Artykuł metodologiczny

Mysi model przewlekłego zwłóknienia wątroby do badania atrezji dróg żółciowych

5.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65044

⸱

3 lutego 2023

 ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, South China University of Technology, 2Provincial Key Laboratory of Research in Structure Birth Defect Disease and Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Women and Children’s Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Stworzyliśmy mysi model przewlekłego zwłóknienia wątroby, który dostarcza odpowiedniego modelu zwierzęcego do mechanistycznego badania atrezji dróg żółciowych (BA) wywołanego przez wirusa i platformy dla przyszłych terapii BA.

Streszczenie

Atrezja dróg żółciowych (BA) jest śmiertelną chorobą polegającą na żółtaczce obturacyjnej i jest najczęstszym wskazaniem do przeszczepu wątroby u dzieci. Ze względu na złożoną etiologię i nieznaną patogenezę nadal nie ma skutecznych metod leczenia farmakologicznego. Obecnie klasyczny mysi model BA indukowany przez rotawirusa rezusa (RRV) jest najczęściej stosowanym modelem do badania patogenezy BA. Model ten charakteryzuje się opóźnieniem wzrostu, żółtaczką skóry i błony śluzowej, gliniastymi stolcami i ciemnożółtym moczem. Histopatologia wykazuje ciężkie zapalenie wątroby i niedrożność wewnątrzwątrobowych i zewnątrzwątrobowych dróg żółciowych, które są podobne do objawów BA u człowieka. Jednak wątroby myszy w końcowym stadium rozwoju w tym modelu nie mają zwłóknienia i nie mogą w pełni symulować charakterystyki zwłóknienia wątroby w klinicznym BA. W prezentowanym badaniu opracowano nowy mysi model BA przewlekłego zwłóknienia wątroby poprzez czterokrotne wstrzyknięcie 5-10 μg przeciwciała anty-Ly6G, z przerwami 2 dni po każdym wstrzyknięciu. Wyniki pokazały, że niektóre myszy z powodzeniem wytworzyły przewlekłe BA z typowym zwłóknieniem po upływie czasu, co oznacza, że myszy te stanowią odpowiedni model zwierzęcy do indukowanego wirusem mechanistycznego badania zwłóknienia wątroby BA i platformę do opracowania przyszłych metod leczenia BA.

Wprowadzenie

Atrezja dróg żółciowych (BA) jest poważną chorobą wątroby i dróg żółciowych, która często występuje u niemowląt i małych dzieci; w szczególności objawia się jako zacierająca się cholangiopatia z żółtaczką noworodków i bladymi stolcami1. Jego kliniczne cechy to zapalne uszkodzenie wewnątrzwątrobowych i zewnątrzwątrobowych dróg żółciowych oraz postępujące zwłóknienie, które ostatecznie przekształca się w niewydolność wątroby2. Według statystyk częstość występowania BA w krajach azjatyckich jest wyższa niż w krajach europejskich i amerykańskich, a częstość występowania BA w krajach azjatyckich wynosi 1/8 000. Etiologia BA obejmuje infekcję wirusową, nieprawidłowy rozwój dróg żółciowych, zaburzenia immunologiczne i różnice genetyczne3. Operacja Kasai jest najczęściej stosowaną metodą poprawy cholestazy u dzieci z BA, ale ostatecznie nie może zapobiec postępowi zwłóknienia4. Obecne leczenie BA opiera się głównie na przeszczepie wątroby, który jest ograniczony przez brak źródeł wątroby. Dogłębne badanie patogenezy BA jest najbardziej bezpośrednim sposobem rozwiązania problemów związanych z tą chorobą. Jednak badania nad patogenezą BA opierają się głównie na modelach zwierzęcych BA, a wybór odpowiedniego modelu zwierzęcego jest kluczowy.

