Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja i charakterystyka całego genomu RNA SARS-CoV-2 w próbkach ścieków i powietrza

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65053

⸱

30 czerwca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Sustainable Processes, University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology, University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology, National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS - School of Medicine and Biomedical Sciences, Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit), Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół ma na celu ilościowe określenie RNA SARS-CoV-2 w próbkach ścieków i powietrza, które mają być wykorzystane do badań epidemiologicznych opartych na ściekach oraz ocenę ryzyka narażenia na SARS-CoV-2 w aerozolach wewnątrz i na zewnątrz. Protokół ten opisuje również podejście do sekwencjonowania długiego szablonu amplikonu w celu charakterystyki całego genomu SARS-CoV-2.

Streszczenie

Epidemiologia oparta na ściekach okazała się obiecującym i skutecznym systemem nadzoru nad SARS-CoV-2 i innymi chorobami zakaźnymi w wielu krajach. Proces ten zazwyczaj obejmuje zagęszczanie ścieków, ekstrakcję kwasów nukleinowych, amplifikację wybranych segmentów genomu oraz wykrywanie i kwantyfikację amplifikowanego segmentu genomu. Metodologia ta może być również wykorzystana do wykrywania i ilościowego oznaczania czynników zakaźnych, takich jak SARS-CoV-2, w próbkach powietrza. Początkowo zakładano, że SARS-CoV-2 rozprzestrzenia się głównie poprzez bliski kontakt osobisty z kropelkami wytwarzanymi przez zakażoną osobę podczas mówienia, kichania, kaszlu, śpiewania lub oddychania. Jednak coraz więcej badań donosi o obecności RNA SARS-CoV-2 w powietrzu placówek opieki zdrowotnej, co oznacza, że transmisja drogą powietrzną jest realną drogą rozprzestrzeniania się wirusa. W badaniu tym przedstawiono kombinację ustalonych protokołów ułatwiających wykrywanie, kwantyfikację i sekwencjonowanie wirusów zarówno w próbkach ścieków, jak i powietrza.

Wprowadzenie

W grudniu 2019 roku pojawiła się nowa choroba o nazwie COVID-19, wywołana przez nieznany wcześniej koronawirus, SARS-CoV-21. Wynikająca z tego globalna pandemia stanowi poważne wyzwanie dla laboratoriów klinicznych i zdrowia publicznego na całym świecie, ponieważ duża liczba osób wymaga testów w celu dokładnej oceny transmisji i rozpowszechnienia wirusa w społeczności. Jednak w wielu regionach osiągnięcie niezbędnego poziomu testowania w odpowiednim czasie i w sposób przestrzennie niewykonalny jest ekonomicznie niewykonalne2,3. Obecne systemy nadzoru oparte na indywidualnej diagnostyce klinicznej opierają się w dużej mierze na nasileniu objawów i indywidualnym zgłaszaniu, a także na stopniu, w jakim objawy te pokrywają się z istniejącymi chorobami krążącymi w populacji4,5,6,7,8,9,10. W związku z tym duża liczba przypadków bezobjawowych przyczynia się do znacznego niedoszacowania obciążenia chorobą7,11.

Ze względu na te wyzwania, epidemiologia oparta na ściekach (WBE) do nadzoru nad COVID-19 została zaproponowana jako uzupełniająca strategia nadzoru. WBE został po raz pierwszy opisany w 200112, i początkowo był używany do śledzenia kokainy i innych nielegalnych narkotyków13. Podejście to opiera się na założeniu, że możliwe jest obliczenie początkowego stężenia dowolnej substancji, która jest stabilna w ściekach i wydalana przez ludzi8,12. WBE został z powodzeniem wdrożony w wielu krajach jako uzupełniający i skuteczny system nadzoru nad SARS-CoV-23,8,14,15,16. Większość metod wykrywania wirusów ludzkich w środowisku wodnym przebiega zgodnie z następującymi krokami: koncentracja, ekstrakcja kwasu nukleinowego, amplifikacja wybranego segmentu (lub segmentów) genomu oraz wykrywanie/kwantyfikacja amplifikowanego segmentu genomowego3.

Innym ważnym środowiskiem do wykrywania i oznaczania ilościowego SARS-CoV-2 są próbki powietrza. Początkowo uważano, że SARS-CoV-2 jest przenoszony głównie poprzez bliski kontakt osobisty z kropelkami oddechowymi z aerozoli wytwarzanymi przez zakażoną osobę podczas mówienia, kichania, kaszlu, śpiewania lub oddychania17. Jednak kilka badań zaczęło donosić o obecności RNA SARS-CoV-2 w powietrzu, zwłaszcza w placówkach służby zdrowia i innych zamkniętych przestrzeniach18,19,20,21. Dowody na żywotność SARS-CoV-2 w próbkach powietrza pobranych w pomieszczeniach szpitalnych i innych zamkniętych pomieszczeniach stwierdzono, gdy stężenie wirusa było wystarczająco wysokie22,23,24. Badania plenerowe na ogół nie wykazały obecności SARS-CoV-2, z wyjątkiem zatłoczonych przestrzeni zewnętrznych21,25,26,27,28,29. Na razie transmisja SARS-CoV-2 drogą powietrzną została uznana za sposób transmisji30,31. Niedawne badanie przeglądowe pokazuje różnice między przebywaniem na zewnątrz, gdzie ryzyko transmisji drogą powietrzną jest minimalne poza zatłoczonymi obszarami, a pomieszczeniami, gdzie większe ryzyko może występować w słabo wentylowanych środowiskach, w których mogą występować silne źródła (tj. liczba zakażonych osób). Niedawne kompleksowe badanie przeglądowe podkreśliło znaczne różnice między ryzykiem przenoszenia drogą powietrzną w środowisku zewnętrznym i wewnętrznym, szczególnie w zatłoczonych obszarach o słabej wentylacji. Badanie wskazuje, że ryzyko przenoszenia drogą powietrzną jest minimalne w środowiskach zewnętrznych, gdzie dostępna jest większa objętość powietrza do rozcieńczania i dyspersji cząsteczek wirusa32. Odkrycia te mają ważne implikacje dla polityki i wytycznych w zakresie zdrowia publicznego związanych z COVID-19. Dostrzegając znaczące różnice w ryzyku transmisji między środowiskiem wewnętrznym i zewnętrznym, decydenci mogą opracować skuteczniejsze strategie łagodzenia rozprzestrzeniania się wirusa i ochrony zdrowia publicznego.

