Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowana stymulacja multimodalna i jednoczesna rejestracja neuronów z wielu małych organizmów

DOI:

10.3791/65042

⸱

3 marca 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute, 2Graduate School of Biomedical Sciences, UMass Chan Medical School, 3Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy metodę elastycznej chemicznej i multimodalnej stymulacji oraz rejestrowania jednoczesnej aktywności neuronalnej wielu robaków Caenorhabditis elegans. Metoda ta wykorzystuje mikrofluidykę, sprzęt i oprogramowanie typu open source oraz nadzorowaną automatyczną analizę danych, aby umożliwić pomiar zjawisk neuronalnych, takich jak adaptacja, hamowanie czasowe i przesłuchy bodźców.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescencyjne, genetycznie kodowane wskaźniki wapnia znacznie przyczyniły się do naszego zrozumienia dynamiki neuronalnej, od poziomu pojedynczych neuronów do całych obwodów mózgu. Jednak reakcje neuronalne mogą się różnić ze względu na wcześniejsze doświadczenia, stany wewnętrzne lub czynniki stochastyczne, co generuje zapotrzebowanie na metody, które mogą ocenić funkcje neuronalne u wielu osób jednocześnie. Podczas gdy większość technik rejestracji bada pojedyncze zwierzę na raz, my opisujemy zastosowanie mikroskopii szerokokątnej do skalowania zapisów neuronalnych do dziesiątek Caenorhabditis elegans lub innych organizmów w skali submilimetrowej jednocześnie. Sprzęt i oprogramowanie typu open source pozwalają na dużą elastyczność w programowaniu w pełni zautomatyzowanych eksperymentów, które kontrolują intensywność i czas różnych typów bodźców, w tym bodźców chemicznych, optycznych, mechanicznych, termicznych i elektromagnetycznych. W szczególności mikroprzepływowe urządzenia przepływowe zapewniają precyzyjną, powtarzalną i ilościową kontrolę bodźców chemosensorycznych z rozdzielczością poniżej sekundy. Półautomatyczny potok analizy danych NeuroTracker wyodrębnia następnie indywidualne i populacyjne reakcje neuronalne, aby odkryć funkcjonalne zmiany w pobudliwości i dynamice neuronalnej. W artykule przedstawiono przykłady pomiaru adaptacji neuronalnej, hamowania czasowego i przesłuchów bodźców. Techniki te zwiększają precyzję i powtarzalność stymulacji, pozwalają na badanie zmienności populacji i można je uogólnić na inne dynamiczne sygnały fluorescencyjne w małych biosystemach od komórek i organoidów po całe organizmy i rośliny.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki obrazowania wapnia pozwoliły na nieinwazyjne rejestrowanie dynamiki neuronalnej in vivo w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i genetycznie kodowanych wskaźników wapnia wyrażanych w komórkach docelowych1,2,3. Czujniki te zazwyczaj wykorzystują białko zielonej fluorescencji (GFP), takie jak peptyd z rodziny GFP-calmodulin-M13 (GCaMP), w celu zwiększenia intensywności fluorescencji po aktywacji neuronów i podwyższonym wewnątrzkomórkowym poziomie wapnia. Obrazowanie wapnia okazało się szczególnie skuteczne w przypadku nicieni C. elegans do badania funkcjonowania neuronów i obwodów nerwowych u żywych, zachowujących się zwierząt4,5,6,7,8,9,10, ponieważ ich przezroczysta natura oznacza, że dostęp optyczny nie jest wymagany żaden proces chirurgiczny, a promotory genów specyficzne dla komórek kierują ekspresję do komórek będących przedmiotem zainteresowania. Techniki te często wykorzystują urządzenia mikroprzepływowe, które zapewniają precyzyjnie kontrolowane środowisko do badania zjawisk biologicznych, chemicznych i fizycznych w małej skali fizycznej11,12. Urządzenia mikroprzepływowe obfitują w urządzenia do pomiaru aktywności neuronalnej, a nowe projekty są stale opracowywane i są łatwo wytwarzane w laboratorium badawczym. Jednak wiele projektów łapie pojedyncze zwierzę na raz, ograniczając przepustowość eksperymentalną7,9,13. Reakcje neuronalne często różnią się znacznie u różnych zwierząt ze względu na różnice we wcześniejszych doświadczeniach, stanach wewnętrznych, takich jak stres lub głód, lub czynnikach stochastycznych, takich jak poziom ekspresji genów. Różnice te wskazują na zapotrzebowanie na metody, które mogą jednocześnie stymulować i obserwować wiele zwierząt oraz wydobywać informacje od osobników4.

