Prospektywne, randomizowane i kontrolowane badanie wstrzyknięcia ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pępowiny w leczeniu owrzodzeń stopy cukrzycowej

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje prospektywne, randomizowane, kontrolowane badanie kliniczne, które ocenia wstrzyknięcie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych do pępowiny w leczeniu przewlekłych owrzodzeń stopy cukrzycowej.

Streszczenie

Wraz z rozwojem społeczeństwa i gospodarki, częstość występowania owrzodzeń stopy cukrzycowej stale rośnie. Obecnie konwencjonalne oczyszczanie z podmianą opatrunku, tlen hiperbaryczny i drenaż próżniowy są głównymi metodami leczenia zachowawczego w praktyce klinicznej, a duże rany często wymagają przeszczepów skóry lub przeszczepów płatów skóry. Jednak efekty leczenia nie są idealne i istnieje wiele powikłań. Ze względu na złożoną patogenezę, długi czas leczenia, znaczne związane z tym trudności i wysoki wskaźnik niepełnosprawności, owrzodzenia stopy cukrzycowej stanowią duże obciążenie dla pacjentów, społeczeństwa i opieki medycznej. Zgodnie z naszym poprzednim badaniem, farmakologiczne działanie ludzkich komórek macierzystych krwi pępowinowej obejmuje nieswoistą regulację immunologiczną; zwiększone wydzielanie czynników wzrostu, czynników wazoaktywnych i czynników przeciwzapalnych; zwiększona zdolność przeciwzakaźna organizmu ludzkiego; eliminacja stanu zapalnego; oraz wspomaganie angiogenezy i gojenia się wrzodów. Efekty te sugerują, że komórki macierzyste mogą być przydatne jako autologiczne lub allogeniczne leczenie ran opornych na leczenie. W związku z tym w naszej klinice prowadzimy badanie kliniczne mające na celu leczenie opornych na leczenie ran cukrzycowych ludzkimi komórkami macierzystymi z pępowiny dla pacjentów z owrzodzeniami stopy cukrzycowej, którzy spełniają kryteria włączenia.

Wprowadzenie

Cukrzyca jest chorobą, która dotyka ludzi na całym świecie, a Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) przewiduje, że liczba osób z cukrzycą wzrośnie z 285 milionów w 2010 roku do 439 milionów w 2030 roku¹. Owrzodzenia stopy cukrzycowej (DFU) są jednym z najpoważniejszych powikłań cukrzycy i są głównymi czynnikami przyczyniającymi się do nieurazowych amputacji kończyn dolnych na całym świecie^2,3,4,5.

Ostatnio, komórki macierzyste rozkwitły jako terapia ze względu na ich pluripotencję, samoodnowę i zdolność do wspomagania wydzielania cytokin regeneracyjnych^6,7. Poprzedni eksperyment kliniczny wykazał, że żele z komórkami macierzystymi pochodzenia tłuszczowego miały pozytywny wpływ na leczenie owrzodzeń stóp w przewlekłej cukrzycy⁸. Autorzy zweryfikowali skuteczność stosowania komórek macierzystych w leczeniu ran cukrzycowych u 59 pacjentów. W 12. tygodniu wskaźnik całkowitego zamknięcia rany w grupie leczonej i kontrolnej wynosił odpowiednio 82% i 53%, co wskazuje, że komórki macierzyste są skuteczne w leczeniu opornych na leczenie ran cukrzycowych. Ogólnie rzecz biorąc, zdolność komórek macierzystych do regeneracji, zastępowania, naprawy i różnicowania dała nieskończoną nadzieję społeczności nauk przyrodniczych⁹.

