Ustalanie, utrzymywanie, różnicowanie, manipulacja genetyczna i przeszczepianie organoidów gruczołów łzowych myszy i ludzi

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak ustanowić, utrzymywać, genetycznie modyfikować, różnicować, funkcjonalnie charakteryzować i przeszczepiać organoidy gruczołów łzowych pochodzące z pierwotnej tkanki mysiej i ludzkiej.

Streszczenie

Gruczoł łzowy jest niezbędnym organem dla homeostazy powierzchni oka. Wytwarzając wodną część filmu łzowego, chroni oko przed stresem związanym z wysuszeniem i zewnętrznymi zniewagami. Niewiele wiadomo na temat (pato)fizjologii gruczołów łzowych z powodu braku odpowiednich modeli in vitro. Technologia organoidów sprawdziła się jako użyteczna platforma eksperymentalna dla wielu narządów. Tutaj udostępniamy protokół tworzenia i utrzymywania organoidów gruczołów łzowych myszy i ludzi, zaczynając od biopsji gruczołów łzowych. Modyfikując warunki hodowli, zwiększamy funkcjonalność organoidów gruczołów łzowych. Funkcjonalność organoidów można badać za pomocą testu "płaczącego", który polega na wystawieniu organoidów gruczołów łzowych na działanie wybranych neuroprzekaźników w celu wywołania uwalniania łez w ich świetle. Wyjaśniamy, jak zobrazować i określić ilościowo to zjawisko. Aby zbadać rolę genów będących przedmiotem zainteresowania w homeostazie gruczołów łzowych, można je genetycznie zmodyfikować. Dokładnie opisujemy, jak genetycznie modyfikować organoidy gruczołów łzowych za pomocą edytorów bazowych - od przewodnika po projektowaniu RNA po genotypowanie klonów organoidów. Na koniec pokazujemy, jak badać potencjał regeneracyjny organoidów ludzkich gruczołów łzowych poprzez implantację ortotopową u myszy. Razem ten kompleksowy zestaw narzędzi zapewnia zasoby do wykorzystania organoidów gruczołów łzowych myszy i ludzi do badania (pato)fizjologii gruczołów łzowych.

Wprowadzenie

Gruczoł łzowy to nabłonek gruczołowy odpowiedzialny za wytwarzanie większości warstwy wodnej filmu łzowego¹. Warstwa wodna filmu łzowego zawiera nie tylko wodę do smarowania powierzchni oka, ale także duży repertuar składników przeciwdrobnoustrojowych, które chronią powierzchnię oka przed infekcjami². Gdy gruczoł łzowy jest uszkodzony lub znajduje się w stanie zapalnym, dochodzi do zespołu suchego oka, który powoduje dyskomfort u pacjentów i może ostatecznie doprowadzić do utraty wzroku³. Z biegiem lat systemy modelowe do badania gruczołu łzowego, w szczególności gruczołu ludzkiego, były ograniczone^4,5,6. Przyczyniło się to do powstania luki w wiedzy na temat funkcji gruczołów łzowych w warunkach fizjologicznych i patologicznych.

Ostatnio opracowano modele in vitro do badania gruczołu łzowego w dish^7,8,9. Te organoidy gruczołów łzowych pochodzą z dorosłych komórek macierzystych hodowanych jako trójwymiarowe struktury w macierzy zewnątrzkomórkowej uzupełnionej koktajlem czynników wzrostu, który podtrzymuje ich zdolności regeneracyjne in vitro⁷. Zaletą organoidów pochodzących z dorosłych komórek macierzystych (ASC) jest to, że mogą być utrzymywane przez bardzo długi czas, jednocześnie rekapitulując zdrowe cechy tkanki. Ten typ organoidu składa się wyłącznie z komórek nabłonkowych, w przeciwieństwie do organoidów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), które mogą również zawierać na przykład komórki zrębu. W przeciwieństwie do organoidów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC), organoidy ASC są tworzone bezpośrednio z dorosłej tkanki i nie wymagają żadnych modyfikacji genetycznych w celu ich namnażania. Organoidy ASC wyrażają cechy dorosłego osobnika¹⁰.

Ten protokół zawiera zestaw narzędzi do pozyskiwania organoidów gruczołów łzowych z mysich i ludzkich tkanek pierwotnych. Protokół opisuje, w jaki sposób można jeszcze bardziej zwiększyć funkcjonalność organoidów poprzez proste wycofanie czynnika wzrostu oraz jak sprowokować organoidy do wydzielania płynu łzowego poprzez wykonanie testu obrzęku. Protokół ten dodatkowo obejmuje metodę transfekcji opartą na elektroporacji w celu genetycznej inżynierii organoidów myszy przy użyciu edytorów zasad pochodzących z CRISPR. W przeciwieństwie do konwencjonalnego Cas9, użycie edytorów zasad pozwala na modyfikację pojedynczych zasad w genomie bez generowania dwuniciowego break^11,12. Na koniec opisano ortotopowe przeszczepienie organoidów ludzkich gruczołów łzowych myszom z niedoborem odporności i późniejszą ocenę histologiczną wszczepienia. Ten zestaw narzędzi organoidowych gruczołów łzowych może być wykorzystany w badaniach nad regeneracją i funkcją gruczołów łzowych oraz do modelowania chorób genetycznych i zapalnych.

Protokół

Eksperymenty na myszach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Królewskiej Holenderskiej Akademii Sztuk i Nauk (KNAW) na podstawie licencji projektu AVD8010020151. Organoidy pochodziły z nadwyżek materiału myszy. Biopsje ludzkiego gruczołu łzowego pobrano z materiału odpadowego pacjentów poddawanych zabiegom chirurgicznym w Uniwersyteckim Centrum Medycznym w Utrechcie (UMCU) po zatwierdzeniu przez komisję etyki medycznej na podstawie protokołu nr 18-740. Protokół zawiera kilka sekcji, które są opisane w Rysunek 1.

Rysunek 1: Przegląd protokołu. Na rysunku przedstawiono różne etapy protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

UWAGA: Wszystkie kompozycje podłoża i bufora są opisane w Tabeli Uzupełniającej 1.