Ponadto, pewne zjawiska neuromodulacyjne stają się widoczne tylko w określonych warunkach stymulacji, takich jak czasowe hamowanie14, co odnosi się do krótkiego tłumienia reakcji, gdy stymulacja następuje w krótkim odstępie czasu. W tym celu systemy elektrofizjologiczne mogą sterować aktywnością neuronalną w szerokiej przestrzeni bodźców, modulując na przykład prąd impulsu elektrycznego, napięcie, częstotliwość, przebieg, cykl pracy i czas okresowych pociągów bodźców. Stymulacja pośrednia za pomocą naturalnie wykrywanych bodźców lub systemów optogenetycznych skorzystałaby z podobnego zakresu mechanizmów kontrolnych. Obecnie wiele naturalnych bodźców jest prezentowanych w prosty sposób "włącz-wyłącz", takich jak prezentacja i usuwanie zapachu, przy użyciu komercyjnych systemów, które powoli zwiększały elastyczność. Jednak niedrogie mikrokontrolery mogą teraz zautomatyzować dostarczanie kilku rodzajów bodźców w sposób, który można dostosować do potrzeb badaczy. W połączeniu z mikrofluidyką, systemy te osiągnęły cel, jakim jest zwiększenie przepustowości i elastyczności eksperymentów, umożliwiając jednoczesne mierzenie reakcji neuronalnych na różnorodne precyzyjne bodźce u wielu zwierząt4,6. Stymulacja multimodalna może być wykorzystana do dalszego badania obwodów neuronalnych, na przykład poprzez monitorowanie zmian w pobudliwości neuronalnej podczas konsekwentnej stymulacji przed, w trakcie i po ortogonalnym zaburzeniu, takim jak ekspozycja na lek4. Korzyści płynące z niedrogich, otwartych systemów mikroskopowych są oczywiste dla postępu badań naukowych, jednak w praktyce potrzeba pozyskiwania części, budowy i walidacji działania może utrudniać przyjęcie tych technik.

Ten protokół ma na celu złagodzenie niektórych z tych technicznych wyzwań. Podczas gdy poprzednie protokoły koncentrowały się na użyciu urządzeń mikroprzepływowych i podstawowej stymulacji9,15,17, tutaj opisujemy budowę i zastosowanie elastycznego, zautomatyzowanego, multimodalnego systemu dostarczania bodźców do obrazowania neuronowego u C. elegans lub innych małych organizmów wykorzystujących wcześniej opisane urządzenia mikroprzepływowe4. System o otwartym kodzie źródłowym jest programowany za pomocą prostych plików tekstowych w celu zdefiniowania eksperymentów, a program do analizy danych NeuroTracker półautomatycznie wyodrębnia dane o aktywności neuronalnej z filmów z mikroskopu. Demonstrujemy ten system na przykładach oceny czasowego hamowania, odhamowywania i przesłuchów bodźców za pomocą neuronu chemosensorycznego AWA, który depolaryzuje się w odpowiedzi na różne zapachy żywności lub w odpowiedzi na światło podczas ekspresji optogenetycznych światłoczułych kanałów jonowych5,6.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sprzęt do obrazowania neuronowego

UWAGA: Zobacz Lawler and Albrecht15, aby uzyskać szczegółowe instrukcje dotyczące budowy systemu obrazowania i stymulacji, który kontroluje czas oświetlenia mikroskopu, akwizycję obrazu i dostarczanie bodźców (Rysunek 1). Niedrogi sterownik bodźców Arduino Nano uruchamia zawory fluidyczne za pomocą sygnałów cyfrowych do sterownika zaworu i steruje oświetleniem optogenetycznym za pomocą analogowych sygnałów napięciowych do sterownika LED. Inne bodźce, takie jak silniki wibracyjne i grzałki termiczne, mogą być sterowane za pomocą sygnałów cyfrowych lub analogowych. Kontroler bodźca synchronizuje stymulację i rejestrację obrazu za pomocą sygnałów z kamery, zgodnie ze specyfikacją oprogramowania sterującego mikroskopem Micro-Manager o otwartym kodzie źródłowym (μManager)16. Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, odczynników, sprzętu i organizmów użytych w tym protokole.

