Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowana stymulacja multimodalna i jednoczesna rejestracja neuronów z wielu małych organizmów

DOI:

10.3791/65042

⸱

3 marca 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute, 2Graduate School of Biomedical Sciences, UMass Chan Medical School, 3Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy metodę elastycznej chemicznej i multimodalnej stymulacji oraz rejestrowania jednoczesnej aktywności neuronalnej wielu robaków Caenorhabditis elegans. Metoda ta wykorzystuje mikrofluidykę, sprzęt i oprogramowanie typu open source oraz nadzorowaną automatyczną analizę danych, aby umożliwić pomiar zjawisk neuronalnych, takich jak adaptacja, hamowanie czasowe i przesłuchy bodźców.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescencyjne, genetycznie kodowane wskaźniki wapnia znacznie przyczyniły się do naszego zrozumienia dynamiki neuronalnej, od poziomu pojedynczych neuronów do całych obwodów mózgu. Jednak reakcje neuronalne mogą się różnić ze względu na wcześniejsze doświadczenia, stany wewnętrzne lub czynniki stochastyczne, co generuje zapotrzebowanie na metody, które mogą ocenić funkcje neuronalne u wielu osób jednocześnie. Podczas gdy większość technik rejestracji bada pojedyncze zwierzę na raz, my opisujemy zastosowanie mikroskopii szerokokątnej do skalowania zapisów neuronalnych do dziesiątek Caenorhabditis elegans lub innych organizmów w skali submilimetrowej jednocześnie. Sprzęt i oprogramowanie typu open source pozwalają na dużą elastyczność w programowaniu w pełni zautomatyzowanych eksperymentów, które kontrolują intensywność i czas różnych typów bodźców, w tym bodźców chemicznych, optycznych, mechanicznych, termicznych i elektromagnetycznych. W szczególności mikroprzepływowe urządzenia przepływowe zapewniają precyzyjną, powtarzalną i ilościową kontrolę bodźców chemosensorycznych z rozdzielczością poniżej sekundy. Półautomatyczny potok analizy danych NeuroTracker wyodrębnia następnie indywidualne i populacyjne reakcje neuronalne, aby odkryć funkcjonalne zmiany w pobudliwości i dynamice neuronalnej. W artykule przedstawiono przykłady pomiaru adaptacji neuronalnej, hamowania czasowego i przesłuchów bodźców. Techniki te zwiększają precyzję i powtarzalność stymulacji, pozwalają na badanie zmienności populacji i można je uogólnić na inne dynamiczne sygnały fluorescencyjne w małych biosystemach od komórek i organoidów po całe organizmy i rośliny.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki obrazowania wapnia pozwoliły na nieinwazyjne rejestrowanie dynamiki neuronalnej in vivo w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i genetycznie kodowanych wskaźników wapnia wyrażanych w komórkach docelowych1,2,3. Czujniki te zazwyczaj wykorzystują białko zielonej fluorescencji (GFP), takie jak peptyd z rodziny GFP-calmodulin-M13 (GCaMP), w celu zwiększenia intensywności fluorescencji po aktywacji neuronów i podwyższonym wewnątrzkomórkowym poziomie wapnia. Obrazowanie wapnia okazało się szczególnie skuteczne w przypadku nicieni C. elega....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sprzęt do obrazowania neuronowego

UWAGA: Zobacz Lawler and Albrecht15, aby uzyskać szczegółowe instrukcje dotyczące budowy systemu obrazowania i stymulacji, który kontroluje czas oświetlenia mikroskopu, akwizycję obrazu i dostarczanie bodźców (Rysunek 1). Niedrogi sterownik bodźców Arduino Nano uruchamia zawory fluidyczne za pomocą sygnałów cyfrowych do sterownika zaworu i steruje oświetleniem optogenetycznym za pomocą analogowych sygnałów napięciowych do sterownika LED. Inne bodźce, takie jak silniki wibracyjne i grzałki termiczne, mogą być sterowane za pomocą sygnałów....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy kilka przykładów wzorców bodźców, które oceniają różne zjawiska neuronalne, w tym czasowe hamowanie, adaptację i odhamowanie. Hamowanie czasowe to chwilowe stłumienie reakcji neuronalnej na drugą prezentację bodźca, które następuje wkrótce po początkowej prezentacji14. Aby przetestować to zjawisko, w eksperymencie z parami impulsów przedstawiono osiem wzorów składających się z dwóch impulsów zapachowych 1 s oddzielonych interwałem od 0 s do 20 s (R.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym protokole opisujemy system mikroskopii o otwartym dostępie do oceny zjawisk aktywności neuronalnej przy użyciu czasowo precyzyjnego dostarczania różnych wzorców bodźców. Platforma mikroprzepływowa dostarcza powtarzalnych bodźców, jednocześnie utrzymując dziesiątki zwierząt w polu widzenia mikroskopu. Niewiele komercyjnych pakietów oprogramowania do mikroskopii pozwala na łatwe programowanie różnych wzorców czasowych bodźców, a te, które to robią, często wymagają ręcznego wprowadzania każdego wzorca lub zastr.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Foxowi Avery'emu za przetestowanie tych protokołów i przejrzenie manuskryptu oraz Ericowi Hallowi za pomoc w programowaniu. Metody przedstawione w niniejszym dokumencie zostały częściowo sfinansowane przez National Science Foundation 1724026 (D.R.A.).

