Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja i charakterystyka całego genomu RNA SARS-CoV-2 w próbkach ścieków i powietrza

DOI:

10.3791/65053

⸱

30 czerwca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Sustainable Processes, University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology, University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology, National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS - School of Medicine and Biomedical Sciences, Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit), Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół ma na celu ilościowe określenie RNA SARS-CoV-2 w próbkach ścieków i powietrza, które mają być wykorzystane do badań epidemiologicznych opartych na ściekach oraz ocenę ryzyka narażenia na SARS-CoV-2 w aerozolach wewnątrz i na zewnątrz. Protokół ten opisuje również podejście do sekwencjonowania długiego szablonu amplikonu w celu charakterystyki całego genomu SARS-CoV-2.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epidemiologia oparta na ściekach okazała się obiecującym i skutecznym systemem nadzoru nad SARS-CoV-2 i innymi chorobami zakaźnymi w wielu krajach. Proces ten zazwyczaj obejmuje zagęszczanie ścieków, ekstrakcję kwasów nukleinowych, amplifikację wybranych segmentów genomu oraz wykrywanie i kwantyfikację amplifikowanego segmentu genomu. Metodologia ta może być również wykorzystana do wykrywania i ilościowego oznaczania czynników zakaźnych, takich jak SARS-CoV-2, w próbkach powietrza. Początkowo zakładano, że SARS-CoV-2 rozprzestrzenia się głównie poprzez bliski kontakt osobisty z kropelkami wytwarzanymi przez zakażoną osobę podczas mówienia, kichania, kaszlu, śpiewania lub oddychania. Jednak coraz więcej badań donosi o obecności RNA SARS-CoV-2 w powietrzu placówek opieki zdrowotnej, co oznacza, że transmisja drogą powietrzną jest realną drogą rozprzestrzeniania się wirusa. W badaniu tym przedstawiono kombinację ustalonych protokołów ułatwiających wykrywanie, kwantyfikację i sekwencjonowanie wirusów zarówno w próbkach ścieków, jak i powietrza.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W grudniu 2019 roku pojawiła się nowa choroba o nazwie COVID-19, wywołana przez nieznany wcześniej koronawirus, SARS-CoV-21. Wynikająca z tego globalna pandemia stanowi poważne wyzwanie dla laboratoriów klinicznych i zdrowia publicznego na całym świecie, ponieważ duża liczba osób wymaga testów w celu dokładnej oceny transmisji i rozpowszechnienia wirusa w społeczności. Jednak w wielu regionach osiągnięcie niezbędnego poziomu testowania w odpowiednim czasie i w sposób przestrzennie niewykonalny jest ekonomicznie niewykonalne2,3. Obecne systemy nadzoru oparte na indywidualnej diagnostyce klinicznej opierają się w dużej mierze na nasileniu objawów i indywidualnym zgłaszaniu, a także na stopniu, w jakim objawy te pokrywają się z istniejącymi chorobami krążącymi w populacji4,5,6,7,8,9,10. W związku z tym duża liczba przypadków bezobjawowych przyczynia się do znacznego niedoszacowania obciążenia chorobą7,11.

Ze względu na te wyzwania, epidemiologia oparta na ściekach (WBE) do nadzoru nad COVID-19 została zaproponowana jako uzupełniająca strategia nadzoru. WBE został po raz pierwszy opisany w 200112, i początkowo był używany do śledzenia kokainy i innych nielegalnych narkotyków13. Podejście to opiera się na założeniu, że możliwe jest obliczenie początkowego stężenia dowolnej substancji, która jest stabilna w ściekach i wydalana przez ludzi8,12. WBE został z powodzeniem wdrożony w wielu krajach jako uzupełniający i skuteczny system nadzoru nad SARS-CoV-23,8,14,15,16. Większość metod wykrywania wirusów ludzkich w środowisku wodnym przebiega zgodnie z następującymi krokami: koncentracja, ekstrakcja kwasu nukleinowego, amplifikacja wybranego segmentu (lub segmentów) genomu oraz wykrywanie/kwantyfikacja amplifikowanego segmentu genomowego3.