  1. Skonfiguruj sprzęt do obrazowania neuronowego, w tym mikroskop epifluorescencyjny z optyką GFP, kamerę sCMOS z cyfrowym sygnałem wyjściowym ekspozycji oraz kontroler bodźców15.
  2. Podłącz sterownik bodźca do żądanych systemów za pomocą sygnałów cyfrowych lub analogowych. W przedstawionych poniżej przykładach stosowane są następujące systemy:
    1. Użyj sterownika zaworu do stymulacji chemicznej. Podłącz sterownik zaworu do elektrozaworu hydraulicznego lub zaworów zaciskowych (Rysunek 1)15.
    2. Użyj czerwonej diody LED 615 nm i kontrolera do stymulacji optogenetycznej, zamontowanego nad stolikiem mikroskopu.
  3. Skonfiguruj komputer za pomocą oprogramowania sterującego mikroskopem, utwórz ustawienie konfiguracji z ustawieniami sprzętu i zapewnij prawidłowe działanie sterowania bodźcem15.

2. Produkcja urządzeń mikroprzepływowych

UWAGA: Zobacz Lagoy et al.17, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat pozyskiwania lub wytwarzania form wzorcowych oraz produkcji, użytkowania i czyszczenia urządzeń mikroprzepływowych. Kroki te zostały podsumowane poniżej.

  1. Uzyskaj lub wyprodukuj formę wzorcową, korzystając z dostarczonego pliku projektu mikroprzepływowego (albrechtlab.github.io/microfluidics)17. W przypadku młodych dorosłych C. elegans upewnij się, że wysokość kanału wynosi 55-70 μm.
  2. Połączyć bazę PDMS i utwardzacz w stosunku wagowym 10:1 i dokładnie wymieszać za pomocą pipet transferowych.
  3. Odgazowuje się przez 30-60 minut w eksykatorze próżniowym, aż pęcherzyki znikną.
  4. Umieść formę wzorcową na dużej (150 mm średnicy) szalce Petriego i zalej odgazowany PDMS na głębokość 4-5 mm (~100 g). Sprawdź i usuń kurz lub pęcherzyki za pomocą pipety transferowej.
  5. Piec w temperaturze 65 °C na równej półce piekarnika przez 3 godziny do nocy.
  6. Po utwardzeniu użyj skalpela, aby odciąć PDMS od formy i prostej żyletki, aby oddzielić urządzenia.
  7. Przebić otwory wlotowe i wylotowe za pomocą 1 mm dziurkacza skórnego i oczyścić je dH2O, etanolem i ponownie dH2O. Wysuszyć urządzenie w strumieniu powietrza (patrz Rysunek 2A).
  8. Wyczyść obie strony urządzenia PDMS taśmą klejącą, usuwając kurz i zanieczyszczenia.
  9. Przygotuj szkiełka podstawowe, aby ukończyć urządzenie mikroprzepływowe zgodnie z opisem17. Wywierć otwory wlotowe w górnym suwaku za pomocą wiertła diamentowego i spraw, aby dolna prowadnica była hydrofobowa poprzez wystawienie na działanie oparów TFOCS lub poprzez zastosowanie wodoodpornej powłoki szklanej (Rysunek 2B).
  10. Zamontuj kanapkę szklanego urządzenia PDMS w zacisk (Rysunek 2C).

3. Przygotowanie zwierząt

  1. Uzyskanie lub stworzenie zwierząt z genetycznie kodowanymi wskaźnikami wapnia wyrażonymi w interesujących neuronach.
    UWAGA: Na przykład linia NZ1091 (kyIs587 [gpa-6p::GCaMP2.2b; unc-122p::d sRed]; kyIs5662 [odr-7p::Chrimson:SL2:mCherry; elt-2p::mWiśnia]) wyraża GCaMP i wrażliwy na światło czerwone kanał kationowy Chrimson w parze neuronów czuciowych AWA6. Oba transgeny są zintegrowane z genomem w celu zapewnienia stabilnej ekspresji u każdego zwierzęcia.
  2. Na jeden dzień przed eksperymentem umieścić co najmniej 20 larw L4 w stadium C. elegans na eksperyment na płytce agarowej z pożywką do wzrostu nicieni (NGM) obsianej trawnikiem OP50 E. coli. Przy utrzymaniu temperatury 20 °C spowoduje to synchronizację zwierząt typu dzikiego w stadium młodego dorosłego osobnika następnego dnia.
    UWAGA: W przypadku transgenów matrycowych, wybierz zwierzęta za pomocą stereoskopu fluorescencyjnego, aby zapewnić ekspresję transgenu u wybranych zwierząt.