Większość badań histopatologicznych BA wykazała, że przerost dróg żółciowych (BDP), zakrzepica żółci i zwłóknienie żyły wrotnej są najważniejszymi cechami patologicznymi BA, a inne patologiczne cechy różnego stopnia występują jednocześnie, takie jak naciekanie komórek zapalnych wrotnych i obrzęk hepatocytów5,6. Obecnie istnieje wiele modeli mysich, które naśladują BA, takich jak przewlekły model myszy karmiony 3,5-die-toksykarbonylo-1,4-dihydrokolidyną (DDC) z segmentalną niedrożnością dróg żółciowych i zapaleniem okołojęzykowym obejmującym pozawątrobowe drogi żółciowe7 oraz mysi model zwłóknienia wątroby z dootrzewnowym wstrzyknięciem czterochlorku węgla8. Model podwiązania dróg żółciowych (BDL) charakteryzuje się żółtaczką i szybkim zwłóknieniem żyły wrotnej9. Model myszy karmiony alfa-naftylizotiocyjanianem (ANIT) charakteryzuje się zapaleniem dróg żółciowych ograniczonym do wewnątrzwątrobowego przewodu żółciowego i uszkodzeniem hepatocytów10. Model mysi z przedłużoną żółtaczką jest indukowany przez szczepienie opóźnionym wirusem rotawirusa rezusów (RRV)11. Chociaż istnieje wiele modeli zwierzęcych, zwłaszcza modeli myszy, każdy model ma swoje własne ograniczenia. Mogą symulować tylko część cech chorobowych BA, takich jak ostre zapalenie lub zwłóknienie wątroby w procesie atrezji dróg żółciowych, i nie ma modelu, który byłby wysoce zgodny z procesem chorobowym i patologicznymi cechami BA.

Klasyczny model myszy BA jest indukowany przez RRV, a ten model jest najbardziej podobny do modelu BA u ludzi. Jednakże, podczas gdy myszy z modelem BA indukowanym RRV wykazują podobne objawy kliniczne i cechy patologiczne do niektórych z pozawątrobowego atrezji dróg żółciowych, model ten nie ma zwłóknienia wątroby, co znacznie ogranicza dogłębne badanie mechanizmów BA i rozwój nowych metod leczenia12. W związku z tym w ramach tego badania opracowano nowy mysi model BA przewlekłego zwłóknienia wątroby. Przeciwciało anty-Ly6G wstrzyknięto dootrzewnowo przed inokulacją RRV w dniu urodzenia. Następnie czterokrotnie wstrzyknięto 5-10 μg przeciwciała anty-Ly6G, z zachowaniem 2-dniowych odstępów między każdym wstrzyknięciem. Objawy BA u myszy uległy poprawie, czas przeżycia został wydłużony, a myszy weszły w stadium przewlekłego zwłóknienia. Model ten nie tylko symuluje ostrą odpowiedź fazową BA, ale także naśladuje procesy zachodzące w wątrobie i postępującym zwłóknieniu. W związku z tym jest to bardziej odpowiedni model zwierzęcy do mechanistycznych badań nad BA, a także może stanowić teoretyczną podstawę do opracowania przyszłych metod leczenia BA.

Cząsteczka Gr-1 to marker powierzchni komórki pochodzenia mieloidalnego, który pierwotnie stwierdzono ekspresję w neutrofilach13. Wyczerpanie przeciwciał anty-Ly6G zmniejsza krążące neutrofile o ponad 90% i zmienia odpowiedź aktywowaną przez inne komórki odpornościowe. Funkcje populacji komórek Gr-1 + zostały opisane w różnych badaniach z użyciem specyficznych przeciwciał wymiatających, z różnymi zidentyfikowanymi efektami na cytokiny i ochronę immunologiczną za pośrednictwem 14. Badaliśmy funkcję komórek Gr-1 + w mysich modelach BA zaszczepionych RRV. Ponieważ jednak nie stwierdzono, aby cząsteczka Gr-1 ulegała ekspresji u ludzi, podobna cząsteczka, CD177, została przebadana u pacjentów z BA15. Nasze dane dowodzą znaczenia populacji komórek Gr-1+, szczególnie w przewlekłej fazie zwłóknienia choroby, i zapewniają odpowiedni model zwierzęcy do zbadania potencjalnych terapii BA.

Protokół

To badanie zostało zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Guangzhou Yongnuo Biomedical Animal Center (IACUC-AEWC-F2208020), gdzie przeprowadzono wszystkie eksperymenty na zwierzętach.

1. Ustanowienie modelu myszy z przewlekłym zwłóknieniem BA

UWAGA: Wszystkie zwierzęta były trzymane w specyficznym środowisku wolnym od patogenów (SPF) w tym samym pomieszczeniu, a eksperymenty były prowadzone w konwencjonalnym środowisku. Myszy BALB/c w 12,5 dniu ciąży (wiek: 10-12 tygodni; waga 35-40 g) były trzymane w pomieszczeniu bez specyficznych patogenów w temperaturze 25°C w 12-godzinnym cyklu ciemności/światła i miały zapewniony swobodny dostęp do autoklawowanego pokarmu i wody. Nowonarodzone myszy, w ciągu 24 godzin po urodzeniu (średnia masa ciała: 1,5-1,6 g), zostały wybrane do mysiego modelu BA.

