Prospektywne, randomizowane i kontrolowane badanie wstrzyknięcia ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pępowiny w leczeniu owrzodzeń stopy cukrzycowej

Summary

Obecny protokół opisuje prospektywne, randomizowane, kontrolowane badanie kliniczne, które ocenia wstrzyknięcie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych do pępowiny w leczeniu przewlekłych owrzodzeń stopy cukrzycowej.

Abstract

Wraz z rozwojem społeczeństwa i gospodarki, częstość występowania owrzodzeń stopy cukrzycowej stale rośnie. Obecnie konwencjonalne oczyszczanie z podmianą opatrunku, tlen hiperbaryczny i drenaż próżniowy są głównymi metodami leczenia zachowawczego w praktyce klinicznej, a duże rany często wymagają przeszczepów skóry lub przeszczepów płatów skóry. Jednak efekty leczenia nie są idealne i istnieje wiele powikłań. Ze względu na złożoną patogenezę, długi czas leczenia, znaczne związane z tym trudności i wysoki wskaźnik niepełnosprawności, owrzodzenia stopy cukrzycowej stanowią duże obciążenie dla pacjentów, społeczeństwa i opieki medycznej. Zgodnie z naszym poprzednim badaniem, farmakologiczne działanie ludzkich komórek macierzystych krwi pępowinowej obejmuje nieswoistą regulację immunologiczną; zwiększone wydzielanie czynników wzrostu, czynników wazoaktywnych i czynników przeciwzapalnych; zwiększona zdolność przeciwzakaźna organizmu ludzkiego; eliminacja stanu zapalnego; oraz wspomaganie angiogenezy i gojenia się wrzodów. Efekty te sugerują, że komórki macierzyste mogą być przydatne jako autologiczne lub allogeniczne leczenie ran opornych na leczenie. W związku z tym w naszej klinice prowadzimy badanie kliniczne mające na celu leczenie opornych na leczenie ran cukrzycowych ludzkimi komórkami macierzystymi z pępowiny dla pacjentów z owrzodzeniami stopy cukrzycowej, którzy spełniają kryteria włączenia.

Introduction

Cukrzyca jest chorobą, która dotyka ludzi na całym świecie, a Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) przewiduje, że liczba osób z cukrzycą wzrośnie z 285 milionów w 2010 roku do 439 milionów w 2030 roku¹. Owrzodzenia stopy cukrzycowej (DFU) są jednym z najpoważniejszych powikłań cukrzycy i są głównymi czynnikami przyczyniającymi się do nieurazowych amputacji kończyn dolnych na całym świecie^2,3,4,5.

Ostatnio, komórki macierzyste rozkwitły jako terapia ze względu na ich pluripotencję, samoodnowę i zdolność do wspomagania wydzielania cytokin regeneracyjnych^6,7. Poprzedni eksperyment kliniczny wykazał, że żele z komórkami macierzystymi pochodzenia tłuszczowego miały pozytywny wpływ na leczenie owrzodzeń stóp w przewlekłej cukrzycy⁸. Autorzy zweryfikowali skuteczność stosowania komórek macierzystych w leczeniu ran cukrzycowych u 59 pacjentów. W 12. tygodniu wskaźnik całkowitego zamknięcia rany w grupie leczonej i kontrolnej wynosił odpowiednio 82% i 53%, co wskazuje, że komórki macierzyste są skuteczne w leczeniu opornych na leczenie ran cukrzycowych. Ogólnie rzecz biorąc, zdolność komórek macierzystych do regeneracji, zastępowania, naprawy i różnicowania dała nieskończoną nadzieję społeczności nauk przyrodniczych⁹.