W 2008 roku Dulchavsky et al.¹⁰ wykorzystało przeszczepy zawierające autologiczne komórki zrębu szpiku kostnego (BMSC) do leczenia 20 przypadków niegojących się ran o różnych przyczynach. Badania histologiczne wykazały, że rany skórne u 18 pacjentów uległy całkowitemu zreepitelializacji. Podobnie, zastosowanie allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) bez cukrzycy w rusztowaniach żelatynowych do leczenia niezrostowych ran cukrzycowych może promować angiogenezę, zwiększać reepitelializację i zmniejszać obszar owrzodzenia¹¹. W krajowych i zagranicznych badaniach klinicznych jest jednak niewiele przypadków leczenia ran stopy cukrzycowej komórkami macierzystymi; Większość z nich to tylko opisy przypadków lub eksploracyjne badania kliniczne pozbawione ścisłego projektu eksperymentalnego, a także niewiele jest dużych próbek z dobrym projektem lub randomizowanymi kontrolowanymi badaniami klinicznymi. Ponieważ komórki macierzyste nie są powszechnie stosowanymi lekami ani produktami biologicznymi, metody przygotowania i kontrole jakości różnią się w zależności od badania. Dane z jednego badania mogą nie odzwierciedlać w pełni bezpieczeństwa wszystkich komórek macierzystych tego samego gatunku. W związku z tym podsumowaliśmy odpowiednie badania podstawowe i eksperymenty przedkliniczne z ludzkimi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi z pępowiny (HUCMSC) i systematycznie ocenialiśmy bezpieczeństwo i skuteczność ich zastosowania klinicznego. Na tej podstawie opracowano jako metodę leczenia wstrzyknięcie mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej pępowiny w celu naprawy ran stopy cukrzycowej. Badanie to ma na celu weryfikację skuteczności i bezpieczeństwa naprawy komórek macierzystych ran stopy cukrzycowej w zastosowaniu klinicznym.

Podsumowując, terapia komórkami macierzystymi ma szerokie spektrum zastosowań i ogromny potencjał oraz stanowi obiecującą nową metodę leczenia. Przy stałym wsparciu Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 81571901, nr 81501671 i nr 82172224) przeprowadziliśmy szereg badań dotyczących leczenia ran cukrzycowych za pomocą HUCMSC. Opublikowaliśmy ponad 20 powiązanych artykułów w Journal of Investigative Dermatology, Stem Cell Research and Therapy oraz Cell Death and Disease i złożyliśmy wniosek o trzy krajowe patenty na wynalazki, gromadząc w ten sposób dużą bazę badań^12,13. W tym miejscu przedstawiamy standardowe podejście do oceny wstrzyknięcia HUCMSC w celu naprawy ran stopy cukrzycowej. Ta standardowa procedura została zatwierdzona przez chińskie badania kliniczne leków (numer rejestracyjny badania: chińskie badania kliniczne leków: MR-32-21-015759, [Pierwsze wydanie: 20.10.2021]).

Protokół

Niniejsze prospektywne, jednocentrowe, randomizowane, kontrolowane badanie kliniczne zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Szpitala Powiązanego z Uniwersytetem Medycznym w Xuzhou (XYFY2021-KL124-02). Badanie rozpoczęło się w lipcu 2021 roku i potrwa do lipca 2023 roku; do eksperymentu zrekrutowano 60 pacjentów. Wszyscy pacjenci podpisali świadomą zgodę, która pozwoliła badaczom na wykorzystanie ich materiałów klinicznych i danych biologicznych.