  1. Przygotuj RRV zgodnie z wcześniejszymi raportami16.
    UWAGA: Ze względu na słaby status przeżywalności myszy modelowych, należy je rozdzielić w wieku 21 dni, aby uniknąć ugryzienia lub nawet zabicia przez inne myszy w tej samej klatce.
  2. Podziel nowonarodzone myszy na trzy grupy: grupę kontrolną, grupę RRV i grupę RRV + anty-Ly6G. Nowonarodzonym myszom wstrzyknąć dootrzewnowo 20 μl RRV (miano: 1,5 x 106 PFU/ml) (grupa RRV) lub soli fizjologicznej (grupa kontrolna) w ciągu 24 godzin po urodzeniu. Aby zubożyć komórki Gr-1+, należy wstępnie potraktować każdą mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym 5 μg przeciwciała anty-Ly6G na 4 godziny przed wstrzyknięciem RRV.
    UWAGA: Roztwór przeciwciała anty-Ly6G jest przechowywany w temperaturze 2-8 °C i nie należy go zamrażać. Wyjmij przeciwciało przed użyciem i umieść je w temperaturze pokojowej na 30 minut, aby się rozgrzało.
  3. Wstrzyknij 10 μg przeciwciała anty-Ly6G do brzucha myszy co 3 dni do 12 dnia po wstrzyknięciu RRV (Figura 1A).
  4. Codziennie sprawdzaj i rejestruj wygląd, wagę i przeżywalność wszystkich myszy.

2. Wstrzyknięcie dootrzewnowe myszom

  1. Wyjmij nowonarodzone myszy z klatki. Za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml wstrzyknąć 20 μl roztworu RRV lub 50 μl roztworu przeciwciała anty-Ly6G. Ściśnij skórę szyi młodej myszy palcem wskazującym i kciukiem jednej ręki i delikatnie przytrzymaj tylne nogi myszy palcem serdecznym i palcem ogonowym, aby odsłonić brzuch.
  2. Podnieś igłę pod kątem do góry. Wbić igłę w środkowe udo prawej tylnej nogi myszy pod kątem 15° ze skórą. Po poruszaniu się po ścieżce podskórnej, aż igła dotrze do prawej krawędzi żebrowej myszy, skieruj igłę w dół do jamy brzusznej. Następnie wstrzyknąć płyn pod wątrobę myszy.
    UWAGA: Nowonarodzone myszy mają żołądek i śledzionę w lewym brzuchu. Jeśli igła zostanie wprowadzona po lewej stronie, łatwo jest przebić żołądek lub spowodować krwotok śledziony.
  3. Natychmiast po wstrzyknięciu należy wyciągnąć igłę i obserwować, czy w miejscu wstrzyknięcia nie ma krwawienia lub wycieku. Jeśli tak, przetrzyj go autoklawizowaną bawełną. Umieść mysz z powrotem w klatce matki.
    UWAGA: W celu zmniejszenia wpływu wycieku płynu podczas wstrzyknięcia na wyniki eksperymentu, należy upewnić się, że działanie iniekcji jest delikatne, powoli wyjmij igłę i uciskaj miejsce wstrzyknięcia bawełnianym wacikiem przez 30 sekund.

3. Pobieranie próbki tkanki

  1. W 12 dniu znieczulij myszy 4% inhalacją izofluranu i poddaj je sekcji pod mikroskopem. Włożyć strzykawkę z insuliną o pojemności 1 ml do lewej komory serca w celu pobrania krwi. Po pobraniu krwi należy poddać myszy eutanazji przez inhalację 4% izofluranu przez 10 minut. Odwirować krew o stężeniu 400 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i oddzielić surowicę do pomiarów czynności wątroby.
    UWAGA: Pobieranie krwi należy przeprowadzić, gdy myszy żyją. Jeśli myszy umrą, krew zostanie zatrzymana w naczyniach krwionośnych i nie będzie można jej zebrać.
  2. Sfotografuj ogólny wygląd wątroby i dróg żółciowych. Następnie wypreparuj wątrobę i śledzionę myszy z otaczających tkanek za pomocą nożyczek i pęsety.
    UWAGA: Wątroba i inne tkanki są pobierane i rezerwowane w temperaturze -80°C w celu ekstrakcji RNA i białek lub moczone w 10% formalinie w celu przygotowania próbek histologicznych.

4. Angiografia fluoresceinowa przewodu żółciowego pozawątrobowego

  1. Po eutanazji myszy całkowicie odsłoń wątrobę, woreczek żółciowy i pozawątrobowe drogi żółciowe nożyczkami i wacikami.
  2. Obserwuj pod mikroskopem postawy, wstrzyknij 5-10 μl barwnika fluorescencyjnego rodaminy 123 (20 mg/ml) do pęcherzyka żółciowego za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml i zrób zdjęcia. Ten proces jest taki sam, jak ten zgłoszony w before16.
    UWAGA: Różne myszy z tej samej grupy są używane do pobierania próbek tkanek i angiografii fluorescencyjnej.

