Artykuł metodologiczny

Ustalanie, utrzymywanie, różnicowanie, manipulacja genetyczna i przeszczepianie organoidów gruczołów łzowych myszy i ludzi

6.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65040

⸱

3 lutego 2023

 ,  ,  ,  , 
1Hubrecht Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW), University Medical Center Utrecht, 2Oncode Institute, Hubrecht Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak ustanowić, utrzymywać, genetycznie modyfikować, różnicować, funkcjonalnie charakteryzować i przeszczepiać organoidy gruczołów łzowych pochodzące z pierwotnej tkanki mysiej i ludzkiej.

Streszczenie

Gruczoł łzowy jest niezbędnym organem dla homeostazy powierzchni oka. Wytwarzając wodną część filmu łzowego, chroni oko przed stresem związanym z wysuszeniem i zewnętrznymi zniewagami. Niewiele wiadomo na temat (pato)fizjologii gruczołów łzowych z powodu braku odpowiednich modeli in vitro. Technologia organoidów sprawdziła się jako użyteczna platforma eksperymentalna dla wielu narządów. Tutaj udostępniamy protokół tworzenia i utrzymywania organoidów gruczołów łzowych myszy i ludzi, zaczynając od biopsji gruczołów łzowych. Modyfikując warunki hodowli, zwiększamy funkcjonalność organoidów gruczołów łzowych. Funkcjonalność organoidów można badać za pomocą testu "płaczącego", który polega na wystawieniu organoidów gruczołów łzowych na działanie wybranych neuroprzekaźników w celu wywołania uwalniania łez w ich świetle. Wyjaśniamy, jak zobrazować i określić ilościowo to zjawisko. Aby zbadać rolę genów będących przedmiotem zainteresowania w homeostazie gruczołów łzowych, można je genetycznie zmodyfikować. Dokładnie opisujemy, jak genetycznie modyfikować organoidy gruczołów łzowych za pomocą edytorów bazowych - od przewodnika po projektowaniu RNA po genotypowanie klonów organoidów. Na koniec pokazujemy, jak badać potencjał regeneracyjny organoidów ludzkich gruczołów łzowych poprzez implantację ortotopową u myszy. Razem ten kompleksowy zestaw narzędzi zapewnia zasoby do wykorzystania organoidów gruczołów łzowych myszy i ludzi do badania (pato)fizjologii gruczołów łzowych.

Wprowadzenie

Gruczoł łzowy to nabłonek gruczołowy odpowiedzialny za wytwarzanie większości warstwy wodnej filmu łzowego1. Warstwa wodna filmu łzowego zawiera nie tylko wodę do smarowania powierzchni oka, ale także duży repertuar składników przeciwdrobnoustrojowych, które chronią powierzchnię oka przed infekcjami2. Gdy gruczoł łzowy jest uszkodzony lub znajduje się w stanie zapalnym, dochodzi do zespołu suchego oka, który powoduje dyskomfort u pacjentów i może ostatecznie doprowadzić do utraty wzroku3. Z biegiem lat systemy modelowe do badania gruczołu łzowego, w szczególności gruczołu ludzkiego, były ograniczone4,5,6. Przyczyniło się to do powstania luki w wiedzy na temat funkcji gruczołów łzowych w warunkach fizjologicznych i patologicznych.

Ostatnio opracowano modele in vitro do badania gruczołu łzowego w dish7,8,9. Te organoidy gruczołów łzowych pochodzą z dorosłych komórek macierzystych hodowanych jako trójwymiarowe struktury w macierzy zewnątrzkomórkowej uzupełnionej koktajlem czynników wzrostu, który podtrzymuje ich zdolności regeneracyjne in vitro7. Zaletą organoidów pochodzących z dorosłych komórek macierzystych (ASC) jest to, że mogą być utrzymywane przez bardzo długi czas, jednocześnie rekapitulując zdrowe cechy tkanki. Ten typ organoidu składa się wyłącznie z komórek nabłonkowych, w przeciwieństwie do organoidów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), które mogą również zawierać na przykład komórki zrębu. W przeciwieństwie do organoidów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC), organoidy ASC są tworzone bezpośrednio z dorosłej tkanki i nie wymagają żadnych modyfikacji genetycznych w celu ich namnażania. Organoidy ASC wyrażają cechy dorosłego osobnika10.

Ten protokół zawiera zestaw narzędzi do pozyskiwania organoidów gruczołów łzowych z mysich i ludzkich tkanek pierwotnych. Protokół opisuje, w jaki sposób można jeszcze bardziej zwiększyć funkcjonalność organoidów poprzez proste wycofanie czynnika wzrostu oraz jak sprowokować organoidy do wydzielania płynu łzowego poprzez wykonanie testu obrzęku. Protokół ten dodatkowo obejmuje metodę transfekcji opartą na elektroporacji w celu genetycznej inżynierii organoidów myszy przy użyciu edytorów zasad pochodzących z CRISPR. W przeciwieństwie do konwencjonalnego Cas9, użycie edytorów zasad pozwala na modyfikację pojedynczych zasad w genomie bez generowania dwuniciowego break11,12. Na koniec opisano ortotopowe przeszczepienie organoidów ludzkich gruczołów łzowych myszom z niedoborem odporności i późniejszą ocenę histologiczną wszczepienia. Ten zestaw narzędzi organoidowych gruczołów łzowych może być wykorzystany w badaniach nad regeneracją i funkcją gruczołów łzowych oraz do modelowania chorób genetycznych i zapalnych.

Protokół

Eksperymenty na myszach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki ds. Zwierząt Królewskiej Holenderskiej Akademii Nauk i Sztuk (KNAW) w ramach licencji projektowej AVD8010020151. Organoidy uzyskano z nadmiarowego materiału mysiego. Biopsje ludzkich gruczołów łzowych pobrano z materiału odpadowego pacjentów poddawanych operacjom w University Medical Centre Utrecht (UMCU) po uzyskaniu zgody komisji etyki lekarskiej zgodnie z protokołem nr 18-740. Protokół składa się z kilku sekcji przedstawionych na Rysunku 1.

Schemat tworzenia organoidów gruczołu łzowego; obejmuje tworzenie, utrzymanie, różnicowanie i edycję genów.
Rysunek 1: Przegląd protokołu. Na tym rysunku przedstawiono poszczególne etapy protokołu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

UWAGA: Wszystkie składy pożywek i buforów zostały opisane w Tabeli uzupełniającej 1.