1. Tworzenie organoidów z mysich i ludzkich gruczołów łzowych

1. Wypreparowanie gruczołu łzowego myszy
   1. Przygotuj narzędzia do preparowania, w tym nożyczki, kleszcze i podkładki preparacyjne. Eutanazja myszy przez inhalację O₂/CO₂ class=¹³.
   2. Umieść uśpioną mysz na jej brzuchu na podkładce sekcyjnej i przypnij jej kończyny. Zwilż włosy znajdujące się między uszami myszy i na czole za pomocą 70% etanolu.
   3. Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj otwór za czaszką między uszami. Rozciągnij ten otwór nad czołem aż do nosa. Nadal używając nożyczek, przetnij skórę za uszami, aby wygenerować dwie klapki.
   4. Pociągnij mocno klapki w kierunku nosa, aż gruczoły łzowe zostaną odsłonięte, jak pokazano na Rysunek 2A. Przypnij klapki do podkładki preparcyjnej. Za pomocą nożyczek wykonaj małe nacięcie w błonie znajdującej się nad gruczołem łzowym, aby całkowicie odsłonić gruczoł łzowy.
   5. Za pomocą kleszczy pociągnij gruczoł łzowy. Powinien być pewien opór, dopóki główny przewód łzowy nie zostanie rozerwany. Jeśli wolisz, przetnij główny przewód łzowy bezpośrednio nożyczkami.
   6. Umieść gruczoł łzowy myszy w PBS klasy hodowli tkankowej do czasu dalszego przetwarzania. Kontynuuj przetwarzanie gruczołu łzowego w ciągu 2-4 godzin, aby ograniczyć śmierć komórki. Jeśli trwa to dłużej, umieść mysi gruczoł łzowy w pożywce do biopsji (Tabela uzupełniająca 1).
      UWAGA: Kilka gruczołów łzowych można połączyć, jeśli natychmiast potrzebna jest duża liczba organoidów.
2. Pobieranie biopsji gruczołów łzowych człowieka
   1. Przed zabiegiem należy przygotować 20 ml porcji pożywki do biopsji (Tabela uzupełniająca 1) w probówce o pojemności 50 ml i przekazać je chirurgowi przed operacją. Pożywka ta może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.
   2. W dniu zabiegu należy pozwolić chirurgowi na pobranie próbki gruczołu łzowego (zwykle <1 mm³) i przechowywać je w pożywce do pobierania biopsji (tabela uzupełniająca 1) w temperaturze 4 °C.
   3. Zbierz biopsję, aby jak najszybciej ją przetworzyć. Idealnie byłoby, gdyby nastąpiło to tego samego dnia w ciągu 2 godzin od pobrania próbki z biopsji.
3. Wyprowadzenie organoidów
   1. Przygotuj wcześniej: rozmrożoną macierz zewnątrzkomórkową (ECM), mysią lub ludzką pożywkę ekspansywną o temperaturze pokojowej (RT) (tabela uzupełniająca 1), rozmrożoną kolagenazę, pożywkę bazową (tabela uzupełniająca 1), dwa skalpele, jedną 10-centymetrową szalkę Petriego, sitko o średnicy 70 μm umieszczone na probówce o pojemności 15 ml oraz 12-dołkowe płytki zawiesinowe podgrzane w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
   2. Przygotować pożywkę wytrawiającą, łącząc wszystkie składniki przedstawione w tabeli uzupełniającej 1. Wstępnie zwilż skalpele w tym podłożu, aby uniknąć przyklejania się do nich kawałków tkanki.
   3. Pobrać mysią lub ludzką tkankę gruczołu łzowego z pożywki i umieścić ją na szalce Petriego.
   4. Za pomocą wstępnie zwilżonych skalpeli zmiel tkankę. Gdy kawałki tkanki są bardzo małe (tj. <0,5 mm³), umieść je w pożywce trawiącej, zeskrobując je skalpelem z szalki Petriego. Jeśli biopsja człowieka jest już bardzo mała, umieść ją bezpośrednio w pożywce trawiącej bez mielenia, aby uniknąć utraty tkanki.
   5. Inkubować kawałki tkanek przez maksymalnie 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Regularnie odwracaj probówkę o pojemności 15 ml, aby ponownie zawiesić kawałki. Monitoruj dysocjację komórek pod mikroskopem laboratoryjnym, aby nie trawić nadmiernie tkanki.
   6. W międzyczasie zwęź pipetę Pasteura, umieszczając jej końcówkę w płomieniu podczas obracania, a następnie zwilż ją w podłożu bazowym. Aby skutecznie zdysocjować tkankę, upewnij się, że otwór jest nieco mniejszy niż największe pozostawione kawałki tkanki. Aby ułatwić proces dysocjacji, pipetować mieszaninę w górę i w dół co 5 minut za pomocą wstępnie zwilżonej, zwężonej pipety Pasteura.
   7. Gdy pod mikroskopem widocznych jest wiele pojedynczych komórek i małych grudek, zatrzymaj dysocjację, dodając 10 ml pożywki bazowej. Wirować przy 400 x g przez 5 minut, aby granulować komórki.
   8. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml podłoża zasadowego, aby powtórzyć mycie. Przefiltruj go przez sitko o wielkości 70 μm, aby usunąć duże niestrawione kawałki tkanki i pozostałe włókna kolagenowe, co uniemożliwiłoby odpowiednią polimeryzację ECM. Wirować eluat w temperaturze 400 x g przez 5 min.
      UWAGA: Osad krwinek czerwonych wskazuje na obecność czerwonych krwinek, co zwykle nie utrudnia wyprowadzania organoidów. Jednak w przypadku niektórych zastosowań, takich jak cytometria przepływowa, czerwone krwinki powinny być poddawane lizie. W tym celu inkubować komórki w 5 ml świeżego buforu do lizy czerwonych krwinek w temperaturze pokojowej przez 5 minut i osadzać komórki w 400 x g przez 5 minut.
   9. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl zimnego ECM w przypadku pojedynczego gruczołu łzowego myszy i w 50 μl zimnego ECM w przypadku biopsji u ludzi. Podczas ponownego zawieszania należy uważać, aby nie tworzyć pęcherzyków, ponieważ wpłynęłyby one również na polimeryzację i stabilność ECM.
   10. Wysiewać do 100 μl komórek na studzienkę 12-dołkowej płytki zawiesinowej. Użyj P200, aby zrobić ~ 20 μL kropelek w studzience. Im mniejsze kropelki, tym lepsza dyfuzja czynników wzrostu i składników odżywczych przez matrycę.
   11. Umieścić płytkę do góry nogami w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C na 20-30 minut, aby umożliwić ECM zastygnięcie.
   12. Po zestaleniu ECM dodaj ~ 1 ml mysiego lub ludzkiego podłoża rozprężnego RT na dołek płytki 12-dołkowej. Odświeżaj pożywkę co 2-3 dni, aż organoidy osiągną wielkość 300 μm. W tym celu należy zassać pożywkę w studzience i delikatnie dodać pożywkę ekspansywną z boku studzienki, nie dotykając kropelek ECM, aby ich nie zakłócić.
       UWAGA: Primocin (100 mg/ml; 1:1,000 z zapasów handlowych) można dodać po izolacji, jeśli dojdzie do skażenia bakteryjnego. Ponieważ jednak spowalnia również wzrost organoidów, lepiej nie dodawać go lub usuwać po jednym lub dwóch przejściach.

2. Rozszerzanie organoidów gruczołów łzowych myszy i człowieka

1. Po ~7 dniach w przypadku organoidów mysich i ~10 dniach w przypadku organoidów ludzkich, gdy organoidy osiągną rozmiar ~300 μm, należy usunąć pożywkę hodowlaną.
2. Zawiesić kropelki ECM zawierające organoidy w 1 ml roztworu trypsyny, energicznie pipetując w górę iw dół za pomocą P1,000, aż kropelki się rozpadną. Przenieść tę mieszaninę do probówki o pojemności 15 ml i krótko inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
3. Po 2-3 minutach użyj zwężonej i wstępnie zwilżonej pipety Pasteura, aby pipetować zawiesinę organoidów w górę iw dół 10x-15x. Sprawdzić stan dysocjacji organoidów pod mikroskopem laboratoryjnym; Należy uzyskać małe grudki po ~20 komórek. Inkubować dłużej w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i powtarzać etap pipetowania, aż dysocjacja będzie zadowalająca.
   UWAGA: Ten krok może potrwać dłużej w przypadku organoidów ludzkich, ponieważ są one wielowarstwowe. Zostaną wygenerowane pojedyncze komórki; Nie wpływa to na wzrost organoidów, o ile większość zawiesiny organoidów składa się z małych grudek.
4. Zatrzymaj dysocjację, dodając 10 ml pożywki zasadowej. Następnie granulować komórki w temperaturze 400 x g przez 5 minut.
5. Po usunięciu supernatantu i ECM, które mogą znajdować się na wierzchu organoidów (przezroczysta, galaretowata warstwa bez organoidów), ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości zimnego ECM przed posiewem na płytce do zawieszania, jak wskazano w kroku 1.3.10.
   UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, organoidy łzowe myszy są dzielone w stosunku 1:5, a organoidy ludzkie w stosunku 1:3. Oznacza to, że rozpoczynając od organoidów zawartych w 100 μl ECM, po podziale należy je ponownie zawiesić odpowiednio w 500 μl i 300 μl.
6. Inkubować płytkę do góry nogami w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 30 minut aż do zestalenia ECM, a następnie przykryć organoidy mysim lub ludzkim podłożem ekspanderacyjnym w temperaturze pokojowej.

3. Kriokonserwacja organoidów gruczołów łzowych myszy i człowieka

1. Aby kriokonserwować organoidy, najpierw rozdziel organoidy w pożywce ekspansyjnej zgodnie z instrukcjami podanymi w sekcji 2.
2. Około 3-4 dni później, gdy organoidy są w fazie wzrostu, należy usunąć pożywkę i ponownie zawiesić 100 μl ECM zawierającego organoidy w 10 ml zimnej pożywki. Inkubować na lodzie przez 10 minut, aby pomóc w dysocjacji ECM. Regularnie obracaj rurkę, aby ułatwić ten proces.
3. Osadzać organoidy w ilości 500 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad organoidowy w 1 ml pożywki do kriokonserwacji (resztki ECM nie wpływają negatywnie na krioprezerwację). Przenieść zawiesinę organoidów do kriowialnego i natychmiast do zamrażarki o temperaturze −80 °C.
   UWAGA: W przypadku korzystania z pożywki do krioprezerwacji opisanej w Tabeli materiałów, kriowiale można przechowywać przez czas nieokreślony w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Jeśli używane jest inne podłoże do krioprezerwacji, po 24 godzinach przenieś kriowial do zbiornika z ciekłym azotem, aby zapewnić optymalną konserwację.
4. Aby rozmrozić organoidy, należy wyjąć kriowial z zamrażarki i przetransportować go na suchym lodzie do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Trzymaj kriowial w wodzie, aż większość jego zawartości zostanie rozmrożona. Przenieść zawartość do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml pożywki zasadowej i wirować komórki w temperaturze 400 x g przez 5 minut.
5. Pokryć organoidy w 100 μl ECM z podłożem ekspandującym, jak opisano w krokach 2.5 i 2.6.

