Artykuł metodologiczny

Opracowanie znacznika PET znakowanego 68galem peptydu D do obrazowania ekspresji programowanego ligandu śmierci 1

DOI:

10.3791/65047

⸱

3 lutego 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nuclear Medicine, Nanjing First Hospital, Nanjing Medical University, 2State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 3Department of Advanced Nuclear Medicine Sciences, Institute for Quantum Medical Science, National Institutes for Quantum Science and Technology, 4Department of Pharmacy, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie opracowało nieinwazyjną metodę oceny rozkładu programowanego ligandu śmierci 1 w całym ciele, na podstawie obrazowania tomograficznego emisji pozytonów antagonisty D-dodekapeptydu [68Ga]. Technika ta ma przewagę nad konwencjonalną immunohistochemią i poprawia skuteczność identyfikacji odpowiednich pacjentów, którzy odniosą korzyści z terapii blokującej immunologiczne punkty kontrolne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój terapii blokującej immunologiczne punkty kontrolne opartej na białku programowanej śmierci komórki 1 (PD-1)/ligandzie programowanej śmierci 1 (PD-L1) zrewolucjonizował terapie przeciwnowotworowe w ostatnich latach. Jednak tylko część pacjentów reaguje na inhibitory PD-1 / PD-L1 ze względu na niejednorodną ekspresję PD-L1 w komórkach nowotworowych. Ta heterogeniczność stanowi wyzwanie w precyzyjnym wykrywaniu komórek nowotworowych za pomocą powszechnie stosowanego podejścia immunohistochemicznego (IHC). Sytuacja ta wymaga lepszych metod stratyfikacji pacjentów, którzy odniosą korzyści z terapii blokującej immunologiczne punkty kontrolne, w celu poprawy skuteczności leczenia. Pozytonowa tomografia emisyjna (PET) umożliwia wizualizację ekspresji PD-L1 w całym ciele w sposób nieinwazyjny. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania znakowanych radioaktywnie znaczników w celu wykrywania dystrybucji PD-L1 w nowotworach za pomocą obrazowania PET.

W porównaniu do swoich L-odpowiedników, prawoskrętne (D)-peptydy mają takie właściwości, jak odporność proteolityczna i niezwykle wydłużony okres półtrwania metabolizmu. W badaniu tym opracowano nową metodę wykrywania ekspresji PD-L1 w oparciu o obrazowanie PET 68znakowanego Ga peptydu D ukierunkowanego na PD-L1, antagonistę D-dodekapeptydu (DPA), u myszy z nowotworem. Wyniki wykazały, że [68Ga]DPA może specyficznie wiązać się z guzami z nadekspresją PD-L1 in vivo i wykazał korzystną stabilność, a także doskonałą zdolność obrazowania, co sugeruje, że [68Ga]DPA-PET jest obiecującym podejściem do oceny statusu PD-L1 w nowotworach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odkrycie białek immunologicznych punktów kontrolnych było przełomem w terapii nowotworów i doprowadziło do znacznych postępów w rozwoju terapii blokady immunologicznego punktu kontrolnego1. Białko programowanej śmierci komórki 1 (PD-1) i ligand programowanej śmierci 1 (PD-L1) są potencjalnymi celami leków z kilkoma przeciwciałami zatwierdzonymi przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA). PD-1 ulega ekspresji przez komórki odpornościowe naciekające nowotwór, takie jak limfocyty T CD4 +, CD8 + i limfocyty T regulatorowe. PD-L1 jest jednym z ligandów PD-1, który ulega nadekspresji w różnych komórkach nowotworowych2,3. Interakcja między PD-1 i PD-L1 inaktywuje PD-1, hamując w ten sposób przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną4. Odkrycia te sugerują, że hamowanie PD-L1 może poprawić efekt zabijania komórek odpornościowych i wyeliminować komórki nowotworowe5. Obecnie immunohistochemia chromogenna (IHC) jest najczęściej stosowanym podejściem do identyfikacji pacjentów, którzy najprawdopodobniej zareagują na terapię immunologicznych punktów kontrolnych6,7. Jednak ze względu na niejednorodną ekspresję PD-L1 w komórkach nowotworowych, wyniki IHC z biopsji nie mogą dostarczyć dokładnych informacji na temat ekspresji PD-L1 u pacjentów8. Poprzednie badania wykazały, że tylko 20%-40% pacjentów uzyskuje długoterminowe korzyści z terapii blokadą immunologicznego punktu kontrolnego1,9,10. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania nowej metody w celu obejścia wyników fałszywie ujemnych spowodowanych niejednorodną ekspresją tych białek immunologicznych punktów kontrolnych.