1. Rekrutacja pacjentów

1. Kryteria włączenia:
   1. Upewnić się, że wiek pacjentów mieści się w przedziale od 18 do 80 lat (włącznie), niezależnie od płci.
   2. Upewnić się, że pacjenci z cukrzycą typu 2 i owrzodzeniami stopy cukrzycowej spełniają kryteria diagnostyczne WHO z 1999 roku¹⁴ i mają poziom hemoglobiny glikowanej (HbA1c) ≤10%, stwierdzony w okresie przesiewowym lub w ciągu 3 miesięcy przed randomizacją.
   3. Potwierdzić, że wskaźnik kostka-ramię¹⁵ w badanej kończynie wynosi co najmniej 0.8, bez obecności chromania przerywanego.
   4. Upewnić się, że owrzodzenie u każdego pacjenta posiada następujące cechy:
      Stopień 1 lub 2 według skali Wagnera¹⁶ dla owrzodzeń.
      Lokalizacja na stopie, kostce lub przedniej części piszczeli.
      Powierzchnia przekroju po opracowaniu rany wynosząca 2-5 cm².
      Brak ropy lub substancji nekrotycznych widocznych gołym okiem na co najmniej 4 tygodnie przed randomizacją.
   5. Nie włączać do badania pacjentów poddawanych rutynowemu leczeniu innych ran.
      1. W przypadku obecności wielu ran, wybrać ranę spełniającą kryteria włączenia, która posiada największą powierzchnię interwencji i oceny.
      2. Jeśli dwie lub więcej ran mają podobną wielkość, wybrać ranę o najwyższym stopniu zaawansowania.
      3. Jeśli istnieją dwie lub więcej ran o tej samej powierzchni i stopniu, wybrać ranę o najdłuższym czasie trwania.
   6. Udział w niniejszym badaniu klinicznym jest dobrowolny. Upewnić się, że pacjenci współpracują z lekarzami prowadzącymi badanie i podpisali formularz świadomej zgody.
2. Kryteria wyłączenia:
   1. Wykluczyć pacjentów z wyraźnymi wskazaniami chirurgicznymi: zamknięciem naczyniowym, odsłonięciem kości, ropniem, zapaleniem kości.
   2. Wykluczyć pacjentów, u których przeprowadzono rewaskularyzację lub angioplastykę w ciągu 3 miesięcy przed włączeniem do badania.
   3. Wykluczyć pacjentów z zaburzeniami czynności wątroby; w szczególności wykluczyć pacjentów, u których poziomy ALT (aminotransferazy alaninowej) i AST (aminotransferazy asparaginianowej) są trzykrotnie wyższe niż górna granica normy.
   4. Wykluczyć pacjentów z poziomem kreatyniny we krwi przekraczającym dwukrotnie górną granicę normy; albuminami w surowicy <2.0 g/dL; leczeniem lekami immunosupresyjnymi; różnymi nowotworami złośliwymi oraz w przypadku ciąży, karmienia piersią lub niedawnego planowanego porodu.
   5. Wykluczyć pacjentów z przeciwwskazaniami, alergiami lub znanymi alergiami na jakikolwiek składnik preparatów z komórek macierzystych.
   6. Wykluczyć pacjentów w innych sytuacjach, które skłaniają badacza do uznania, że pacjent nie powinien uczestniczyć w badaniu:
      1. Wykluczyć pacjentów, jeśli po przyjęciu okaże się, że nie spełniają najważniejszych kryteriów włączenia.
      2. Wykluczyć pacjentów z poważnymi reakcjami niepożądanymi, pacjentów, którzy wnioskują o wycofanie się z badania, oraz pacjentów, których opiekun prawny wnioskuje o ich wycofanie z badania.
      3. Wykluczyć pacjentów z brakiem leczenia lub efektywnych danych obserwacyjnych po włączeniu do badania.
3. Randomizacja i zaślepienie
   1. Zrandomizować pacjentów zrekrutowanych z poradni szpitala Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University w stosunku 1:1 do grupy terapii komórkami macierzystymi oraz grupy konwencjonalnego leczenia ran.
   2. Przeprowadzić podwójnie ślepą próbę leczenia. Upewnić się, że powierzchnia rany każdego pacjenta jest mierzona przez osobę trzecią.

2. Leczenie przedoperacyjne

1. Po rekrutacji należy przeprowadzić u pacjentów rutynowe badania wstępne, w tym morfologię krwi, badanie ogólne moczu, badanie ogólne kału, ocenę funkcji biochemicznych, ocenę układu krzepnięcia, badania wirusologiczne itp. Należy dopilnować, aby pacjenci byli badani w tym samym szpitalu w celu zapewnienia dokładności wyników testów.
2. Należy włączyć do badania pacjentów, którzy spełniają kryteria włączenia i podpisali pisemną zgodę świadomą. Każdego uczestnika należy losowo przypisać do grupy terapii komórkami macierzystymi lub grupy konwencjonalnego leczenia ran w stosunku 1:1, stosując technikę doboru proporcjonalnego.

3. Procedury traktowania

UWAGA: Pacjenci w obu grupach poddawani są systematycznym, rutynowym zmianom opatrunków rany co 3 dni. W grupie leczonej komórkami macierzystymi pacjenci otrzymują miejscowe iniekcje komórek macierzystych czterokrotnie (w 1., 8., 15. i 22. dniu po włączeniu do badania). W grupie konwencjonalnego leczenia ran pacjenci są leczeni opatrunkiem z jonami srebra czterokrotnie (w 1., 8., 15. i 22. dniu po włączeniu do badania). Szczegółowe kroki są następujące.