4. Różnicowanie organoidów gruczołów łzowych i ocena ich funkcjonalności

1. Różnicowanie organoidów
   1. Aby rozróżnić organoidy gruczołów łzowych, najpierw podziel organoidy w pożywce ekspansyjnej zgodnie z instrukcjami w sekcji 2.
   2. Po 2 dniach zastąp podłoże rozszerzające pożywką dla myszy lub człowieka, jak opisano w kroku 1.3.12. Odświeżaj pożywkę co 2-3 dni, aby utrzymać organoidy myszy przez 5 dni w tym pożywce, a organoidy ludzkie przez 9 dni.
   3. Aby ocenić różnicowanie organoidów po 5 dniach lub 9 dniach w pożywce różnicującej, należy zebrać 100 μl ECM zawierającego organoidy w celu ekstrakcji RNA. W tym celu należy ponownie zawiesić kropelki ECM w 1 ml pożywki zawartej w studzience za pomocą P1,000 i przenieść zawiesinę organoidów w 3 ml lodowatej pożywki bazowej. Osadzać organoidy w otoczce 500 x g przez 5 minut.
   4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w buforze do ekstrakcji RNA. Wykonaj ekstrakcję RNA zgodnie z instrukcjami zestawu do ekstrakcji RNA. Otrzymany RNA wykorzystaj np. do analizy RT-qPCR ekspresji komórek macierzystych (TP63, KRT5, KRT14) i markerów komórek zróżnicowanych (LCN2, WFDC2, AQP5, LTF, ACTA2...)¹⁴.
      UWAGA: Aby uzyskać odpowiednią analizę ekspresji, należy zmierzyć ekspresję wybranych markerów w jednej lub kilku próbkach tkanek. Organoidy hodowane w warunkach różnicowania zwykle zawierają mniej RNA.
2. Funkcjonalny test pęcznienia
   UWAGA: W tej części protokołu należy użyć organoidów ludzkich gruczołów łzowych, które były różnicowane przez co najmniej 7 dni. Minimalny wymagany czas to 7 dni, aby zapewnić wystarczającą ekspresję markera do funkcjonalnego rozrywania. Każdy studzienek na płytce 12-dołkowej stanowi jeden warunek. Minimalna liczba warunków to trzy: kontrola pozytywna, kontrola ujemna i warunek testowy.
   1. Świeżo przygotować 1 ml pożywki różnicującej dla ludzi zawierającej poszczególne składniki, które indukują wydzielanie przez organoidy gruczołów łzowych. Na przykład dodaj 100 μM noradrenaliny i 1 μM forskoliny i dokładnie wymieszaj.
      UWAGA: Forskolina służy jako kontrola pozytywna, która zwykle wywołuje maksymalny obrzęk.
   2. W zautomatyzowanym mikroskopie poklatkowym w jasnym polu ustaw pozycje, które mają być obrazowane na płycie, przedział czasu (5 min) i czas trwania (4 h). Upewnij się, że cała kropla ECM jest widoczna w każdej pozycji.
   3. Tuż przed rozpoczęciem obrazowania i bez odsuwania płytki od mikroskopu, należy usunąć pożywkę hodowlaną z dołków, które będą obrazowane, i zastąpić ją dobrze zawieszonym podłożem przygotowanym w kroku 4.2.1. Jako kontrolę ujemną należy włączyć studzienkę z pożywką różnicującą zastąpioną samą pożywką różnicującą, ponieważ odświeżenie pożywki może wywołać pewien obrzęk organoidów.
   4. Po 4 godzinach test pęcznienia kończy się. Analizuj wyniki.
      UWAGA: Czynności te są wykonywane za pomocą mikroskopu EVOS M7000, który umożliwia automatyczne obrazowanie poklatkowe w jasnym polu. W przypadku tego mikroskopu należy zapoznać się ze szczegółową instrukcją producenta, aby skonfigurować obrazowanie poklatkowe. Warto zauważyć, że można użyć dowolnego innego mikroskopu o podobnych parametrach.
   5. Aby określić ilościowo obrzęk organoidów, zmierz średnicę każdego pojedynczego organoidu po 0 i 4 godzinach. Otwórz obrazy pojedynczej kropli organoidu po 0 h i 4 h na ImageJ.
   6. Kliknij ikonę linii prostej na pasku narzędzi i najpierw narysuj średnicę organoidu w 0 godzinach. Następnie użyj narzędzia Zmierz w ImageJ (Analizuj > Zmierz), aby zmierzyć długość tej linii, a tym samym średnicę organoidu przed pęcznieniem. Powtórz proces na tym samym organoidzie po 4 godzinach, aby uzyskać średnicę organoidu po spęcznieniu.
   7. Zmierz średnicę organoidu ~ 20 organoidów na stan przed i po teście pęcznienia.