Technologia obrazowania molekularnego, taka jak pozytonowa tomografia emisyjna (PET), umożliwia wizualizację całego ciała w czasie rzeczywistym w nieinwazyjny sposób, a tym samym może przewyższyć konwencjonalną metodę IHC11,12,13. Znakowane radioizotopowo przeciwciała, peptydy i małe cząsteczki są obiecującymi znacznikami do monitorowania ekspresji PD-L1 u pacjentów z rakiem14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25. FDA zatwierdziła trzy terapeutyczne przeciwciała monoklonalne PD-L1: awelumab, atezolizumab i durwalumab26. Znaczniki immuno-PET oparte na tych przeciwciałach zostały dobrze udokumentowane27,28,29,30,31,32. Badania kliniczne we wczesnej fazie wykazały ograniczoną wartość dla zastosowań klinicznych ze względu na niekorzystną farmakokinetykę30. W porównaniu z przeciwciałami, peptydy wykazują szybszy klirens krwi i narządów ze zdrowych narządów i mogą być łatwo modyfikowane chemicznie33. Odnotowano wiele peptydów o wysokim powinowactwie do PD-1/PD-L12; WL12 jest zgłoszonym peptydem, który wykazuje specyficzne wiązanie z PD-L134. Doniesiono, że znakowane radioizotopem, [64Cu]WL12, [68Ga]WL12 i [18F]FPyWL12, wykazują wysoką zdolność do celowania w nowotwór specyficzny in vivo, co pozwala na zbieranie wysokiej jakości obrazów ekspresji PD-L1 w nowotworach26,35,36,37. Co więcej, pierwsza ocena znakowanego radioaktywnie WL12 na ludziach wykazała, że [68Ga]WL12 (schelatowany przez NOTA) ma bezpieczny i skuteczny potencjał do klinicznego obrazowania nowotworów38. Ze względu na wysoką hydrofobowość i wysoki wychwyt w zdrowej wątrobie, WL12 ma ograniczone zastosowanie kliniczne. Inne peptydy znakowane radioizotopem, takie jak TPP1 i SETSKSF, które specyficznie wiążą się z PD-L1, również wykazały potencjalną stabilność i swoistość w wizualizacji ekspresji PD-L1 w całym ciele39,40. Jednak niezmodyfikowane peptydy są łatwo degradowane przez proteazy i są szybko metabolizowane przez nerki. Peptydy prawoskrętne(D)-są szeroko stosowane jako skuteczne mediatory, ze względu na słabą stabilność lewoskrętnych (L)-peptydów41,42,43. Peptydy D są hiperodporne na degradację proteolityczną i znacznie wydłużają okres półtrwania metabolizmu. W porównaniu ze swoimi L-odpowiednikami, peptydy D w większości wykazują specyficzne zdolności wiązania44,45,46.

To badanie zaprojektowało nową metodę wykrywania ekspresji PD-L1, opartą na obrazowaniu PET znakowanego 68Ga PD-L1 D-peptydu, antagonisty D-dodekapeptydu (DPA), w modelu myszy z nowotworem47. Stabilność [68Ga]DPA po raz pierwszy badano w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i surowicy myszy, po czym zbadano powinowactwo wiązania [68Ga]DPA w guzach z nadekspresją PD-L1. Następnie przeprowadzono obrazowanie PET w modelach ksenoprzeszczepów glejaka, aby potwierdzić, czy [68Ga]DPA jest idealnym znacznikiem PET do monitorowania ekspresji PD-L1 w nowotworach. Połączenie obrazowania PET i DPA nie tylko zapewnia nowe podejście do przezwyciężania wyzwań związanych z niejednorodną ekspresją PD-L1, ale także stanowi podstawę do opracowania radioznaczników na bazie peptydu D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury eksperymentalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Nankinie lub Narodowe Instytuty Nauki i Technologii Kwantowej. Eksperymenty na myszach były ściśle przeprowadzane zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Laboratoryjnych.

1. Synteza peptydów

  1. Pęcznieć 100 mg żywicy 4-metylobenzhydrylaminy (MBHA) (zdolność ładowania 0,37 mmol/g) w 1 ml N-metylo-2-pirolidonu (NMP) przez 30 minut pod łagodnym bulgotaniemN2.
  2. Przygotuj świeży bufor podstawowy składający się z aminokwasów chronionych Fmoc (5,0 equiv), HCTU (4,9 equiv) i DIPEA (10,0 equiv) w 1 ml NMP i dodaj do żywicy (100 mg). Pozwól, aby reakcja sprzęgania postępowała przez 1,5-2 godziny.
  3. Przygotować bufor deprotekcyjny składający się z 50% (vol/vol) morfoliny w NMP. Przemyć żywicę (100 mg) 2 x 30 minut 1 ml buforu odbezpieczającego w każdym płukaniu, aby usunąć grupę Fmoc z grupy aminowej. Płukać żywicę dichlorometanem (DCM; 1 ml) przez 1 minutę, usunąć DCM i ponownie przemyć żywicę NMP (1 ml) przez kolejną 1 minutę. Następnie usuń NMP i ponownie umyj żywicę DCM przez 1 min.
    UWAGA: Wszystkie procedury prania przeprowadza się przy łagodnym bulgotaniu azotu2. Powyższe procedury powtarza się aż do ostatniego aminokwasu.
  4. W celu dodania kwasu 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraoctowego (DOTA) do peptydu, należy wstępnie aktywować DOTA chlorowodorkiem N-(3-dimetyloaminopropylo)-N-etylokarbodimidu (EDC·HCl) i N-hydroksysukcynimidem (NHS). Inkubować bufor podstawowy DOTA/EDC·HCl/NHS w stosunku molowym 1:1:1 w dimetylosulfotlenku (DMSO) przez 3 godziny, przy końcowym stężeniu DOTA 1 M. Następnie dodać bufor podstawowy (1 ml) do żywicy (100 mg) i pozostawić reakcję do przebiegu przez 2 godziny z delikatnym bulgotaniemN2.
    UWAGA: Kwas 1,4,7-triazacyklononano-1,4,7-trioctowy (NOTA) może być również stosowany jako chelator do kompleksowania 68Ga. Te same procedury można zastosować w przypadku sprzężenia NOTA.
  5. Dokładnie spłucz żywicę od góry za pomocą DCM i jednocześnie zastosuj próżnię, aby usunąć resztki roztworu reakcyjnego. Wypłucz żywicę 3x za pomocą DCM (1,5 ml), a następnie spłucz MeOH (1,5 ml), aby skurczyć żywicę. Umieść żywicę pod azotem na noc lub pod wysoką próżnią przez co najmniej 4 godziny, aż żywica wyschnie.
  6. Wysuszoną żywicę zawierającą peptydy DPA umieścić w polipropylenowym pojemniku o pojemności 2 ml z zakrętką. Dodać odpowiedni koktajl rozszczepialny (95/2,5/2,5 TFA/TIS/H2O objętości; 1 ml/100 mg żywicy) i szczelnie zamknąć pojemnik za pomocą zakrętki. Delikatnie mieszać reakcję na wytrząsarce orbitalnej w dygestorium w temperaturze 20-25 °C przez 2 h.
    UWAGA: Kwas trifluorooctowy (TFA) należy przygotować w dygestoriach w odzieży ochronnej, ze względu na jego silnie charakter.
  7. Usunąć większość TFA przez odparowanie pod azotem w dygestorium. Wytrącić peptydy, dodając eter dietylowy (~1,5 ml/100 mg żywicy).
  8. Zmieszać mieszaninę w celu rozprowadzenia peptydów i odwirować w temperaturze pokojowej (10 000 × g, 5 min). Ostrożnie wylej rozpuszczalnik z pojemnika. Powtórz kroki 1.7-1.8.
  9. Pozostałość suszyć na powietrzu w otwartym pojemniku przez 10 minut. Dodać 50% (obj./obj.) wodnego acetonitrylu i wirować przez 1-2 s do rozpuszczenia produktów (1 ml/100 mg żywicy).
  10. Usuń żywicę, filtrując mieszaninę, a następnie umyj żywicę 2x za pomocą 0,2 ml 50% (obj./obj.) wodnego roztworu acetonitrylu. Wymieszać filtraty do oczyszczania metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Należy użyć następujących warunków HPLC. Kolumna: YMC-Triat-C18 (średnica wewnętrzna 4,6 mm [i.d.], 150 mm, 5 mm); gradient rozpuszczalnika: rozpuszczalnik A-woda dejonizowana; rozpuszczalnik B-acetonitryl (0,1% TFA); czas przepływu: 20 min, z acetonitrylem od 10% do 90%; przepływ: 1 mL/min.
  11. Zebrane eluenty HPLC zamrozić przez noc w temperaturze -80 °C i poddać liofilizacji (-50 °C i <1 pa). W celu znakowania promieniotwórczego należy rozpuścić stały peptyd w buforze octanu sodu (100 mM, pH 5,0) w końcowym stężeniu 1 mg/ml jako bufor podstawowy.