Istnieje wiele metod i protokołów do wykrywania, kwantyfikacji i sekwencjonowania SARS-CoV-2 z różnych próbek środowiskowych. Niniejszy artykuł dotyczący metody ma na celu przedstawienie kombinacji dobrze ugruntowanych protokołów, które umożliwiają laboratoriom o różnych poziomach wydajności wykrywanie, kwantyfikację i sekwencjonowanie wirusów w środowisku z próbek ścieków i powietrza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały opublikowane w innym miejscu i zawierają niewielkie modyfikacje względem metod oryginalnych.

1. Pobieranie ścieków i wstępne przetwarzanie próbek

UWAGA: Ze względu na niskie stężenia RNA SARS-CoV-2 w próbkach środowiskowych, przeprowadzenie etapu zagęszczania jest kluczowe dla skutecznej detekcji33,34,35. Opisana tutaj metoda jest pierwszą raportowaną metodą detekcji SARS-CoV-2 w ściekach36.

  1. Pobieranie i zagęszczanie próbek ścieków
    1. Pobrać 1 L złożonej próby ścieków z 24 h. Próbkę przechowywać w temperaturze 4 °C i przystąpić do protokołu w ciągu 24 h.
    2. Uhomogenizować próbkę, delikatnie wstrząsając butelką. Odlać 70 mL do probówki wirówki o pojemności 100 mL lub podzielić próbkę do dwóch probówek wirówki po 50 mL.
    3. Dodać 20 µL mengowirusa (3,2 x 103 kopii/µL) do 70 mL każdej próbki jako kontrolę wewnętrzną procesu zagęszczania. Alternatywnie, dodać 10 µL mengowirusa (3,2 x 103 kopii/µL) do każdej probówki wirówki 50 mL.
    4. Uhomogenizować próbkę i wirować przy 700 x g przez 10 min, aby usunąć duże cząstki i organizmy (osad).
    5. Uzyskany supernatant poddać zagęszczaniu za pomocą urządzeń do ultrafiltracji odwirygowej z odcięciem 10 KDa, wirując przy 4 000 x g przez 40 min w temperaturze 4 °C. Eluować koncentrat, wirując przy 700 x g przez 40 min po odwróceniu urządzenia do ultrafiltracji.
    6. Zmierzyć objętość otrzymanego koncentratu. Objętość będzie się różnić w zależności od ilości ciał stałych w próbce, które zapychają filtry wirówki. W niniejszym badaniu uzyskane objętości koncentratu wynosiły od 200 do 1 200 µL.
    7. Uzyskany koncentrat wykorzystać do ekstrakcji RNA przy użyciu zestawu komercyjnego lub metody wewnętrznej. W przypadku próbek użytych w tym badaniu zastosowano specjalistyczny komercyjny zestaw do ekstrakcji viralnego RNA z objętością elucji 50 µL.
    8. Zmierzyć stężenie wyekstrahowanego RNA za pomocą fluorometrycznego zestawu do ilościowego oznaczania RNA. Podzielić wyekstrahowane RNA na alikwoty i zamrozić w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.
      UWAGA: Dla każdego zestawu procedur izolacji RNA należy dołączyć negatywną kontrolę izolacji (NCI), zawierającą wyłącznie bufory, w celu wykrycia ewentualnego zanieczyszczenia podczas ekstrakcji.
  2. Pobieranie próbek powietrza za pomocą kompaktowego próbnika powietrza Coriolis
    1. Wybrać strategię pobierania próbek zgodnie z celem badawczym, definiując częstotliwość oraz miejsca poboru próbek.
    2. Ustawić szybkość przepływu w próbniku powietrza (w tym przypadku 50 L/min przez 30 min). Należy pamiętać, że szybkość przepływu przekraczająca 200 L/min może degradować viralne RNA, dlatego zaleca się stosowanie przepływu poniżej 200 L/min.
    3. Przed rozpoczęciem pobierania umieścić sterylny stożek w próbniku powietrza, uruchamiając go impulsem startowym. Po zakończeniu pobierania dodać 5-15 mL sterylnego roztworu soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) do stożka. Delikatnie wymieszać na wortexie lub wstrząsnąć próbką ręcznie przez 15 s. Próbki przechowywać do 24 h w temperaturze 4 °C lub w temperaturze -80 °C w probówkach kriogenicznych.
    4. Można przeprowadzić opcjonalny etap zagęszczania. Stożki należy czyścić i odkażać po każdym eksperymencie za pomocą wybielacza.
    5. Wyekstrahować RNA przy użyciu zestawu komercyjnego lub metody wewnętrznej. W przypadku próbek w tym badaniu zastosowano specjalistyczny komercyjny zestaw do ekstrakcji viralnego RNA z objętością elucji 50 µL.
    6. Zmierzyć stężenie wyekstrahowanego RNA za pomocą fluorometrycznego zestawu do ilościowego oznaczania RNA. Podzielić wyekstrahowane RNA na alikwoty i zamrozić w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.
      ​UWAGA: Dla każdego zestawu procedur izolacji RNA należy dołączyć negatywną kontrolę izolacji (NCI), zawierającą wyłącznie bufory, w celu wykrycia ewentualnego zanieczyszczenia podczas ekstrakcji.