5. Konstruowanie plazmidu do znokautowania Pax6

1. Projekt gRNA do nokautowania Pax6 za pomocą edytorów bazowych C > T
   UWAGA: Dostępnych jest wiele programów do projektowania gRNA. W tym przypadku zastosowano Benchling, ponieważ pozwala to na zintegrowane projektowanie gRNA, adnotację i wyrównanie śladów Sangera. Wszystkie kolejne kroki można zatem wykonać również za pomocą alternatywnych programów. >
   1. Rozpocznij proces projektowania gRNA od wizualizacji docelowego genu w Benchling, klikając Nowy (+) > Sekwencja DNA > Importuj sekwencje DNA.
   2. W zakładce Import from Database (Importuj z bazy danych) wpisz interesujący Cię gen Pax6 i naciśnij Szukaj.
   3. Wybierz najnowszą wersję genomu referencyjnego myszy GRCm38 (mm10, Mus musculus) i naciśnij Importuj.
   4. Wybierz ekson, w którym można zaprojektować nokautujące gRNA, przestrzegając następujących zasad:
      1. Unikaj umieszczania gRNA w pierwszym eksonie kodującym, ponieważ alternatywne miejsca startowe w kolejnych eksonach mogą być wykorzystane przez komórkę do obejścia wcześnie indukowanego kodonu stop.
      2. Zaprojektuj gRNA w eksonach, które są obecne we wszystkich alternatywnych transkryptach, które mogą wystąpić w wyniku splicingu mRNA Pax6. Aby to zapewnić, zwizualizuj Pax6 w przeglądarce genomu Ensembl i wybierz ekson, który jest używany we wszystkich transkryptach.
      3. Aby jeszcze bardziej obejść alternatywne splicing, skoncentruj się na eksonie, który ma niekompletny kodon (jedną lub dwie pozostałe zasady trypletu). Ma to mniejsze znaczenie, ale daje większą pewność co do skutków indukowanych indeli. Dla Pax6 dobrym celem są eksony od 4 do 11. Ponadto wybierz ekson, który zawiera reszty tryptofanu (W), glutaminy (Q) lub argininy (R).
         UWAGA: Standardowe edytory zasad C > T, które używają SpCas9, mają okno edycji, które rozciąga się od nukleotydu 4 do nukleotydu 8 od początku gRNA (najdalej od PAM). Edytory zasad C > T mogą wprowadzić kodony stop na wszystkich resztach tryptofanu (W) (TGG do TGA, TAG lub TAA) z gRNA na odwrotnej nici, na resztach glutaminy (Q) (CAG do TAG lub CAA do TAA) i wreszcie na resztach argininy (R) (CGA do TGA) na przedniej nici.
   5. Wybierz ekson + 20 zasad w górę i w dół. Kliknij po prawej stronie ekranu na znak celu CRISPR, a następnie kliknij przewodniki Projektowanie i analiza.
   6. W nowo otwartym menu, w zakładce Typ projektu, zaznacz Przewodniki do "edycji bazy" (Komor i in., 2016). Utrzymuj długość przewodnika na poziomie 20 nukleotydów, a w obszarze Genom dla myszy wybierz GRCm38 (mm10, Mus musculus).
   7. Po kliknięciu zielonego znaku + program automatycznie wykryje wszystkie sekwencje motywu przyległego protospaceru (PAM) i po prawej stronie ekranu utworzy listę wszystkich potencjalnych gRNA w obszarze wokół interesującego nas eksonu.
   8. Przewiń listę, aż znak kodonu stop (*) w czerwonym polu, który sygnalizuje gRNA, które może potencjalnie przekształcić aminokwas w kodon stop, a tym samym spowodować nokaut.
   9. W pierwszej kolumnie po prawej stronie sekwencji gRNA, dla każdego celu "C" wokół okna edycji, obliczane są przewidywane wydajności edycji in silico. Upewnij się, że edycja C > T, która powoduje powstanie kodonu stop, ma wydajność edycji co najmniej ~10.
   10. Kliknij wartość w kolumnie Off-Target, aby sprawdzić, z którymi loci off-target gRNA może się związać. Unikaj wybierania gRNA, które wiąże się z jakimikolwiek dodatkowymi genami w celu zwiększenia specyficzności. Na przykład dobry gRNA do edycji Pax6 za pomocą edytora zasad C > T jest ukierunkowany na ekson 7 i jest 5'-AAGCAACAGATGGGCGCAGA-3'.
   11. Utwórz adnotację w pliku Benchling, klikając ikonę Adnotacje w prawym górnym rogu ekranu, a następnie kliknij opcję Nowa adnotacja. Nazwij adnotację i upewnij się, że w menu rozwijanym Nici wybrano właściwą orientację gRNA.
2. Generacja plazmidu gRNA
   UWAGA: Dostępne są różne wektory do dostarczania gRNA do organoidów. Jako bazę do budowy gRNA użyto następującego plazmidu: pFYF1320 (Addgene #47511, miły prezent od Keitha Jounga).
   1. Aby sklonować gRNA w pFYF1320, zaimplementuj strategię odwróconego PCR z wykorzystaniem standardowego startera do przodu: "/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC. Aby zaprojektować odwrócony starter, wklej odwrotny dopełniacz sekwencji dystansowej gRNA (dokładnie sprawdź orientację gRNA [+ lub - nić]) przed następującą uniwersalną odwróconą częścią startera: CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. Aby celować w ekson 7 myszy Pax6 za pomocą edytora podstawowego C > T, odwrotny starter jest następujący: TCTGCCCCCATCTGTTGCTTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. Zamów oba podkłady.
   2. Przeprowadź odwrotną reakcję PCR, używając 1 ng pFYF1320 jako matrycy przy użyciu polimerazy DNA o wysokiej wierności przez 35 cykli w temperaturze wyżarzania 61 °C.
   3. Uruchom reakcję PCR na 1% żelu agarozowym w buforze TAE przy napięciu 100 V przez ~45 minut, aby uwidocznić oczekiwany fragment 2,281 par zasad (bp). Wykonaj czyszczenie żelem za pomocą wybranego zestawu.
   4. Ustaw następującą reakcję ligacji: 100 ng oczyszczonego produktu PCR, enzym Dpn1 w celu usunięcia początkowego DNA matrycy pFYF1320 i ligaza T4. Inkubować mieszaninę przez 15 minut w temperaturze 20 °C, 30 minut w temperaturze 37 °C i 20 minut w temperaturze 80 °C.
   5. Przekształć mieszaninę reakcyjną w chemicznie kompetentne bakterie DH5α i rozprowadź bakterie na płytkach agarowych zawierających ampicylinę¹⁵.
   6. Następnego dnia zbierz i rozmnoż trzy pojedyncze kolonie w 3 ml bulionu lizogenicznego (LB) uzupełnionego 50 μg/ml ampicyliny.
   7. Następnego dnia wykonaj minipreparację na 1 ml każdej z trzech mini-kultur za pomocą zestawu do miniprzygotowania, a resztę przechowuj w temperaturze 4 °C. Poddaj uzyskany plazmid sekwencjonowaniu Sangera za pomocą startera U6_Forward, aby upewnić się, że gRNA jest prawidłowo wstawione do vector¹⁶.
   8. Po zidentyfikowaniu pojedynczej kolonii bakteryjnej z odpowiednim plazmidem, zaszczepij 500 μl odpowiedniej mini-kultury w 50 ml LB uzupełnionym ampicyliną w celu amplifikacji plazmidowego DNA przez noc. Wykonaj przygotowanie midi-prep następnego dnia po użyciu zestawu midiprep. Plazmid ten zostanie wykorzystany do elektroporacji w sekcji 6.

6. Generacja klonów Pax6 KO

1. Elektroporacja organoidowa
   1. Zacznij od organoidów myszy, które zostały podzielone co najwyżej 5 dni wcześniej, więc są w stanie proliferacyjnym. Użyj ~300-400 μl kropelek organoidów na nokaut. Uwzględnij dodatkowy warunek wyboru kontroli ujemnej, która będzie elektroporowana bez plazmidu.
   2. Wykonaj kroki 2.1-2.4, aby oddzielić organoidy, ale rozdziel organoidy dłużej, tak aby były pojedynczymi komórkami. Odrzucić supernatant.
   3. Zawiesić ogniwa w 80 μl buforu do elektroporacji.
   4. W probówce o pojemności 1,5 ml przygotuj następujące plazmidy na maksymalną ilość 20 μl: 2,5 μg plazmidu pFYF1320-gRNA, 2,8 μg plazmidu zawierającego transpozazę, 7,2 μg plazmidu zawierającego transpozon oporności na higromycynę i 7,5 μg plazmidu pCMV_ABEmax_P2A_GFP,
      UWAGA: Plazmid pFYF1320-gRNA koduje wcześniej zaprojektowane gRNA, które prowadzi edytor zasady do docelowego locus. Plazmid pCMV_ABEmax_P2A_GFP koduje edytor zasady, a także reporter GFP, który może być używany do monitorowania komórek, które wyrażają edytor zasady po elektroporacji. Plazmid zawierający transpozazę koduje transpozę, która wkleja kasetę oporności na higromycynę dostarczoną przez plazmid zawierający transpozon oporności higromycyny gdzieś losowo do genomu. Komórki, które włączyły tę kasetę do swojego genomu, stają się odporne na higromycynę i mogą być pozytywnie selekcjonowane przez dodanie higromycyny. Ponieważ współwłączenie kilku plazmidów jest bardzo prawdopodobne, oporność na higromycynę stanowi funkcjonalną selekcję w celu wzbogacenia komórek, które zostały edytowane dla Pax6.
   5. Dodaj plazmidy do komórek i dobrze wymieszaj, pipetując w górę iw dół.
   6. Ustaw elektroporator z następującymi parametrami dla impulsu porowania (napięcie: 175 V; długość impulsu: 5 ms; interwał impulsów: 50 ms; liczba impulsów: 2; szybkość zaniku: 10%; polaryzacja: +) oraz dla impulsu przenoszenia (napięcie: 20 V; długość impulsu: 50 ms; interwał impulsów: 50 ms; szybkość zaniku: 40%; polaryzacja: +/-).
   7. Umieść komórki z plazmidami w kuwecie do elektroporacji. Natychmiast zmierz rezystancję (Ω), która powinna wynosić od 0,30 A do 0,55 A, i od razu poddaj się elektroporacji. Szybkie wykonanie tego kroku jest wymagane, aby uniknąć osiadania ogniw na dnie kuwety i zmniejszania wydajności elektroporacji.
   8. Przenieś komórki do probówki o pojemności 1,5 ml i dodaj 400 μl buforu do elektroporacji uzupełnionego inhibitorem kinazy Rho. Pozwól komórkom zregenerować się w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
   9. Osadzać komórki w masie 500 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i umieścić komórki w 200 μl ECM. Po zestaleniu dodaj podłoże ekspandujące myszy.
   10. Organoidy torbielowate wyrastają po 2-3 dniach. Codziennie monitoruj sygnał GFP, który ujawnia obecność edytora bazowego C > T.
2. Selekcja organoidów
   1. Po ~ 3 dniach, gdy organoidy zregenerują się, dodaj 100 μg / ml higromycyny do pożywki ekspansywnej myszy, aby wybrać organoidy, które mają zintegrowaną kasetę odporności na higromycynę. Istnieje duże prawdopodobieństwo, że komórki, które zajmują jeden plazmid, będą pobierać kilka plazmidów. Poprzez selekcję organoidów opornych na higromycynę, edytowane organoidy w locus Pax6 są wzbogacane.
   2. Gdy wszystkie komórki w kontroli ujemnej są martwe, a organoidy, które przeżyły, mają ~300 μm, wybierz organoidy odporne na higromycynę.
3. Pobieranie organoidów i genotypowanie
   1. Przygotuj sterylne końcówki P20 obok mikroskopu i probówki o pojemności 1,5 ml zawierające 100 μl roztworu trypsyny każda na lodzie.
   2. Zegnij końcówkę P20 za pomocą kleszczy. Obserwować płytkę zawierającą ocalałe organoidy pod mikroskopem laboratoryjnym. Gdy ocalały organoid jest w ostrości, zdejmij pokrywkę płytki. Używając wygiętej końcówki P20 i nadal pod mikroskopem, odessaj każdy ocalały organoid z osobna i umieść każdy z nich w osobnej probówce zawierającej roztwór trypsyny.
   3. Zbierz do 20 klonów. Liczba klonów do wybrania zależy od liczby klonów wymaganych dla każdego projektu eksperymentalnego oraz od wydajności edycji, która różni się w zależności od każdego gRNA i locus.
   4. Po wybraniu wszystkich klonów umieść probówki o pojemności 1,5 ml w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na okres do 5 minut. Regularnie obracaj każdą probówkę, aby zwiększyć prędkość dysocjacji, i sprawdzaj organoidy pod mikroskopem laboratoryjnym. Gdy organoidy zostaną zdysocjowane na małe grudki i/lub pojedyncze komórki, należy zatrzymać trawienie, dodając 1 ml pożywki zasadowej.
   5. Dla każdego wybranego klonu przechowuj ~400 μl do genotypu w osobnej probówce o pojemności 1,5 ml. Wirować ~600 μL pozostawione przy 500 x g przez 5 minut, usunąć supernatant, ponownie zawiesić komórki w 20 μl ECM, pokryć je jako pojedynczą kroplę w studzience 24-dołkowej płytki i dodać mysią pożywkę ekspandacyjną bez higromycyny.
   6. Aby genotypować klony, odwiruj probówki zawierające ~400 μl zawiesiny komórek o sile 500 x g przez 5 minut, usuń supernatant i ponownie zawieś komórki w 50 μl buforu do ekstrakcji DNA w celu ekstrakcji DNA.
   7. Natychmiast inkubować komórki w następujący sposób: 6 minut w temperaturze 60 °C, wir i 4 minuty w temperaturze 95 °C. To DNA może być przechowywane do 7 dni w temperaturze -20 °C, ale natychmiastowe wykonanie PCR jest najbardziej optymalne.
   8. Aby amplifikować locus, do którego dąży nukleaza, należy przeprowadzić PCR na 2 μl wyekstrahowanego DNA, używając odpowiednich zamówionych wcześniej starterów genotypowania i polimerazy o niskiej wierności. Starterami genotypowania są AGACTGTTCCAGGATGGCTG (Pax6_C>T_F) i TCTCCTAGGTACTGGAAGCC (Pax6_C>T_R). Amplikon powinien zaczynać się około 100 pz od oczekiwanego edytowanego locus, aby zapewnić jego efektywne sekwencjonowanie.
   9. Uruchom produkt PCR na żelu agarozowym, aby ocenić skuteczność PCR, jak wspomniano w kroku 5.2.3. Po wykryciu opaski o odpowiednim rozmiarze wytnij ją z żelu, aby przeprowadzić ekstrakcję żelu DNA za pomocą zestawu.
   10. Sekwencjonuj wyekstrahowane DNA z każdego klonu organoidu wcześniej wybranego za pomocą starterów genotypowania.
   11. Dopasuj uzyskane sekwencje do genu Pax6 w Benchling. Otwórz zaimportowaną sekwencję genów z kroku 4.1. Kliknij pozycję Linie trasowania po prawej stronie, a następnie opcję Utwórz nową linię trasowania. Prześlij pliki .ab1 uzyskane od dostawcy sekwencjonowania, wybierz DNA jako typ nukleotydu i naciśnij Dalej.
   12. W następnym oknie wybierz Multisequence i program do wyrównywania Auto (MAFFT) przed kliknięciem Utwórz wyrównanie.
   13. Zidentyfikuj genotypy, które mają homozygotyczny przedwczesny kodon stop (uzyskany za pomocą edytorów zasad) na obu allelach. Zachowaj odpowiednie klony organoidów do ekspansji i zakonserwuj je w krioterapii do dalszej analizy. Idealnie byłoby, gdyby trzy różne klony organoidów były analizowane obok siebie, aby obejść potencjalne efekty nukleazy poza celem.