4. Przygotowanie roztworu

  1. Przygotować 1x bufor podstawowy S (100 mM NaCl i 0,05 M KPO4, pH 6,0) z 10x roztworu podstawowego.
  2. Przygotować 1 mM bufor tetramizolowy, rozcieńczając 1 M bulion w 1x S Basal. Użyj tego bufora paralitycznego, aby przygotować wszystkie bodźce. W eksperymencie zwykle zużywa się około 150 ml.
  3. Dodaj 0,1-1 μg/ml fluoresceiny do "kontrolnych" zbiorników buforowych, aby zobrazować przepływ.
  4. Tworzyć roztwory stymulacyjne przez seryjne rozcieńczanie do pożądanego stężenia końcowego. Na przykład utwórz rozcieńczenie atraktantu diacetylowego 10-7, tworząc najpierw zapas 10-3.
    UWAGA: Niewielka ilość fluoresceiny (0,1–1 μg/ml) może zostać dodana do bodźca lub roztworu buforowego w celu sprawdzenia czasu bodźca, ale stężenie powinno być minimalne, aby uniknąć artefaktów we fluorescencji neuronalnej.

5. Przygotowanie urządzenia mikroprzepływowego

UWAGA: Zobacz Reilly et al.9 dla protokołu wideo pokazującego generowanie zbiornika, konfigurację urządzenia i ładowanie zwierząt. Zobacz także Lagoy et al.17, aby uzyskać pisemny protokół zawierający wiele pomocnych wskazówek.

  1. Przygotuj trzy lub więcej zbiorników na płyny. Dla każdego z nich należy podłączyć zbiornik strzykawki o pojemności 30 ml lub 60 ml, strzykawkę zalewową o pojemności 3 ml i końcówkę igły do trójdrogowego zaworu Luer (Rysunek 2D). Podłącz igłę do rurki z mikrootworem wyposażonej na końcu w metalową rurkę. Oznacz zbiorniki, zamontuj je na stojaku przymocowanym do stojaka pierścieniowego i napełnij je odpowiednim buforem lub płynami stymulacyjnymi (Rysunek 2E).
  2. Zmontowane urządzenie mikroprzepływowe odgazowywać w eksykatorze próżniowym przez ~1 h.
  3. Napełnij i usuń pęcherzyki powietrza z rurki zbiornika za pomocą strzykawki zalewowej. Napełnij rurkę odpływową buforem.
  4. Wyjmij urządzenie mikroprzepływowe z próżni i szybko włóż rurkę wylotową i wstrzyknij płyn przez urządzenie, aż z jednego wlotu wypłynie kropla.
  5. Na tym wlocie użyj połączenia "kropla-kropla" 17, aby włożyć odpowiednią rurkę doprowadzającą płyn (Rysunek 2F). Upewnij się, że krople cieczy są obecne zarówno na rurce dolotowej, jak i na otworze portu urządzenia, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków.
  6. Wlej więcej płynu z wylotu, podłącz następną rurkę wlotową i powtarzaj, aż wszystkie wloty zostaną wypełnione. Włóż solidny kołek blokujący do wszystkich nieużywanych wlotów i portu ładowania ślimaka.
  7. Zainicjuj przepływ, otwierając wlotowe i wylotowe zawory Luer. Sprawdź urządzenie pod kątem wycieków na wlotach i szklanej podstawie. Sprawdź, czy w urządzeniu nie ma pęcherzyków powietrza w kanałach przepływowych lub wlotach za pomocą oprogramowania do przechwytywania obrazu mikroskopu w trybie na żywo.
    UWAGA: Jeśli obecne są pęcherzyki, poczekaj, aż wchłoną się w materiał PDMS.

6. Ładowanie zwierząt

UWAGA: Zobacz Lagoy et al.17.