2. Ilościowe oznaczanie RNA SARS-CoV-2 za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR)

UWAGA: Poniższy protokół jest zgodny z panelem diagnostycznym RT-PCR dla nowego koronawirusa z 2019 roku (2019-nCoV) opracowanym przez CDC37. Należy podzielić mieszaninę starterów i sond na kilka alikwotów, aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania.

  1. Przygotować mastermix reakcyjny dla każdego celu (mengowirus; SARS-CoV-2 [geny N1 i N2]) zgodnie z Tabelą 1, w czystym dygestorium w pomieszczeniu do przygotowania odczynników. Pomieszać mieszaninę starterów/sond i enzym poprzez pięciokrotne odwracanie probówek. Alternatywnie, lekko wymieszać mieszaninę starterów/sond i enzym w wstrząsarce typu vortex pięć razy.
    UWAGA: Wszystkie odczynniki należy utrzymywać w niskiej temperaturze podczas przygotowania i użytkowania. Aby zminimalizować liczbę cykli zamrażania i rozmrażania, zdecydowanie zaleca się mrożenie w alikwotach.
  2. Odwirować (1 000 x g przez 15-30 s) probówki, aby zebrać zawartość na dnie, a następnie umieścić je w zimnym statywie lub w lodzie.
  3. Oznaczyć probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL dla każdego celu. Do każdej probówki dodać wymaganą ilość każdego odczynnika (objętość na jedną reakcję pomnożona przez liczbę reakcji, w tym niezbędne kontrole). Pomieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie odwirować przez 5 s, aby zebrać zawartość na dnie.
  4. Przechowywać probówki w zimnym statywie i rozdać po 15 µL do paskowych probówek PCR lub na płytkę 96-dołkową w statywie chłodzącym. Przykryć płytkę i przenieść ją do strefy manipulacji kwasami nukleinowymi (przechowując ją w statywie chłodzącym).
  5. Rozmrozić alikwot wyekstrahowanego RNA i delikatnie wymieszać w wstrząsarce typu vortex przez 5 s. Do każdego dołka reakcyjnego lub probówki zawierającej wcześniej przygotowany mastermix pipetować 5 µL RNA (dodatkowo 5 µL kontroli bez matrycy [NTC], negatywnej kontroli izolacji [NCI] oraz kontroli pozytywnej [PC]). Często zmieniać rękawiczki w razie potrzeby, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej.
  6. Przykryć całą płytkę reakcyjną lub probówki i delikatnie wymieszać w wstrząsarce typu vortex. Odwirować (1 000 x g przez 15-30 s) płytkę lub probówki PCR.
  7. Rozpocząć reakcję RT-qPCR o objętości 25 µL z następującymi warunkami cyklicznymi: odwrotna transkrypcja w 45 °C przez 10 min; aktywacja polimerazy w 95 °C przez 10 min; 45 cykli denaturacji w 95 °C przez 15 s oraz przyłączania/elongacji w 60 °C przez 45 s.
  8. Obliczyć wydajność odzysku kontroli mengowirusa zgodnie z opisem Conte i wsp.38:
    wzór na wydajność odzysku mengowirusa; równanie obliczania kopii genomowych; zastosowanie badawcze × 100

3. Sekwencjonowanie wariantów w ściekach i analiza danych

UWAGA: Opisany protokół jest zmodyfikowaną procedurą opracowaną przez Quick i współpracowników39,40. Wykorzystuje on dwa zestawy starterów do amplifikacji genomu SARS-CoV-2 metodą PCR tiling – startery ARTIC oraz startery VarSkip. Zastosowanie kombinacji starterów ma na celu zapewnienie optymalnego pokrycia genomu oraz zminimalizowanie ryzyka, że nowe mutacje spowodują niepowodzenie amplifikacji z użyciem starterów jednego typu. Ogólnie protokół dzieli się na trzy etapy: odwrotną transkrypcję (RT) i generowanie amplikonów, przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania oraz sekwencjonowanie i analizę danych.