7. Ortotopowa transplantacja organoidów ludzkich gruczołów łzowych u myszy NSG

1. Przygotowanie organoidów
   1. Organoidy ludzkich gruczołów łzowych muszą zostać podzielone ~3 dni przed dniem przeszczepienia, jak opisano w punkcie 2. W dniu przeszczepu upewnij się, że organoidy są w fazie proliferacyjnej, aby zwiększyć szanse na wszczepienie.
   2. Aby wyekstrahować organoidy z ECM, dodaj dyszazę do pożywki hodowlanej, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,125 U/ml. Za pomocą P1 000 dokładnie zawiesić kropelki ECM, aby je rozbić, a następnie umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 30 minut. Objętość 100 μL ECM wystarcza do wstrzyknięcia ~10 gruczołów łzowych.
   3. Ponownie zawiesić organoidy w 10 ml pożywki zasadowej, aby wypłukać enzym. Granulować komórki w rozmiarze 400 x g przez 5 minut.
   4. Ponownie zawiesić komórki (~1 500 000) w 50 μl zimnej ludzkiej pożywki ekspansyjnej uzupełnionej 5% ECM. Umieścić zawiesinę organoidu na lodzie i natychmiast przystąpić do przeszczepu.
2. Przeszczep ortotopowy u myszy
   1. W pomieszczeniu dla zwierząt zawiesinę organoidów i igły insulinowe należy umieścić na lodzie. Odessać zawiesinę organoidu do zimnej igły insulinowej.
   2. Uspokoić mysz NOD scid gamma (NSG) z niedoborem odporności 3% izofluranem, aby rozpocząć znieczulenie. Kiedy mysz śpi, szybko połóż ją na boku z dostępem do głównego gruczołu łzowego (znajdującego się w połowie drogi między okiem a uchem).
   3. Wstrzyknąć 5 μl zawiesiny organoidowej bezpośrednio przez skórę do gruczołu łzowego. Maksymalna objętość, jaką może zawierać gruczoł łzowy myszy, wynosi 5 μl.
   4. Pozwól myszy dojść do siebie i monitoruj ją codziennie, aby ocenić obecność dyskomfortu związanego z przeszczepem, zwłaszcza na oku.
3. Ocena wszczepienia
   1. Ofiaruj mysz za pomocą inhalacji_O2/CO₂ po upływie do 90 dni, w zależności od tego, czy należy ocenić krótkotrwałe, czy długoterminowe wszczepienie¹³.
   2. Rozciąć gruczoł łzowy zgodnie z opisem w punkcie 1. Napraw go w 4% formalinie przez 24 godziny w RT.
   3. Umieść gruczoł łzowy w kasecie. Odwodnić gruczoł łzowy poprzez inkubację w następujący sposób: 2 godziny w 70% etanolu, 2 godziny w 96% etanolu, 1 h w 100% etanolu (2x), 2 godziny w ksylenie i przez noc w ciekłej parafinie w temperaturze 58 °C w piecu.
   4. Następnego dnia ułóż gruczoł łzowy zgodnie z preferencjami w metalowej formie, uzupełnij go płynną parafiną i pozwól blokowi zestalić się na zimnej powierzchni. Ten proces najlepiej wykonywać za pomocą maszyny do zatapiania.
   5. Gdy blok parafiny jest stały, pokrój cały blok na odcinki 4-5 μm za pomocą mikrotomu. Przechowuj wszystkie sekcje (w kształcie wstążek) w suchym, wolnym od przeciągów środowisku. Sekcje można przechowywać w nieskończoność w temperaturze pokojowej.
   6. Próbka jednej z każdych 10 sekcji obejmujących cały blok.
      1. Zamontuj sekcje na zjeżdżalni w następujący sposób: umieść kroplę wody na zjeżdżalni, umieść sekcję na górze, pozwól jej odpocząć na ~2 minuty, aby mogła się rozciągnąć na płycie grzejnej o temperaturze 42 °C i delikatnie usuń wodę papierem.
      2. Umieść szkiełka do wyschnięcia na noc w piekarniku o temperaturze 58 °C. Po tym etapie slajdy mogą być przechowywane w RT przez czas nieokreślony.
   7. Aby odróżnić komórki ludzkie od komórek myszy, należy wykonać barwienie ludzkim antygenem jądrowym na tych odcinkach. Ponownie nawodnij sekcje, wykonując następujące płukania: 3 min w ksylenie (2x), 1 min w 100% etanolu (2x), po 1 min w 96% etanolu, 90% etanolu, 80% etanolu, 70% etanolu, 60% etanolu i 25% etanolu, a na koniec 1 min w demi wodzie (2x).
   8. Inkubować szkiełka przez 15 minut w buforze PO (tabela uzupełniająca 1). Umyj szkiełka 3x w ultraczystej wodzie.
   9. Wykonać pobranie antygenu na bazie cytrynianu w autoklawie:
      1. Umieścić szkiełka w uchwycie na szkiełka odpornego na autoklaw w koszu wypełnionym buforem cytrynianowym (tabela uzupełniająca 1). Umieścić kosz w autoklawie i uruchomić cykl autoklawu (ciśnienie: 10 PSI; temperatura: 121 °C; czas: 15 min).
      2. Gdy autoklaw jest rozhermetyzowany, wyjmij kosz zawierający szkiełka i umieść go w łaźni wodnej RT, aby doprowadzić szkiełka do RT.
         UWAGA: Strategia pobierania antygenu zależy od użytego przeciwciała. Zapoznaj się z arkuszem danych dostawcy, aby przeprowadzić najbardziej odpowiednie pobieranie antygenu.
   10. Umieść szkiełka poziomo, sekcją do góry, na tacy inkubacyjnej. Dodać 500 μl buforu blokującego zawierającego 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS na wierzchu i inkubować przez 1 godzinę. Usuń bufor blokujący.
   11. Przygotować roztwór przeciwciała, dodając 1 μl ludzkiego przeciwciała przeciwko jądrze do 500 μl buforu blokującego na szkiełko do barwienia. Dodać roztwór przeciwciał do każdego szkiełka. Inkubować przez noc na wilgotnej tacce inkubacyjnej w temperaturze 4 °C.
   12. Następnego dnia umyj szkiełka 3x w PBS. Inkubować szkiełka z nierozcieńczonym przeciwciałem drugorzędowym przeciwko mysim HRP przez 45 minut. Umyj szkiełka 3x w PBS.
       OSTROŻNOŚĆ. W okapie chemicznym przygotować bufor DAB (tabela uzupełniająca 1). Inkubować szkiełka z buforem DAB przez 10 minut. Wyrzuć wszelkie odpady do pojemników na organiczne odpady chemiczne i płynne.
   13. Umyj szkiełka wodą. Inkubować szkiełka przez 2 minuty w hematoksylinie, aby przeciwdziałać barwieniu jąder. Myj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 10 minut.
   14. Odwodnić szkiełka, inkubując je przez 1 minutę w 50% etanolu, 60% etanolu, 70% etanolu, 80% etanolu i 90% etanolu, 1 minutę w 96% etanolu (2x), 1 minutę w 100% etanolu (2x) i 1 minutę w ksylenie (2x).
   15. Owiń szkiełka w podłoże montażowe i szkiełko nakrywkowe. Po wyschnięciu przez około 20 minut obserwuj szkiełka pod mikroskopem.