  1. Przenieś młode dorosłe zwierzęta na nieobsianą płytkę agarową NGM za pomocą "kilofa" z drucianą końcówką.
  2. Zalej płytkę około 5 ml buforu 1x S Basal, tak aby zwierzęta pływały.
  3. Wciągnij robaki do strzykawki ładującej (strzykawka 1 ml lub 3 ml z dołączoną rurką, która została wstępnie napełniona 1x S Basal).
    1. Za pomocą stereoskopu przesuń jedną ręką końcówkę rurki pod powierzchnię cieczy do każdego pożądanego zwierzęcia i wciągnij ją do rurki za pomocą strzykawki trzymanej w drugiej ręce.
    2. Wciągnąć robaki tylko do rurki, a nie do strzykawki.
      UWAGA: Rurka zwykle mieści tylko około 100 μl. Zwierzęta mogą zostać wydalone w lokalne miejsce, a następnie ponownie wciągnięte do rurki o małej objętości.
  4. Zamknij przewód wylotowy, wyjmij kołek ładujący ślimakowy i podłącz strzykawkę ładującą ślimakową do urządzenia za pomocą połączenia drop-to-drop.
  5. Delikatnie wprowadzić zwierzęta na arenę, ustalić przepływ buforowy i odczekać do 1 godziny na unieruchomienie za pomocą tetramizolu.
    UWAGA: W okresie unieruchomienia upewnij się, że na arenę dostaje się tylko płyn buforowy. Zbiorniki bodźca i kontroli można w tym okresie wyłączyć, ale należy je otworzyć i sprawdzić prawidłowy przepływ przed uruchomieniem prób stymulacji.

7. Automatyczna stymulacja i rejestracja neuronów

  1. Utwórz plik tekstowy definicji bodźca o nazwie "User Defined Acquisition Settings.txt" za pomocą edytora tekstu (np. Notatnika) zawierającego ustawienia stymulacji dla automatycznej akwizycji obrazu (zobacz przykłady w Rysunek 3). Ustawienia są podzielone na dwie sekcje:
    1. Ustawienia akwizycji mikroskopu: Zdefiniuj typ eksperymentu (pojedynczy bodziec lub wiele wzorców), czas ekspozycji i wzbudzenia, czas trwania próby i interwały oraz zapisz katalog.
    2. Ustawienia stymulacji: Zdefiniuj parametry kontroli bodźca. "Polecenie stymulacji" określa działania zachodzące w określonych klatkach wideo za pomocą składni , gdzie kody literowe to A = zawór1, B = zawór2, C = zawór3, L = światło LED; Dodatkowo wielkie litery = włączone, a małe = wyłączone. Natężenie diody LED ustawia się za pomocą kodu literowego "i" i wartości od 0 (wyłącz) do 255 (maksymalna jasność).
      UWAGA: Wartość natężenia diody LED od 0 do 255 ustawia wyjściowe napięcie analogowe od 0 V do 5 V. Zastosowany tutaj regulator prądu ma liniowe skalowanie natężenia, a inne powinny być skalibrowane miernikiem mocy światła.
      1. W przypadku eksperymentu z pojedynczym bodźcem z tylko jednym powtarzającym się poleceniem stymulacji użyj formatu w Rysunek 3A.
      2. W przypadku eksperymentu z wieloma wzorcami z wieloma poleceniami stymulacji użyj formatu w Rysunek 3B. Dołącz "Sekwencję wzorca" cyfr, która reprezentuje kolejność wzorców bodźców. Dla każdego wzorca wprowadź polecenie stymulacji w osobnym wierszu.
        UWAGA: Sekwencja pseudolosowa lub sekwencja m może być przydatna do badania zależności od historii bodźców.
  2. Uruchom oprogramowanie sterujące mikroskopem. Sprawdź, czy wszystkie wloty płynów są otwarte, przepływ jest zgodny z oczekiwaniami w arenie (patrz Rysunek 2H), a neurony będące przedmiotem zainteresowania są w centrum uwagi.
  3. Zamknij okno na żywo i uruchom skrypt "MultiPattern_RunScript.bsh" w oprogramowaniu.
    UWAGA: Przydatne jest przeprowadzenie eksperymentu testowego bez zwierząt, aby sprawdzić prawidłowy przepływ i stymulację. Zastąpienie innego stężenia fluoresceiny dla każdego płynu bodźcowego może pomóc w wizualizacji i udokumentowaniu nowych wzorców bodźców.
  4. Po eksperymentach zdemontuj urządzenie mikroprzepływowe i spłucz wszystkie powierzchnie, rurki i zbiorniki wodą.
    UWAGA: Wszystkie elementy mogą być ponownie użyte dziesiątki razy, jeśli są utrzymywane w czystości. Upewnij się, że zbiorniki, rurki i urządzenia mikroprzepływowe są mokre lub całkowicie wysuszone w strumieniu powietrza, aby uniknąć krystalizacji soli, która może się zatkać i jest trudna do usunięcia. Urządzenia mogą być przechowywane w etanolu w celu sterylizacji, ale powinny być całkowicie wysuszone przed ponownym użyciem (>1 h w temperaturze 65 °C)17.