1. Hodowla organoidów z gruczołów łzowych myszy i człowieka

  1. Wyizolowanie gruczołu łzowego myszy
    1. Przygotować narzędzia do sekcji, w tym nożyczki, pęsety i podkładki do sekcji. Uśpić mysz poprzez O2/CO2 inhalacja13.
    2. Umieść uśpioną mysz na brzuchu na podkładce do sekcji i przymocuj jej kończyny szpilkami. Zwilż sierść znajdującą się między uszami oraz na czole myszy, używając 70% etanolu.
    3. Za pomocą nożyczek do sekcji wykonaj nacięcie za czaszką, pomiędzy uszami. Przedłuż to nacięcie przez czoło aż do nosa. Nadal używając nożyczek, rozetnij skórę za uszami, aby utworzyć dwie klapy.
    4. Mocno odciągnij zakładki w kierunku nosa, aż do odsłonięcia gruczołów łzowych, jak pokazano na Rycina 2APrzypiąć zakładki do podkładki sekcyjnej. Za pomocą nożyczek wykonać niewielkie nacięcie w błonie znajdującej się nad gruczołem łzowym, aby całkowicie odsłonić gruczoł łzowy.
    5. Za pomocą pęsety odciągnij gruczoł łzowy. Powinien pojawić się opór, aż do momentu przerwania głównego przewodu łzowego. Opcjonalnie można przeciąć główny przewód łzowy bezpośrednio za pomocą nożyczek.
    6. Umieścić gruczoł łzowy myszy w roztworze PBS klasy do hodowli tkankowych do czasu dalszej obróbki. Przystąpić do obróbki gruczołu łzowego w ciągu 2–4 h, aby ograniczyć obumieranie komórek. Jeśli proces ten potrwa dłużej, umieścić gruczoł łzowy myszy w medium do pobierania biopsji (Tabela uzupełniająca 1).
      UWAGA: W przypadku natychmiastowego zapotrzebowania na dużą liczbę organoidów można połączyć materiał z kilku gruczołów łzowych.
  2. Pobieranie biopsji ludzkiego gruczołu łzowego
    1. Przed zabiegiem chirurgicznym należy przygotować 20 ml alikwotów medium do pobierania biopsji (Tabela uzupełniająca 1) w probówce o pojemności 50 ml i przekazać ją chirurgowi przed operacją. Pożywkę tę można przechowywać w 4 °C przez kilka miesięcy.
    2. W dniu operacji chirurg powinien pobrać fragment gruczołu łzowego (zazwyczaj <1 mm3), a następnie przechowywać w medium do pobierania biopsji (Tabela uzupełniająca 1) w 4 °C.
    3. Pobrać biopsjat i poddać go obróbce tak szybko, jak to możliwe. Idealnie powinno to nastąpić w tym samym dniu, w ciągu 2 h od pobrania próbki.
  3. Wytwarzanie organoidów
    1. Należy przygotować wcześniej: rozmrożoną macierz zewnątrzkomórkową (ECM) oraz pożywkę do ekspansji mysiej lub ludzkiej w temperaturze pokojowej (RT) (Tabela uzupełniająca 1), rozmrożoną kolagenazę, podłoże podstawowe (Tabela uzupełniająca 1), dwa skalpele, jedna szalka Petriego o średnicy 10 cm, a 70 µm sitko dopasowane do probówki 15 ml oraz 12-dołkowe płytki do zawiesin wstępnie ogrzane do 37 °C przez 30 min.
    2. Przygotować medium do trawienia, łącząc wszystkie składniki przedstawione w Tabela uzupełniająca 1Należy uprzednio zwilżyć skalpele w tym medium, aby zapobiec przywieraniu do nich fragmentów tkanki.
    3. Wyjąć tkankę gruczołu łzowego myszy lub człowieka z medium i umieścić ją w szalce Petriego.
    4. Za pomocą uprzednio zwilżonych skalpeli rozdrobnij tkankę. Gdy fragmenty tkanki będą bardzo małe (tzn., <0,5 mm3), a następnie przenieść je do medium do trawienia, zeskrobując je z szalki Petriego za pomocą skalpela. Jeśli biopsja ludzka jest już bardzo mała, należy umieścić ją bezpośrednio w medium do trawienia bez rozdrabniania, aby uniknąć utraty tkanki.
    5. Inkubować fragmenty tkanki przez maksymalnie 15 min w 37 °C łaźnia wodna. Regularnie odwracaj probówkę o pojemności 15 ml, aby ponownie zawiesić fragmenty. Monitoruj dysocjację komórek pod mikroskopem laboratoryjnym, aby nie doprowadzić do nadmiernego trawienia tkanki.
    6. W międzyczasie zwęź pipetę Pasteura, umieszczając jej końcówkę w płomieniu i obracając ją, a następnie zwilż ją w pożywce podstawowej. Aby efektywnie dysocjować tkankę, upewnij się, że otwór jest nieco mniejszy niż największe pozostałe fragmenty tkanki. W celu ułatwienia procesu dysocjacji, co 5 min pipetuj mieszaninę w górę i w dół za pomocą zwilżonej, zwężonej pipety Pasteura.
    7. Gdy pod mikroskopem widoczne będą liczne pojedyncze komórki oraz małe skupiska, należy przerwać dysocjację, dodając 10 ml pożywki podstawowej. Odwirować z prędkością 400 x g przez 5 min w celu zpelletowania komórek.
    8. Usunąć nadsącz i resuspendować osad w 10 ml pożywki podstawowej, aby powtórzyć przemywanie. Przefiltrować go przez 70 µm sitko w celu usunięcia dużych, niestrawionych fragmentów tkanek oraz pozostałych włókien kolagenowych, które mogłyby zapobiec prawidłowej polimeryzacji ECM. Odwiruj eluat przy 400 x g przez 5 min.
      UWAGA: Czerwony osad wskazuje na obecność erytrocytów, co zazwyczaj nie utrudnia otrzymywania organoidów. Jednakże w przypadku niektórych zastosowań, takich jak cytometria przepływowa, erytrocyty należy poddać lizie. W tym celu inkubować komórki w 5 ml świeżego buforu do lizy erytrocytów w temperaturze pokojowej przez 5 min, a następnie odwirować komórki przy 400 x g przez 5 min.
    9. Usunąć nadsącz i resuspender osad komórkowy w 100 µL zimnej macierzy pozakomórkowej (ECM) dla pojedynczego gruczołu łzowego myszy oraz w 50 µL zimnej ECM z biopsji ludzkiej. Podczas resuspensji należy uważać, aby nie doprowadzić do powstania pęcherzyków powietrza, ponieważ mogłyby one wpłynąć na polimeryzację i stabilność ECM.
    10. Wysiać do 100 µL komórek na dołek 12-dołkowej płytki do hodowli zawiesinowych. Użyj pipety P200, aby przygotować ok.20 µL kropelki w dołku. Im mniejsze są kropelki, tym lepsza jest dyfuzja czynników wzrostu i składników odżywczych przez macierz.
    11. Umieść płytkę odwróconą dnem do góry w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C przez 20–30 min, aby umożliwić zastygnięcie ECM.
    12. Po zestaleniu ECM, do każdego dołka płytki 12-dołkowej należy dodać ok. 1 ml pożywki do ekspansji mysiej lub ludzkiej w temperaturze pokojowej. Pożywkę należy wymieniać co 2-3 dni, aż organoidy osiągną rozmiar 300 µmW tym celu należy odessać pożywkę z dołka, a następnie ostrożnie dodać pożywkę do ekspansji przy ściance dołka, unikając kontaktu z kroplami ECM, aby ich nie rozbić.
      UWAGA: W przypadku wystąpienia zanieczyszczenia bakteryjnego, po izolacji można dodać Primocin (100 mg/mL; 1:1000 z roztworu stokowego dostawcy). Ponieważ spowalnia on jednak również wzrost organoidów, zaleca się go nie dodawać lub usunąć po jednym lub dwóch pasażach.

2. Ekspansja organoidów gruczołu łzowego myszy i człowieka

  1. Po około 7 dniach w przypadku organoidów mysich i około 10 dniach w przypadku organoidów ludzkich, gdy organoidy osiągną rozmiar ~300 µm, należy usunąć pożywkę hodowlaną.
  2. Kropelki ECM zawierające organoidy należy resuspendować w 1 mL roztworu trypsyny, energicznie pipetując w górę i w dół za pomocą pipety P1,000, aż kropelki się rozpadną. Mieszaninę tę należy przenieść do probówki 15 mL i krótko inkubować w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
  3. Po 2-3 min pipetą Pasteura (zwężoną i uprzednio zwilżoną) należy 10-15 razy wypipetować zawiesinę organoidów w górę i w dół. Stan dysocjacji organoidów należy sprawdzić pod mikroskopem laboratoryjnym; powinny powstać małe skupiska liczące około 20 komórek. Jeśli dysocjacja jest niewystarczająca, należy wydłużyć czas inkubacji w kąpieli wodnej 37 °C i powtórzyć etap pipetowania.
    UWAGA: Krok ten może zająć więcej czasu w przypadku organoidów ludzkich, ponieważ są one wielowarstwowe. Powstaną pojedyncze komórki; nie wpływa to na wzrost organoidów, dopóki większość zawiesiny składa się z małych skupisk.
  4. Dysocjację należy zatrzymać, dodając 10 mL pożywki podstawowej. Następnie komórki należy sfaulować przy 400 x g przez 5 min.
  5. Po usunięciu supernatantu oraz ECM, który może znajdować się na powierzchni organoidów (przezroczysta, galaretowata warstwa bez organoidów), komórki należy resuspendować w odpowiedniej objętości zimnego ECM przed wysianiem na płytkę do zawiesin, zgodnie z opisem w kroku 1.3.10.
    ​UWAGA: Zazwyczaj organoidy łzowe mysie są dzielone w stosunku 1:5, a ludzkie w stosunku 1:3. Oznacza to, że rozpoczynając od organoidów zawartych w 100 µL ECM, po podziale należy je resuspendować odpowiednio w 500 µL i 300 µL.
  6. Płytkę należy inkubować do góry dnem w inkubatorze 37 °C przez 30 min do czasu zestalenia się ECM, a następnie w temperaturze pokojowej przykryć organoidy pożywką ekspansyjną dla myszy lub ludzi.

3. Kriokonserwacja organoidów gruczołów łzowych myszy i człowieka

  1. Aby kriokonserwować organoidy, najpierw należy je rozdzielić w medium do ekspansji zgodnie z instrukcjami podanymi w sekcji 2.
  2. Około 3-4 dni później, gdy organoidy są w fazie wzrostu, należy usunąć medium i resuspendować 100 µL ECM zawierającego organoidy w 10 mL zimnego medium bazowego. Inkubować na lodzie przez 10 min, aby wspomóc dysocjację ECM. Regularnie obracać probówką, aby ułatwić ten proces.
  3. Z pelletować organoidy przy 500 x g przez 5 min. Usunąć nadsącz i resuspendować pellet organoidów w 1 mL medium do kriokonserwacji (pozostałości ECM nie upośledzają kriokonserwacji). Przenieść zawiesinę organoidów do krioprobówki i niezwłocznie umieścić w zamrażarce w temperaturze −80 °C.
    UWAGA: Przy zastosowaniu medium do kriokonserwacji opisanego w Tabeli materiałów, krioprobówki mogą być przechowywane w zamrażarce −80 °C w nieokreślonym czasie. W przypadku zastosowania innego medium do kriokonserwacji, należy przenieść krioprobówkę do zbiornika z ciekłym azotem po 24 h, aby zapewnić optymalną konserwację.
  4. Aby rozmrozić organoidy, należy wyjąć krioprobówkę z zamrażarki i przetransportować ją na suchym lodzie do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Trzymać krioprobówkę w wodzie do momentu rozmrożenia większości jej zawartości. Przenieść zawartość do probówki 15 mL zawierającej 10 mL medium bazowego i odwirować komórki przy 400 x g przez 5 min.
  5. Wysiać organoidy w 100 µL ECM z medium do ekspansji, zgodnie z opisem w kroku 2.5 i kroku 2.6.