2. Radioznakowanie 68Ga

UWAGA 68Ga zostało wygenerowane wewnętrznie w Pierwszym Szpitalu w Nankinie (Nanjing, Chiny) przy użyciu generatora 68Ge/68Ga.

  1. Odpipetować 5 μl buforu wyjściowego do 1,5 ml polipropylenowego pojemnika z zakrętką. Dodać 200 MBq [68Ga]GaCl3 (400 μL) do pojemnika.
  2. Wiruj mieszaninę przez 5 s. Zmierz pH za pomocą pasków testowych pH. Doprowadzić pH do 4-4,5 za pomocą NaOH (0,1 M).
    UWAGA: Odpowiednie pH ma kluczowe znaczenie dla kompleksowania między 68Ga i DOTA.
  3. Roztwór inkubować w temperaturze pokojowej przez 5-10 minut. Mieszaninę reakcyjną poddać działaniu radio-HPLC w celu analizy wydajności znakowania radioizotopowego w następujących warunkach: kolumna: YMC-triat-C18 (średnica wewnętrzna 4,6 mm, 150 mm, 5 mm); gradient rozpuszczalnika: rozpuszczalnik A-woda dejonizowana; rozpuszczalnik B-acetonitryl (0,1% TFA); czas przepływu: 20 min, z acetonitrylem od 10% do 90%; natężenie przepływu: 1 ml/min.
    UWAGA: Radioaktywna chromatografia cienkowarstwowa (TLC) może być stosowana jako alternatywne podejście do badania wydajności znakowania radioaktywnego. Sugerowany bufor elucyjny TLC to 0,1 M Na3C6H5O7, pH 4.

3. Test stabilności znacznika

  1. Test stabilności znacznika w PBS
    1. Dodać [68Ga]DPA (10 μL, 3,7 MBq, w NaOAc) do PBS (990 μL). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1, 2 i 4 godziny z lekkim mieszaniem.
    2. Zebrać 200 μl roztworu w każdym punkcie czasowym. Wstrzyknąć go do radio-HPLC w celu analizy.
  2. Stabilność znacznika w surowicy myszy
    1. Dodaj [68Ga]DPA (10 μL, ~3,7 MBq, w NaOAc) do surowicy myszy (90 μL, świeżo przygotowanej). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1, 2 i 4 godziny z lekkim mieszaniem.
    2. Zebrać 20 μl roztworu w każdym punkcie czasowym. Dodać MeCN i wodę (100 μL, 1:1, v/v).
    3. Odwirować mieszaninę przez 10 minut (5 000 × g, 25 °C). Analizować supernatant za pomocą radio-HPLC.

4. Analiza ekspresji PD-L1 za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Przygotować pożywkę, uzupełniając pożywkę RPMI-1640 10% (obj./obj.) płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny-streptomycyny (obj./obj.). Ponownie zawiesić komórki U87MG w pożywce hodowlanej i wysiać na 12-dołkowych płytkach o gęstości10-5 komórek/dołek. Umieścić komórki w inkubatorze (5% CO2, 37 °C) i hodować je przez co najmniej 24 godziny, nie zakłócając spokoju.
  2. Umyj komórki 0,5 ml PBS i dodaj 250 μl trypsyny-EDTA (0,25%). Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze (5% CO2, 37 °C) na 2 minuty.
  3. Dodaj 1 ml pożywki hodowlanej, aby zatrzymać dysocjację komórek. Dodaj pożywkę do komórek, aby odłączyć je od szalek, pipetując w górę iw dół, a następnie zebrać je do probówek o pojemności 1,5 ml. Odwirowywać komórki przez 5 minut (100 × g).
  4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS. Odwirowywać komórki przez 5 minut (100 × g). Powtórz ten krok jeszcze raz.
  5. Rozcieńczyć przeciwciało PD-L1 sprzężone z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) z 3% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) do 20 nmol/l. Dodać do komórek i inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
  6. Odwirować komórki przez 5 minut (100 × g), a następnie dwukrotnie przemyć zimnym PBS. Analizuj komórki PD-L1-dodatnie za pomocą cytometru przepływowego i oprogramowania do analizy.