8. Analiza danych za pomocą NeuroTracker

UWAGA: NeuroTracker4,18,19 to wtyczka oprogramowania ImageJ/FIJI20 do śledzenia intensywności fluorescencji wielu neuronów i zwierząt, nawet gdy poruszają się podczas prób. Ta wtyczka zapisuje dane jako pliki tekstowe z pozycją każdego neuronu i intensywnością fluorescencji skorygowaną o tło (F). Dane dotyczące fluorescencji są znormalizowane do fluorescencji wyjściowej (F0), na przykład średniej z kilku sekund przed stymulacją, jako ΔF/F0 = (F -F0)/F0, które można uśrednić dla wszystkich populacji.

  1. Zainstaluj skrypty NeuroTracker zgodnie z instrukcją (github.com/albrechtLab/Neurotracker).
  2. Uruchom NeuroTracker, klikając Wtyczki | Śledzenie | NeuroTracker.
  3. Wybierz folder zawierający plik . TIF pliki wideo do śledzenia i wybierz żądane ustawienia.
    UWAGA: Jeśli śledzony ma być tylko podzbiór plików wideo, wybierz zakres liczbowy plików do analizy po wyświetleniu monitu. Domyślne ustawienia śledzenia są odpowiednie dla zwierząt nieruchomych w rozdzielczości 250 pikseli/mm. Dostosuj parametry proporcjonalnie do innych rozdzielczości. Więcej informacji na temat ustawień można znaleźć w Podręczniku użytkownika19.
  4. Ustaw próg intensywności tak, aby neurony były widoczne do selekcji (Rysunek 4).
  5. Otwórz okna Jasność/Kontrast (B/C) i Próg za pomocą aplikacji Obraz | Dostosuj menu.
  6. W oknie B/C dostosuj suwaki Minimum i Maksimum, aż neurony będą wyraźnie rozróżnialne (Rysunek 4A).
  7. W oknie Próg zaznacz opcję Ciemne tło i Nie resetuj zakresu.
  8. Przesuń suwak ramki, aby obserwować zmiany ruchu i intensywności neuronów, zwracając uwagę na zwierzęta, które mają zostać wykluczone ze śledzenia, na przykład z powodu nakładania się na siebie z innymi zwierzętami.
  9. Zidentyfikuj neurony do śledzenia.
  10. Dla każdego zwierzęcia dostosuj poziom progu tak, aby czerwony obszar progowy nad neuronem był widoczny w każdej klatce przed, w trakcie i po stymulacji.
  11. Kliknij neuron, aby zapisać jego położenie i poziom progowy.
  12. Powtórz regulację i selekcję progu dla każdego zwierzęcia i neuronu do śledzenia. Zobacz Rysunek 4C, aby zobaczyć dobry przykład poziomu progowego i Rysunek 4D,E dla przykładów powyżej i poniżej progu. Wcześniej wybrane neurony są oznaczone małym polem.
  13. Gdy wszystkie neurony zostaną wybrane, naciśnij spację, aby rozpocząć śledzenie.
    UWAGA: Aby uzyskać dodatkowe przykłady NeuroTracker, zobacz poprzednie referencje4,19.
  14. Monitoruj proces śledzenia każdego zwierzęcia i wprowadzaj wszelkie niezbędne poprawki.
  15. Jeśli NeuroTracker zatrzyma się, oznacza to, że utracił neuron. Kliknij ponownie neuron, dostosowując poziom progu w razie potrzeby.
  16. Jeśli pole integracji przeskoczy do innego pobliskiego zwierzęcia lub struktury nieneuronalnej, naciśnij spację, aby się zatrzymać, przesuń suwak z powrotem do pierwszej błędnej klatki i ponownie kliknij właściwą lokalizację neuronu.

9. Eksploracja i wizualizacja danych

UWAGA: Skrypt analizy MATLAB jest używany do przetwarzania i wizualizacji danych oraz do generowania podsumowań PDF dla każdej analizy.