4. Różnicowanie organoidów gruczołu łzowego i ocena ich funkcjonalności

  1. Różnicowanie organoidów
    1. Aby przeprowadzić różnicowanie organoidów gruczołu łzowego, należy najpierw rozdzielić organoidy w pożywce ekspansyjnej zgodnie z instrukcjami w sekcji 2.
    2. Po 2 dniach zastąpić pożywkę ekspansyjną pożywką do różnicowania mysich lub ludzkich komórek, zgodnie z opisem w kroku 1.3.12. Wymieniać pożywkę co 2-3 dni, utrzymując organoidy mysie w tej pożywce przez 5 dni, a ludzkie przez 9 dni.
    3. Aby ocenić różnicowanie organoidów po 5 lub 9 dniach w pożywce do różnicowania, zebrać 100 µL ECM zawierającego organoidy w celu ekstrakcji RNA. W tym celu resuspender krople ECM w 1 mL pożywki znajdującej się w dołku za pomocą pipety P1,000, a następnie przenieść zawiesinę organoidów do 3 mL schłodzonej na lodzie pożywki podstawowej. Odwirować organoidy przy 500 x g przez 5 min.
    4. Odlać nadsącz i resuspender osad w buforze do ekstrakcji RNA. Przeprowadzić dalszą ekstrakcję RNA zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu do ekstrakcji RNA. Uzyskane RNA wykorzystać, na przykład, do analizy RT-qPCR ekspresji komórek macierzystych (TP63, KRT5, KRT14) oraz markerów komórek zróżnicowanych (LCN2, WFDC2, AQP5, LTF, ACTA2…)14.
      UWAGA: Aby uzyskać odpowiednią analizę ekspresji, należy zmierzyć ekspresję wybranych markerów w jednej lub kilku próbkach tkanki. Organoidy hodowane w warunkach różnicowania mają tendencję do zawierania mniejszej ilości RNA.
  2. Funkcjonalny test pęcznienia
    UWAGA: W tej części protokołu należy użyć ludzkich organoidów gruczołu łzowego, które były różnicowane przez co najmniej 7 dni. Minimalny wymagany czas to 7 dni, aby zapewnić wystarczającą ekspresję markerów dla funkcjonalnego łzawienia. Każdy dołek płytki 12-dołkowej stanowi jeden wariant. Minimalna liczba wariantów to trzy: kontrola pozytywna, kontrola negatywna oraz wariant badawczy.
    1. Świeżo przygotować 1 mL ludzkiej pożywki do różnicowania zawierającej poszczególne komponenty indukujące sekrecję w organoidach gruczołu łzowego. Na przykład dodać 100 µM noradrenaliny i 1 µM forskoliny, a następnie dokładnie wymieszać.
      UWAGA: Forskolina służy jako kontrola pozytywna, która zazwyczaj indukuje maksymalne pęcznienie.
    2. W automatycznym mikroskopie do obrazowania time-lapse w polu jasnym ustawić pozycje do obrazowania na płytce, odstęp czasu (5 min) oraz czas trwania (4 h). Upewnić się, że w każdej pozycji widoczna jest cała kropla ECM.
    3. Bezpośrednio przed rozpoczęciem obrazowania i bez przesuwania płytki z mikroskopu, usunąć pożywkę hodowlaną z dołków, które będą obrazowane, i zastąpić ją dobrze zresuspenderowaną pożywką przygotowaną w kroku 4.2.1. Jako kontrolę negatywną uwzględnić dołek, w którym pożywkę do różnicowania zastąpiono samą pożywką do różnicowania, ponieważ odświeżenie pożywki może wywołać pewne pęcznienie organoidów.
    4. Po maksymalnie 4 h test pęcznienia zostaje zakończony. Przeanalizować wyniki.
      UWAGA: Kroki te są wykonywane przy użyciu mikroskopu EVOS M7000, który umożliwia automatyczne obrazowanie time-lapse w polu jasnym. W przypadku tego mikroskopu należy zapoznać się ze szczegółową instrukcją producenta w celu konfiguracji obrazowania time-lapse. Warto zaznaczyć, że można użyć każdego innego mikroskopu o podobnych parametrach.
    5. Aby określić ilość pęcznienia organoidów, zmierzyć średnicę każdego pojedynczego organoidu w 0 h i 4 h. Otworzyć obrazy pojedynczej kropli organoidu w 0 h i 4 h w programie ImageJ.
    6. Kliknąć ikonę Straight line na pasku narzędzi i najpierw narysować średnicę organoidu w 0 h. Następnie użyć narzędzia Measure w programie ImageJ (Analyze > Measure), aby zmierzyć długość tej linii, a tym samym średnicę organoidu przed pęcznieniem. Powtórzyć proces dla tego samego organoidu w 4 h, aby uzyskać średnicę organoidu po pęcznieniu.
    7. Zmierzyć średnicę ~20 organoidów na wariant przed i po teście pęcznienia.

5. Konstrukcja plazmidu do wyłączenia genu Pax6

  1. Projektowanie gRNA w celu nokautu Pax6 przy użyciu edytorów zasad C > T
    UWAGA: Do projektowania gRNA dostępnych jest wiele programów komputerowych. W niniejszym protokole wykorzystano program Benchling, ponieważ umożliwia on zintegrowane projektowanie gRNA, adnotację oraz dopasowanie sekwencji z sekwencjonowania metodą Sangera. Wszystkie kolejne kroki można zatem przeprowadzić również przy użyciu alternatywnych programów.
    1. Rozpocznij proces projektowania gRNA od wizualizacji genu docelowego w programie Benchling, klikając New (+) > DNA Sequence > Import DNA Sequences.
    2. W karcie Import from Database wpisz nazwę interesującego genu, Pax6, i naciśnij Search.
    3. Wybierz najnowszą wersję referencyjnego genomu mysiego GRCm38 (mm10, Mus musculus) i naciśnij Import.
    4. Wybierz ekson, w którym można zaprojektować gRNA do nokautu, przestrzegając następujących zasad:
      1. Unikaj umieszczania gRNA w pierwszym eksonie kodującym, ponieważ komórka może wykorzystać alternatywne miejsca startu w kolejnych eksonach, aby obejść wczesny indukowany kodon stop.
      2. Projektuj gRNA w eksonach obecnych we wszystkich alternatywnych transkryptach, które mogą powstać w wyniku splicingu mRNA Pax6. Aby to zapewnić, zwizualizuj Pax6 w przeglądarce genomu Ensembl i wybierz ekson wykorzystywany we wszystkich transkryptach.
      3. Aby dodatkowo zapobiec alternatywnemu splicingowi, wybierz ekson posiadający niepełny kodon (pozostała jedna lub dwie zasady tripletu). Jest to mniej istotne, ale daje większą pewność co do efektów indukowanych indeli. W przypadku Pax6 dobrym celem są eksony od 4 do 11. Ponadto wybierz ekson zawierający reszty tryptofanu (W), glutaminy (Q) lub argininy (R).
        UWAGA: Standardowe edytory zasad C > T wykorzystujące SpCas9 mają okno edycji obejmujące nukleotydy od 4 do 8 od początku gRNA (najdalej od sekwencji PAM). Edytory zasad C > T mogą wprowadzać kodony stop we wszystkich resztach tryptofanu (W) (TGG na TGA, TAG lub TAA) przy gRNA na nici odwrotnej, w resztach glutaminy (Q) (CAG na TAG lub CAA na TAA) oraz wreszcie w resztach argininy (R) (CGA na TGA) na nici prostej.
    5. Wybierz ekson oraz po 20 zasad powyżej i poniżej. Kliknij po prawej stronie ekranu znak celu CRISPR, a następnie kliknij Design and Analyze guides.
    6. W nowo otwartym menu, w karcie Design Type, zaznacz Guides for "base editing" (Komor et al., 2016). Pozostaw Guide Length na poziomie 20 nukleotydów, a w sekcji Genome dla myszy wybierz GRCm38 (mm10, Mus musculus).
    7. Po kliknięciu zielonego znaku + program automatycznie wykryje wszystkie sekwencje motywu PAM (protospacer adjacent motif) i po prawej stronie ekranu utworzy listę wszystkich potencjalnych gRNA w obszarze wokół wybranego eksonu.
    8. Przewijaj listę, aż znajdziesz znak kodonu stop (*) w czerwonej ramce, co wskazuje na gRNA, które potencjalnie może zmienić aminokwas w kodon stop, a tym samym doprowadzić do nokautu.
    9. W pierwszej kolumnie po prawej stronie sekwencji gRNA, dla każdego docelowego „C” w oknie edycji, obliczana jest przewidywana efektywność edycji in silico. Upewnij się, że edycja C > T skutkująca kodonem stop ma efektywność edycji wynoszącą co najmniej ~10.
    10. Kliknij wartość w kolumnie Off-Target, aby sprawdzić, do których loci poza celem gRNA mogłoby się przyłączyć. Aby zwiększyć specyficzność, unikaj wyboru gRNA, które wiąże się z jakimikolwiek dodatkowymi genami. Na przykład dobrym gRNA do edycji Pax6 za pomocą edytora zasad C > T jest sekwencja celująca w ekson 7: 5'-AAGCAACAGATGGGCGCAGA-3'.
    11. Utwórz adnotację w pliku Benchling, klikając ikonę Annotations w prawym górnym rogu ekranu, a następnie New Annotation. Nazwij adnotację i upewnij się, że w rozwijanym menu Strand wybrano właściwą orientację gRNA.
  2. Generowanie plazmidu gRNA
    UWAGA: Do dostarczania gRNA do organoidów dostępnych jest wiele różnych wektorów. Jako bazę do konstrukcji gRNA wykorzystano następujący plazmid: pFYF1320 (Addgene #47511, uprzejmy dar od Keitha Jounga).
    1. Aby sklonować gRNA do pFYF1320, zastosuj strategię odwrotnej PCR z wykorzystaniem standardowego startera forward: "/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC. Aby zaprojektować starter reverse, wklej odwrotny komplement sekwencji spacera gRNA (dwukrotnie sprawdź orientację gRNA [+ lub - nić]) przed następującą uniwersalną częścią startera reverse: CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. W celu celowania w ekson 7 mysiego Pax6 przy użyciu edytora zasad C > T, starter reverse ma następującą sekwencję: TCTGCGCCCATCTGTTGCTTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. Zamów oba startery.
    2. Przeprowadź reakcję odwrotnej PCR, używając 1 ng pFYF1320 jako matrycy, z zastosowaniem polimerazy DNA o wysokiej wierności przez 35 cykli w temperaturze przyłączania 61 °C.
    3. Przeprowadź elektroforezę produktu PCR na 1% żelu agarozowym w buforze TAE przy 100 V przez ~45 min, aby zwizualizować oczekiwany fragment o długości 2 281 par zasad (bp). Wykonaj oczyszczanie żelu przy użyciu wybranego zestawu.
    4. Przygotuj następującą reakcję ligacji: 100 ng oczyszczonego produktu PCR, enzym Dpn1 w celu usunięcia początkowego DNA matrycowego pFYF1320 oraz ligazę T4. Inkubuj mieszaninę przez 15 min w 20 °C, 30 min w 37 °C i 20 min w 80 °C.
    5. Przetransformuj mieszaninę reakcyjną do chemicznie kompetentnych bakterii DH5α i wysiej bakterie na płytki agarowe zawierające ampicylinę15.
    6. Następnego dnia wybierz i namnóż trzy pojedyncze kolonie w 3 mL pożywki LB (lysogeny broth) uzupełnionej o 50 µg/mL ampicyliny.
    7. Kolejnego dnia wykonaj miniprep z 1 mL każdej z trzech minikultur za pomocą zestawu do miniprepu, a resztę przechowuj w 4 °C. Uzyskany plazmid poddaj sekwencjonowaniu metodą Sangera z użyciem startera U6_Forward, aby upewnić się, że gRNA zostało prawidłowo wstawione do wektora16.
    8. Po zidentyfikowaniu pojedynczej kolonii bakteryjnej z prawidłowym plazmidem, zaszczep 500 µL odpowiadającej jej minikultury w 50 mL LB z ampicyliną, aby namnożyć DNA plazmidowe przez noc. Następnego dnia wykonaj midiprep za pomocą zestawu do midiprepu. Plazmid ten zostanie wykorzystany do elektroporacji w sekcji 6.