Innym ważnym środowiskiem do wykrywania i oznaczania ilościowego SARS-CoV-2 są próbki powietrza. Początkowo uważano, że SARS-CoV-2 jest przenoszony głównie poprzez bliski kontakt osobisty z kropelkami oddechowymi z aerozoli wytwarzanymi przez zakażoną osobę podczas mówienia, kichania, kaszlu, śpiewania lub oddychania17. Jednak kilka badań zaczęło donosić o obecności RNA SARS-CoV-2 w powietrzu, zwłaszcza w placówkach służby zdrowia i innych zamkniętych przestrzeniach18,19,20,21. Dowody na żywotność SARS-CoV-2 w próbkach powietrza pobranych w pomieszczeniach szpitalnych i innych zamkniętych pomieszczeniach stwierdzono, gdy stężenie wirusa było wystarczająco wysokie22,23,24. Badania plenerowe na ogół nie wykazały obecności SARS-CoV-2, z wyjątkiem zatłoczonych przestrzeni zewnętrznych21,25,26,27,28,29. Na razie transmisja SARS-CoV-2 drogą powietrzną została uznana za sposób transmisji30,31. Niedawne badanie przeglądowe pokazuje różnice między przebywaniem na zewnątrz, gdzie ryzyko transmisji drogą powietrzną jest minimalne poza zatłoczonymi obszarami, a pomieszczeniami, gdzie większe ryzyko może występować w słabo wentylowanych środowiskach, w których mogą występować silne źródła (tj. liczba zakażonych osób). Niedawne kompleksowe badanie przeglądowe podkreśliło znaczne różnice między ryzykiem przenoszenia drogą powietrzną w środowisku zewnętrznym i wewnętrznym, szczególnie w zatłoczonych obszarach o słabej wentylacji. Badanie wskazuje, że ryzyko przenoszenia drogą powietrzną jest minimalne w środowiskach zewnętrznych, gdzie dostępna jest większa objętość powietrza do rozcieńczania i dyspersji cząsteczek wirusa32. Odkrycia te mają ważne implikacje dla polityki i wytycznych w zakresie zdrowia publicznego związanych z COVID-19. Dostrzegając znaczące różnice w ryzyku transmisji między środowiskiem wewnętrznym i zewnętrznym, decydenci mogą opracować skuteczniejsze strategie łagodzenia rozprzestrzeniania się wirusa i ochrony zdrowia publicznego.

Istnieje wiele metod i protokołów do wykrywania, kwantyfikacji i sekwencjonowania SARS-CoV-2 z różnych próbek środowiskowych. Niniejszy artykuł dotyczący metody ma na celu przedstawienie kombinacji dobrze ugruntowanych protokołów, które umożliwiają laboratoriom o różnych poziomach wydajności wykrywanie, kwantyfikację i sekwencjonowanie wirusów w środowisku z próbek ścieków i powietrza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały opublikowane gdzie indziej i zawierają drobne modyfikacje w stosunku do oryginalnych metod.

1. Zbieranie ścieków i wstępne przetwarzanie próbek

UWAGA: Ze względu na niskie stężenia RNA SARS-CoV-2 w próbkach środowiskowych, wdrożenie etapu koncentracji jest kluczowe dla pomyślnego wykrywania33,34,35. Opisana poniżej jest pierwsza opisana metoda wykrywania SARS-CoV-2 w ściekach36.