Wyniki

Po rozebraniu gruczołu łzowego myszy (Rysunek 2A), trawienie enzymatyczne i mechaniczne wytworzyło małe fragmenty tkanki, wśród których można było wyróżnić acini i przewody (Rysunek 2B). Pozostałe duże kawałki tkanki zdestabilizowałyby ECM, co zmniejszyłoby początkowy wzrost organoidów. Wyprowadzenie organoidów gruczołów łzowych myszy zakończyło się sukcesem, gdy organoidy torbielowate o średnicy ~500 μm zostały znalezione po ~7 dniach, etapie, w którym organoidy były gotowe do rozszczepienia (Rysunek 2C). Nawet jeśli ogólne wyprowadzenie organoidów zakończy się sukcesem, niektóre organoidy mogą zacząć rosnąć, zanim ostatecznie się zatrzymają. Ludzkie organoidy gruczołów łzowych wyrosły jako torbiele w ciągu 3-4 dni i osiągnęły pełny rozmiar w ciągu 10-14 dni po izolacji tkanek (Ryc. 2D). Zarówno w przypadku myszy, jak i ludzi, wyprowadzanie organoidów czasami kończyło się niepowodzeniem, przy braku lub niewielkiej liczbie organoidów; Było to na ogół spowodowane nadmiernym trawieniem tkanki. Organoidy gruczołów łzowych myszy mogą być pasażowane co najmniej 40 razy, a ludzkie organoidy co najmniej 20 razy. Pasażowanie wykonywano średnio co 7-10 dni, w zależności od wzrostu organoidu.

Rysunek 2: Tworzenie organoidów gruczołów łzowych myszy i człowieka.(A) Fotografie różnych etapów rozwarstwienia gruczołów łzowych myszy. Strzałka wskazuje na gruczoł łzowy pod jego błoną ochronną. (B) Obrazy w jasnym polu komórek gruczołów łzowych myszy zaraz po trawieniu tkanek, z wstawkami pokazującymi acinus i przewód. (C) Obrazy w jasnym polu udanego i nieudanego wyprowadzenia organoidu gruczołu łzowego myszy. (D) Obrazy w jasnym polu ludzkiego wzrostu organoidów w ciągu 14 dni. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Organoidy gruczołów łzowych zawierają dużą ilość komórek macierzystych, gdy są hodowane w pożywce ekspansywnej. Aby zwiększyć ich poziom zróżnicowania, ustawiliśmy pożywkę różnicującą mysz i człowieka o obniżonej zawartości czynnika wzrostu. Po odpowiednio 5 dniach i 7 dniach w pożywce różnicowej organoidy gruczołów łzowych myszy i człowieka stały się gęstsze (Ryc. 3A-B). Ta zmiana morfologiczna korelowała ze zwiększonymi właściwościami funkcjonalnymi. Zastosowanie cyklicznego aktywatora AMP forskoliny lub neuroprzekaźnika noradrenaliny spowodowało obrzęk organoidów (tj. wierzchołkowe wydzielanie wody) w czasie krótszym niż 3 godziny (Rysunek 3C). Gdy obrzęk trwał dłużej niż 3-4 godziny, sugerowało to, że organoidy nie były wystarczająco zróżnicowane i/lub nie wyrażały funkcjonalnych markerów, takich jak receptory dla neuroprzekaźników.

Rysunek 3: Różnicowanie organoidów gruczołów łzowych myszy i ludzi oraz funkcjonalny test obrzęku u ludzkich organoidów.(A) Obrazy w jasnym polu organoidów gruczołów łzowych myszy hodowanych w pożywce ekspansywnej przez 7 dni i w pożywce różnicującej przez 5 dni po 2 dniach w pożywce ekspandowanej. (B) Obrazy w jasnym polu ludzkich organoidów gruczołów łzowych hodowanych w pożywce ekspansywnej przez 11 dni i w pożywce różnicującej przez 9 dni po 2 dniach w pożywce ekspandowanej. (C) Obrazy w jasnym polu zróżnicowanych organoidów ludzkich gruczołów łzowych wystawionych na świeże podłoże różnicujące (kontrola), na 1 μM forskoliny i na 100 μM noradrenaliny w ciągu 3 godzin. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby znokautować Pax6 w organoidach gruczołów łzowych myszy, plazmid zawierający wybrane gRNA ukierunkowane na Pax6 został wygenerowany przez PCR i ligację (Figura 4A). Ten plazmid zawierający gRNA został poddany elektropostacji wraz z plazmidami Piggy-Bac (plazmidy zawierające transpozony i transpozazy oporności na higromycynę) oraz edytor zasad C > T Cas9 w organoidach gruczołów łzowych myszy zdysocjowanych na pojedyncze komórki. Po 3 dniach, kiedy organoidy wyzdrowiały, poddano je działaniu higromycyny w celu wyselekcjonowania klonów, które zawierały kasetę oporności na higromycynę. W wyniku udanych elektroporacji wyrosły organoidy odporne na higromycynę (Ryc. 4B). Rosnące klony organoidów, które były większe niż ~300 μm, zostały wybrane, najlepiej zanim zaczęły się spontanicznie różnicować (Ryc. 4C). DNA wyekstrahowano z części organoidu, pozostawiając pozostałą część w hodowli. Amplifikacja PCR locus Pax6 docelowego przez gRNA dała pasmo 367 pz dla każdego z wybranych klonów (Figura 4D). Po zsekwencjonowaniu amplifikowanego locus zachowano klony, które były homozygycznie edytowane C > T (n = 1). Z drugiej strony, klony, które nie były edytowane (n = 4), heterozygycznie edytowane lub błędnie edytowane (n = 1) były odrzucane (Rysunek 4E). Ogólnie rzecz biorąc, przy użyciu tego gRNA ukierunkowanego na Pax6, uzyskano jeden homozygotyczny klon mysiego gruczołu łzowego z sześcioma zsekwencjonowanymi klonami. Niektóre klony dobrze wyrosły, ale niektóre klony organoidów zostały utracone po zerwaniu lub zaczęły się różnicować (Ryc. 4F). Z 10 wybranych klonów organoidów, 7 wyrosło dobrze.