5. Barwienie H&E

  1. Zanurz świeżą tkankę wątroby myszy w 10% formalinie na 24 godziny.
  2. Po zatopieniu tkanki w parafinie za pomocą mikrotomu parafinowego pokrój blok parafiny na odcinki o grubości 4 μm i umieść dwa kolejne odcinki na tym samym szkiełku. Doświadczony personel jest zobowiązany do standaryzacji operacji, aby uniknąć skaleczeń palców17.
  3. Plastry ułożyć w kratce do krojenia, odparafisować w ksylenie, uwodnić kolejno w absolutnym etanolu, 95% etanolu, 80% etanolu, 70% etanolu i wodzie destylowanej i moczyć w każdym przez 5 minut.
  4. Skrawki barwić roztworem hematoksyliny przez 5 minut i moczyć je w 1% kwasie solnym i 75% alkoholu przez 5 s. Skrawki spłukać czystą wodą i zabarwić roztworem eozyny przez 1 minutę.

6. Barwienie immunohistochemiczne CK19 i F4/80

  1. Pierwsze trzy kroki są takie same, jak etapy osadzania, cięcia i odparafinowania tkanek w sekcji barwienia H&E.
  2. Wykonać naprawę antygenu za pomocą buforu Tris-EDTA (10 mmol/L zasady Tris, 1 mmol/L roztwór EDTA, pH 9,0), podgrzać sekcje w kuchence mikrofalowej w temperaturze 95°C przez 10 min, a następnie wyjąć i schłodzić w naturalny sposób do temperatury pokojowej.
  3. Umieść skrawki tkanki w 3% roztworze nadtlenku wodoru na 10 minut, aby usunąć endogenną peroksydazę.
  4. Potraktuj plastry 5% kozią surowicą, aby zablokować niespecyficzne wiązanie.
  5. Dodać pierwszorzędowe szczurze przeciwciało monoklonalne anty-mysie cytokeratyna 19 lub szczurze przeciwciało monoklonalne F4/80 przeciwko myszom i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  6. Inkubować skrawki z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Użyj 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) jako środka chromogennego do obserwacji reakcji chromogennej pod mikroskopem.
  8. Obserwuj plastry pod mikroskopem 40x, aby uzyskać zdjęcia i analizuj je w razie potrzeby.

7. Czerwone zabarwienie Syriusza

  1. Wykonaj pierwsze trzy etapy osadzania, cięcia i odparafinowania tkanek zgodnie z opisem w sekcji Barwienie H&E.
  2. Po barwieniu skrawków tkanek hematoksyliną, przykryj każdą tkankę 50 μl roztworu barwnika Sirius Red w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  3. Suszyć szkiełka w sposób naturalny w temperaturze pokojowej przez 4 godziny, dodać kroplę neutralnej gumy do każdego szkiełka i użyć szkiełka nakrywkowego, aby powoli przykryć chusteczkę, aby uniknąć pęcherzyków. Pozostaw szkiełka w temperaturze pokojowej na 24 godziny, aby zestalić neutralną gumę.
  4. Użyj mikroskopii światła spolaryzowanego z kontrastem, aby obserwować szczegóły osadzania się kolagenu; wybierz wyraźne i odpowiednie pole view, a następnie dostosuj jasność i balans bieli pola widzenia mikroskopu. Uzyskuj obrazy i analizuj je w razie potrzeby pod 40-krotnym mikroskopem.