6. Generowanie klonów KO Pax6

  1. Elektroporacja organoidów
    1. Należy rozpocząć od organoidów mysich, które zostały podzielone maksymalnie 5 dni wcześniej, aby znajdowały się w stanie proliferacyjnym. Na każdy knock-out należy użyć ~300-400 µL kropli organoidów. Należy uwzględnić dodatkowy warunek dla kontroli negatywnej, która zostanie poddana elektroporacji bez żadnego plazmidu.
    2. Należy wykonać kroki 2.1-2.4 w celu dysocjacji organoidów, jednak proces dysocjacji należy prowadzić dłużej, aż do uzyskania pojedynczych komórek. Następnie należy odrzucić nadosad.
    3. Komórki należy resuspendować w 80 µL buforu do elektroporacji.
    4. W probówce 1,5 mL należy przygotować następujące plazmidy w objętości maksymalnie 20 µL: 2,5 µg plazmidu pFYF1320-gRNA, 2,8 µg plazmidu zawierającego transpozazę, 7,2 µg plazmidu zawierającego transpozon oporności na hygromycynę oraz 7,5 µg pCMV_ABEmax_P2A_GFP.
      UWAGA: Plazmid pFYF1320-gRNA koduje wcześniej zaprojektowane gRNA, które kieruje edytor baz do docelowego locus. Plazmid pCMV_ABEmax_P2A_GFP koduje edytor baz oraz reporter GFP, który może być wykorzystany do monitorowania komórek wykazujących ekspresję edytora baz po elektroporacji. Plazmid zawierający transpozazę koduje transpozazę, która wstawia kasetę oporności na hygromycynę (dostarczoną przez plazmid zawierający transpozon oporności na hygromycynę) w losowe miejsce w genomie. Komórki, które włączyły tę kasetę do swojego genomu, stają się oporne na hygromycynę i mogą zostać poddane selekcji pozytywnej poprzez dodanie hygromycyny. Ponieważ współinkorporacja kilku plazmidów jest bardzo prawdopodobna, oporność na hygromycynę stanowi selekcję funkcjonalną w celu wzbogacenia populacji komórek poddanych edycji w locus Pax6.
    5. Plazmidy należy dodać do komórek i dokładnie wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół.
    6. Elektroporator należy ustawić na następujące parametry dla impulsu porującego (napięcie: 175 V; czas trwania impulsu: 5 ms; odstęp między impulsami: 50 ms; liczba impulsów: 2; szybkość zaniku: 10%; polaryzacja: +) oraz dla impulsu transferowego (napięcie: 20 V; czas trwania impulsu: 50 ms; odstęp między impulsami: 50 ms; liczba impulsów: 5; szybkość zaniku: 40%; polaryzacja: +/-).
    7. Komórki z plazmidami należy umieścić w kuwecie do elektroporacji. Należy niezwłocznie zmierzyć rezystancję (Ω), która powinna wynosić od 0,30 A do 0,55 A, i natychmiast przeprowadzić elektroporację. Szybkie wykonanie tego kroku jest niezbędne, aby zapobiec osiadaniu komórek na dnie kuwety, co zmniejszyłoby wydajność elektroporacji.
    8. Komórki należy przenieść do probówki 1,5 mL i dodać 400 µL buforu do elektroporacji uzupełnionego inhibitorem kinazy Rho. Pozostawić komórki do regeneracji w temperaturze pokojowej przez 30 min.
    9. Komórki należy zcentryfugować przy 500 x g przez 5 min, odrzucić nadosad i wysiać komórki w 200 µL ECM. Po zestaleniu należy dodać medium ekspansyjne dla myszy.
    10. Organoidy cystyczne wyrastają po 2-3 dniach. Należy codziennie monitorować sygnał GFP, który wskazuje na obecność edytora baz C > T.
  2. Selekcja organoidów
    1. Po około 3 dniach, gdy organoidy się zregenerują, do medium ekspansyjnego dla myszy należy dodać 100 µg/mL hygromycyny, aby wyselekcjonować organoidy, które zintegrowały kasetę oporności na hygromycynę. Istnieje duże prawdopodobieństwo, że komórki, które pobrały jeden plazmid, pobiorą ich kilka. Poprzez selekcję organoidów opornych na hygromycynę dochodzi do wzbogacenia populacji organoidów z edytowanym locus Pax6.
    2. Gdy wszystkie komórki w kontroli negatywnej zginą, a przeżyłe organoidy osiągną wielkość ok. 300 µm, należy wyłowić organoidy oporne na hygromycynę.
  3. Wyławianie i genotypowanie organoidów
    1. Obok mikroskopu należy przygotować sterylne końcówki P20 oraz probówki 1,5 mL zawierające każda po 100 µL roztworu trypsyny, utrzymywane w lodzie.
    2. Za pomocą pincety należy zagiąć końcówkę P20. Płytkę z przeżyłymi organoidami należy obserwować pod mikroskopem laboratoryjnym. Gdy przeżyły organoid znajdzie się w polu widzenia, należy zdjąć pokrywkę płytki. Używając zagiętej końcówki P20, wciąż pod mikroskopem, należy pojedynczo odessać każdy przeżyły organoid i umieścić go w oddzielnej probówce z roztworem trypsyny.
    3. Należy wyłowić do 20 klonów. Liczba wyłowionych klonów zależy od liczby wymaganej dla każdego projektu eksperymentalnego oraz od wydajności edycji, która różni się w zależności od gRNA i locus.
    4. Po wyłowieniu wszystkich klonów, probówki 1,5 mL należy umieścić w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na maksymalnie 5 min. Każdą probówkę należy regularnie wstrząsać na wortexie, aby przyspieszyć dysocjację, i kontrolować organoidy pod mikroskopem laboratoryjnym. Gdy organoidy zostaną zdysocjowane do postaci małych grudek i/lub pojedynczych komórek, należy zatrzymać trawienie, dodając 1 mL medium podstawowego.
    5. Z każdego wyłowionego klonu należy zachować ~400 µL do genotypowania w oddzielnej probówce 1,5 mL. Pozostałe ~600 µL należy odwirować przy 500 x g przez 5 min, usunąć nadosad, resuspendować komórki w 20 µL ECM, wysiać je w postaci pojedynczej kropli w dołku płytki 24-dołkowej i dodać medium ekspansyjne dla myszy bez hygromycyny.
    6. Aby przeprowadzić genotypowanie klonów, probówki zawierające ~400 µL zawiesiny komórkowej należy odwirować przy 500 x g przez 5 min, usunąć nadosad i resuspendować komórki w 50 µL buforu do ekstrakcji DNA w celu wyizolowania DNA.
    7. Komórki należy niezwłocznie inkubować w następujący sposób: 6 min w 60 °C, wstrząsnąć na wortexie, a następnie 4 min w 95 °C. Tak przygotowane DNA można przechowywać do 7 dni w temperaturze −20 °C, jednak najbardziej optymalne jest niezwłoczne przeprowadzenie reakcji PCR.
    8. W celu amplifikacji locus będącego celem nukleazy, należy przeprowadzić reakcję PCR z użyciem 2 µL wyizolowanego DNA, odpowiednich starterów do genotypowania zamówionych wcześniej oraz polimerazy o niskiej wierności. Startery do genotypowania to AGACTGTTCCAGGATGGCTG (Pax6_C>T_F) oraz TCTCCTAGGTACTGGAAGCC (Pax6_C>T_R). Amplikon powinien zaczynać się około 100 bp od przewidywanego edytowanego locus, aby zapewnić wydajne sekwencjonowanie.
    9. Produkt PCR należy rozdzielić w żelu agarozowym w celu oceny wydajności PCR, zgodnie z opisem w kroku 5.2.3. Po wykryciu prążka o prawidłowej wielkości, należy go wyciąć z żelu i przeprowadzić ekstrakcję DNA z żelu przy użyciu zestawu.
    10. Wyekstrahowane DNA z każdego wcześniej wyłowionego klonu organoidu należy zsekwencjonować za pomocą starterów do genotypowania.
    11. Uzyskane sekwencje należy dopasować do genu Pax6 w programie Benchling. Należy otworzyć importowaną sekwencję genu z kroku 4.1. Kliknąć Alignments po prawej stronie, a następnie Create new alignment. Należy wgrać pliki .ab1 otrzymane od dostawcy usług sekwencjonowania, wybrać DNA jako typ nukleotydu i nacisnąć Next.
    12. W następnym oknie należy wybrać Multisequence oraz program dopasowywania Auto (MAFFT), a następnie kliknąć Create alignment.
    13. Należy zidentyfikować genotypy posiadające homozygotyczny przedwczesny kodon stop (uzyskany za pomocą edytorów baz) na obu allelach. Odpowiednie klony organoidów należy zachować do ekspansji oraz kriokonserwować do dalszych analiz. Idealnie powinno się przeanalizować obok siebie trzy różne klony organoidów, aby wykluczyć potencjalne efekty off-target nukleazy.