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szczepy bakteryjne
E.  coli (OP50)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)Cat# OP50
Modele eksperymentalne: Organizmy/szczepy
C.  elegans szczepy eksprymujące GCaMP (i opcjonalnie Chrimson) w pożądanych neuronachCaenorhabditis Genetics Center (CGC) lub korespondencyjnych autorów opublikowanej pracyNZ1091, na przykład
Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies
2,3-ButanedioneSigma-AldrichCat# B85307diacetyl, przykład chemiczny bodziec
Chlorek wapnia, CaCl2Sigma-AldrichCat# C3881
Fluoresceina, Sól sodowaSigma-AldrichCat# F6377
Szklany środek hydrofobowyRain-XCat #800002250szklana powłoka hydrofobowa (jednorazowa)
Chlorek magnezu, MgCl2Sigma-AldrichCat# M2393
Pożywka do wzrostu nicieni (NGM) agarGeneseeCat #: 20-273NGM
Szalki Petriego (60  mm)TritechCat #T3305
Poli(dimetylosiloksan) (PDMS): Sylgard 184Dow ChemicalCat# 1673921
Fosforan potasu jednozasadowySigma-AldrichCat# P5655
Fosforan potasu dwuzasadowySigma-AldrichCat# P8281
Chlorek sodu, NaClSigma-AldrichCat# S7653
(tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo)trichlorosilan (TFOCS)GelestCAS# 78560-45-9szklana hydrofobowa obróbka hydrofobowa (trwała)
Oprogramowanie i algorytmy
Arduino IDEArduinohttps://www.arduino.cc/en/software
ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
Micro-managerOprogramowanie sterujące mikroskopem Mikromenedżerhttps://micro-manager.org/
Oprogramowanie do analizyAlbrecht Labhttps://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl
NeurotrackerAlbrecht Labhttps://github.com/albrechtLab/Neurotracker
Automated Microscope and Stimulation System
Axio Observer.A1 mikroskop odwrócony ustawiony do epifluorescencji (kostki filtra GFP, 5&krotne; obiektywne lub podobne)ZeissCat #491237-0012-000
Oświetlacz LED Excelitas X-cite XYLIS ExcelitasCat #XYLIS
Orca Flash 4.0 Cyfrowa kamera sCMOSHamamatsuCat #C11440-22CU
Arduino nanoArduinoCat #A000005
3-drogowy miniaturowy zawór odcinający Diapragm (LQX12)ParkerCat #LQX12-3W24FF48-000Zawór 1: Steruj
2-drogowym normalnie zamkniętym (NC) zaworem zaciskowymBio-Chem Valve IncCat #075P2-S432Zawór 2: Odpływowy
3-drogowy zawór zaciskowyNResearchCat #161P091 Zawór 3: bodziec wybór
Dioda LED i kontroler stymulacji optogenetycznej (615 nm)MightexCat #PLS-0625-030-S i #SLA-1200-2
ValveLink 8.2 cyfrowy/ręczny sterownik zaworuAutoMate ScientificCat #01-18
Przewody i złączaróżneZobacz rys. 2 protokołu Cell STARS (Lawler, 2021)
Przygotowanie urządzenia mikroprzepływowego
Frez rotacyjny Dremel o zmiennej prędkości 4000 DremelCat #F0134000ABUstaw prędkość na 5 tys. obr./min do cięcia szkła
Wiertarka rotacyjna Dremel Stacja roboczaDremelCat #220-01
Wiertło diamentoweDremelCat #7134
Szkiełko szklane, 1  mm grubościVWRCat #75799-268
Szklany rysik (rysik diamentowy)Ted PellaCat #54468
Luer 3-drożny kranCole-ParmerCat #EW-30600-07
Luer 23 G igłaVWRCat #89134-100
Urządzenie mikroprzepływoweOdpowiadanie autorowi lub producentowi na podstawie plików CAD powiązanych z tym artykułemNie dotyczy
Zacisk urządzenia mikroprzepływowegoWarner Instruments (lub warsztat mechaniczny)P-2
Rurka mikroprzepływowa, 0,02″ IDCole-ParmerCat #EW-06419-01
Tuba 19 g, 0,5′Nowa Anglia Mała rurkaKot #NE-1027-12
danych

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).
  2. Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -H.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zautomatyzowany zapis aktywno ci neuronalnejurz dzenia mikroprzep ywowemikroskopia szerokopolowaCaenorhabditis elegansobrazowanie wapniazmienno populacji neuronalnejgenetycznie kodowane wska nikianaliza NeuroTrackerprogramowanie wzorc w bod c w

Powiązane artykuły