Wyniki

Myszy otrzymały dootrzewnowe wstrzyknięcie 5 µg przeciwciała anty-Ly6G w ciągu 24 h od narodzin, a następnie, 4 h później, otrzymały dootrzewnowy wstrzyk 20 µL RRV. Następnie co 3 dni, aż do 12. dnia, wstrzykiwano 10 µg przeciwciała anty-Ly6G (Rycyna 1A). Mediana czasu przeżycia w grupie RRV wyniosła 13 dni. Przeciwnie, u większości myszy leczonych przeciwciałem rozwinęła się łagodna żółtaczka i nie zaobserwowano utraty masy ciała (Rycyna 1C). Około 20%-30% myszy zapadło na zespół BA z długotrwałą żółtaczką i niską masą ciała, lecz przeżyło ponad 42 dni. Po leczeniu przeciwciałem anty-Ly6G liczba komórek Gr-1+ spadła15, a myszy weszły w stadium przewlekłego włóknienia, określane jako przewlekłe BA. Próbki pobrano w 12. i 42. dniu, a skrawki tkanek barwione Sirius Red wykazały stopniowy wzrost włóknienia wątroby. Myszy z przewlekłym BA, które przeżyły 42 dni, wykorzystano do szczegółowych analiz. Oprócz niewielkich rozmiarów, na uszach, łapach i skórze ogona widoczna była wyraźna żółtaczka (niebieskie strzałki na Rycynie 1E). W 6. dniu po wstrzyknięciu RRV kolor kału myszy stał się jaśniejszy, a kolor moczu ciemniejszy; różnica ta stała się istotna w porównaniu z grupą kontrolną w 12. dniu, kiedy u myszy z grupy RRV zaobserwowano biały kał i ciemnożółty mocz. W 42. dniu mocz i kał myszy z przewlekłym BA również wykazywały wyraźne cechy żółtaczki (Rycyna 1D,E). Wątroby myszy z BA usunięto i porównano z wątrobami grupy kontrolnej. Wątroby były mniejsze (Rycyna 2B), gołym okiem widoczne były zmiany martwicze (Rycyna 2A, czarny trójkąt), a pozawątrobowo zaobserwowano również odcinek atrezji dróg żółciowych (Rycyna 2A, białe gwiazdki).

Analiza przekrojów tkanki wątroby wykazała, że terapia przeciwciałami anty-Ly6G w niskiej dawce zmniejszyła stan zapalny żyły wrotnej. Jednakże w 42. dniu w skrawkach tkanki wątroby nadal obserwowano akumulację komórek zapalnych (Rysunek 3A). Barwienie Sirius Red wykazało niewielki wzrost odkładania kolagenu w obszarze wrotnym w 12. dniu po wstrzyknięciu RRV. Ponadto po leczeniu przeciwciałem anty-Ly6g nie zaobserwowano istotnych zmian w ekspresji kolagenu, natomiast ekspresja kolagenu w próbkach tkanki BA w 42. dniu była znacząco zwiększona (Rysunek 3B). Podczas badania pod mikroskopem w świetle spolaryzowanym zaobserwowano, że w sąsiedniej tkance wątroby nagromadziły się włókna kolagenu. W preparatach tkanki BA w 42. dniu stwierdzono znaczne odkładanie kolagenu, głównie zielonego (Rysunek 3C), a odkładanie kolagenu uległo dalszemu zwiększeniu u myszy, które przeżyły 42 dni bez przyrostu masy ciała. Wraz z redukcją zapalenia wrotnego w 12. dniu zaobserwowano komórki przewodów żółciowych CK19+. W 42. dniu dojrzałe przewody żółciowe były jednak prawie niewykrywalne, mimo zaobserwowanego wzrostu liczby komórek przewodów żółciowych CK19+ (Rysunek 4A, czerwone strzałki wskazują komórki nabłonka przewodów żółciowych). W przypadku pozawątrobowych przewodów żółciowych u myszy z przewlekłym BA, sekcyjne badanie obszaru wrotnego u myszy wykazało, że pozawątrobowe przewody żółciowe były zablokowane i zawierały nacieki zapalne makrofagów (Rysunek 4B, czarne strzałki wskazują makrofagi).

W porównaniu z samą infekcją RRV, leczenie niską dawką przeciwciał anty-Ly6G zmniejszyło uszkodzenie wątroby pod kątem poziomu enzymów wątrobowych w 12. dniu po inokulacji RRV. Poziomy aminotransferazy alaninowej i fosfatazy alkalicznej w wątrobie były wyższe w grupie z przewlekłym BA niż w grupie kontrolnej. Najbardziej wyraźne zmiany zaobserwowano w poziomach bilirubiny, gdzie myszy RRV + anty-Ly6G wykazywały obniżone poziomy TBIL, DBIL i IBIL w ostrym BA w przeciwieństwie do grupy z samym RRV. U myszy z przewlekłym BA poziomy TBIL, DBIL i IBIL były podwyższone (Rycina 5), co wskazuje, że funkcja wątroby była znacznie upośledzona w stadium przewlekłego włóknienia BA.