5. Immunocytochemia

  1. Umieść komórki U87MG w szklanych szalkach do hodowli komórek (35 mm) o gęstości 2,5 × 105 komórek na dołek. Po osiągnięciu 60% zbiegu należy odessać pożywkę hodowlaną i dodać 1 ml PBS. Delikatnie wstrząśnij kilka razy i aspiruj. Wykonaj krok prania 3x.
  2. Do potraw dodać 500 μl 4% paraformaldehydu. Umieść komórki w temperaturze pokojowej i utrwal na 30 minut.
  3. Umyj komórki 3x PBS. Dodać 1 ml 3% BSA (wag./obj., w PBS) i zablokować utrwalone komórki na 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  4. Usunąć 3% BSA i bezpośrednio inkubować komórki z pierwszorzędowym przeciwciałem anty-PD-L1 (mAb,1:100, rozcieńczonym w 3% BSA) przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Po zablokowaniu komórek za pomocą BSA nie myć PBS.
  5. Umyj komórki 3x 3% buforem BSA. Inkubować komórki z przeciwciałem anty-ludzkim IgG Fc sprzężonym z FITC (1:500, rozcieńczonym w PBS) przez 1 godzinę.
  6. Umyj komórki 3x PBS. Dodać 0,5 ml DAPI (1 μg/ml) do komórek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Przemyj wybarwione komórki 3x PBS i obserwuj za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego.

6. Eksperyment z wychwytem i hamowaniem komórkowym

  1. Eksperyment z wychwytem komórkowym
    1. Hoduj komórki U87MG na płytkach 12-dołkowych, aż do osiągnięcia 80% konfluencji. Usuń pożywkę i przemyj komórki 0,5 ml PBS.
    2. Rozcieńczyć [68Ga]DPA w świeżej pożywce do stężenia 74 KBq/ml. Dodać 0,5 ml rozcieńczonego buforu [68Ga]DPA do każdego dołka.
    3. Inkubować komórki z [68Ga]DPA w temperaturze 37 °C przez różne okresy czasu (10, 30, 40 i 120 min). Odessać pożywkę za pomocą pipety. Umyj komórki PBS (0,5 ml) trzy razy.
    4. Dodać roztwór NaOH (0,5 M, 300 μl na studzienkę) w celu lizy komórek. Po 30 s zbierz lepkie lizaty komórkowe w probówkach o pojemności 1,5 ml.
    5. Umyj płytkę dwukrotnie 0,4 ml PBS. Zebrać roztwór myjący do powyższej probówki o pojemności 1,5 ml.
    6. Uruchom wbudowany komputer automatycznego licznika gamma; włóż lampy do wbudowanej półki. Po załadowaniu wszystkich próbek na przenośnik należy nacisnąć przycisk START. Wyniki są obliczane w wewnętrznym oprogramowaniu. Odczyt rejestruje skorelowaną z rozpadem liczbę na minutę (CPM) każdej probówki.
  2. Konkurencyjny test wiązania
    1. Hoduj komórki U87MG na płytkach 12-dołkowych, aż do osiągnięcia 80% konfluencji. Usuń pożywkę i przemyj komórki 0,5 ml PBS.
    2. Rozcieńczyć [68Ga]DPA w świeżej pożywce do stężenia 74 KBq/ml. Rozpuść odpowiednią ilość związków BMS202 w 10% DMSO, aby uzyskać stężenie 10 mM (400 μL).
    3. Rozcieńczyć 4 μl 10 mM BMS202 w 396 μl PBS, aby uzyskać stężenie 100 μM. Powtórzyć ten krok, aby uzyskać różne stężenia BMS202 (1 μM, 10 nM, 100 pM i 1 pM).
    4. Dodać 0,5 ml rozcieńczonego buforu [68Ga]DPA do każdego dołka (0,37 MBq na studzienkę). Dodać 5 μl roztworów BMS202 do każdego dołka (trzy dołki dla każdego stężenia). Inkubować komórki w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C przez 120 minut.
    5. Odessać pożywkę za pomocą pipety. Umyj komórki 3 x 0,5 ml PBS.
    6. Dodać roztwór NaOH (0,5 M, 300 μl na studzienkę) w celu lizy komórek. Po 30 s zebrać lepkie lizaty komórkowe do probówek o pojemności 1,5 ml. Umyj płytkę 2 x 0,4 ml PBS.
    7. Zebrać roztwór myjący do powyższej probówki o pojemności 1,5 ml. Włóż probówki do wbudowanej półki automatycznego licznika gamma.
    8. Postępuj zgodnie z tymi samymi procedurami, co w kroku 6.1.6.

7. Obrazowanie PET

UWAGA: Wykonaj obrazowanie PET małych zwierząt, używając mikro skanera PET, który dostarcza 159 poprzecznych przekrojów osiowych oddalonych od siebie o 0,796 mm (od środka do środka), z poziomym polem widzenia 10 cm i osiowym polem widzenia 12,7 cm. Wszystkie dane zebrane w trybie listy są zorganizowane w trójwymiarowe sinogramy. Fourier jest następnie ponownie składany w dwuwymiarowe sinogramy (klatka × min: 4 × 1, 8 × 2, 8 × 5).