  1. Uruchom plik "NeuroTrackerSummary_pdf.m" w MATLAB i wybierz folder zawierający pliki tekstowe danych NeuroTracker.
  2. Poczekaj na utworzenie pliku PDF z podsumowaniem, który pozwoli na weryfikację procesu śledzenia (Rysunek 5). Zwierzęta są identyfikowane za pomocą liczby (Rysunek 5A), a reakcje neuronalne każdego zwierzęcia i próby mogą być przeglądane w celu oceny zmienności populacji (Rysunek 5B).
  3. Użyj funkcji "databrowse.m", aby eksplorować dane neuronowe, na przykład grupując według numeru badania (Rysunek 5C), według liczby zwierząt (Rysunek 5D), według wzorca stymulacji lub według innej kategorii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy kilka przykładów wzorców bodźców, które oceniają różne zjawiska neuronalne, w tym czasowe hamowanie, adaptację i odhamowanie. Hamowanie czasowe to chwilowe stłumienie reakcji neuronalnej na drugą prezentację bodźca, które następuje wkrótce po początkowej prezentacji14. Aby przetestować to zjawisko, w eksperymencie z parami impulsów przedstawiono osiem wzorów składających się z dwóch impulsów zapachowych 1 s oddzielonych interwałem od 0 s do 20 s (R...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym protokole opisujemy system mikroskopii o otwartym dostępie do oceny zjawisk aktywności neuronalnej przy użyciu czasowo precyzyjnego dostarczania różnych wzorców bodźców. Platforma mikroprzepływowa dostarcza powtarzalnych bodźców, jednocześnie utrzymując dziesiątki zwierząt w polu widzenia mikroskopu. Niewiele komercyjnych pakietów oprogramowania do mikroskopii pozwala na łatwe programowanie różnych wzorców czasowych bodźców, a te, które to robią, często wymagają ręcznego wprowadzania każdego wzorca lub zastr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Foxowi Avery'emu za przetestowanie tych protokołów i przejrzenie manuskryptu oraz Ericowi Hallowi za pomoc w programowaniu. Metody przedstawione w niniejszym dokumencie zostały częściowo sfinansowane przez National Science Foundation 1724026 (D.R.A.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szczepy bakteryjne
E.  coli (OP50)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)Cat# OP50
Modele eksperymentalne: Organizmy/szczepy
C.  elegans szczepy eksprymujące GCaMP (i opcjonalnie Chrimson) w pożądanych neuronachCaenorhabditis Genetics Center (CGC) lub korespondencyjnych autorów opublikowanej pracyNZ1091, na przykład
Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies
2,3-ButanedioneSigma-AldrichCat# B85307diacetyl, przykład chemiczny bodziec
Chlorek wapnia, CaCl2Sigma-AldrichCat# C3881
Fluoresceina, Sól sodowaSigma-AldrichCat# F6377
Szklany środek hydrofobowyRain-XCat #800002250szklana powłoka hydrofobowa (jednorazowa)
Chlorek magnezu, MgCl2Sigma-AldrichCat# M2393
Pożywka do wzrostu nicieni (NGM) agarGeneseeCat #: 20-273NGM
Szalki Petriego (60  mm)TritechCat #T3305
Poli(dimetylosiloksan) (PDMS): Sylgard 184Dow ChemicalCat# 1673921
Fosforan potasu jednozasadowySigma-AldrichCat# P5655
Fosforan potasu dwuzasadowySigma-AldrichCat# P8281
Chlorek sodu, NaClSigma-AldrichCat# S7653
(tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo)trichlorosilan (TFOCS)GelestCAS# 78560-45-9szklana hydrofobowa obróbka hydrofobowa (trwała)
Oprogramowanie i algorytmy
Arduino IDEArduinohttps://www.arduino.cc/en/software
ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
Micro-managerOprogramowanie sterujące mikroskopem Mikromenedżerhttps://micro-manager.org/
Oprogramowanie do analizyAlbrecht Labhttps://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl
NeurotrackerAlbrecht Labhttps://github.com/albrechtLab/Neurotracker
Automated Microscope and Stimulation System
Axio Observer.A1 mikroskop odwrócony ustawiony do epifluorescencji (kostki filtra GFP, 5&krotne; obiektywne lub podobne)ZeissCat #491237-0012-000
Oświetlacz LED Excelitas X-cite XYLIS ExcelitasCat #XYLIS
Orca Flash 4.0 Cyfrowa kamera sCMOSHamamatsuCat #C11440-22CU
Arduino nanoArduinoCat #A000005
3-drogowy miniaturowy zawór odcinający Diapragm (LQX12)ParkerCat #LQX12-3W24FF48-000Zawór 1: Steruj
2-drogowym normalnie zamkniętym (NC) zaworem zaciskowymBio-Chem Valve IncCat #075P2-S432Zawór 2: Odpływowy
3-drogowy zawór zaciskowyNResearchCat #161P091 Zawór 3: bodziec wybór
Dioda LED i kontroler stymulacji optogenetycznej (615 nm)MightexCat #PLS-0625-030-S i #SLA-1200-2
ValveLink 8.2 cyfrowy/ręczny sterownik zaworuAutoMate ScientificCat #01-18
Przewody i złączaróżneZobacz rys. 2 protokołu Cell STARS (Lawler, 2021)
Przygotowanie urządzenia mikroprzepływowego
Frez rotacyjny Dremel o zmiennej prędkości 4000 DremelCat #F0134000ABUstaw prędkość na 5 tys. obr./min do cięcia szkła
Wiertarka rotacyjna Dremel Stacja roboczaDremelCat #220-01
Wiertło diamentoweDremelCat #7134
Szkiełko szklane, 1  mm grubościVWRCat #75799-268
Szklany rysik (rysik diamentowy)Ted PellaCat #54468
Luer 3-drożny kranCole-ParmerCat #EW-30600-07
Luer 23 G igłaVWRCat #89134-100
Urządzenie mikroprzepływoweOdpowiadanie autorowi lub producentowi na podstawie plików CAD powiązanych z tym artykułemNie dotyczy
Zacisk urządzenia mikroprzepływowegoWarner Instruments (lub warsztat mechaniczny)P-2
Rurka mikroprzepływowa, 0,02″ IDCole-ParmerCat #EW-06419-01
Tuba 19 g, 0,5′Nowa Anglia Mała rurkaKot #NE-1027-12
danych