Oś czasu podawania przeciwciała anty-Ly6G i RRV u myszy, wykresy przeżywalności i masy ciała, wyniki wizualne.
Rycina 1: Efekty leczenia przeciwciałem anty-Ly6G w mysim modelu atrezji dróg żółciowych z zakażeniem RRV. (A) Schematyczne przedstawienie podawania niskich dawek przeciwciał w celu wywołania ostrej i przewlekłej fazy BA u myszy, gdzie strzałki wskazują czas wstrzyknięcia przeciwciała i RRV. (B) Krzywe przeżywalności myszy w grupie kontrolnej (Cont.), grupie z wirusem rotawirusa rhesus (RRV) oraz grupie RRV + przeciwciało anty-Ly6G. (C) Krzywe masy ciała myszy w każdej grupie. (D) Reprezentatywne zdjęcia myszy oraz ich kału i moczu w każdej grupie w 12. dniu. (E) Reprezentatywne zdjęcia myszy oraz ich kału i moczu w każdej grupie w 42. dniu. Niebieskie strzałki wskazują żółte uszy i ogony. Rycina przedrukowana za zgodą Zhang i wsp.15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Porównanie stanu zapalnego wątroby u myszy; kontrola vs RRV+Anti-Ly6G; analiza wizualna i fluorescencyjna.
Rycina 2: Wpływ leczenia przeciwciałami anty-Ly6G na wątrobę w mysim modelu atrezji dróg żółciowych zakażonym RRV. (A) Porównanie anatomii wątroby i angiografii fluorescencyjnej pozawatropowych dróg żółciowych u myszy z przewlekłą atrezją dróg żółciowych (po prawej) oraz myszy prawidłowych w 42. dniu. (B) Porównanie wielkości wątroby u myszy z przewlekłą atrezją dróg żółciowych i myszy prawidłowych. Czarny trójkąt wskazuje martwicę wątroby u myszy z przewlekłą atrezją dróg żółciowych. Biała gwiazdka wskazuje pozawatropową atrezję dróg żółciowych. Rycina przedrukowana za zgodą Zhang et al.15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza tkanki wątroby z użyciem H&E, PSR, mikroskopii w świetle spolaryzowanym; progresja włóknienia w dniach 12 i 42.
Rycina 3: Przekroje tkanki wątroby myszy w grupie kontrolnej (Cont.), grupie z wirusem rotawirus rhesus (RRV) oraz grupie RRV + przeciwciało anty-Ly6G w dniu 12 i dniu 42. (A) Obrazy przekrojów tkanki wątroby barwionych hematoksyliną i eozyną (H&E). (B) Barwienie Sirius Red wykazało odkładanie kolagenu (PSR). (C) Dalsza obserwacja przekrojów przy użyciu mikroskopii w świetle spolaryzowanym (Pol. Light). Skrót: PV = żyła wrotna. Pasek skali = 50 µm. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Zhang et al.15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza histologiczna CK19 i markerów makrofagów w tkankach wątroby, obrazy mikroskopowe w 12. i 42. dniu.
Rysunek 4: Barwienie immunohistochemiczne skrawków tkanki wątroby z grupy kontrolnej prawidłowej (Cont.), grupy z rotawirusem rhesus (RRV) oraz grupy RRV + przeciwciało anty-Ly6G w 12. i 42. dniu. (A) Ekspresja markera komórek nabłonkowych przewodów żółciowych (CK19) w różnych grupach badawczych. (B) Infiltracja komórek zapalnych makrofagów wykazana w różnych grupach badawczych. Skrót: PV = żyła wrotna. Czerwona strzałka wskazuje komórki nabłonkowe przewodów żółciowych. Czarna strzałka wskazuje makrofagi. Pasek skali = 50 µm. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Zhang et al.15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wykresy markerów funkcji wątroby; ALT, AST, ALP; TBIL, DBIL, IBIL; dane porównawcze z 12 i 42 dnia.
Rycina 5: Porównanie funkcji wątroby u myszy w różnych grupach terapeutycznych. Krew myszy pobrano po zakończeniu eksperymentu i przebadano w oddziale laboratoryjnym szpitala. Każda grupa składała się z trzech do pięciu myszy. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Skróty: ALT = aminotransferaza alaninowa; AST = aminotransferaza asparaginianowa; ALP = fosfataza zasadowa; TBIL = bilirubina całkowita; DBIL = bilirubina bezpośrednia; IBIL = bilirubina pośrednia. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Zhang i wsp.15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

W naszym badaniu użyliśmy przeciwciała anty-Ly6G w celu wyeliminowania lub zmniejszenia komórek Gr-1 + w mysim modelu atrezji dróg żółciowych zakażonych RRV w celu poprawy ostrego zespołu BA, przedłużenia wskaźnika przeżycia i umożliwienia myszom BA wejścia w fazę przewlekłą. Zmniejszenie dawki przeciwciał może prowadzić do przewlekłego BA ze zwłóknieniem wątroby, co wskazuje, że liczba komórek Gr-1+ zmienia wynik BA w fazie ostrej i przewlekłej. W naszym poprzednim badaniu komórki Gr-1 + zostały zmniejszone po podaniu przeciwciała anty-Ly6G, a ogólny stan przeżycia myszy BA uległ poprawie15. Jednocześnie doniesiono, że makrofagi Gr-1 + 19, neutrofile Gr-1 + 20, komórki mieloidalne Gr-1 + 21 i granulocyty Gr-1 + mogą nasilać zwłóknienie w niektórych modelach zwierzęcych22. Jednak w tym badaniu komórki Gr-1 + u myszy zostały częściowo zubożone niskimi dawkami przeciwciała anty-Ly6G, a złogi kolagenu pozostały. W rezultacie może być potrzebne więcej czasu, aby dokładniej zająć się chorobą.