  1. W tym badaniu wykorzystano samce, 5-8-tygodniowe nagie myszy BALB/C. Zebrać komórki U87MG wykonując kroki 4.1-4.4 i odessać komórki do strzykawki o pojemności 0,5 ml. Podskórnie wstrzyknąć komórki myszom (1 × 106 komórek na guz, dwa guzy na mysz). Monitoruj wzrost guza po wstrzyknięciu, aż objętość guza osiągnie 100-300 mm3.
  2. Znieczulenie myszy za pomocą 1%-2% (v/v) izofluranu (1 ml/min). Włącz urządzenie grzewcze i utrzymuj legowisko dla zwierząt z PET w temperaturze 37 °C.
  3. Umieść znieczulone myszy we właściwej pozycji na łóżku zwierzęcym maszyny PET. Nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
    UWAGA: Trzymaj myszy w pozycji leżącej, aby uniknąć śmierci podczas skanowania. Podczas całego procesu obrazowania należy podać przepływ izofluranu (1,0 ml/min) przez nos za pomocą wstępnie zainstalowanej rurki.
  4. Dostosuj pozycję legowiska dla zwierząt za pomocą panelu sterowania. Znaczniki należy wstrzyknąć dożylnie przez fabrycznie zainstalowany cewnik do żyły ogonowej.
  5. Utwórz przepływ pracy skanowania na komputerze hosta przy użyciu odpowiedniego oprogramowania (patrz Spis materiałów) Utwórz folder badania i ustaw protokół akwizycji zgodnie z protokołem producenta. Wykonuj skanowanie dynamiczne (60 minut dla każdej myszy) na wszystkich myszach w trybie listy 3D.
  6. Zdefiniuj protokół histogramu i protokół rekonstrukcji zgodnie z protokołem producenta. Użyj filtra Hanninga z odcięciem Nyquista wynoszącym 0,5 cyklu/piksel, aby zrekonstruować dynamiczne obrazy PET (25-30 min i 55-60 min) za pomocą filtrowanej projekcji wstecznej. Generuj obrazy projekcji o maksymalnej intensywności (MIP) dla wszystkich myszy.
  7. Łączenie protokołów w przepływ pracy i uruchamianie przepływu pracy. Analizuj wynikowe obrazy trójwymiarowe za pomocą oprogramowania, postępując zgodnie z protokołem producenta.
    UWAGA: Użyj oprogramowania symulacyjnego, aby wybrać interesujące Cię woluminy. Radioaktywność jest korygowana pod kątem rozpadu do czasu wstrzyknięcia i przedstawiana jako procent całkowitej dawki iniekcyjnej na gram tkanki (% ID/g).

8. Biodystrybucja ex vivo

  1. Podaj [68Ga]DPA (1,85 MBq/100 μL) nagim myszom z BALB/C noszącym U87MG poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej. Znieczulić myszy za pomocą 1%-2% (v/v) izofluranu (1 ml / min), a następnie uśmiercić trzy myszy przez zwichnięcie szyjki macicy po wstrzyknięciu przez 5, 30, 60 i 120 min.
    UWAGA: Osoby demonstrujące tę procedurę powinny być przeszkolone w zakresie technicznych umiejętności zwichnięcia szyjki macicy, aby zapewnić szybką utratę przytomności. Zapewni to, że wszystkie procedury eutanazji w tym eksperymencie zostaną przeprowadzone w sposób humanitarny.
  2. Po potwierdzeniu śmierci otwórz ścianę klatki piersiowej myszy. Następnie otwórz serce. Użyj strzykawki o pojemności 1 ml, aby pobrać krew; Wycisnąć krew ze strzykawki do probówki do testu radioimmunologicznego (RIA) (o średnicy 13 mm) do licznika gamma.
  3. Wytnij główne narządy i guzy i umieść je w probówkach RIA (o średnicy 13 mm) do licznika gamma. Główne narządy obejmują krew ogółem, serce, grasicę, wątrobę, śledzionę, kości, żołądek, nerki, mięśnie, węzły chłonne jelitowe, jelito cienkie, trzustkę, jądra, mózg i płuca. Zważ wszystkie narządy.
  4. Zmierz radioaktywność w pobranych narządach za pomocą licznika autogamma i skoryguj wartości w fazie rozpadu. Obliczyć procent wstrzykniętej dawki na gram mokrej tkanki (% ID/g).

9. Immunohistochemia

  1. Zbierz tkanki glejaka i umyj je 3x PBS. Umieść świeże chusteczki w 4% paraformaldehydzie i utrwal na noc w temperaturze 4 °C.
  2. Utrwalone tkanki zanurzyć w parafinie i pokroić je na kawałki o grubości 10 μm. Umieścić skrawki w inkubatorze (60 °C) i inkubować przez 2 godziny. Odwoskować i uwodnić skrawki przez inkubację przez 10 minut każda w następujący sposób: ksylen (dwukrotnie), alkohol bezwodny, 95% alkoholu, 90% alkoholu, 80% alkoholu, 75% alkoholu.
  3. Umieścić skrawki w 0,01 M roztworze cytrynianu sodu i podgrzać je do temperatury 92-95 °C. Utrzymać temperaturę przez 40 minut, aby uzyskać pobranie antygenu.
  4. Dodać 200 μl roztworuH2O2(3%) do skrawków i dezaktywować endoperoksydazy przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Zablokuj niespecyficzne miejsca poprzez traktowanie 3% BSA przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  5. Inkubować skrawki w pierwszorzędowym przeciwciałie anty-PD-L1 (mAb, 1:100, rozcieńczony w 3% BSA) przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Po zablokowaniu za pomocą BSA nie myć PBS.
  6. Umyj sekcje 3x PBS. Inkubować skrawki z kozim przeciwciałem wtórnym przeciwko królikom znakowanym HRP (1:500, rozcieńczonym w PBS) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  7. Umyj komórki 3x PBS. Dodać 200 μl roztworu roboczego 3,3-diaminobenzydyny (DAB) (roztwór A: roztwór B: roztwór C = 1:1:18) do sekcji i inkubować przez 5 minut w ciemności.
  8. Umyj sekcje 3x PBS. Dodać 500 μl roztworu hematoksyliny (100%) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Umyj sekcje wodą przez 30 s. Skrawki umieścić w roztworze różnicującym (75% alkoholu:HCL = 99:1) przez 30 s. Umyj sekcje wodą przez 1 min.
  9. Odwodnić próbki, sekwencyjnie inkubując je z 75% alkoholem, 80% alkoholem, 90% alkoholem, 95% alkoholem, alkoholem absolutnym i ksylenem (dwukrotnie) (10 min każda). Zamontuj wszystkie sekcje za pomocą żywicy neutralnej i obserwuj je pod mikroskopem optycznym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