  1. Odwrotna transkrypcja i generowanie amplikonów
    1. Należy upewnić się, że próbki wejściowe mają znaną wartość progu cyklu (Ct) qPCR, aby poprawnie rozcieńczyć je w wodzie klasy PCR. Wartość Ct uzyskuje się podczas kwantyfikacji metodą qPCR. Rozcieńczenia są następujące: jeśli wartość Ct wynosi 12-15, rozcieńczyć próbki 1:100; jeśli wartość Ct wynosi 15-18, rozcieńczyć próbki 1:10; jeśli wartość Ct wynosi 18-35, nie rozcieńczać próbki. Próbki o wartości Ct powyżej 35 mają duże prawdopodobieństwo niepowodzenia reakcji.
    2. Na płytkę PCR nanieść pipetą 16 µL każdej próbki na odpowiadające jej miejsce na płytce. Dodać 4 µL mastermixu do odwrotnej transkrypcji (RT) (5x). Przykryć płytkę i rozpocząć reakcję PCR w następujących warunkach: 25 °C przez 2 min, 55 °C przez 20 min oraz 95 °C przez 1 min.
    3. Przygotować rozcieńczenia 10 µM każdego zestawu starterów (ARTIC pool A i pool B oraz VarSkip pool A i pool B). Przygotować mastermix dla każdego zestawu starterów (ARTIC zestaw A i B oraz VarSkip zestaw A i B) zgodnie z Tabelą 2. W wyniku tego powstaną cztery mastermixy.
    4. Na nową płytkę PCR nanieść pipetą 20 µL mastermixu do każdego odpowiedniego dołka. Dodać 5 µL próbki RT do każdej mieszaniny.
      UWAGA: Każda próbka będzie miała cztery mieszaniny reakcyjne: ARTIC pool A i B oraz VarSkip pool A i B.
    5. Przykryć płytkę i rozpocząć reakcję PCR w następujący sposób: aktywacja polimerazy przy 98 °C przez 30 s; 35 cykli denaturacji przy 98 °C przez 15 s oraz annealingu/elongacji przy 65 °C przez 4 min. Odwirować płytkę (1 000 x g przez 15-30 s). Połączyć pule reakcyjne ARTIC oraz oddzielnie połączyć pule reakcyjne VarSkip. Każda próbka będzie miała dwie reakcje amplikonowe o objętości 50 µL.
    6. Dodać 50 µL odczynnika do oczyszczania PCR opartego na kuletkach do każdego dołka i dobrze wymieszać poprzez pipetowanie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
      UWAGA: Przed każdym użyciem należy energicznie wymieszać odczynnik do oczyszczania PCR, aby resuspenderć kuletki.
    7. Umieścić płytkę na statywie do separacji magnetycznej i poczekać, aż kuletki utworzą pellet, a ciecz stanie się przejrzysta (~5 min). Odessać i odrzucić nadsącz.
    8. Utrzymując płytkę PCR na statywie magnetycznym, dodać 200 µL 80% etanolu do każdej próbki, nie dotykając pelletu kuletek. Usunąć etanol.
    9. Powtórzyć poprzedni krok. Pozostawić płytkę na statywie magnetycznym bez przykrycia przez 30 s, aby etanol odparował.
    10. Zdjąć płytkę ze statywu magnetycznego i dodać 15 µL wody klasy PCR do każdej próbki. Resuspenderć pellet poprzez pipetowanie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 min.
    11. Umieścić płytkę ponownie na statywie magnetycznym i pozwolić kuletkom opaść na dno (2 min). Ostrożnie nanieść pipetą 15 µL nadsączu z każdej próbki na nową płytkę PCR.
    12. Zmierzyć stężenie każdej próbki za pomocą fluorometrycznego zestawu do kwantyfikacji RNA. Do następnego kroku przenieść około 50 ng każdej próbki w 12,5 µL. W razie potrzeby rozcieńczyć próbkę w wodzie klasy PCR.
  2. Przygotowanie biblioteki
    1. Dodać 1,75 µL buforu reakcyjnego z zestawu do przygotowania bibliotek DNA Illumina oraz 0,75 µL mieszaniny enzymów do każdej próbki. Przykryć płytkę, krótko wymieszać w wortexie i odwirować (1 000 x g przez 15-30 s). Inkubować w temperaturze 21 °C przez 5 min oraz 65 °C przez 5 min.
    2. Na nowej płytce PCR nanieść pipetą 3 µL wody klasy PCR dla każdej próbki. Dodać 0,75 µL przygotowanych próbek, 1,25 µL kodów kreskowych (barcodes) do przygotowania biblioteki sekwencyjnej oraz 5 µL mastermixu ligazy DNA T4. Dobrze wymieszać poprzez pipetowanie, krótko odwirować (1 000 x g przez 15-30 s) w wirówce i inkubować w temperaturze 21 °C przez 20 min oraz 65 °C przez 10 min.
      UWAGA: W przypadku użycia mniej niż 25 próbek należy podwoić wszystkie objętości w tym kroku.
    3. Połączyć wszystkie próbki, dodając 10 µL każdej próbki do tej samej probówki o niskim wiązaniu (low-binding). Przenieść 480 µL do następnego kroku.
    4. Dodać 192 µL odczynnika do oczyszczania PCR opartego na kuletkach do puli i dobrze wymieszać poprzez pipetowanie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.
    5. Umieścić probówkę na statywie magnetycznym i poczekać, aż nadsącz stanie się przejrzysty, a kuletki utworzą pellet. Usunąć nadsącz. Zdjąć probówkę ze statywu magnetycznego.
    6. Dodać 700 µL buforu do krótkich fragmentów (SFB) i wymieszać poprzez pipetowanie. Umieścić ponownie na statywie magnetycznym i poczekać, aż utworzy się pellet, a ciecz stanie się przejrzysta (~5 min). Odessać i odrzucić nadsącz.