W 2008 roku Dulchavsky et al.¹⁰ wykorzystało przeszczepy zawierające autologiczne komórki zrębu szpiku kostnego (BMSC) do leczenia 20 przypadków niegojących się ran o różnych przyczynach. Badania histologiczne wykazały, że rany skórne u 18 pacjentów uległy całkowitemu zreepitelializacji. Podobnie, zastosowanie allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) bez cukrzycy w rusztowaniach żelatynowych do leczenia niezrostowych ran cukrzycowych może promować angiogenezę, zwiększać reepitelializację i zmniejszać obszar owrzodzenia¹¹. W krajowych i zagranicznych badaniach klinicznych jest jednak niewiele przypadków leczenia ran stopy cukrzycowej komórkami macierzystymi; Większość z nich to tylko opisy przypadków lub eksploracyjne badania kliniczne pozbawione ścisłego projektu eksperymentalnego, a także niewiele jest dużych próbek z dobrym projektem lub randomizowanymi kontrolowanymi badaniami klinicznymi. Ponieważ komórki macierzyste nie są powszechnie stosowanymi lekami ani produktami biologicznymi, metody przygotowania i kontrole jakości różnią się w zależności od badania. Dane z jednego badania mogą nie odzwierciedlać w pełni bezpieczeństwa wszystkich komórek macierzystych tego samego gatunku. W związku z tym podsumowaliśmy odpowiednie badania podstawowe i eksperymenty przedkliniczne z ludzkimi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi z pępowiny (HUCMSC) i systematycznie ocenialiśmy bezpieczeństwo i skuteczność ich zastosowania klinicznego. Na tej podstawie opracowano jako metodę leczenia wstrzyknięcie mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej pępowiny w celu naprawy ran stopy cukrzycowej. Badanie to ma na celu weryfikację skuteczności i bezpieczeństwa naprawy komórek macierzystych ran stopy cukrzycowej w zastosowaniu klinicznym.

Podsumowując, terapia komórkami macierzystymi ma szerokie spektrum zastosowań i ogromny potencjał oraz stanowi obiecującą nową metodę leczenia. Przy stałym wsparciu Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 81571901, nr 81501671 i nr 82172224) przeprowadziliśmy szereg badań dotyczących leczenia ran cukrzycowych za pomocą HUCMSC. Opublikowaliśmy ponad 20 powiązanych artykułów w Journal of Investigative Dermatology, Stem Cell Research and Therapy oraz Cell Death and Disease i złożyliśmy wniosek o trzy krajowe patenty na wynalazki, gromadząc w ten sposób dużą bazę badań^12,13. W tym miejscu przedstawiamy standardowe podejście do oceny wstrzyknięcia HUCMSC w celu naprawy ran stopy cukrzycowej. Ta standardowa procedura została zatwierdzona przez chińskie badania kliniczne leków (numer rejestracyjny badania: chińskie badania kliniczne leków: MR-32-21-015759, [Pierwsze wydanie: 20.10.2021]).

Protocol

To prospektywne, jednoośrodkowe, randomizowane, kontrolowane badanie kliniczne zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Medycznego Xuzhou (XYFY2021-KL124-02). Badanie rozpoczęło się w lipcu 2021 r. i potrwa do lipca 2023 r.; W eksperymencie tym zrekrutowano 60 pacjentów. Wszyscy pacjenci podpisali świadomą zgodę, która pozwoliła badaczom na wykorzystanie ich materiałów klinicznych i danych biologicznych.