[68Ga]Radioznakowanie DPA i stabilność
Modelowy peptyd DPA jest skutecznym antagonistą PD-L1. DOTA-DPA uzyskano o czystości >95% i wydajności 68%. Masa DOTA-DPA jest eksperymentalnie obserwowana na poziomie 1 073,3 ([M+2H]2+). 68 RozdziałGal jest uważany za odpowiedni radionuklid do znakowania peptydów do obrazowania PET i dlatego został wybrany do tego badania. Do znakowania radioaktywnego DPA za pomocą 68Ga (okres półt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krytyczne kroki opisane w tej metodzie obejmują skuteczne znakowanie 68Ga do DPA i wybór odpowiedniego okna czasowego do obrazowania PET, które musi idealnie pasować do wzorca farmakodynamicznego DPA w guzie.

W przeciwieństwie do IHC, obrazowanie PET umożliwia wykrywanie ekspresji PD-L1 w całym ciele w sposób nieinwazyjny, umożliwiając wizualizację każdego dodatniego obszaru w heterogenicznym guzie 6,7. Peptydy wybrano jako ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie deklaruje się żadnych sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Non-profit Fundusz Centralnego Instytutu Badawczego Chińskiej Akademii Nauk Medycznych (nr 2022-RC350-04) oraz Fundusz Innowacji CAMS dla Nauk Medycznych (nr 2021-I2M-1-026, 2022-I2M-1-026-1, 02120101, 02130101 i 2022-I2M-2-002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraoctowy (DOTA)Merck60239-18-168Ga  chelatacja
3,3-diaminobenzydyny (DAB) ZestawSigma-AldrichD7304-1SETImmunohistochemia
przeciwciało monoklonalne anty-PD-L1Wuhan Proteintech17952-1-apImmunohistochemia: przeciwciało pierwotne
BMS202Selleck1675203-84-5Kompetycyjny test wiązania: inhibitor
BSAMerckV900933Immunofluorescencyjny : blokowanie 
DAPIMerckD9542Immunofluorescencyjny: barwienie jądra
Dichlorometan (DCM)Merck34856Rozpuszczalnik
DIPEAMerck3439Sprzężenie peptydowe
EDC· HClMerckE6383Aktywacja DOTA
FBSGibco10099Hodowla komórkowa: suplement
FITC-sprzężone przeciwciało anty-ludzkie IgG FcBiolegend409310Immunofluorescencyjne: przeciwciało drugorzędowe
Przeciwciało anty PD-L1 sprzężone z FITCBiolegend393606Cytometria przepływowa: przeciwciało bezpośrednie
HCTUEnergy ChemicalE070004-25gSprzężenie peptydowe
Przeciwciało przeciw królikowi znakowane HRPServicebioGB23303Immunohistochemia: przeciwciało drugorzędowe
Hydroksysukcynimid (NHS)Merck130672Aktywacja DOTA
MeCNMerckPHR1551Rozpuszczalnik
MorpholineMerck8.06127Fmoc- deprotekcja
NMPMerck8.06072Solevent
ParaformaldehydMerck30525-89-4Utrwalanie tkanek
PBSGibco10010023Hodowla komórkowa: bufor
Penicylina-streptomycyna Gibco10378016Hodowla komórkowa: suplement
RIA probówkaPolyLabP10301AJako pojemnik na próbkę tkanki
RPMI-1640 podłożeGibco11875093Hodowla komórkowa: podłoże podstawowe
Octan soduMerck1.06264Sól do buforu
Trypsyna-EDTAGibco25200056Hodowla komórkowa: środek dysocjacyjny
U87MG linia komórkowaProcell Nauki przyrodnicze & Technology CoCL-0238Model komórki
Equipment
68Ge/68GaIsotope Technologies Monachium, ITMNie dotyczyGeneracja [68Ga]
Autogamma licznikPerkin Elmer Wizard2Wykrywanie promieniotwórczości
Konfokalna mikroskopia fluorescencyjnaKeyence Obserwacjawyników immunofluorescencyjnych
Cytometr przepływowyBecton Dickinson, BDLSRIIMonitorowanie komórek PD-L1 dodatnich
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)SHIMAZULC-20AT Oczyszczanie peptydu DPA
Skaner PETSiemens Medical SolutionsInveon MultiModality System ObrazowaniePET
Mikroskopia optycznaNikon Eclipse E100Obserwacja wyników immunohistochemii
Syntezator peptydów w fazie stałejPromega Vac-Man Laboratoryjny kolektor próżniowyLOT#11101Synteza peptydu DPA-DOTA
Software
ASIProSiemens Medical SolutionsNie dotyczyAnaliza wyników PET-CT
FlowJoBecton Dickinson, BDFlowJo 7.6.1Analiza wyników cytometru przepływowego
Inveon Acquisition Workplace (IAW)Siemens Medical SolutionsNie dotyczyZarządzanie mechine PET
PrismGraphpad Prism8.0Analiza danych 

