
- Umieść zarodek na odwróconej plastikowej pokrywce szalki Petriego razem z pojedynczymi kroplami agarozy (~30-40 μL), aby zamontować każdy zarodek osobno na pokrywie, jak pokazano na Rysunek 1. Połóż zarodki płasko bocznie w agarozie i utrzymuj tę pozycję, aż agaroza zestali się w temperaturze pokojowej.
- Zamontuj 12 zarodków w trzech rzędach jeden po drugim, jak powyżej. Przykryj wszystkie zamontowane zarodki w agarozie pożywką jajową.
3. Mikroiniekcja
- Umieść osadzone zarodki pod mikroskopem stereoskopowym i zalej agarozę wodą jajeczną .
- Ustaw wtryskiwacz ciśnienia powietrza razem z mikromanipulatorami, umieszczając je blisko mikroskopów, jak pokazano na Rysunek 1. Użyj stalowej butli gazowej zawierającej gazowy azot (N2) pod wysokim ciśnieniem jako źródło powietrza.
- Zawór gazowy należy otworzyć dopiero po zamontowaniu zarodków w agarozie. Następnie załaduj przygotowaną szklaną igłę z 2 μl mieszaniny przeciwciał na mikromanipulatorze, jak pokazano na Rysunek 1, podczas korzystania z przedniego modułu napełniającego mikrowtryskiwacza.
- Dostosuj ciśnienie wejściowe do ~80-90 psi, a ciśnienie wtrysku do ~20 psi.
- Skalibruj objętość wtrysku za pomocą mikrometru pod mikroskopem, jak opisano wcześniej15. Ustaw czas strojenia na czas strojenia od 10 ms do 120 ms, w zależności od wielkości otworu igły. Dostarczyć każdy impuls wstrzyknięcia, stukając w łopatkę. Dostosuj objętość wstrzyknięcia każdej dawki do ~4-5 nL.
- Wbić końcówkę igły do mikroiniekcji przez grzbietową płytkę dachową tylnego odcinka mózgowia z tyłu do punktu zawiasu r0/r1 i wstrzyknąć około 10 nL (dwa lub trzy impulsy) mieszaniny przeciwciał bez uderzania w tkankę mózgową. Obserwuj przepływ czerwonych płynów w komorze mózgu.
UWAGA: Komora tyłomózgowia znajduje się za granicą tyłomózgowia śródmózgowia. Wstrzyknięta mieszanina przeciwciał zawierających czerwień fenolową natychmiast wypełnia komorę mózgu od tyłomózgowia do przodomózgowia poprzez dyfuzję z płynem mózgowo-rdzeniowym. - Po wstrzyknięciu należy szybko usunąć końcówkę igły z zarodka, obracając pokrętło mikromanipulatora. Aby wstrzyknięcie było udane, czerwony barwnik z wstrzykniętej mieszaniny pozostaje stabilnie w komorze mózgu, nie przeciekając do otaczającej agarozy.
- Przesuń płytkę montażową pod mikroskopem, aby zlokalizować inny zamontowany zarodek w odpowiedniej pozycji do powtórzeń.
- Po wstrzyknięciu sześciu do ośmiu zarodków obierz agarozę nożem mikrochirurgicznym, aby uwolnić zarodki z osadzonej agarozy. Przenieś zarodki z mikrowstrzykniętymi zarodkami do świeżego naczynia z 30 ml pożywki dla zarodków i umieść je w temperaturze pokojowej do następnych kroków.
4. Montaż i obrazowanie poklatkowe na żywo
- Po 30 minutach przenieść wybrane zarodki do 10 ml pożywki zarodkowej. Dodać 420 μl wywaru trikainowego (4 mg/ml) do 10 ml podłoża zarodkowego, aby znieczulić zarodki.
- Aby zamontować zarodki, przygotuj 0,8% agarozy o niskiej temperaturze topnienia zawierającej takie samo stężenie trikainy w probówce. Przechowywać podwielokrotności w bloku grzewczym w temperaturze ~40 °C.
- Za pomocą szklanej pipety zanurz wstrzyknięte zarodki w ciepłej agarozie na 3 sekundy. Następnie natychmiast wyjmij zarodki z agarozy za pomocą tej samej szklanej pipety i umieść zarodki na środku 35-milimetrowych szklanych szalek hodowlanych z kroplą agarozy z probówki. Umieść tylko jeden zarodek na kroplę na szklance.
- Delikatnie ułóż zarodki za pomocą sondy światłowodowej lub końcówki ładującej, aby grzbietowa strona embrionalnego mózgu znajdowała się jak najbliżej szklanego dna. Delikatnie dostosuj pozycję zarodka, aby przedłużyć zarodek bez zwijania się, gdy agaroza stopniowo krzepnie.
- Następnie sprawdź pozycję zarodka, odwracając szklane dno naczynia. Upewnij się, że pod mikroskopem można zobaczyć całe grzbietowe przodomózgowie z prawidłowo zamontowanymi zarodkami.
- Dodać 2-3 ml podgrzanej pożywki embrionalnej o temperaturze 28,5 °C zawierającej trikainę, aby przykryć zarodek. Umieść naczynie prawidłowo na stoliku mikroskopu konfokalnego o kontrolowanej temperaturze, jak pokazano na Rysunek 1. Ustawić temperaturę komory obrazowania na 28,5 °C. Zarodek jest teraz gotowy do obrazowania.
- Wykonuj poklatkowe obrazowanie na żywo z ustalonym odstępem czasu, korzystając z obiektywu 40-krotnego zanurzenia w wodzie.
- Użyj oprogramowania do obrazowania i sterowania mikroskopem (μMANAGER: https://micro-manager.org/)16.