    7. Powtórzyć poprzedni krok. Pozostawić probówkę na statywie magnetycznym. Dodać 100 µL 80% etanolu, nie dotykając kuletek. Odessać etanol i pozwolić kuletkom wyschnąć przez 30 s.
      UWAGA: Nie dopuścić do nadmiernego wysuszenia kuletek.
    8. Zdjąć probówkę ze statywu magnetycznego i dodać 35 µL wody klasy PCR. Wymieszać poprzez pipetowanie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 min. Umieścić probówkę na statywie magnetycznym i pozwolić kuletkom opaść na dno, a cieczy stać się przejrzystą. Przenieść 35 µL nadsączu do nowej probówki.
    9. Zmierzyć stężenie RNA połączonej biblioteki. Nanieść objętość potrzebną do uzyskania ilości 30-50 ng RNA i dopełnić wodą klasy PCR do końcowej objętości 30 µL.
    10. Przygotować mieszaninę reakcji ligacji adapterów: 30 µL połączonej biblioteki, 5 µL Adapter Mix II, 10 µL buforu do reakcji ligacji (5x) oraz 5 µL ligazy DNA T4. Wymieszać poprzez pipetowanie i odwirować (1 000 x g przez 15-30 s). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.
    11. Dodać 20 µL odczynnika do oczyszczania PCR opartego na kuletkach i wymieszać poprzez pipetowanie. Inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    12. Umieścić probówkę na statywie magnetycznym i poczekać, aż utworzy się pellet kuletek, a nadsącz stanie się bezbarwny. Ostrożnie odessać i odrzucić nadsącz.
    13. Zdjąć ze statywu magnetycznego i dodać 125 µL SFB. Wymieszać poprzez pipetowanie i ponownie umieścić na statywie magnetycznym w celu oddzielenia kuletek. Gdy ciecz stanie się przejrzysta, odessać i odrzucić nadsącz.
    14. Powtórzyć poprzedni krok. Pozostawić probówkę otwartą na statywie magnetycznym przez 30 s, aby odparowała część pozostałej cieczy.
    15. Zdjąć probówkę ze statywu magnetycznego i dodać 15 µL buforu do elucji. Dobrze wymieszać poprzez pipetowanie i krótko odwirować (1 000 x g przez 15-30 s). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min. Umieścić na statywie magnetycznym na 2 min.
    16. Przenieść 15 µL nadsączu do nowej probówki o niskim wiązaniu. Jest to końcowa biblioteka. Zmierzyć stężenie za pomocą fluorometrycznego zestawu do kwantyfikacji DNA.
      UWAGA: W następnym kroku wymagane jest 12 µL. Jeśli stężenie jest bardzo wysokie i potrzeba mniej niż 12 µL biblioteki, dopełnić do 12 µL odczynnikiem buforu do elucji.
  3. Ładowanie komórki przepływowej i sekwencjonowanie
    1. Włożyć komórkę przepływową (R9.4.1) do urządzenia do sekwencjonowania DNA i RNA w czasie rzeczywistym.
    2. Przygotować mieszaninę startową (priming mix), dodając 30 µL odczynnika flush tether (FLT) do probówki z odczynnikiem buforu płuczącego (FB). Wymieszać w wortexie i odwirować (1 000 x g przez 15-30 s).
    3. Otworzyć pokrywę portu startowego. Używając pipety 1 000 µL ustawionej na 200 µL, włożyć końcówkę do portu startowego. Obracać pokrętło ustawiania objętości i zwiększać ją, aż w końcówce pojawi się ciecz. Wyrzucić końcówkę.
      UWAGA: Obracać pokrętło tylko do momentu, aż w końcówce pojawi się kilka µL cieczy. Pobranie większych ilości mogłoby uszkodzić komórkę przepływową.
    4. Powoli dodać 800 µL mieszaniny startowej do portu startowego, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Odczekać 5 min.
    5. W tym czasie przygotować biblioteki do ładowania. Wymieszać 37,5 µL buforu do sekwencjonowania, 25,5 µL buforu do ładowania i 12 µL biblioteki.
      ​UWAGA: Wymieszać bufor do ładowania przed pipetowaniem. Kuletki w tym odczynniku osiadają bardzo szybko.
    6. Otworzyć pokrywę portu. Pipetować 200 µL mieszaniny startowej do portu startowego.
      UWAGA: Podczas pipetowania do portu startowego przy otwartej pokrywie można zauważyć małe krople wypływające z portu próbkowego. Pipetować wystarczająco wolno, aby port próbkowy mógł wessać krople bez ich przelania.
    7. Przed załadowaniem przygotowanej biblioteki dobrze wymieszać ją poprzez pipetowanie. Używając pipety 100 µL ustawionej na 75 µL, pobrać bibliotekę i nanosić kropla po kropli do portu próbkowego. Nie dotykać portu i poczekać, aż każda kropla zostanie wchłonięta do portu przed nałożeniem kolejnej, aby uniknąć przelania cieczy.
    8. Zamknąć pokrywę portu oraz port startowy. Uruchomić oprogramowanie i rozpocząć eksperyment sekwencjonowania. Wybrać opcję basecalling On. W przypadku biblioteki z 96 zmuksowanymi próbkami 10-12 h sekwencjonowania jest zazwyczaj wystarczające do wygenerowania odpowiedniej ilości danych.