Zastosowanie przeciwciała anty-Ly6G zmniejszyło stan zapalny, częściowo zachowało drogi żółciowe i zapobiegło ostrej śmierci wywołanej BA u myszy. Jednak tylko 20% do 30% myszy weszło w przewlekłą fazę BA; może to być związane z punktem czasowym i liczbą wstrzyknięć przeciwciała anty-Ly6G. Musimy dalej badać ten kluczowy punkt, aby poprawić wskaźnik sukcesu. Ponadto uważamy, że nie tylko komórki Gr-1 + , ale także inne komórki odpornościowe mogą odgrywać ważną rolę, takie jak komórki NK, limfocyty T, limfocyty B i makrofagi.

Jeśli chodzi o protokół, należy zwrócić uwagę na kilka szczegółów. (i) W celu uniknięcia wycieku wstrzykiwanych leków używamy strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml z igłą o średnicy 0,33 mm, ponieważ średnica igły jest mała, a otwór igły w strzykawce jest mały, co sprzyja zmniejszeniu możliwości wycieku leku. (ii) Przed wstrzyknięciem należy unieruchomić mysz, aby zapobiec jej ruchomości, uniknąć wycieku leku, a tym samym dodatkowo zapewnić efekt eksperymentalny. (iii) Podczas wstrzykiwania leku wstrzyknęliśmy lek w powierzchnię lub dolny margines wątroby myszy tak daleko, jak to możliwe, tak aby lek dostał się do jamy brzusznej i w pełni zetknął się z wątrobą, aby zadziałał. (iv) Wstrzyknięcie jest zwykle wykonywane z prawego górnego odcinka uda myszy, ponieważ żołądek i śledziona nowonarodzonej myszy znajdują się w lewym brzuchu, a żołądek jest pełen mleka. Jeśli igła zostanie wprowadzona z lewej strony, może łatwo przebić żołądek, powodując napływ mleka do jamy brzusznej, lub przebić śledzionę, powodując krwawienie.

CD177 jest homologiem Ly6G, a ekspresja CD177 u pacjentów z BA została zbadana. CD177 może być stosowany jako marker do wczesnej diagnostyki BA u dzieci, co wskazuje, że komórki CD177+ odgrywają znaczącą rolę w przebiegu BA23. Analizując dane sekwencjonowania RNA, nasz zespół odkrył, że komórki CD177 były dominującą populacją komórek Gr-1 + ; tymczasem myszy Cd177−/− BALB/c zaszczepione RRV wykazały opóźniony początek BA oraz zmniejszoną zachorowalność i śmiertelność18. Tak więc nasz mysi model przewlekłego BA ma oczywiste zalety w badaniu patogenezy i progresji choroby BA; zapewnia również odpowiedni model zwierzęcy do badania potencjalnych metod leczenia BA.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (81974056) dla R.Z. oraz z National Nature Youth Foundation of China (82101808) oraz Science and Technology Planning Project of Guangzhou (nr 202102020196) dla Z.L.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mysz Balb/cGuangdong Skarjingda Biotechnology Co., LTD20221000112
szczur anty-mysz Ly6GBio X Cellklon 1A8Zachodni Liban, NH
szczur anty-mysia cytokeratyna 19Badania rozwojowe Hybridoma Bankklon TROMA IIIIowa City, IA
szczur anty-mysz F4/80R& D SystemsMAB5580Minneapolis, MN
Szczep RRV ATCCMMU 18006Manassas, Wirginia
Stereoskop fluorescencyjnyOlympusSZX7
Mikroskopia świetlnaLeica Leica MicrosystemsLeica DMI8+DFC7000TWetzlar, Niemcy
System automatyzacji procesów przedanalitycznych HitachiAnalizator kliniczny Hitachi7600Tokio, Japonia
Znieczulenie izofluranemRWDR510-22-10
Rodamina 123Sigma-Aldrich83702
czerwony barwnik siriusLeageneDC0041
mikrotom parafinowyLeica MicrosystemsRM2235
guma neutralnaSolarbioG8590