7. Ortotopowa transplantacja ludzkich organoidów gruczołu łzowego u myszy NSG

  1. Przygotowanie organoidów
    1. Organoidy ludzkiego gruczołu łzowego należy podzielić na około 3 dni przed dniem transplantacji, zgodnie z opisem w sekcji 2. W dniu transplantacji należy upewnić się, że organoidy znajdują się w fazie proliferacyjnej, aby zwiększyć szanse na przyjęcie przeszczepu.
    2. Aby wyekstrahować organoidy z ECM, należy dodać dyspazę do pożywki hodowlanej do osiągnięcia stężenia końcowego 0,125 U/mL. Używając pipety P1,000, należy dokładnie resuspender krople ECM w celu ich rozbicia, a następnie umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 min. Objętość 100 µL ECM jest wystarczająca do wstrzyknięcia w około 10 gruczołów łzowych.
    3. Organoidy należy resuspender w 10 mL pożywki podstawowej, aby wypłukać enzym. Komórki należy odwirować przy 400 x g przez 5 min.
    4. Komórki (około 1 500 000) należy resuspender w 50 µL zimnej ludzkiej pożywki do ekspansji uzupełnionej o 5% ECM. Zawiesinę z organoidami należy umieścić na lodzie i niezwłocznie przystąpić do transplantacji.
  2. Transplantacja ortotopowa u myszy
    1. W pomieszczeniu dla zwierząt należy przygotować zawiesinę z organoidami oraz igły insulinowe na lodzie. Zawiesinę z organoidami należy zaciągnąć do zimnej igły insulinowej.
    2. Mysz immunodeficyjną NOD scid gamma (NSG) należy uśpić 3% izofluranem w celu wprowadzenia w narkozę. Gdy mysz zaśnie, należy ją szybko położyć na boku tak, aby główny gruczoł łzowy (znajdujący się w połowie drogi między okiem a uchem) był dostępny.
    3. Należy wstrzyknąć 5 µL zawiesiny z organoidami bezpośrednio przez skórę do gruczołu łzowego. Maksymalna objętość, jaką może pomieścić mysi gruczoł łzowy, wynosi 5 µL.
    4. Należy pozwolić myszy dojść do siebie i monitorować ją codziennie, aby ocenić występowanie jakiegokolwiek dyskomfortu związanego z transplantacją, szczególnie w obrębie oka.
  3. Ocena przyjęcia przeszczepu
    1. Mysz należy uśmiercić poprzez inhalację O2/CO2 po maksymalnie 90 dniach, w zależności od tego, czy oceniane jest przyjęcie krótkoterminowe czy długoterminowe13.
    2. Gruczoł łzowy należy wypreparować zgodnie z opisem w sekcji 1. Następnie należy go utrwalić w 4% formalinie przez 24 h w temperaturze pokojowej (RT).
    3. Gruczoł łzowy należy umieścić w kasecie. Dehydratację gruczołu łzowego przeprowadza się poprzez inkubację w następujący sposób: 2 h w 70% etanolu, 2 h w 96% etanolu, 1 h w 100% etanolu (2x), 2 h w ksylenie i przez noc w ciekłej parafinie w temperaturze 58 °C w piecu.
    4. Następnego dnia gruczoł łzowy należy zorientować zgodnie z preferencjami w formie metalowej, uzupełnić ciekłą parafiną i pozwolić blokowi zastygnąć na zimnej powierzchni. Proces ten najlepiej przeprowadzić za pomocą urządzenia do zatapiania próbek.
    5. Po zastygnięciu bloku parafinowego, cały blok należy pociąć na sekcje o grubości 4-5 µm przy użyciu mikrotomu. Wszystkie sekcje (w formie wstążek) należy przechowywać w suchym środowisku, bez przeciągów. Sekcje można przechowywać w temperaturze pokojowej bezterminowo.
    6. Należy pobrać co dziesiątą sekcję z całego bloku.
      1. Sekcje należy zamocować na szkiełku w następujący sposób: na szkiełko nanosi się kroplę wody, kładzie na niej sekcję, pozostawia na około 2 min, aby rozprostowała się na płytce grzewczej o temperaturze 42 °C, a następnie delikatnie usuwa wodę papierem.
      2. Szkiełka należy pozostawić do wyschnięcia na noc w piecu w temperaturze 58 °C. Po tym etapie szkiełka można przechowywać w RT bezterminowo.
    7. Aby odróżnić komórki ludzkie od mysich, na tych sekcjach należy przeprowadzić barwienie na ludzki antygen jądrowy. Sekcje należy rehydratować, wykonując następujące płukania: 3 min w ksylenie (2x), 1 min w 100% etanolu (2x), po 1 min w 96% etanolu, 90% etanolu, 80% etanolu, 70% etanolu, 60% etanolu i 25% etanolu, a na koniec 1 min w wodzie destylowanej (2x).
    8. Szkiełka należy inkubować przez 15 min w buforze PO (Tabela uzupełniająca 1). Szkiełka należy płukać 3x w wodzie ultrapurej.
    9. W autoklawie należy przeprowadzić przywracanie antygenu w oparciu o cytrynian:
      1. Szkiełka należy umieścić w odpornym na autoklawowanie uchwycie do szkiełek w koszyku wypełnionym buforem cytrynianowym (Tabela uzupełniająca 1). Koszyk należy umieścić w autoklawie i uruchomić cykl autoklawowania (ciśnienie: 10 PSI; temperatura: 121 °C; czas: 15 min).
      2. Po odbarczeniu autoklawu należy wyjąć koszyk ze szkiełkami i umieścić go w kąpieli wodnej w RT, aby schłodzić szkiełka do temperatury pokojowej.
        UWAGA: Strategia przywracania antygenu zależy od użytego przeciwciała. W celu przeprowadzenia najbardziej odpowiedniego przywracania antygenu należy zapoznać się z kartą charakterystyki dostawcy.
    10. Szkiełka należy ułożyć poziomo, stroną z sekcją do góry, na tacy inkubacyjnej. Na wierzch należy dodać 500 µL buforu blokującego zawierającego 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS i inkubować przez 1 h. Następnie należy usunąć bufor blokujący.
    11. Roztwór przeciwciał należy przygotować, dodając 1 µL przeciwciała przeciwko ludzkiemu antygenowi jąderkowemu do 500 µL buforu blokującego na każde barwione szkiełko. Roztwór przeciwciał należy nanieść na każde szkiełko. Inkubować przez noc w wilgotnej tacy inkubacyjnej w temperaturze 4 °C.
    12. Następnego dnia szkiełka należy płukać 3x w PBS. Szkiełka należy inkubować z nierozcieńczonym przeciwciałem wtórnym anty-mysim znakowanym HRP przez 45 min. Szkiełka należy płukać 3x w PBS.
      OSTROŻNIE. W dygestorium należy przygotować bufor DAB (Tabela uzupełniająca 1). Szkiełka należy inkubować w buforze DAB przez 10 min. Wszelkie odpady należy utylizować w pojemnikach na płynne odpady chemiczne organiczne.
    13. Szkiełka należy płukać wodą. Inkubować szkiełka przez 2 min w hematoksylinie w celu kontrastowego barwienia jąder. Płukać szkiełka w bieżącej wodzie z kranu przez 10 min.
    14. Szkiełka należy dehydratować, inkubując je po 1 min w 50% etanolu, 60% etanolu, 70% etanolu, 80% etanolu i 90% etanolu, 1 min w 96% etanolu (2x), 1 min w 100% etanolu (2x) i 1 min w ksylenie (2x).
    15. Szkiełka należy zamknąć za pomocą medium montażowego i szkiełka nakrywkowego. Po wysuszeniu przez około 20 min należy obserwować szkiełka pod mikroskopem.