- Wybierz kanały obrazowania 564 nm i 647 nm do obrazowania fluorescencji błony transgenicznego danio pręgowanego MyR-Tdtomato i endosomalnego anty-Dld-Atto647N w komórce (Rysunek 1).
- Ustaw moc lasera na 30% dla obu kanałów. Użyj czasu naświetlania na płaszczyznę z wynoszącego 200 ms dla każdego kanału.
- Dla każdego zamontowanego zarodka danio pręgowanego należy zastosować krok Z skanowania wynoszący 1 μm dla łącznie 20 płaszczyzn Z i cykl skanowania obejmujący 100 ram czasowych.
- Ustaw odstęp czasu między każdym cyklem skanowania na 20 s a trybem skanowania jako kanał, wycinek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Na Rysunku 2A zarodki wstrzyknięte z Atto647N, bez wiązania z przeciwciałem pierwotnym, wykazywały fluorescencję tła w komorze mózgu. W komórkach można zaobserwować bardzo niewiele pochłoniętych cząsteczek fluorescencyjnych. Zarodki rybek zebrafish, którym wstrzyknięto anti-Dld-Atto647N, wykazały duże ilości zinternalizowanych cząsteczek fluorescencyjnych w większości komórek rozwijającego się przodomózwia (Rysunek 2A, panel prawy). Po powiększeniu obrazu w celu...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opracowaliśmy test wychwytu przeciwciał do znakowania i obrazowania endosomalnego transportu Notch/Delta u promienistych komórek progenitorowych gleju danio pręgowanego z wysoką skutecznością. W porównaniu z poprzednimi metodami stosowanymi do śledzenia znakowanego przeciwciała anty-DeltaD w komórkach Drosophila SOP 7,8, nasza metoda wykorzystywała mikroiniekcję zamiast inkubacji próbek w sprzężonym przeciwciałie. Fluorescencyjnie sprzężone przeciwciała anty-Dld ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Projekt był wspierany przez NIH R01NS120218, UCSF Mary Anne Koda-Kimble Seed Award for Innovation oraz Chan Zuckerberg Biohub.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Naczynie hodowlane ze szklanym dnem 35 mm | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
| Narishige | IM300 | ||
| Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Kapilary, 1,2 mm OD, 0,9 mm ID, z filamentem | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 Wirujący dysk/szybkobieżny szerokokątny | nikin | N/A | Nikon Mikroskop fluorescencyjny odwrócony Ti z dużym polem widzenia CSU-W1 konfokalny. |
| Pęseta medyczna Dumont Style 5 | Scientific | 72877-D | |
| Flaming-Brown P897 ściągacz | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Mikromanipulatory | ||
| World Precision Instruments | WPI M3301R | ||
| Mysz anty-DLD | Abcam | AB_1268496 | |
| Bufor blokujący IgG myszy firmy Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Czerwień fenolowa | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| E10521 | |||
| UltraPureTM agaroza o niskiej temperaturze topnienia | Invitrogen | 16520050 |
Bibliografia
- Baonza, A., Garcia-Bellido, A. Notch signaling directly controls cell proliferation in the Drosophila wing disc. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (6), 2609-2614 (2000).
- Chitnis, A. Developmental Dynamics. 235 (4), 886-894 (2006).
- Daeden, A., Gonzalez-Gaitan, M. Endosomal trafficking during mitosis and notch-dependent asymmetric division. Progress in Molecular and Subcellular Biology. 57, 301-329 (2018).
- Le Borgne, R., Schweisguth, F. Notch signaling: endocytosis makes delta signal better. Current Biology. 13 (7), 273-275 (2003).
- Chapman, G., et al. Notch1 endocytosis is induced by ligand and is required for signal transduction. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (1), 166-177 (2016).
- Schroeter, E. H., Kisslinger, J. A., Kopan, R. Notch-1 signalling requires ligand-induced proteolytic release of intracellular domain. Nature. 393 (6683), 382-386 (1998).
- Coumailleau, F., Fürthauer, M., Knoblich, J. A., González-Gaitán, M. Directional Delta and Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division. Nature. 458 (7241), 1051-1055 (2009).
- Derivery, E., et al. Polarized endosome dynamics by spindle asymmetry during asymmetric cell division. Nature. 528 (7581), 280-285 (2015).
- Matsuda, M., Chitnis, A. B. Interaction with Notch determines endocytosis of specific Delta ligands in zebrafish neural tissue. Development. 136 (2), 197-206 (2009).
- Kressmann, S., Campos, C., Castanon, I., Fürthauer, M., González-Gaitán, M. Directional Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division in the spinal cord. Nature Cell Biology. 17 (3), 333-339 (2015).
- Dong, Z., Yang, N., Yeo, S. -Y., Chitnis, A., Guo, S. Intralineage directional Notch signaling regulates self-renewal and differentiation of asymmetrically dividing radial glia. Neuron. 74 (1), 65-78 (2012).
- Zhao, X., et al. Polarized endosome dynamics engage cytoplasmic Par-3 that recruits dynein during asymmetric cell division. Science Advances. 7 (24), (2021).
- Zhao, X., Garcia, J., Royer, L. A., Guo, S. Colocalization analysis for cryosectioned and immunostained tissue samples with or without label retention expansion microscopy (LR-ExM) by JACoP. Bio-Protocol. 12 (5), 4336(2022).
- Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish brain ventricle injection. Journal of Visualized Experiments. (26), e1218(2009).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Calibration of the injection volume for microinjection of Xenopus oocytes and embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit 14.20 (2010).
- Lukinavičius, G., et al. Fluorogenic probes for multicolor imaging in living cells. Journal of the American Chemical Society. 138 (30), 9365-9368 (2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