Bibliografia

  1. Lakshminarayanan, B., Davenport, M. Biliary atresia: A comprehensive review. Journal of Autoimmunity. 73, 1-9 (2016).
  2. Bassett, M. D., Murray, K. F. Biliary atresia: Recent progress. Journal of Clinical Gastroenterology. 42 (6), 720-729 (2008).
  3. Bezerra, J. A., et al. Biliary atresia: Clinical and research challenges for the twenty-first century. Hepatology. 68 (3), 1163-1173 (2018).
  4. Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. Biliary atresia. Lancet. 374 (9702), 1704-1713 (2009).
  5. Lee, W. S., Looi, L. M. Usefulness of a scoring system in the interpretation of histology in neonatal cholestasis. World Journal of Gastroenterology. 15 (42), 5326-5333 (2009).
  6. Russo, P., et al. Key histopathologic features of liver biopsies that distinguish biliary atresia from other causes of infantile cholestasis and their correlation with outcome: A multicenter study. The American Journal of Surgical Pathology. 40 (12), 1601-1615 (2016).
  7. Fickert, P., et al. Characterization of animal models for primary sclerosing cholangitis (PSC). Journal of Hepatology. 60 (6), 1290-1303 (2014).
  8. Sonoda, S., et al. Biliary atresia-specific deciduous pulp stem cells feature biliary deficiency. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 582(2021).
  9. Xiao, Y., et al. Long noncoding RNA H19 contributes to cholangiocyte proliferation and cholestatic liver fibrosis in biliary atresia. Hepatology. 70 (5), 1658-1673 (2019).
  10. Desmet, V. J., Krstulović, B., Van Damme, B. Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis. The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).
  11. Luo, Z., Shivakumar, P., Mourya, R., Gutta, S., Bezerra, J. A. Gene expression signatures associated with survival times of pediatric patients with biliary atresia identify potential therapeutic agents. Gastroenterology. 157 (4), 1138-1152 (2019).
  12. Mariotti, V., Strazzabosco, M., Fabris, L., Calvisi, D. F. Animal models of biliary injury and altered bile acid metabolism. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864, 1254-1261 (2018).
  13. Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection. Immunologic Research. 40 (1), 35-48 (2008).
  14. McDermott, A. J., et al. The role of Gr-1(+) cells and tumour necrosis factor-α signalling during Clostridium difficile colitis in mice. Immunology. 144 (4), 704-716 (2015).
  15. Zhang, R., et al. The role of neonatal Gr-1(+) myeloid cells in a murine model of rhesus-rotavirus-induced biliary atresia. The American Journal of Pathology. 188 (11), 2617-2628 (2018).
  16. Fu, M., et al. A silver nanoparticle method for ameliorating biliary atresia syndrome in mice. Journal of Visualized Experiments. (140), e58158(2018).
  17. Sy, J., Ang, L. C. Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Methods in Molecular Biology. 1897, 269-278 (2019).
  18. Zhang, R., et al. CD177(+) cells produce neutrophil extracellular traps that promote biliary atresia. Journal of Hepatology. 77 (5), 1299-1310 (2022).
  19. Engel, D. R., et al. CX3CR1 reduces kidney fibrosis by inhibiting local proliferation of profibrotic macrophages. Journal of Immunology. 194 (4), 1628-1638 (2015).
  20. Liang, M., et al. A modified murine model of systemic sclerosis: Bleomycin given by pump infusion induced skin and pulmonary inflammation and fibrosis. Laboratory Investigation. 95 (3), 342-350 (2015).
  21. Chen, Y., et al. Differential effects of sorafenib on liver versus tumor fibrosis mediated by stromal-derived factor 1 alpha/C-X-C receptor type 4 axis and myeloid differentiation antigen-positive myeloid cell infiltration in mice. Hepatology. 59 (4), 1435-1447 (2014).
  22. Tomasson, M. H., et al. Fatal myeloproliferation, induced in mice by TEL/PDGFbetaR expression, depends on PDGFbetaR tyrosines 579/581. Journal of Clinical Investigation. 105 (4), 423-432 (2000).
  23. Zhang, R., Huang, J., Shan, J., Chen, Y., Xia, H. Peripheral blood CD177(+) cells as an early diagnostic marker for biliary atresia: A prospective multicentre study in pediatric patients with cholestasis. Journal of Hepatology. 77 (6), 1714-1716 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Rotawirus rhesusprzeciwciało anty-Ly6Gprzewlekła choroba wątrobyodkładanie kolagenuanaliza histologicznazapalenie żyły wrotnejkomórki CK19-dodatnie
Mysi model przewlekłego zwłóknienia wątroby do badania atrezji dróg żółciowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.