      UWAGA: Za pomocą oprogramowania można wprowadzić arkusz próbek w formacie .csv. Arkusz próbek wymaga następujących danych: flow_cell_id, position_id, sample_id, experiment_id, flow_cell_product_code oraz kit. Wymagane jest ID komórki przepływowej (podane z boku komórki przepływowej) wraz z użytym zestawem. Dla sugerowanego protokołu należy wybrać zestaw LSK109.
  4. Analiza danych sekwencyjnych
    1. Wprowadzić skompresowane odczyty fastq do przepływu pracy wf-artic41. Uruchomić przepływ pracy oddzielnie dla dwóch różnych schematów starterów (ARTIC/V4.1 oraz NEB-VarSkip/v1a). Dla każdej próbki zostaną utworzone dwa pliki „. primertrimmed.rg.sorted.bam”.
    2. Połączyć pliki BAM w jeden plik za pomocą komendy „samtools merge”42. Wprowadzić połączony plik BAM do narzędzia Freyja, pozostawiając ustawienia domyślne, aby odzyskać względne obfitości linii43.
    3. Aby utworzyć plik FASTA, wprowadzić połączony plik BAM do narzędzi „samtools mpileup” i „ivar” z domyślnymi ustawieniami44,45. Do wyznaczania mutacji załadować plik FASTA do narzędzia Nextclade46,47.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyniki podsumowane w Tabeli 3 przedstawiają przykłady wykrywania i oznaczania ilościowego RNA SARS-CoV-2 w próbkach ścieków i powietrza przy użyciu metody opisanej w niniejszym artykule. Próbki ścieków pobrano z oczyszczalni ścieków w Hiszpanii i Słowenii; uznano je za pozytywne, jeśli wartość Ct była mniejsza niż 40 w co najmniej dwóch z trzech powtórzeń, a oznaczanie ilościowe uznano za prawidłowe, jeśli zmienność Ct wynosiła mniej niż 5%. W Hiszpanii i Portugalii pobrano próbki powietrza wewnątrz i na...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wykrywanie i oznaczanie ilościowe drobnoustrojów i wirusów za pomocą metod (RT-)qPCR zyskało powszechną akceptację ze względu na ich niezwykłą czułość. Techniki te napotykają jednak wiele wyzwań podczas analizy próbek środowiskowych. Próbki ścieków zawierają mnóstwo substancji hamujących, które mogą zniekształcać pomiary i generować mylące wyniki. Aby poradzić sobie z tymi ograniczeniami i zwiększyć precyzję, opracowano, zaprojektowano i wdrożono złożony protokół. Protokół ten został opracowany poprzez połączenie protoko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów ekonomicznych ani innych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca została wykonana dzięki wsparciu finansowemu Rządu Regionalnego Kastylii i León oraz programu FEDER (projekty CLU 2017-09, UIC315 i VA266P20).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Adapter + A25 + A2: D19 + A2: D20 + A2 + A2: D19SekwencjonowanieOxford NanoporeEXP-AMII001
Zestaw AllPrep PowerViral DNA/RNA Zestawekstrakcji RNAQiagen28000-50
AMPure XPBeckman CoulterA63880Oczyszczanie PCR, NGS Oczyszczanie, Czyszczenie PCR
Panel amplikonów ARTIC SARS-CoV-2IDT10011442Amplifikacja genomu SARS-CoV-2
Blunt/TA Ligase Master MixNEBM0367SPrzygotowanie biblioteki
CENTRICON PLUS&nieśmiały; 70 10 kda.Fisher Scientific10296062Filtry stężenia
CORIOLIS KOMPAKTOWY PRÓBNIK POWIETRZABertin Technologies083-DU001Próbnik powietrza
Duran  butelki laboratoryjneButelki do pobierania próbekMerckZ305200-10EA
Komórka przepływowa (R9.4.1)SekwencjonowanieOxford NanoporeFLO-MIN106D
Ogólne materiały eksploatacyjne laboratoryjne (probówki, płytki qPCR itp.)
Zestaw do sekwencjonowania ligacjiOxford NanoporeSQK-LSK109Sekwencjonowanie
LunaScript  Zestaw RT SuperMix NEBE3010  Synteza cDNA
Zestaw do kontroli ekstrakcji mengowirusaBiom é rieuxKMGKontrola koncentracji
Nalgene Ogólne długoterminowe przechowywanie Probówki kriogeniczneThermofisher5011-0012Przechowywanie próbek
Natywne rozszerzenie kodów kreskowych 1-12 (bez PCROxford NanoporeEXP-NBD104Kod kreskowy
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEBE7595Naprawa DNA
NEBNext VarSkip Krótkie mieszanki podkładowe SARS-CoV-2NEBE7658Amplifikacja genomu SARS-CoV-2
NEBNext  Bufor reakcyjny do szybkiej ligacjiSekwencjonowanie NEBB6058S 
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiMerckP4474Bufor zbiorczy
Sola fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, 1X), sterylnie filtrowanaThermofisherJ61196. APElucja próbek powietrza
Q5  Hot Start High-Fidelity 2X Master MixNEBM0494Sgorący start Polimeraza DNA
Zestaw testowy Qubit RNA HS ThermofisherQ32852Kwantyfikacja RNA
SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer i Zestaw sondIDT10006713Mieszanka startera-sondy i kontrola pozytywna qPCR
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master MixThermofisherA15299Zestaw RT-qPCR
do