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doroshow, D. B., et al. PD-L1 as a biomarker of response to immune-checkpoint inhibitors. Natire Reviews Clinical Oncology. 18 (6), 345-362 (2021).
  2. Krutzek, F., Kopka, K., Stadlbauer, S. Development of radiotracers for imaging of the PD-1/PD-L1 axis. Pharmaceuticals. 15 (6), 747(2022).
  3. Topalian, S. L., Drake, C. G., Pardoll, D. M. Immune checkpoint blockade: a common denominator approach to cancer therapy. Cancer Cell. 27 (4), 450-461 (2015).
  4. Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
  5. Xiao, Z., et al. PEIGel: A biocompatible and injectable scaffold with innate immune adjuvanticity for synergized local immunotherapy. Materials Today Bio. 15, 100297(2022).
  6. Teng, M. W. L., Ngiow, S. F., Ribas, A., Smyth, M. J. Classifying cancers based on T-cell infiltration and PD-L1. Cancer Research. 75 (11), 2139-2145 (2015).
  7. Dolled-Filhart, M., et al. Development of a companion diagnostic for pembrolizumab in non-small cell lung cancer using immunohistochemistry for programmed death ligand-1. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 140 (11), 1243-1249 (2016).
  8. Meng, X. J., Huang, Z. Q., Teng, F. F., Xing, L. G., Yu, J. M. Predictive biomarkers in PD-1/PD-L1 checkpoint blockade immunotherapy. Cancer Treatment Reviews. 41 (10), 868-876 (2015).
  9. Hakozaki, T., Hosomi, Y., Kitadai, R., Kitagawa, S., Okuma, Y. Efficacy of immune checkpoint inhibitor monotherapy for patients with massive non-small-cell lung cancer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 146 (11), 2957-2966 (2020).
  10. Haslam, A., Prasad, V. Estimation of the percentage of US patients with cancer who are eligible for and respond to checkpoint inhibitor immunotherapy drugs. Jama Network Open. 2 (5), 192535(2019).
  11. Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S. Molecular imaging in drug development. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (7), 591-607 (2008).
  12. Zhang, L., et al. Recent developments on PET radiotracers for TSPO and their applications in neuroimaging. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (2), 373-393 (2021).
  13. Sun, J., et al. Imaging-guided targeted radionuclide tumor therapy: From concept to clinical translation. Advanced Drug Delivery Reviews. 190, 114538(2022).
  14. Xu, M., et al. Preclinical study of a fully human Anti-PD-L1 antibody as a theranostic agent for cancer immunotherapy. Molecular Pharmaceutics. 15 (10), 4426-4433 (2018).
  15. Niemeijer, A. N., et al. Whole body PD-1 and PD-L1 positron emission tomography in patients with non-small-cell lung cancer. Nature Communications. 9 (1), 4664(2018).
  16. Mayer, A. T., et al. Practical immuno-PET radiotracer design considerations for human immune checkpoint imaging. Journal of Nuclear Medicine. 58 (4), 538-546 (2017).
  17. Lv, G., et al. PET Imaging of tumor PD-L1 expression with a highly specific nonblocking single-domain antibody. Journal of Nuclear Medicine. 61 (1), 117-122 (2020).
  18. Li, D., et al. Immuno-PET imaging of 89Zr labeled anti-PD-L1 domain antibody. Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1674-1681 (2018).
  19. Lesniak, W. G., et al. PD-L1 detection in tumors using [(64)Cu]Atezolizumab with PET. Bioconjugate Chemistry. 27 (64), 2103-2110 (2016).
  20. Kristensen, L. K., et al. CD4(+) and CD8a(+) PET imaging predicts response to novel PD-1 checkpoint inhibitor: studies of Sym021 in syngeneic mouse cancer models. Theranostics. 9 (26), 8221-8238 (2019).
  21. Christensen, C., Kristensen, L. K., Alfsen, M. Z., Nielsen, C. H., Kjaer, A. Quantitative PET imaging of PD-L1 expression in xenograft and syngeneic tumour models using a site-specifically labelled PD-L1 antibody. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 47 (5), 1302-1313 (2020).
  22. Bensch, F., et al. 89Zr-atezolizumab imaging as a non-invasive approach to assess clinical response to PD-L1 blockade in cancer. Nature Medicine. 24 (12), 1852-1858 (2018).
  23. Gonzalez Trotter, D. E., et al. In vivo imaging of the programmed death ligand 1 by 18F PET. Journal of Nuclear Medicine. 58 (11), 1852-1857 (2017).
  24. Lv, G., et al. Promising potential of a 18F-labelled small-molecular radiotracer to evaluate PD-L1 expression in tumors by PET imaging. Bioorganic Chemistry. 115, 105294(2021).
  25. Miao, Y., et al. One-step radiosynthesis and initial evaluation of a small molecule PET tracer for PD-L1 imaging. Bioorganic & Medicinal Chemical Letters. 30 (24), 127572(2020).
  26. Kumar, D., et al. Peptide-based PET quantifies target engagement of PD-L1 therapeutics. The Journal of Clinical Investigation. 129 (2), 616-630 (2019).
  27. Powles, T., et al. MPDL3280A (anti-PD-L1) treatment leads to clinical activity in metastatic bladder cancer. Nature. 515 (7528), 558-562 (2014).
  28. Herbst, R. S., et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature. 515 (7528), 563-567 (2014).
  29. Marciscano, A. E., Gulley, J. L. Avelumab demonstrates promise in advanced NSCLC. Oncotarget. 8 (61), 102767-102768 (2017).