1. Rekrutacja pacjentów

1. Kryteria włączenia:
   1. Upewnij się, że wiek pacjentów wynosi od 18 do 80 lat (włącznie), niezależnie od płci.
   2. Upewnij się, że pacjenci z cukrzycą typu 2 i owrzodzeniami stopy cukrzycowej spełniają kryteria diagnostyczne WHO z 1999 r. ¹⁴ i mają poziom hemoglobiny glikowanej (HbA1c) ≤10%, wykryty podczas okresu przesiewowego lub w ciągu 3 miesięcy przed randomizacją.
   3. Upewnij się, że wskaźnik stawu skokowo-ramiennego¹⁵ kończyny docelowej wynosi co najmniej 0,8 bez chromania przestankowego.
   4. Upewnij się, że wrzód każdego pacjenta ma następujące cechy:
      Stopień 1 lub stopień 2 według systemu ocen Wagnera¹⁶ dla wrzodów.
      Lokalizacja w stopie, kostce lub przedniej goleni.
      Pole przekroju poprzecznego po oczyszczeniu 2-5 cm²,
      Brak ropy lub substancji martwiczej widocznych gołym okiem co najmniej 4 tygodnie przed randomizacją.
   5. Do badania nie należy włączać pacjentów poddawanych rutynowemu leczeniu innych ran.
      1. Jeśli występuje wiele ran, wybierz ranę, która spełnia kryteria włączenia i ma największy obszar interwencji i oceny.
      2. Jeśli dwie lub więcej ran jest podobnie dużych, wybierz tę o najcięższym stopniu.
      3. Jeśli są dwie lub więcej ran o tej samej powierzchni i stopniu, wybierz tę, która ma najdłuższy czas trwania rany.
   6. Udział w tym badaniu klinicznym jest dobrowolny. Upewnij się, że pacjenci współpracują z lekarzami prowadzącymi badanie i podpisują formularz świadomej zgody.
2. Kryteria wyłączenia:
   1. Wyklucz pacjentów z wyraźnymi wskazaniami chirurgicznymi: niedrożność naczyń, odsłonięcie kości, ropień, zapalenie kości i szpiku.
   2. Wykluczyć pacjentów z rewaskularyzacją lub angioplastyką w ciągu 3 miesięcy przed włączeniem.
   3. Wykluczyć pacjentów z zaburzeniami czynności wątroby, a konkretnie wykluczyć pacjentów z poziomami AlAT (aminotransferaza asparaginianowa) i AST (aminotransferaza alaninowa) trzykrotnie wyższymi niż górna granica normy.
   4. Należy wykluczyć pacjentów z poziomem kreatyniny we krwi więcej niż dwa razy powyżej górnej granicy normy, albuminy surowicy <2,0 g/dl, leczenia lekami immunosupresyjnymi, różnych nowotworów złośliwych oraz ciąży, karmienia piersią lub niedawnego planu porodu.
   5. Należy wykluczyć pacjentów z przeciwwskazaniami, alergiami lub stwierdzonymi alergiami na którykolwiek składnik preparatów z komórek macierzystych.
   6. Wyklucz pacjentów w innych sytuacjach, które powodują, że badacz uważa, że pacjent nie powinien brać udziału w tym badaniu:
      1. Wykluczaj pacjentów, jeśli po przyjęciu do szpitala okaże się, że nie spełniają najważniejszych kryteriów przyjęcia.
      2. Wykluczenie pacjentów z ciężkimi działaniami niepożądanymi, pacjentów, którzy wnioskują o wycofanie się z badania oraz pacjentów, których opiekun prawny wnioskuje o wycofanie się z badania.
      3. Wyklucz pacjentów z brakiem leków lub skutecznych danych obserwacyjnych po rejestracji.
3. Randomizacja i zaślepienie
   1. Randomizacja pacjentów rekrutowanych z oddziału ambulatoryjnego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Medycznego Xuzhou w stosunku 1:1 do grupy terapii komórkami macierzystymi i grupy konwencjonalnego leczenia ran.
   2. Przeprowadź podwójnie ślepą próbę leczenia. Upewnij się, że osoba trzecia mierzy obszar rany każdego pacjenta.

2. Leczenie przedoperacyjne

1. Wykonywanie rutynowych badań przed leczeniem pacjentów po włączeniu do badania, w tym rutynowe badanie krwi, analiza moczu, rutynowa ocena stolca, ocena funkcji biochemicznej, ocena funkcji krzepnięcia, wirusologia itp. Upewnij się, że pacjenci są monitorowani w tym samym szpitalu, aby zapewnić dokładność testów.
2. Uwzględnij pacjentów, którzy spełniają kryteria włączenia i podpisali pisemną świadomą zgodę. Każdemu pacjentowi należy losowo przypisać grupę terapii komórkami macierzystymi lub grupę konwencjonalnego leczenia ran w stosunku 1:1 przy użyciu techniki proporcjonalnego pobierania próbek.

3. Procedury leczenia

UWAGA: Pacjenci w obu grupach otrzymują systematyczne rutynowe zmiany opatrunków co 3 dni. W grupie leczonej komórkami macierzystymi pacjenci otrzymują miejscowe wstrzyknięcia komórek macierzystych cztery razy (w dniu 1, dniu 8, dniu 15 i dniu 22 po włączeniu). W grupie konwencjonalnego leczenia ran pacjenci są leczeni opatrunkiem jonowym srebra cztery razy (w dniu 1, w dniu 8, w dniu 15 i w dniu 22 po włączeniu). Konkretne kroki są następujące.