Rysunek 4: Nokaut Pax6 za pośrednictwem edycji bazy w organoidach gruczołów łzowych myszy. (A) Ślad sekwencjonowania Sangera pFYF1320 po poprawnej integracji gRNA ukierunkowanego na locus Pax6. (B) Obrazy w jasnym polu organoidów gruczołów łzowych myszy 5 dni po ekspozycji na higromycynę po elektroporacji. Organoidy hodowano w pożywce ekspansyjnej dla myszy. Po lewej stronie znajduje się przykład nieudanej elektroporacji, z której nie wyrasta żaden klon odporny na higromycynę. Po prawej stronie znajduje się przykład udanej elektroporacji, z kilkoma ocalałymi klonami organoidów odpornych na higromycynę. (C) Obrazy w jasnym polu klonów, które powinny zostać wybrane, i klonów, które nie powinny być wybierane. (D) Żel agarozowy wykazujący amplifikację locus Pax6 docelowego za pomocą gRNA. Na zielono zaznaczone jest pasmo oczekiwanej wielkości 367 pz. (E) Ślad sekwencjonowania Sangera trzech klonów organoidów, które były oporne na higromycynę. Górny klon nie jest edytowany. Środkowy klon jest homozygotyczną edycją C > T, a co za tym idzie, homozygotycznym nokautem. Dolny klon przedstawia dwie heterozygotyczne mutacje punktowe i jest albo heterozygotycznym nokautem, albo klonem mieszanym i został błędnie edytowany. (F) Obrazy w jasnym polu wybranych klonów organoidów o różnych poziomach wyrostka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Na koniec, aby przeprowadzić ortotopową transplantację organoidów ludzkich gruczołów łzowych u myszy, użyto organoidów, które zostały podzielone 3 dni wcześniej (< średnicy 100 μm). Wszczepienie organoidów potwierdzono 1 miesiąc po wstrzyknięciu organoidów do mysiego gruczołu łzowego poprzez barwienie pod kątem specyficznego dla człowieka markera, ludzkiego antygenu jąderkowego (Ryc. 5). Brak punktowego barwienia ze wszystkich odcinków gruczołu łzowego myszy oznaczał brak wszczepienia ludzkich organoidów.

Rysunek 5: Przeszczepienie organoidów ludzkich gruczołów łzowych do gruczołu łzowego myszy. Barwienie przeszczepionych mysich gruczołów łzowych pod kątem ludzkiego markera jąderka w celu monitorowania wszczepienia 1 miesiąc po przeszczepie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1: Skład nośników i. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Protokół ten opisuje tworzenie i stosowanie organoidów gruczołów łzowych do testów funkcjonalnych, modelowania mutacji i przeszczepów. Podczas tworzenia organoidów gruczołów łzowych myszy i ludzi dysocjacja tkanek ma kluczowe znaczenie. Jeśli tkanka nie zostanie wystarczająco strawiona, wydajność organoidów będzie niska. Jeśli tkanka zostanie nadmiernie strawiona, komórki umrą i nie wyrosną jako organoidy. Każda tkanka powinna być trawiona przez określony enzym przez określony czas, aby zapewnić optymalny wzrost organoidów 14,17,18. Gruczoł łzowy jest raczej miękką tkanką, dla której trawienie kolagenazą trwające 5-10 minut w połączeniu z mechaniczną dysocjacją opartą na pipetowaniu jest wystarczające do wyizolowania małych fragmentów tkanki. Jeśli konieczne jest uzyskanie pojedynczych komórek do zastosowań takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki, dysocjację można przeprowadzać przez dłuższy czas, aż do osiągnięcia stadium pojedynczej komórki, ale dysocjację należy przerwać, gdy tylko uzyska się pojedyncze komórki, aby ograniczyć jakikolwiek spadek żywotności. Ponieważ dysocjacja tkanek jest tak ważna, nadmierne trawienie jest najbardziej prawdopodobną przyczyną niewydolności organoidów gruczołów łzowych.

Właściwa konserwacja organoidów gruczołów łzowych jest ważna dla ich stosowania. Długotrwałe utrzymanie jest cechą charakterystyczną organoidów gruczołów łzowych pochodzących z dorosłych komórek macierzystych, w porównaniu z indukowanymi organoidami pochodzącymi z pluripotencjalnych komórek macierzystych ^7,17. Aby osiągnąć długotrwałe utrzymanie, należy przeprowadzać regularne rozszczepianie organoidów i zmiany podłoża. Bez tego organoidy zaczynają się różnicować i rozwijać zmniejszony potencjał komórek macierzystych, co utrudnia ich długoterminowe utrzymanie⁷. Na tym etapie nadmierne trawienie może zabić komórki macierzyste i zaburzyć utrzymanie organoidów. Do regularnej konserwacji dysocjacja organoidów na pojedyncze komórki nie jest wymagana. Jednak, aby wygenerować klonalne linie organoidów z nokautem, ważne jest, aby zacząć od pojedynczych komórek. Jeśli tak się nie stanie, organoidy będą składać się z mozaiki komórek o różnym pochodzeniu genetycznym, co uniemożliwi analizę efektu pojedynczej, zdefiniowanej mutacji. Tutaj opisujemy użycie edytora bazowego C > T do generowania kodonów stop. Ten edytor genomu opiera się na obecności kodonów argininy, glutaminy lub tryptofanu w obrębie 12-18 zasad z NGG PAM. Gdy te warunki nie są spełnione przy projektowaniu gRNA, można zastosować konwencjonalne edytory zasad Cas9 lub C >T z alternatywnymi PAM ^7,18. Jednak konwencjonalny Cas9 wprowadza dwuniciowe przerwy, które powodują powstawanie indeli po naprawie¹¹. Ponieważ oba allele mogą zawierać różne indele, genotypowanie klonów wymaga dodatkowej ostrożności. Dekonwolucja wprowadzonych modyfikacji powinna być przeprowadzona w celu upewnienia się, że oba allele zawierają indele poza ramką, a tym samym, że klony organoidów są znokautowane dla genu docelowego¹⁹. Zaletą edytorów zasad C > T jest fakt, że można je wykorzystać do modelowania mutacji punktowych, które niekoniecznie skutkują kodonami stop. Na przykład można je wykorzystać do modelowania określonych mutacji Pax6 występujących u pacjentów z aniridią w celu zbadania ich wpływu na fizjologię gruczołów łzowych²⁰.

Gruczoł łzowy wydziela wodną część filmu łzowego¹. Wydzielanie łez można zrekapitulować w ludzkich organoidach po różnicowaniu, w którym pośredniczy wycofanie czynnika wzrostu i hamowanie NOTCH. W tych warunkach organoidy ulegają końcowemu różnicowaniu i nie mogą być dalej utrzymywane. Jednak zróżnicowane organoidy gruczołów łzowych mogą kierować opracowywaniem leków wywołujących łzawienie w kontekście zespołu suchego oka, potencjalnie w badaniach przesiewowych o wysokiej przepustowości. Test rozrywania przedstawiony w tym protokole jest tym, który obecnie daje największą zmianę wielkości organoidu w krótkim czasie, co ułatwia jego ilościowe określenie w kontekście badania przesiewowego leków ^7,9,17.