Wyniki

Po wycięciu gruczołu łzowego myszy (Ryc. 2A), trawienie enzymatyczne i mechaniczne doprowadziło do powstania małych fragmentów tkanki, wśród których można było rozróżnić acini i przewody (Ryc. 2B). Pozostałe duże kawałki tkanki mogłyby zdestabilizować ECM, co zmniejszyłoby początkowy wzrost organoidów. Uzyskanie organoidów gruczołu łzowego myszy uznawano za udane, gdy po około 7 dniach zaobserwowano cystyczne organoidy o średnicy ~500 µm; był to etap, w którym organoidy były gotowe do pasażowania (Ryc. 2C). Nawet jeśli ogólny proces otrzymywania organoidów przebiega pomyślnie, niektóre z nich mogą zacząć rosnąć, a następnie ostatecznie przestać. Organoidy ludzkiego gruczołu łzowego wyrosły jako cysty w ciągu 3-4 dni i osiągnęły pełną wielkość w ciągu 10-14 dni po izolacji tkanki (Ryc. 2D). Zarówno w przypadku myszy, jak i ludzi, otrzymywanie organoidów czasami nie powiodło się, co objawiało się brakiem lub małą liczbą wyrośniętych organoidów; było to zazwyczaj spowodowane zbyt intensywnym trawieniem tkanki. Organoidy gruczołu łzowego myszy można było pasażować co najmniej 40 razy, a organoidy ludzkie co najmniej 20 razy. Pasażowanie wykonywano średnio co 7-10 dni, w zależności od tempa wzrostu organoidów.

Schemat ekstrakcji gruczołu łzowego myszy, izolacji komórek i wzrostu organoidów do analizy badawczej.
Rycina 2: Ustanowienie organoidów gruczołu łzowego myszy i człowieka. (A) Zdjęcia poszczególnych etapów sekcji gruczołu łzowego myszy. Strzałka wskazuje gruczoł łzowy pod błoną ochronną. (B) Obrazy w polu jasnym komórek gruczołu łzowego myszy bezpośrednio po trawieniu tkanki, z wstawkami pokazującymi pęcherzyk i przewód. (C) Obrazy w polu jasnym udanej i nieudanej hodowli organoidów gruczołu łzowego myszy. (D) Obrazy w polu jasnym wzrostu ludzkich organoidów w ciągu 14 dni. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Organoidy gruczołu łzowego zawierają dużą proporcję komórek macierzystych podczas hodowli w medium ekspansyjnym. Aby zwiększyć ich poziom różnicowania, opracowaliśmy medium do różnicowania dla myszy i ludzi z obniżoną zawartością czynników wzrostu. Po odpowiednio 5 i 7 dniach w medium do różnicowania, mysie i ludzkie organoidy gruczołu łzowego stały się gęstsze (Rycina 3A-B). Ta zmiana morfologiczna korelowała ze zwiększeniem właściwości funkcjonalnych. Zastosowanie aktywatora cyklicznego AMP, forskoliny, lub neuroprzekaźnika noradrenaliny spowodowało obrzęk organoidów (tj. apikalną sekrecję wody) w czasie krótszym niż 3 h (Rycina 3C). W przypadku, gdy obrzęk trwał dłużej niż 3-4 h, sugerowało to, że organoidy nie były wystarczająco zróżnicowane i/lub nie wykazywały ekspresji markerów funkcjonalnych, takich jak receptory dla neuroprzekaźników.

Różnicowanie i pęcznienie gruczołu łzowego, wzrost organoidów w czasie, wyniki mikroskopowe.
Rycina 3: Różnicowanie organoidów gruczołu łzowego myszy i człowieka oraz test funkcjonalnego pęcznienia w organoidach ludzkich. (A) Obrazy w polu jasnym organoidów gruczołu łzowego myszy hodowanych w medium ekspansyjnym przez 7 dni oraz w medium różnicującym przez 5 dni po 2 dniach w medium ekspansyjnym. (B) Obrazy w polu jasnym organoidów gruczołu łzowego człowieka hodowanych w medium ekspansyjnym przez 11 dni oraz w medium różnicującym przez 9 dni po 2 dniach w medium ekspansyjnym. (C) Obrazy w polu jasnym zróżnicowanych organoidów gruczołu łzowego człowieka eksponowanych na świeże medium różnicujące (kontrola), 1 µM forskoliny oraz 100 µM norepinefryny w ciągu 3 h. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Aby przeprowadzić nokaut Pax6 w organoidach gruczołu łzowego myszy, za pomocą PCR i ligacji wygenerowano plazmid zawierający wybrany gRNA celujący w Pax6 (Ryc. 4A). Plazmid zawierający gRNA wprowadzono metodą elektroporacji wraz z plazmidami Piggy-Bac (plazmidem zawierającym transpozon oporności na hygromycynę oraz plazmidem zawierającym transpozazę) oraz edytorem zasad Cas9 C > T do organoidów gruczołu łzowego myszy rozdzielonych do pojedynczych komórek. Po 3 dniach, gdy organoidy się zregenerowały, poddano je działaniu hygromycyny w celu wyselekcjonowania klonów, które włączyły kasetę oporności na hygromycynę. W przypadku udanej elektroporacji wyrosły organoidy oporne na hygromycynę (Ryc. 4B). Wybrano rosnące klony organoidów o wielkości większej niż ~300 µm, najlepiej przed rozpoczęciem przez nie spontanicznej różnicowania (Ryc. 4C). Z części organoidu wyekstrahowano DNA, natomiast pozostałą część pozostawiono w kulturze. Amplifikacja PCR locus Pax6 celowanego przez gRNA dała prążek 367 bp dla każdego z wybranych klonów (Ryc. 4D). Po sekwencjonowaniu amplifikowanego locus zachowano klony z homozygotyczną edycją C > T (n = 1). Z kolei klony nieedytowane (n = 4), heterozygotycznie edytowane lub błędnie edytowane (n = 1) odrzucono (Ryc. 4E). Ogólnie, stosując ten gRNA celujący w Pax6, uzyskano jeden homozygotyczny klon nokautowy gruczołu łzowego myszy z sześciu zsekwencjonowanych. Niektóre klony rosły dobrze, jednak niektóre klony organoidów utracono po wyselekcjonowaniu lub zaczęły one ulegać różnicowaniu (Ryc. 4F). Z 10 wybranych klonów organoidów 7 rozrosło się prawidłowo.

Proces edycji genów CRISPR; sekwencjonowanie, selekcja higromycyną, elektroforeza w żelu, analiza klonów.
Rycina 4: Knock-out genu Pax6 w organoidach gruczołu łzowego myszy za pomocą edycji zasad.(A) Wynik sekwencjonowania metodą Sangera plazmidu pFYF1320 po prawidłowej integracji gRNA celującego w locus Pax6. (B) Obrazy w świetle przechodzącym organoidów gruczołu łzowego myszy 5 dni po ekspozycji na higromycynę po elektroporacji. Organoidy hodowano w mysiej pożywce ekspansyjnej. Po lewej znajduje się przykład nieudanej elektroporacji, w której nie wyrosły żadne klony oporne na higromycynę. Po prawej znajduje się przykład udanej elektroporacji, w której przeżyło kilka klonów organoidów opornych na higromycynę. (C) Obrazy w świetle przechodzącym klonów, które należy wybrać, oraz klonów, których nie należy wybierać. (D) Żel agarozowy pokazujący amplifikację locus Pax6 celowanego przez gRNA. Na zielono zaznaczono prążek o oczekiwanej wielkości 367 bp. (E) Wynik sekwencjonowania metodą Sangera trzech klonów organoidów opornych na higromycynę. Górny klon nie został poddany edycji. Środkowy klon to edycja homozygotyczna C > T, a zatem homozygotyczny knock-out. Dolny klon wykazuje dwie heterozygotyczne mutacje punktowe i jest albo heterozygotycznym knock-outem, albo klonem mieszanym, który został błędnie zedytowany. (F) Obrazy w świetle przechodzącym wybranych klonów organoidów o różnym stopniu wzrostu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Na koniec, w celu przeprowadzenia ortotopowego przeszczepienia ludzkich organoidów gruczołu łzowego u myszy, wykorzystano organoidy rozdzielone z 3-dniowym wyprzedzeniem (o średnicy < 100 µm). Przyjęcie organoidów potwierdzono 1 miesiąc po ich wstrzyknięciu do mysiego gruczołu łzowego poprzez barwienie na marker specyficzny dla człowieka, ludzki antygen jąderkowaty (Rycina 5). Brak punktowego barwienia we wszystkich przekrojach mysiego gruczołu łzowego oznaczał brak przyjęcia ludzkiego organoidu.