Rycina 1: Proces leczenia. W każdej grupie 30 pacjentów zostanie poddanych leczeniu ściśle według protokołu opisanego w niniejszym badaniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

1. Grupa terapii komórkami macierzystymi
   1. Po lokalnej dezynfekcji rany powidonem jodowym i usunięciu martwiczej tkanki z powierzchni rany za pomocą nożyczek chirurgicznych, należy za pomocą strzykawki pobrać 50 mL soli fizjologicznej, aby oczyścić powierzchnię rany wewnątrz i na zewnątrz.
   2. Zmierz powierzchnię rany metodą haczyka z jałowej folii¹⁷. Nałóż na powierzchnię rany jałowy przezroczysty opatrunek foliowy z siatką współrzędnych i obrysuj markerem kształt powierzchni rany wzdłuż jej krawędzi. Oblicz powierzchnię rany na podstawie pola każdego kwadratu siatki współrzędnych folii.
   3. Wstrzyknij ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste z pępowiny (2 x 10⁵ komórek/cm²; 0,4 mL/cm²) w obrzeża i podstawę rany (odstępy między wstrzyknięciami: 0,75 cm; objętość wstrzyknięcia: 0,1 mL/miejsce).
      UWAGA: Liczba wstrzyknięć dla każdego pacjenta zależy od powierzchni rany.
   4. Przytnij jałowy opatrunek do odpowiedniego rozmiaru, przykryj nim powierzchnię rany, a następnie załóż opatrunek bandażowy.
2. Grupa konwencjonalnego leczenia ran
   1. Po lokalnej dezynfekcji rany jodoforem i usunięciu martwiczej tkanki z powierzchni rany za pomocą nożyczek chirurgicznych, należy za pomocą strzykawki pobrać 50 mL soli fizjologicznej, aby oczyścić powierzchnię rany wewnątrz i na zewnątrz.
   2. Zmierz powierzchnię rany metodą haczyka z jałowej folii¹⁷. Nałóż na powierzchnię rany jałowy przezroczysty opatrunek foliowy z siatką współrzędnych i obrysuj markerem kształt powierzchni rany wzdłuż jej krawędzi. Oblicz powierzchnię rany na podstawie pola każdego kwadratu siatki współrzędnych folii.
   3. Przytnij opatrunek z jonami srebra do odpowiedniego rozmiaru, przykryj nim powierzchnię rany, a następnie załóż opatrunek bandażowy.

Rysunek 2: Schemat pomiaru powierzchni owrzodzenia stopy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 3: Schemat wstrzykiwania mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej pępowiny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

4. Wskaźniki obserwacyjne

1. Zgromadź dane demograficzne uczestników.
2. Zanotuj stosowane leczenie wspomagające; w szczególności odnotuj stan rany (lokalizację, powierzchnię, głębokość, obecność infekcji i niedokrwienia), tempo gojenia rany, czas gojenia oraz powikłania.
3. Wykonaj badania laboratoryjne. Pobierz wydzielinę z rany do wymazów i posiewu bakteriologicznego. Przeprowadź rutynowe badania krwi oraz badania czynności wątroby i nerek.

5. Obserwacja

1. Zbadaj pacjentów w pierwszym dniu terapii oraz podczas wizyt kontrolnych 15 i 30 dni po zakończeniu leczenia.
2. Przeprowadź kontrole podczas wizyt ambulatoryjnych oraz telefonicznych w celu zarejestrowania efektów leczenia, zmian w stanie zdrowia, stopnia rekonwalescencji oraz aktualnego statusu życiowego.