Bibliografia

  1. Naming the Coronavirus Disease (COVID-19) and the Virus that Causes it. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/naming-the-coronavirus-disease-(cover-2019)-and-the-virus-that-causes-it (2020).
  2. Lab Workplace Safety. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/lab-safety-practices.html (2020).
  3. Gonçalves, J., et al. Centralized and decentralized wastewater-based epidemiology to infer COVID-19 transmission - A brief review. One Health. 15, 100405(2022).
  4. Dawood, F. S., et al. Estimated global mortality associated with the first 12 months of 2009 pandemic influenza A H1N1 virus circulation: a modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 12 (9), 687-695 (2012).
  5. Gonçalves, J., Koritnik, T., Paragi, M. Assessment of weather and atmospheric pollution as a co-factor in the spread of SARS-CoV-2. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 92 (3), e2021094(2021).
  6. Gonçalves, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA in hospital wastewater from a low COVID-19 disease prevalence area. The Science of The Total Environment. 755, 143226(2021).
  7. Mizumoto, K., Kagaya, K., Zarebski, A., Chowell, G. Estimating the asymptomatic proportion of coronavirus disease 2019 (COVID-19) cases on board the Diamond Princess cruise ship, Yokohama, Japan, 2020. Eurosurveillance. 25 (10), 2000180(2020).
  8. Polo, D., et al. Making waves: Wastewater-based epidemiology for COVID-19 - approaches and challenges for surveillance and prediction. Water Research. 186, 116404(2020).
  9. Shmueli, G., Burkom, H. Statistical challenges facing early outbreak detection in biosurveillance. Technometrics. 52 (1), 39-51 (2010).
  10. Simonsen, L., et al. Global mortality estimates for the 2009 influenza pandemic from the GLaMOR project: A modeling study. PLoS Medicine. 10 (11), e1001558(2013).
  11. Oran, D. P., Topol, E. J. Prevalence of asymptomatic SARS-CoV-2 infection: a narrative reivew. Annals of Internal Medicine. 173, 362-367 (2020).
  12. Daughton, C., Jones-Lepp, T. Pharmaceuticals and Personal Care Products in the Environment: Scientific and Regulatory Issues. ACS Symposium Series. , American Chemical Society. Washington, DC. (2001).
  13. Zuccato, E., et al. Cocaine in surface waters: a new evidence-based tool to monitor community drug abuse. Environmental Health. 4, 14(2005).
  14. Aguiar-Oliveira, M. deL., et al. Wastewater-based epidemiology (WBE) and viral detection in polluted surface water: A valuable tool for COVID-19 surveillance-a brief review. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 9251(2020).
  15. García-Encina, P. A. Wastewater-based epidemiology (WBE). Water and Environment Journal. 35 (4), 1162-1163 (2021).
  16. Mao, K., Zhang, H., Pan, Y., Yang, Z. Biosensors for wastewater-based epidemiology for monitoring public health. Water Research. 191, 116787(2021).
  17. Shereen, M. A., Khan, S., Kazmi, A., Bashir, N., Siddique, R. COVID-19 infection: Origin, transmission, and characteristics of human coronaviruses. Journal of Advanced Research. 24, 91-98 (2020).
  18. Chia, P. Y., et al. Detection of air and surface contamination by SARS-CoV-2 in hospital rooms of infected patients. Nature Communications. 11 (1), 2800(2020).
  19. Lei, H., et al. SARS-CoV-2 environmental contamination associated with persistently infected COVID-19 patients. Influenza and Other Respiratory Viruses. 14 (6), 688-699 (2020).
  20. Razzini, K., et al. SARS-CoV-2 RNA detection in the air and on surfaces in the COVID-19 ward of a hospital in Milan, Italy. The Science of The Total Environment. 742, 140540(2020).
  21. da Silva, P. G., Gonçalves, J., Nascimento, M. S. J., Sousa, S. I. V., Mesquita, J. R. Detection of SARS-CoV-2 in the indoor and outdoor areas of urban public transport systems of three major cities of Portugal in 2021. International Journal of Environmental Research and Public Health. 19 (10), 5955(2022).
  22. Barbieri, P., et al. Molecular detection of SARS-CoV-2 from indoor air samples in environmental monitoring needs adequate temporal coverage and infectivity assessment. Environmental Research. 198, 111200(2021).
  23. Lednicky, J., et al. Earliest detection to date of SARS-CoV-2 in Florida: Identification together with influenza virus on the main entry door of a university building, February 2020. PLoS One. 16 (1), 0245352(2021).
  24. Santarpia, J. L., et al. Aerosol and surface contamination of SARS-CoV-2 observed in quarantine and isolation care. Scientific Reports. 10 (1), 12732(2020).
  25. Chirizzi, D., et al. SARS-CoV-2 concentrations and virus-laden aerosol size distributions in outdoor air in north and south of Italy. Environment International. 146, 106255(2021).
  26. Hadei, M., et al. Presence of SARS-CoV-2 in the air of public places and transportation. Atmospheric Pollution Research. 12 (3), 302-306 (2021).
  27. Moreno, T., et al. Tracing surface and airborne SARS-CoV-2 RNA inside public buses and subway trains. Environment International. 147, 106326(2021).
  28. Mouchtouri, V. A., et al. Environmental contamination of SARS-CoV-2 on surfaces, air-conditioner and ventilation systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 230, 113599(2020).
  29. Setti, L., et al. Airborne transmission route of COVID-19: why 2 meters/6 feet of inter-personal distance could not be enough. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 2932(2020).
  30. SARS-CoV-2 Transmission. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/science/science-briefs/sars-cov-2-transmission.html (2021).
  31. Coronavirus Disease (COVID-19): How is it Transmitted. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/q-a-detail/coronavirus-disease-covid-19-how-is-it-transmitted (2021).
  32. Dinoi, A., et al. A review on measurements of SARS-CoV-2 genetic material in air in outdoor and indoor environments: Implication for airborne transmission. The Science of the Total Environment. 809, 151137(2022).