Ludzki antygen jąderkowy, wynik mikroskopowy; porównanie przeszczepienia komórek ludzkich vs. brak przeszczepienia.
Rysunek 5: Transplantacja ludzkich organoidów gruczołu łzowego do mysiego gruczołu łzowego. Barwienie przeszczepionych mysich gruczołów łzowych na ludzki marker jąderkowy w celu monitorowania przyjęcia przeszczepu 1 miesiąc po transplantacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1: Skład pożywek i buforów. Aby pobrać tę tabelę, kliknij tutaj.

Dyskusja

Protokół ten opisuje tworzenie i stosowanie organoidów gruczołów łzowych do testów funkcjonalnych, modelowania mutacji i przeszczepów. Podczas tworzenia organoidów gruczołów łzowych myszy i ludzi dysocjacja tkanek ma kluczowe znaczenie. Jeśli tkanka nie zostanie wystarczająco strawiona, wydajność organoidów będzie niska. Jeśli tkanka zostanie nadmiernie strawiona, komórki umrą i nie wyrosną jako organoidy. Każda tkanka powinna być trawiona przez określony enzym przez określony czas, aby zapewnić optymalny wzrost organoidów 14,17,18. Gruczoł łzowy jest raczej miękką tkanką, dla której trawienie kolagenazą trwające 5-10 minut w połączeniu z mechaniczną dysocjacją opartą na pipetowaniu jest wystarczające do wyizolowania małych fragmentów tkanki. Jeśli konieczne jest uzyskanie pojedynczych komórek do zastosowań takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki, dysocjację można przeprowadzać przez dłuższy czas, aż do osiągnięcia stadium pojedynczej komórki, ale dysocjację należy przerwać, gdy tylko uzyska się pojedyncze komórki, aby ograniczyć jakikolwiek spadek żywotności. Ponieważ dysocjacja tkanek jest tak ważna, nadmierne trawienie jest najbardziej prawdopodobną przyczyną niewydolności organoidów gruczołów łzowych.

Właściwa konserwacja organoidów gruczołów łzowych jest ważna dla ich stosowania. Długotrwałe utrzymanie jest cechą charakterystyczną organoidów gruczołów łzowych pochodzących z dorosłych komórek macierzystych, w porównaniu z indukowanymi organoidami pochodzącymi z pluripotencjalnych komórek macierzystych 7,17. Aby osiągnąć długotrwałe utrzymanie, należy przeprowadzać regularne rozszczepianie organoidów i zmiany podłoża. Bez tego organoidy zaczynają się różnicować i rozwijać zmniejszony potencjał komórek macierzystych, co utrudnia ich długoterminowe utrzymanie7. Na tym etapie nadmierne trawienie może zabić komórki macierzyste i zaburzyć utrzymanie organoidów. Do regularnej konserwacji dysocjacja organoidów na pojedyncze komórki nie jest wymagana. Jednak, aby wygenerować klonalne linie organoidów z nokautem, ważne jest, aby zacząć od pojedynczych komórek. Jeśli tak się nie stanie, organoidy będą składać się z mozaiki komórek o różnym pochodzeniu genetycznym, co uniemożliwi analizę efektu pojedynczej, zdefiniowanej mutacji. Tutaj opisujemy użycie edytora bazowego C > T do generowania kodonów stop. Ten edytor genomu opiera się na obecności kodonów argininy, glutaminy lub tryptofanu w obrębie 12-18 zasad z NGG PAM. Gdy te warunki nie są spełnione przy projektowaniu gRNA, można zastosować konwencjonalne edytory zasad Cas9 lub C >T z alternatywnymi PAM 7,18. Jednak konwencjonalny Cas9 wprowadza dwuniciowe przerwy, które powodują powstawanie indeli po naprawie11. Ponieważ oba allele mogą zawierać różne indele, genotypowanie klonów wymaga dodatkowej ostrożności. Dekonwolucja wprowadzonych modyfikacji powinna być przeprowadzona w celu upewnienia się, że oba allele zawierają indele poza ramką, a tym samym, że klony organoidów są znokautowane dla genu docelowego19. Zaletą edytorów zasad C > T jest fakt, że można je wykorzystać do modelowania mutacji punktowych, które niekoniecznie skutkują kodonami stop. Na przykład można je wykorzystać do modelowania określonych mutacji Pax6 występujących u pacjentów z aniridią w celu zbadania ich wpływu na fizjologię gruczołów łzowych20.

Gruczoł łzowy wydziela wodną część filmu łzowego1. Wydzielanie łez można zrekapitulować w ludzkich organoidach po różnicowaniu, w którym pośredniczy wycofanie czynnika wzrostu i hamowanie NOTCH. W tych warunkach organoidy ulegają końcowemu różnicowaniu i nie mogą być dalej utrzymywane. Jednak zróżnicowane organoidy gruczołów łzowych mogą kierować opracowywaniem leków wywołujących łzawienie w kontekście zespołu suchego oka, potencjalnie w badaniach przesiewowych o wysokiej przepustowości. Test rozrywania przedstawiony w tym protokole jest tym, który obecnie daje największą zmianę wielkości organoidu w krótkim czasie, co ułatwia jego ilościowe określenie w kontekście badania przesiewowego leków 7,9,17.

Terapia komórkami macierzystymi jest bardzo obiecująca w regeneracji gruczołów łzowych w chorobie suchego oka21. Organoidy gruczołów łzowych pochodzące z dorosłych komórek macierzystych mogą być materiałem źródłowym do takich zastosowań. Przedstawiony tutaj protokół skutkuje wszczepieniem organoidów ludzkich gruczołów łzowych, głównie w postaci torbieli. Niskie wszczepienie organoidów może powstać w wyniku wstrzyknięcia organoidów w niewłaściwe miejsce. Szkolenie procedury iniekcji za pomocą barwnika pozwala na śledzenie miejsca wstrzyknięcia i ostatecznie poprawia dokładność iniekcji. Alternatywnie, naskórek myszy może zostać nacięty, aby mieć bezpośredni dostęp do gruczołu łzowego, tak jak to miało miejsce u szczurów przed22 rokiem życia. Ta metoda trwa dłużej, ale może być dokładniejsza. Z drugiej strony, przy obecnym protokole, organoidy nie integrowały się funkcjonalnie z gruczołem łzowym myszy. Podobne wyniki zaobserwowano w przypadku wszczepienia gruczołu łzowego pochodzącego z iPSC22. Metodę przeszczepu można jeszcze bardziej udoskonalić, raniąc wcześniej gruczoł łzowy przy użyciu mysiego modelu suchego oka i/lub wstrzykując organoidy w postaci pojedynczych komórek lub małych kępek. Niemniej jednak organoidy gruczołów łzowych pochodzące z dorosłych komórek macierzystych i związany z nimi zestaw narzędzi mogą stanowić podstawę przyszłych zastosowań w badaniach gruczołów łzowych i medycynie regeneracyjnej.

Oświadczenia

Hans Clevers jest szefem działu badań farmaceutycznych i wczesnego rozwoju w firmie Roche w Bazylei i posiada kilka patentów związanych z technologią organoidów.