Rysunek 1: Proces leczenia. W każdej grupie 30 pacjentów zostanie poddanych leczeniu ściśle według protokołu opisanego w tym badaniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Grupa terapii komórkami macierzystymi
   1. Po miejscowym zdezynfekowaniu rany powidonem i usunięciu martwiczej tkanki z powierzchni rany za pomocą nożyczek chirurgicznych, za pomocą strzykawki odessać 50 ml soli fizjologicznej w celu oczyszczenia powierzchni rany wewnątrz i na zewnątrz.
   2. Zmierz obszar rany za pomocą metody haczyka do krawędzi sterylnej folii¹⁷. Nałożyć sterylny opatrunek z przezroczystej folii z siatką współrzędnych na powierzchnię rany i obrysować kształt powierzchni rany wzdłuż jej krawędzi za pomocą markera. Oblicz obszar rany zgodnie z obszarem każdej siatki współrzędnych folii.
   3. Wstrzyknąć ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste pępowiny (2 x 10 5 komórek/^cm2; 0,4 ml/^cm2) na obrzeża i podstawę rany (odstęp między wstrzyknięciami: 0,75 cm; objętość wstrzyknięcia: 0,1 ml/miejsce).
      UWAGA: Liczba wstrzyknięć dla każdego pacjenta zależy od obszaru rany.
   4. Przyciąć sterylny opatrunek do odpowiedniego rozmiaru, przykryć nim powierzchnię rany, a następnie zabandażować.
2. Grupa zajmująca się konwencjonalnym leczeniem ran
   1. Po miejscowym zdezynfekowaniu rany jodoforem i usunięciu tkanki martwiczej z powierzchni rany za pomocą nożyczek chirurgicznych, za pomocą strzykawki odessać 50 ml soli fizjologicznej w celu oczyszczenia powierzchni rany wewnątrz i na zewnątrz.
   2. Zmierz obszar rany za pomocą metody haczyka do krawędzi sterylnej folii¹⁷. Nałożyć sterylny opatrunek z przezroczystej folii z siatką współrzędnych na powierzchnię rany i obrysować kształt powierzchni rany wzdłuż jej krawędzi za pomocą markera. Oblicz obszar rany zgodnie z obszarem każdej siatki współrzędnych folii.
   3. Przyciąć opatrunek z jonami srebra do odpowiedniego rozmiaru, przykryć nim powierzchnię rany, a następnie zabandażować.

Rysunek 2: Schemat ideowy pomiaru obszaru owrzodzenia stopy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Schemat wstrzyknięcia ludzkich komórek macierzystych z pępowiny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Wskaźniki obserwacji

1. Uzyskaj dane demograficzne badanych.
2. Zapisz równoczesne leczenie, w szczególności zapisz stan rany (lokalizacja, obszar, głębokość, infekcja i niedokrwienie), szybkość gojenia się rany, czas gojenia i powikłania.
3. Wykonaj badania laboratoryjne. Pobrać wydzielinę z rany do wymazów i posiewu bakteriologicznego. Przeprowadzaj rutynowe badania krwi i testy na czynność wątroby i nerek.

5. Kontynuacja

1. Badaj pacjentów w pierwszym dniu terapii oraz podczas wizyt kontrolnych 15 dni i 30 dni po ostatniej terapii.
2. Przeprowadzaj wizyty kontrolne zarówno podczas wizyt ambulatoryjnych, jak i telefonicznych, aby rejestrować efekty leczenia, zmiany stanu, sytuację rekonwalescencji i aktualny stan życia.