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).
  2. Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1, 025008(2014).
  3. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  4. Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 4266-4273 (2013).
  5. Larsch, J., et al. A circuit for gradient climbing in C. elegans chemotaxis. Cell Reports. 12 (11), 1748-1760 (2015).
  6. Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Automated fluid delivery from multiwell plates to microfluidic devices for high-throughput experiments and microscopy. Scientific Reports. 8, 6217(2018).
  7. Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
  8. Lawler, D. E., et al. Sleep analysis in adult C. elegans reveals state-dependent alteration of neural and behavioral responses. The Journal of Neuroscience. 41 (9), 1892-1907 (2021).
  9. Reilly, D. K., Lawler, D. E., Albrecht, D. R., Srinivasan, J. Using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male C. elegans head neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), e56026(2017).
  10. Han, X., et al. A polymer index-matched to water enables diverse applications in fluorescence microscopy. Lab on a Chip. 21 (8), 1549-1562 (2021).
  11. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
  12. Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nature Methods. 8 (7), 599-605 (2011).
  13. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  14. Cohen, R. A. Temporal Inhibition. Encyclopedia of Clinical Neuropsychology. Kreutzer, J. S., DeLuca, J., Caplan, B. , Springer. New York, NY. 2480-2481 (2011).
  15. Lawler, D. E., Albrecht, D. R. Monitoring neural activity during sleep/wake events in adult C. elegans by automated sleep detection and stimulation. STAR Protocols. 3 (3), 101532(2022).
  16. Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), 10(2014).
  17. Lagoy, R. C., Larsen, E., Lawler, D., White, H., Albrecht, D. R. Microfluidic devices for behavioral analysis, microscopy, and neuronal imaging in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 2468, 293-318 (2022).
  18. NeuroTracker. GitHub. , Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022).
  19. NeuroTracker User Guide. GitHub. , Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Galotto, G. Chitin triggers calcium-mediated immune response in the plant model Physcomitrella patens. Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (7), 911-920 (2020).
  22. Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), 166074(2019).
  23. Ventimiglia, D., Bargmann, C. I. Diverse modes of synaptic signaling, regulation, and plasticity distinguish two classes of C. elegans glutamatergic neurons. eLife. 6, 31234(2017).
  24. Boulin, T. Reporter gene fusions. WormBook. , (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zautomatyzowany zapis aktywno ci neuronalnejurz dzenia mikroprzep ywowemikroskopia szerokopolowaCaenorhabditis elegansobrazowanie wapniazmienno populacji neuronalnejgenetycznie kodowane wska nikianaliza NeuroTrackerprogramowanie wzorc w bod c w

Powiązane artykuły