Terapia komórkami macierzystymi jest bardzo obiecująca w regeneracji gruczołów łzowych w chorobie suchego oka²¹. Organoidy gruczołów łzowych pochodzące z dorosłych komórek macierzystych mogą być materiałem źródłowym do takich zastosowań. Przedstawiony tutaj protokół skutkuje wszczepieniem organoidów ludzkich gruczołów łzowych, głównie w postaci torbieli. Niskie wszczepienie organoidów może powstać w wyniku wstrzyknięcia organoidów w niewłaściwe miejsce. Szkolenie procedury iniekcji za pomocą barwnika pozwala na śledzenie miejsca wstrzyknięcia i ostatecznie poprawia dokładność iniekcji. Alternatywnie, naskórek myszy może zostać nacięty, aby mieć bezpośredni dostęp do gruczołu łzowego, tak jak to miało miejsce u szczurów przed^{22 rokiem życia}. Ta metoda trwa dłużej, ale może być dokładniejsza. Z drugiej strony, przy obecnym protokole, organoidy nie integrowały się funkcjonalnie z gruczołem łzowym myszy. Podobne wyniki zaobserwowano w przypadku wszczepienia gruczołu łzowego pochodzącego z iPSC²². Metodę przeszczepu można jeszcze bardziej udoskonalić, raniąc wcześniej gruczoł łzowy przy użyciu mysiego modelu suchego oka i/lub wstrzykując organoidy w postaci pojedynczych komórek lub małych kępek. Niemniej jednak organoidy gruczołów łzowych pochodzące z dorosłych komórek macierzystych i związany z nimi zestaw narzędzi mogą stanowić podstawę przyszłych zastosowań w badaniach gruczołów łzowych i medycynie regeneracyjnej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,5 ml probówki wirówkowe z blokadą safe-lock	Eppendorf	EP0030 120.094
3,3′-diaminobenzydyny tetrachlorowodorek hydrat (DAB)	Sigma-Aldrich	D5637	CAS: 868272-85-9 , UWAGA, roztwór 6 g/l można przechowywać w porcji w temperaturze -20 & stopni; C
5x zielony bufor GoTaq Flexi	Promega	M891A	Przechowywać przy -20 & deg; C
A83-01	Tocris	2939	Przechowywać przy -20 ° C, stan magazynowy 30 mM, 10000x
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	przechowywać pod kątem 4 stopni; C
Płytki agarowe zawierające ampicylinę	Instytut
Hubrechta Sól sodowa ampicyliny	Sigma-Aldrich	A9518
Autoklaw VAPOUR-Line lite	Chemikalia
B27 suplement	Invitrogen	17504-044	Przechowywać w temperaturze -20 ° C, 50x
BD Micro-Fine igła insulinowa 1 ml	BD Bioscience	324825
Mikroskop stołowy DMI1	Leica
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	MP biomedyczne	160069	Sklep w 4 & stopni; C
BTXpress	BTX	MDS450805
C57BL/6 myszy	Hubrecht Institute
Kasety	Klinipath	410-02S
CellBanker 1	amsbio	11910	Pożywka do kriokonserwacji, postępuj zgodnie z instrukcją
Wirówka	Eppendorf
Monohydrat kwasu cytrynowego	J.T. Baker	0088	CAS: 5949-29-1
Kolagenaza I	Sigma Aldrich	C9407	Podwielokrotności w dawce 20 mg / ml, 20x, przechowywać w temperaturze -20 & deg; C
Probówki stożkowe 15 ml	Greiner Bio-One	5618-8271
Rurki stożkowe 50 ml	Corning	CLS430828-500EA
Szkiełka nakrywkowe 24 mm x 50 mm	Menzel-Glä zer	BB024050S1
Ekstrakt z błony podstawnej Cultrex (BME), Obniżony czynnik wzrostu, Typ 2 - macierz zewnątrzkomórkowa	R& D Systems, Bio-Techne	3533-001-02	Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C, utrzymuj na 4 & stopni; C przez okres do 1 miesiąca
DAPT	Sigma Aldrich	D5942	Przechowywać w temperaturze -20 ° C, zapas przy 10 mM, 1000x
Wodorofosforan disodowy bezwodny	Chemikalia VWR	28026.292	CAS: 7558-79-4
Dihydrat wodorofosforanu sodu	Sigma-Aldrich	71643	CAS: 10028-24-7
Dypaza	ThermoFisher Scientific	17105-041	Podwielokrotności w stężeniu 50 U/ml, przechowywać w temperaturze -20 ° C do momentu użycia, 400x
Jednorazowy skalpel Sterylny N° 10	Mikroskop Swann Morton	3033838
DM4000	Leica
dNTPs 25 mM	Promega	U1420	Wymieszaj wszystkie 4 nukleotydy razem, Przechowuj w temperaturze -20 & stopni; C
Dpn1	New England Biolabs	R0176
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)	Gibco	14190144	1x
Łatwe sitka 70 i mikro; m	Greiner	542170
Kuweta do elektroporacji	Nepagene	EC002S
Mysz EnVision+/HRP	Agilent	K400111-2
Etanol 100%	BOOM	84045206; 5000	UWAGA, Służy do przygotowania innych rozcieńczeń etanolu
Etanol 70%	BOOM	84010059.5000	UWAGA
Etanol 96%	BOOM	84050065.5000	UWAGA
EVOS FL Auto 2 System obrazowania komórek	ThermoFisher Scientific		Mikroskop do obrazowania na żywo w jasnym polu
FGF10	Peprotech	100-26	Przechowywać przy -20 stopniach; C, zapas w 100 mg/ml w podłożu bazowym, 100x
Fidżi	NIH, Fidżi deweloperzy
Roztwór formaldehydu 4%	Sigma-Aldrich	1.00496	CAS: 50-00-0, UWAGA
Forskolina	Tocris	1099	Przechowywać w temperaturze -20 ° C, zapas przy 10 mM, 10000x
Glutamax	Gibco	35050-061	100x
GoTaq G2 Flexi DNA Polimeraza	Promega	M7805	Przechowywać w -20 ° C
Chemikalia Hematoksylina	VWR	10047105	Przechowywać w temperaturze pokojowej
HEPES	Gibco	15630-080	Przechowywać w temperaturze 4 stopni C, 100x
Histocore H i C, Maszyna do zatapiania tkanek	Leica
Płyta grzejna	Meidax
Ludzkie przeciwciało antygenu jąderkowego	Abcam	ab-190710
Kwas solny 5 N	ThermoFisher Scientific	10605882	CAS: 7647-01-0, UWAGA
Nadtlenek wodoru 30%	Chem-lab	CL00.2308.1000	CAS: 7722-84-1, UWAGA
Hygromycyna B-gold	InvivoGen	ant-hg	Zapas w dawce 100 mg/&mikro; L, 1000x
kaseta odporności na higromycynę plazmid			Andersson-Rolf i inni, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156
IsoFlo 100%	Mecan	5960501
LB medium	Hubrecht Institute
MgCl2 25 mM	Promega	A351H	Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
Microtome RM2235	Zestaw
Midiprep Zestaw do izolacji DNA	ThermoFisher Scientific	K210005
Miniprep	ThermoFisher scientific	K210003
N-acetylocysteina	Sigma	Aldrich A9165	Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C, zapas na 500 mM, 400x
NEPA21 elektroporator	Nepagene
Nikotynamid	Sigma Aldrich	N0636	Przechowywać przy -20 ° C, zapas w 1M, 100x
myszy NOD Scid Gamma (NSG)	Hubrecht Institute colony
Noggin conditioned medium	U-Protein Express	Na zamówienie niestandardowe	Przechowywać w -20 ° C
Noradrenaline	Sigma Aldrich	A7257	Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C, zapas przy 100 mM
Piekarnik	Memmert		Zestaw na 58 & deg; Pipety C
P20, P200 i P1000 Chemikalia	Gilson
Paraffin	VWR 10048502
Pipety Pasteura, z zaślepką szklaną	ThermoFisher Scientific	1150-6973
Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG	Pax6_C>T_R IDT
: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC	IDT
pCMV_ABEmax_P2A_GFP	Addgene	112101
Penicylina/Streptomycyna	Invitrogen	15140-122	Przechowywać pod adresem -20 ° C
Pertex	Klinipath	AM-08010
pFYF1320	Addgene	47511
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1	1000X, przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
Prostaglandyna E2 (PGE2)	Tocris	2296	Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C, zapas 10 mM, 10000x
szalka Petriego, 10 cm	Greiner	633102
bufor Q5	New England Biolabs	B9027S
Q5 polimeraza DNA o wysokiej wierności	New England Biolabs	M0491S
żelu	Qiagen	28704
Roztwór do ekstrakcji DNA QuickExtract	Lucigen	QE09050	Store podwielokrotności przy -20 ° C
R-spondyna 3 kondycjonowana pożywka	U-Protein Express	na zamówienie Przechowywać	w temperaturze -20 ° C
sgRNA Odwrotny starter: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTT CGGTGTTTCGTCCTCCAAG	IDT
Slajdy	StarFrost	MBB-0302-55A	Klej, mielony
Azydek sodu	Merck	8.22335.1000	CAS: 26628-22-8, UWAGA
Cytrynian sodu dwuwodny	J.T. Baker	0280	CAS: 6132-04-3
Standardowy starter do przodu: "/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGC	IDT
Skuteczność subklonowania kompetentne komórki DH5alpha	Invitrogen	18265-017
Płytki do hodowli komórek zawiesinowych (24-dołkowe)	Greiner Bio-One	662102	24-dołkowe
płytki do hodowli komórek zawiesinowych (12-dołkowe)	Greiner Bio-One	665102	12-dołkowe
Ligaza DNA T4	New England Biolabs	M0202
Bufor TAE	ThermoFisher Scientific	B49	Stock przy 50x, rozcieńczyć do 1x plazmidem
		zawierającym transpozazę	Andersson-Rolf i in., Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156
TrypLE Express Enzyme	Invitrogen	12605-028	przechowywać w 4 ° C
U6_Forward podkład: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT	IDT
UltraPure Agarose 1000	Invitrogen	16550
Kąpiel wodna	Tulabo
Xylene	Klinipath	4055-9005	CAS: 1330-20-7, UWAGA
Y-27632	Abmole Bioscience	Y-27632 dichlorowodorek	Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C, zapas przy 10 mM, 1000x