Podziękowania

Dziękujemy Yorickowi Postowi za początkowy rozwój protokołu. Prace te zostały częściowo wsparte nagrodą przyznaną zespołowi SPECIFICANCER przez Cancer Research UK Grand Challenge (C6307/A29058) oraz Mark Foundation for Cancer Research.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml probówki wirówkowe z blokadą safe-lockEppendorfEP0030 120.094
3,3′-diaminobenzydyny tetrachlorowodorek hydrat (DAB)Sigma-AldrichD5637CAS: 868272-85-9 , UWAGA, roztwór 6 g/l można przechowywać w porcji w temperaturze -20 & stopni; C
5x zielony bufor GoTaq FlexiPromegaM891APrzechowywać przy -20 & deg; C
A83-01Tocris2939Przechowywać przy -20 ° C, stan magazynowy 30 mM, 10000x
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634-010przechowywać pod kątem 4 stopni; C
Płytki agarowe zawierające ampicylinęInstytut
Hubrechta Sól sodowa ampicylinySigma-AldrichA9518
Autoklaw VAPOUR-Line liteChemikalia
B27 suplementInvitrogen17504-044Przechowywać w temperaturze -20 ° C, 50x
BD Micro-Fine igła insulinowa 1 mlBD Bioscience324825
Mikroskop stołowy DMI1Leica
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)MP biomedyczne160069Sklep w 4 & stopni; C
BTXpressBTXMDS450805
C57BL/6 myszyHubrecht Institute
KasetyKlinipath410-02S
CellBanker 1amsbio11910Pożywka do kriokonserwacji, postępuj zgodnie z instrukcją
WirówkaEppendorf
Monohydrat kwasu cytrynowegoJ.T. Baker0088CAS: 5949-29-1
Kolagenaza ISigma AldrichC9407Podwielokrotności w dawce 20 mg / ml, 20x, przechowywać w temperaturze -20 & deg; C
Probówki stożkowe 15 mlGreiner Bio-One5618-8271
Rurki stożkowe 50 mlCorningCLS430828-500EA
Szkiełka nakrywkowe 24 mm x 50 mmMenzel-Glä zerBB024050S1
Ekstrakt z błony podstawnej Cultrex (BME), Obniżony czynnik wzrostu, Typ 2 - macierz zewnątrzkomórkowaR& D Systems, Bio-Techne3533-001-02Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C, utrzymuj na 4 & stopni; C przez okres do 1 miesiąca
DAPTSigma AldrichD5942Przechowywać w temperaturze -20 ° C, zapas przy 10 mM, 1000x
Wodorofosforan disodowy bezwodnyChemikalia VWR28026.292CAS: 7558-79-4
Dihydrat wodorofosforanu soduSigma-Aldrich71643CAS: 10028-24-7
DypazaThermoFisher Scientific17105-041Podwielokrotności w stężeniu 50 U/ml, przechowywać w temperaturze -20 ° C do momentu użycia, 400x
Jednorazowy skalpel Sterylny N° 10Mikroskop Swann Morton3033838
DM4000Leica
dNTPs 25 mMPromegaU1420Wymieszaj wszystkie 4 nukleotydy razem, Przechowuj w temperaturze -20 & stopni; C
Dpn1New England BiolabsR0176
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)Gibco141901441x
Łatwe sitka 70 i mikro; mGreiner542170
Kuweta do elektroporacjiNepageneEC002S
Mysz EnVision+/HRPAgilentK400111-2
Etanol 100%BOOM84045206; 5000UWAGA, Służy do przygotowania innych rozcieńczeń etanolu
Etanol 70%BOOM84010059.5000UWAGA
Etanol 96%BOOM84050065.5000UWAGA
EVOS FL Auto 2 System obrazowania komórekThermoFisher ScientificMikroskop do obrazowania na żywo w jasnym polu
FGF10Peprotech100-26Przechowywać przy -20 stopniach; C, zapas w 100 mg/ml w podłożu bazowym, 100x
FidżiNIH, Fidżi deweloperzy
Roztwór formaldehydu 4%Sigma-Aldrich1.00496CAS: 50-00-0, UWAGA
ForskolinaTocris1099Przechowywać w temperaturze -20 ° C, zapas przy 10 mM, 10000x
GlutamaxGibco35050-061100x
GoTaq G2 Flexi DNA PolimerazaPromegaM7805Przechowywać w -20 ° C
Chemikalia HematoksylinaVWR10047105Przechowywać w temperaturze pokojowej
HEPESGibco15630-080Przechowywać w temperaturze 4 stopni C, 100x
Histocore H i C, Maszyna do zatapiania tkanekLeica
Płyta grzejnaMeidax
Ludzkie przeciwciało antygenu jąderkowegoAbcamab-190710
Kwas solny 5 NThermoFisher Scientific10605882CAS: 7647-01-0, UWAGA
Nadtlenek wodoru 30%Chem-labCL00.2308.1000CAS: 7722-84-1, UWAGA
Hygromycyna B-goldInvivoGenant-hgZapas w dawce 100 mg/&mikro; L, 1000x
kaseta odporności na higromycynę plazmidAndersson-Rolf i inni, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156
IsoFlo 100%Mecan5960501
LB mediumHubrecht Institute
MgCl2 25 mMPromegaA351HPrzechowywać w temperaturze -20 stopni; C
Microtome RM2235Zestaw
Midiprep Zestaw do izolacji DNAThermoFisher ScientificK210005
MiniprepThermoFisher scientificK210003
N-acetylocysteinaSigmaAldrich A9165Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C, zapas na 500 mM, 400x
NEPA21 elektroporatorNepagene
NikotynamidSigma AldrichN0636Przechowywać przy -20 ° C, zapas w 1M, 100x
myszy NOD Scid Gamma (NSG)Hubrecht Institute colony
Noggin conditioned mediumU-Protein ExpressNa zamówienie niestandardowePrzechowywać w -20 ° C
NoradrenalineSigma AldrichA7257Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C, zapas przy 100 mM
PiekarnikMemmertZestaw na 58 & deg; Pipety C
P20, P200 i P1000 ChemikaliaGilson
ParaffinVWR 10048502
Pipety Pasteura, z zaślepką szklanąThermoFisher Scientific1150-6973
Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG Pax6_C>T_R IDT
: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC IDT
pCMV_ABEmax_P2A_GFPAddgene112101
Penicylina/StreptomycynaInvitrogen15140-122Przechowywać pod adresem -20 ° C
PertexKlinipathAM-08010
pFYF1320 Addgene47511
PrimocinInvivoGenant-pm-11000X, przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
Prostaglandyna E2 (PGE2)Tocris2296Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C, zapas 10 mM, 10000x
szalka Petriego, 10 cmGreiner633102
bufor Q5New England BiolabsB9027S
Q5 polimeraza DNA o wysokiej wiernościNew England BiolabsM0491S
żeluQiagen28704
Roztwór do ekstrakcji DNA QuickExtractLucigenQE09050Store podwielokrotności przy -20 ° C
R-spondyna 3 kondycjonowana pożywkaU-Protein Expressna zamówienie Przechowywaćw temperaturze -20 ° C
sgRNA Odwrotny starter: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTT CGGTGTTTCGTCCTCCAAGIDT
SlajdyStarFrostMBB-0302-55AKlej, mielony
Azydek soduMerck8.22335.1000CAS: 26628-22-8, UWAGA
Cytrynian sodu dwuwodnyJ.T. Baker0280CAS: 6132-04-3
Standardowy starter do przodu: "/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
TTAAAATAAGGC		IDT
Skuteczność subklonowania kompetentne komórki DH5alphaInvitrogen18265-017
Płytki do hodowli komórek zawiesinowych (24-dołkowe)Greiner Bio-One66210224-dołkowe
płytki do hodowli komórek zawiesinowych (12-dołkowe)Greiner Bio-One66510212-dołkowe
Ligaza DNA T4New England BiolabsM0202
Bufor TAEThermoFisher ScientificB49Stock przy 50x, rozcieńczyć do 1x plazmidem
zawierającym transpozazęAndersson-Rolf i in., Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156
TrypLE Express EnzymeInvitrogen12605-028przechowywać w 4 ° C
U6_Forward podkład: GGGCAGGAAGAGGGCCTATIDT
UltraPure Agarose 1000Invitrogen16550
Kąpiel wodnaTulabo
XyleneKlinipath4055-9005CAS: 1330-20-7, UWAGA
Y-27632Abmole BioscienceY-27632 dichlorowodorekPrzechowywać w temperaturze -20 stopni; C, zapas przy 10 mM, 1000x
VWR zawierający do izolacji DNA Leica QIAquick Zestaw do ekstrakcji wody ultraczystej

Bibliografia

  1. Garg, A., Zhang, X. Lacrimal gland development: From signaling interactions to regenerative medicine. Developmental Dynamics. 246 (12), 970-980 (2017).
  2. Selinger, D. S., Selinger, R. C., Reed, W. P. Resistance to infection of the external eye: The role of tears. Survey of Ophthalmology. 24 (1), 33-38 (1979).
  3. Messmer, E. M. The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease. Deutsches Arzteblatt International. 112 (5), 71-81 (2015).
  4. Massie, I., et al. Development of lacrimal gland spheroids for lacrimal gland tissue regeneration. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2001-2009 (2018).
  5. Tiwari, S., et al. Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function. PloS One. 7 (1), 29458(2012).
  6. Nguyen, D. H., Beuerman, R. W., Halbert, C. L., Ma, Q., Sun, G. Characterization of immortalized rabbit lacrimal gland epithelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (4), 198-204 (1999).
  7. Bannier-Hélaouët, M., et al. Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing. Cell Stem Cell. 28 (7), 1221-1232 (2021).
  8. Hayashi, R., et al. Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells. Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).
  9. Jeong, S. Y., et al. Establishment of functional epithelial organoids from human lacrimal glands. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 247(2021).
  10. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nature Reviews Materials. 6 (5), 402-420 (2021).
  11. Meyenberg, M., Ferreira da Silva, J., Loizou, J. I. Tissue specific DNA repair outcomes shape the landscape of genome editing. Frontiers in Genetics. 12, 728520(2021).
  12. Geurts, M. H., et al. CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank. Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).
  13. Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: Studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232(2015).
  14. Driehuis, E., et al. Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy. Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).
  15. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), e253(2007).
  16. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  17. Lian, J., Meng, X., Zhang, X., Hu, H. Establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids. Journal of Visualized Experiments. (180), e62438(2022).
  18. Lõhmussaar, K., et al. Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer. Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).
  19. Bloh, K., et al. Deconvolution of complex DNA repair (DECODR): Establishing a novel deconvolution algorithm for comprehensive analysis of CRISPR-edited Sanger sequencing data. The CRISPR Journal. 4 (1), 120-131 (2021).
  20. Latta, L., et al. Pathophysiology of aniridia-associated keratopathy: Developmental aspects and unanswered questions. The Ocular Surface. 22, 245-266 (2021).
  21. Veernala, I., et al. Lacrimal gland regeneration: The unmet challenges and promise for dry eye therapy. The Ocular Surface. 25, 129-141 (2022).
  22. Hayashi, R., et al. Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells. Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

R nicowanie organoid wtransplantacja organoid wtrawienie tkanekprotok elektroporacjihodowla organoid wgruczo zowy myszyprzeszczepienie organoid w
Ustalanie, utrzymywanie, różnicowanie, manipulacja genetyczna i przeszczepianie organoidów gruczołów łzowych myszy i ludzi
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.