6. Ocena skuteczności wyników

1. Przeprowadź ocenę kliniczną zgodnie z poniższymi kryteriami.
   1. Oblicz pierwszorzędowy indeks wyniku:
      30-dniowy wskaźnik gojenia się ran = (pierwotny obszar rany − niezagojony obszar rany po 30 dniach)/pierwotny obszar rany × 100%.
   2. Obliczanie wskaźnika wyniku wtórnego
      1. Czas gojenia się rany: Zdefiniuj czas zamknięcia rany jako czas, w którym rana jest całkowicie ponownie nabłonkowana.
      2. Oblicz całkowity współczynnik gojenia:
         Całkowity wskaźnik leczenia = liczba całkowicie wyleczonych przypadków/całkowita liczba przypadków × 100%
   3. Oblicz wskaźnik interwencji chirurgicznej:
      Wskaźnik interwencji chirurgicznych = liczba interwencji chirurgicznych/całkowita liczba przypadków × 100%.
      UWAGA: Pacjenci, którzy przeszli jedną z następujących procedur, są rejestrowani jako pacjenci z interwencjami chirurgicznymi: oczyszczenie i drenaż, przeszczep skóry, sąsiedni płat skóry, dystalny płat skóry, niezespoleniowy płat skóry i amputacja.
   4. Wykonaj badanie bacterial culture¹⁸ zgodnie ze standardowymi procedurami kontroli klinicznej i zapisz wyniki hodowli bakteryjnej patogenu ≥1 jako pozytywne. Obliczać wskaźnik dodatniego patogenu:
      Odsetek pozytywnych przypadków patogenu = liczba wykrytych przypadków z dodatnim wynikiem testu na obecność patogenu/całkowita liczba przypadków × 100%.

7. Procedury bezpieczeństwa

1. W przypadku wystąpienia zdarzenia niepożądanego (jakiejkolwiek choroby, nowych objawów, oznak lub nieprawidłowości w badaniu laboratoryjnym lub pogorszenia pierwotnych objawów i oznak występujących podczas badania klinicznego z wykorzystaniem komórek macierzystych, niezależnie od tego, czy zdarzenie jest związane z lekiem prowadzonym w badaniach klinicznych, czy nie), należy podjąć niezbędne środki w celu leczenia i ratowania.
2. Śledź i badaj wszystkie zdarzenia niepożądane i proces leczenia oraz szczegółowo rejestruj wyniki, aż do prawidłowego ustąpienia lub do momentu, gdy stan się ustabilizuje. Jeśli test jest nieprawidłowy i ma znaczenie kliniczne, należy go śledzić, aż wróci do normy.

Results

Obecnie nasze badania są nadal w fazie rekrutacji pacjentów, a obecnie zakończyliśmy trzy przypadki leczenia HUCMSs i trzech pacjentów w grupie kontrolnej z opatrunkami z jonami srebra, co daje w sumie sześciu pacjentów z przewlekłymi ranami stopy cukrzycowej. Średnia wielkość obszaru owrzodzenia u pacjenta w grupie leczonej HUCMSC wynosiła 3,5 cm² i została zmniejszona do 2,6 cm², 1,8 cm² i 1,25 cm² odpowiednio w 8, 15 i 22 dniu po leczeniu HUCMSC (Figura 4...

Discussion

DFU są poważnym globalnym problemem zdrowia publicznego i główną przyczyną amputacji kończyn dolnych oraz złej jakości życia związanej ze zdrowiem^19,20. Obecnie postępowanie kliniczne jest nadal zdominowane przez konwencjonalne oczyszczanie, tlenoterapię hiperbaryczną, drenaż próżniowy (VSD) i leczenie zachowawcze. Większe rany często wymagają przeszczepu skóry i płatów skórnych. Wielu pacjentów cierpi na długotrwałe i powtarzające się choroby, które powodują sil...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Opatrunek na rany Silver Iin	Shandong Cheerain Medical Co., Ltd.	20152640521	Sterylny opatrunek z jonami srebra do użytku medycznego (typ F) 10 cm x 10 cm
Ludzka pępowina Mezenchymalne komórki macierzyste Wstrzyknięcie	Shandong Qilu Cell Therapy Engineering Technology Co., Ltd.	32183185-X Główne	składniki: mezenchymalne komórki macierzyste ludzkiej pępowiny. Efekt farmakologiczny: nieswoisty immunomodulator może zwiększać wydzielanie czynnika wzrostu, czynnika wazoaktywnego i czynnika przeciwzapalnego, poprawiać zdolność przeciwinfekcyjną organizmu ludzkiego, eliminować stany zapalne, promować angiogenezę i gojenie się wrzodów.
Sterylny przezroczysty opatrunek z folii siatkowej	Smith & Siostrzeniec	20162644490	Sterylny przezroczysty opatrunek z folii siatkowej (używany do pomiaru powierzchni rany) 6 cm x 7 cm