  30. Vaddepally, R. K., Kharel, P., Pandey, R., Garje, R., Chandra, A. B. Review of indications of FDA-approved immune checkpoint inhibitors per NCCN guidelines with the level of evidence. Cancers. 12 (3), 738(2020).
  31. Antonia, S. J., et al. Durvalumab after chemoradiotherapy in stage III non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 377 (20), 1919-1929 (2017).
  32. Wang, D. Y., et al. Fatal toxic effects associated with immune checkpoint inhibitors: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 4 (12), 1721-1728 (2018).
  33. Sgouros, G., Bodei, L., McDevitt, M. R., Nedrow, J. R. Radiopharmaceutical therapy in cancer: clinical advances and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (9), 589-608 (2020).
  34. (US) M. M. M, et al. Macrocyclic inhibitors of the pd-1/pd-l1 and cd80(b7-1)/pd-l1 protein/protein interactions. United States patent. , US-2017260237-A1 (2014).
  35. Chatterjee, S., et al. Rapid PD-L1 detection in tumors with PET using a highly specific peptide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 258-263 (2017).
  36. De Silva, R. A., et al. Peptide-based 68Ga-PET radiotracer for imaging PD-L1 expression in cancer. Molecular Pharmaceutics. 15 (9), 3946-3952 (2018).
  37. Lesniak, W. G., et al. Development of [18F]FPy-WL12 as a PD-L1 specific PET imaging peptide. Molecular Imaging. 18, 1536012119852189(2019).
  38. Zhou, X., et al. First-in-humans evaluation of a PD-L1-binding peptide PET radiotracer in non-small cell lung cancer patients. Journal of Nuclear Medicine. 63 (4), 536-542 (2022).
  39. Hu, K., et al. Developing native peptide-based radiotracers for PD-L1 PET imaging and improving imaging contrast by pegylation. Chemical Communications. 55 (29), 4162-4165 (2019).
  40. Liu, H., et al. A novel small cyclic peptide-based 68Ga-Radiotracer for positron emission tomography imaging of PD-L1 expression in tumors. Molecular Pharmaceutics. 19 (1), 138-147 (2022).
  41. Rabideau, A. E., Pentelute, B. L. A D-amino acid at the N-terminus of a protein abrogates its degradation by the N-end rule pathway. ACS Central Science. 1 (8), 423-430 (2015).
  42. Uppalapati, M., et al. A potent D-protein antagonist of VEGF-A is nonimmunogenic, metabolically stable, and longer-circulating in vivo. ACS Chemical Biology. 11 (4), 1058-1065 (2016).
  43. Garton, M., et al. Method to generate highly stable D-amino acid analogs of bioactive helical peptides using a mirror image of the entire PDB. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1505-1510 (2018).
  44. Jia, F. J., et al. D-amino acid substitution enhances the stability of antimicrobial peptide polybia-CP. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (10), 916-925 (2017).
  45. Carmona, G., Rodriguez, A., Juarez, D., Corzo, G., Villegas, E. Improved protease stability of the antimicrobial peptide Pin2 substituted with D-amino acids. Protein Journal. 32 (6), 456-466 (2013).
  46. Feng, Z., Xu, B. Inspiration from the mirror: D-amino acid containing peptides in biomedical approaches. Biomolecular Concepts. 7 (3), 179-187 (2016).
  47. Hu, K., et al. Whole-body PET tracking of a d-dodecapeptide and its radiotheranostic potential for PD-L1 overexpressing tumors. Acta Pharmaceutica Sinica. B. 12 (3), 1363-1376 (2022).
  48. Qiu, X. Y., et al. PD-L1 confers glioblastoma multiforme malignancy via Ras binding and Ras/Erk/EMT activation. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864, 1754-1769 (2018).
  49. Hu, K., et al. Development of a stable peptide-based PET tracer for detecting CD133-expressing cancer cells. ACS Omega. 7 (1), 334-341 (2021).
  50. Jin, Z. -H., et al. Radiotheranostic agent 64Cu-cyclam-RAFT-c(-RGDfK-)4 for management of peritoneal metastasis in ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 26 (23), 6230-6241 (2020).
  51. Hu, K., et al. Harnessing the PD-L1 interface peptide for positron emission tomography imaging of the PD-1 immune checkpoint. RSC Chemical Biology. 1 (4), 214-224 (2020).
  52. Hu, K., et al. PET imaging of VEGFR with a novel 64Cu-labeled peptide. ACS Omega. 5 (15), 8508-8514 (2020).
  53. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  54. Zhao, J., et al. Concurrent injection of unlabeled antibodies allows positron emission tomography imaging of programmed cell death ligand 1 expression in an orthotopic pancreatic tumor model. ACS Omega. 5 (15), 8474-8482 (2020).
  55. Moroz, A., et al. A preclinical assessment of 89Zr-atezolizumab identifies a requirement for carrier added formulations not observed with 89Zr-C4. Bioconjugate Chemistry. 29 (10), 3476-3482 (2018).
  56. Nedrow, J. R., et al. Imaging of programmed cell death ligand 1: impact of protein concentration on distribution of anti-PD-L1 SPECT agents in an immunocompetent murine model of melanoma. Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1560-1566 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Znak znacznikowy PET z galem 68obrazowanie D peptydamiekspresja PD L1punkt kontrolny uk adu odporno ciowegoobrazowanie guzapeptyd znakowany promieniotw rczoobrazowanie PETcytometria przep ywowaimmunohistochemiabiodystrybucja w guzie

Powiązane artykuły