6. Ocena skuteczności wyników

1. Przeprowadzić ocenę kliniczną zgodnie z następującymi kryteriami.
   1. Obliczyć główny wskaźnik wyniku:
      Wskaźnik gojenia rany w 30. dniu = (pierwotna powierzchnia rany − niezagojona powierzchnia rany w 30. dniu)/pierwotna powierzchnia rany × 100%.
   2. Obliczyć wtórne wskaźniki wyniku
      1. Czas gojenia rany: Zdefiniować czas zamknięcia rany jako moment, w którym rana uległa całkowitej reepitelializacji.
      2. Obliczyć wskaźnik całkowitego wygojenia:
         Wskaźnik całkowitego wygojenia = liczba przypadków całkowitego wygojenia/całkowita liczba przypadków × 100%
   3. Obliczyć wskaźnik interwencji chirurgicznych:
      Wskaźnik interwencji chirurgicznych = liczba interwencji chirurgicznych/całkowita liczba przypadków × 100%.
      UWAGA: Osoby, które przeszły jedną z poniższych procedur, zapisuje się jako pacjentów z interwencjami chirurgicznymi: opracowanie chirurgiczne i drenaż, przeszczep skóry, płat skóry sąsiedniej, płat skóry odległy, płat skóry nieanastomozowy oraz amputacja.
   4. Wykonać posiew bakteryjny¹⁸ zgodnie ze standardowymi procedurami badania klinicznego i zapisać wyniki posiewu bakterii z obecnością ≥1 patogenu jako dodatnie. Obliczyć odsetek wyników dodatnich na obecność patogenów:
      Odsetek wyników dodatnich na obecność patogenów = liczba przypadków z dodatnim wynikiem na obecność patogenu/całkowita liczba przypadków × 100%.

7. Procedury bezpieczeństwa

1. W przypadku wystąpienia zdarzenia niepożądanego (jakiejkolwiek choroby, nowych objawów, oznak, nieprawidłowości w badaniach laboratoryjnych lub pogorszenia pierwotnych objawów i oznak występujących w trakcie badań klinicznych nad komórkami macierzystymi, niezależnie od tego, czy zdarzenie jest związane z badanym lekiem, czy nie), należy podjąć niezbędne środki w celu leczenia i ratowania pacjenta.
2. Należy monitorować i badać wszystkie zdarzenia niepożądane oraz proces leczenia i szczegółowo rejestrować wyniki aż do całkowitego ustąpienia problemu lub stabilizacji stanu pacjenta. Jeśli wynik badania jest nieprawidłowy i ma znaczenie kliniczne, należy prowadzić obserwację do czasu powrotu do normy.

Wyniki

Obecnie nasze badania znajdują się w fazie rekrutacji pacjentów; do tej pory zakończono leczenie trzech pacjentów w grupie traktowanej HUCMSCs oraz trzech pacjentów w grupie kontrolnej otrzymującej opatrunki z jonami srebra, co daje łącznie sześciu pacjentów z przewlekłymi ranami stopy cukrzycowej. Średnia powierzchnia owrzodzenia u pacjenta w grupie traktowanej HUCMSCs wynosiła 3,5 cm², a w 8., 15. i 22. dniu po zastosowaniu HUCMSCs uległa ona redukcji odpowiednio do 2,6 cm², 1,8 cm² i 1...

Dyskusja

DFU są poważnym globalnym problemem zdrowia publicznego i główną przyczyną amputacji kończyn dolnych oraz złej jakości życia związanej ze zdrowiem^19,20. Obecnie postępowanie kliniczne jest nadal zdominowane przez konwencjonalne oczyszczanie, tlenoterapię hiperbaryczną, drenaż próżniowy (VSD) i leczenie zachowawcze. Większe rany często wymagają przeszczepu skóry i płatów skórnych. Wielu pacjentów cierpi na długotrwałe i powtarzające się choroby, które powodują sil...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Opatrunek na rany Silver Iin	Shandong Cheerain Medical Co., Ltd.	20152640521	Sterylny opatrunek z jonami srebra do użytku medycznego (typ F) 10 cm x 10 cm
Ludzka pępowina Mezenchymalne komórki macierzyste Wstrzyknięcie	Shandong Qilu Cell Therapy Engineering Technology Co., Ltd.	32183185-X Główne	składniki: mezenchymalne komórki macierzyste ludzkiej pępowiny. Efekt farmakologiczny: nieswoisty immunomodulator może zwiększać wydzielanie czynnika wzrostu, czynnika wazoaktywnego i czynnika przeciwzapalnego, poprawiać zdolność przeciwinfekcyjną organizmu ludzkiego, eliminować stany zapalne, promować angiogenezę i gojenie się wrzodów.
Sterylny przezroczysty opatrunek z folii siatkowej	Smith & Siostrzeniec	20162644490	Sterylny przezroczysty opatrunek z folii siatkowej (używany do pomiaru powierzchni rany) 6 cm x 7 cm