  33. Bosch, A., et al. Analytical methods for virus detection in water and food. Food Analytical Methods. 4, 4-12 (2011).
  34. Gonçalves, J., et al. Surveillance of human enteric viruses in coastal waters using concentration with methacrylate monolithic supports prior to detection by RT-qPCR. Marine Pollution Bulletin. 128, 307-317 (2018).
  35. La Rosa, G., Muscillo, M. Molecular detection of viruses in water and sewage. Viruses in Food and Water. , Woodhead Publishing. 97-125 (2013).
  36. Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
  37. CDC - 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Fact Sheet for Healthcare Providers. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/85028 (2020).
  38. Conte, M. Airborne concentrations of SARS-CoV-2 in indoor community environments in Italy. Environmental Science and Pollution Research International. 29 (10), 13905-13916 (2022).
  39. Quick, J. nCoV-2019 sequencing protocol v3 (LoCost). protocols.io. , Available from: https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing-protocol-v3-locost-bh42j8ye (2020).
  40. Tyson, J. R. Improvements to the ARTIC multiplex PCR method for SARS-CoV-2 genome sequencing using nanopore. , (2020).
  41. ARTIC SARS-CoV-2 Workflow. , Available from: https://github.com/epi2me-labs/wf-artic (2022).
  42. Li, H., et al. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  43. Freyja. , Available from: https://github.com/andersen-lab/Freyja (2022).
  44. Li, H. A statistical framework for SNP calling, mutation discovery, association mapping and population genetical parameter estimation from sequencing data. Bioinformatics. 27 (21), 2987-2993 (2011).
  45. Grubaugh, N. D., et al. An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar. Genome Biology. 20 (1), 8(2019).
  46. Hadfield, J., et al. Nextstrain: real-time tracking of pathogen evolution. Bioinformatics. 34 (23), 4121-4123 (2018).
  47. Aksamentov, I., Roemer, C., Hodcroft, E. B., Neher, R. A. Nextclade: clade assignment, mutation calling and quality control for viral genomes. Journal of Open Source Software. 6 (67), 3773(2021).
  48. Markt, R., et al. Detection and stability of SARS-CoV-2 fragments in wastewater: impact of storage temperature. Pathogens. 10 (9), 1215(2021).
  49. Kocamemi, B. A., et al. First Data-Set on SARS-CoV-2 Detection for Istanbul Wastewaters in Turkey. MedRxiv. , (2020).
  50. Randazzo, W., et al. SARS-CoV-2 RNA in wastewater anticipated COVID-19 occurrence in a low prevalence area. Water Research. 181, 115942(2020).
  51. Hoorfar, J., et al. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays. Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1863-1868 (2004).
  52. Parshionikar, S. U., Cashdollar, J., Shay Fout, G. Development of homologous viral internal controls for use in RT-PCR assays of waterborne enteric viruses. Journal of Virological Methods. 121, 39-48 (2004).
  53. Nalla, A. K. Comparative performance of SARS-CoV-2 detection assays using seven different primer-probe sets and one assay kit. Journal of Clinical Microbiology. 58 (6), 00557(2020).
  54. Hirotsu, Y., Mochizuki, H., Omata, M. Double-quencher probes improve detection sensitivity toward Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in a reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. Journal of Virological Methods. 284, 113926(2020).
  55. Ahmed, W. First confirmed detection of SARS-CoV-2 in untreated wastewater in Australia: A proof of concept for the wastewater surveillance of COVID-19 in the community. The Science of The Total Environment. 728, 138764(2020).
  56. Bar-Or, I., et al. Detection of SARS-CoV-2 variants by genomic analysis of wastewater samples in Israel. The Science of the Total Environment. 789, 148002(2021).
  57. La Rosa, G., Bonadonna, L., Lucentini, L., Kenmoe, S., Suffredini, E. Coronavirus in water environments: Occurrence, persistence and concentration methods - A scoping review. Water Research. 179, 115899(2020).
  58. Wu, F., et al. SARS-CoV-2 titers in wastewater are higher than expected from clinically confirmed cases. mSystems. 5, 00614(2020).
  59. Wurtzer, S., et al. Evaluation of lockdown effect on SARS-CoV-2 dynamics through viral genome quantification in waste water, Greater Paris, France, 5 March to 23 April 2020. European Communicable Disease Bulletin. 25 (50), 2000776(2020).
  60. VATar COVID-19 | Caso de Exito - Ministerio para la Transición Ecologica y el Reto Demografico. , Available from: https://esri.es/es-es/descubre-los-gis/casos-de-exito/administracion-/vatar-covod19-miteco-cs (2022).
  61. Nemudryi, A., et al. Temporal detection and phylogenetic assessment of SARS-CoV-2 in municipal wastewater. Cell Reports. Medicine. 1 (6), 100098(2020).
  62. Rios, G., et al. Monitoring SARS-CoV-2 variants alterations in Nice neighborhoods by wastewater nanopore sequencing. The Lancet Regional Health. Europe. 10, 100202(2021).
  63. Gomes da Silva, P. Environmental dissemination of SARS-CoV-2 in a University Hospital during the COVID-19 5th wave Delta variant peak in Castile-León, Spain. International Journal of Environmental Research and Public Health. 20, 1574(2023).
  64. Gonçalves, J., et al. Exposure assessment of SARS-CoV-2 and Nov GII/GII in aerosols generated by a municipal wastewater treatment plant. , (2022).
  65. Lednicky, J. A., et al. Isolation of SARS-CoV-2 from the air in a car driven by a COVID patient with mild illness. International Journal of Infectious Diseases. 108, 212-216 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

epidemiologia ściekówpobieranie próbek powietrzailościowe oznaczanie RNA wirusasekwencjonowanie całego genomuRT-qPCRzagęszczanie ściekówekstrakcja kwasów nukleinowychseparacja magnetycznanadzór środowiskowy
Kwantyfikacja i charakterystyka całego genomu RNA SARS-CoV-2 w próbkach ścieków i powietrza
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.