  1. Pobieranie i zagęszczanie próbek ścieków
    1. Pobrać 1 l złożonej próbki ścieków z ciągu 24 godzin. Przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C i postępować zgodnie z protokołem w ciągu 24 godzin.
    2. Homogenizować próbkę, delikatnie potrząsając butelką. Zebrać 70 ml do probówki odśrodkowej o pojemności 100 ml lub podzielić próbkę na dwie probówki odśrodkowe o pojemności 50 ml.
    3. Zwiększyć 20 μl mengowirusa (3,2 x 103 kopie/μl) do 70 ml każdej próbki jako wewnętrzna kontrola procesu zagęszczania. Alternatywnie, wstrzyknąć 10 μl mengowirusa (3,2 x 103 kopii/μl) do każdej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
    4. Homogenizować próbkę i odwirowywać przy 700 x g przez 10 minut w celu usunięcia dużych cząstek i organizmów (osadów).
    5. Otrzymany supernatant należy wykorzystać do zagęszczenia za pomocą odśrodkowych urządzeń ultrafiltracyjnych o wartości granicznej 10 KDa poprzez odwirowanie przy 4 000 x g przez 40 minut w temperaturze 4 °C. Eluować koncentrat przez odwirowanie przy 700 x g przez 40 minut i odwrócenie położenia urządzenia do ultrafiltracji.
    6. Zmierz objętość powstałego koncentratu. Objętość będzie się zmieniać w zależności od ilości ciał stałych w próbce, które zatykają filtry odśrodkowe. W tym badaniu uzyskane objętości koncentratu mieściły się w przedziale 200-1 200 μL.
    7. Otrzymany koncentrat należy wykorzystać do ekstrakcji RNA za pomocą komercyjnego zestawu lub metody wewnętrznej. Do próbek wykorzystywanych w tym badaniu stosuje się specjalny komercyjny zestaw do ekstrakcji wirusowego RNA o objętości elucji 50 μl.
    8. Zmierz stężenie wyekstrahowanego RNA za pomocą zestawu do kwantyfikacji fluorometrycznego RNA. Wyekstrahowany RNA podzielić na podwielokrotności i zamrozić w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.
      UWAGA: Dla każdego zestawu procedur izolacji RNA należy uwzględnić ujemną kontrolę izolacji (NCI), zawierającą jedynie do wykrywania ewentualnego zanieczyszczenia podczas ekstrakcji.
  2. Pobieranie próbek powietrza za pomocą kompaktowego próbnika powietrza Coriolisa
    1. Wybierz strategię doboru próby zgodnie z celem badawczym, definiując częstotliwość próbkowania i lokalizacje pobierania próbek.
    2. Ustaw natężenie przepływu na próbniku powietrza (tutaj 50 l/min przez 30 minut). Należy pamiętać, że natężenie przepływu większe niż 200 l/min może powodować degradację wirusowego RNA, dlatego zaleca się stosowanie natężenia przepływu poniżej 200 l/min.
    3. Umieścić sterylny stożek w próbniku powietrza przed rozpoczęciem pobierania, pulsując początkiem. Po zakończeniu pobierania próbek dodaj 5-15 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do stożka. Delikatnie wirować lub wstrząsać próbką ręcznie przez 15 sekund. Próbki należy przechowywać w krioprobówkach do 24 godzin w temperaturze 4 °C lub w temperaturze -80 °C.
    4. Można wykonać opcjonalny etap zatężania. Oczyść i odkaż szyszki po każdym eksperymencie za pomocą wybielacza.
    5. Ekstrakcja RNA za pomocą komercyjnego zestawu lub metody wewnętrznej. Do próbek w tym badaniu stosuje się specjalny komercyjny zestaw do ekstrakcji wirusowego RNA o objętości elucji 50 μl.
    6. Zmierz stężenie wyekstrahowanego RNA za pomocą zestawu do kwantyfikacji fluorometrycznego RNA. Wyekstrahowany RNA podzielić na podwielokrotności i zamrozić w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.
      UWAGA: Dla każdego zestawu procedur izolacji RNA należy uwzględnić ujemną kontrolę izolacji (NCI), zawierającą jedynie do wykrywania ewentualnego zanieczyszczenia podczas ekstrakcji.

2. Kwantyfikacja RNA SARS-CoV-2 za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR)

UWAGA: Poniższy protokół jest zgodny z panelem diagnostycznym CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) rt-PCR37. Podzielić mieszaninę startera/sondy na kilka porcji, aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania.

  1. Przygotować wzorcową mieszankę reakcji dla każdego celu (mengowirus; SARS-CoV-2 [geny N1 i N2]) jak w Tabeli 1, w czystym kapturze w pomieszczeniu do ustawiania odczynników. Wymieszaj startery/sondę, mieszaninę i enzym przez odwrócenie pięć razy. Alternatywnie, impuls świetlny wiruje startery/sondę i enzym pięć razy.
    UWAGA: Podczas przygotowywania i używania wszystkie odczynniki należy przechowywać w chłodnym miejscu. Aby zminimalizować cykle zamrażania i rozmrażania, zdecydowanie zaleca się zamrażanie w podwielokrotnościach.
  2. Zakręć (1,000 x g przez 15-30 s) probówki, aby zebrać zawartość na dnie i umieść probówki w zimnym stojaku lub na lodzie.
  3. Oznaczyć probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml dla każdego celu. Do każdej probówki mikrowirówki dodać ilość każdego potrzebnego odczynnika (objętość na reakcję razy liczba reakcji wraz z potrzebnymi kontrolami). Mieszaj, pipetując w górę i w dół, a następnie wiruj przez 5 sekund, aby zebrać zawartość na dnie.
  4. Probówki do mikrowirówek należy przechowywać w chłodni i dozować 15 μl do probówek do PCR w paski lub na płytkę 96-dołkową w stojaku chłodzącym. Przykryj płytkę i przenieś ją do obszaru obchodzenia się z kwasami nukleinowymi (przechowuj ją w stojaku chłodzącym).
  5. Rozmrozić podwielokrotność wyekstrahowanego RNA i delikatnie wirować przez 5 s. Odpipetować 5 μl RNA (oprócz 5 μl kontroli bez matrycy [NTC], ujemnej kontroli izolacji [NCI] i kontroli pozytywnej [PC]) do każdej studzienki reakcyjnej lub probówki zawierającej wcześniej przygotowany mastermix. W razie potrzeby często zmieniaj rękawice, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
  6. Przykryj całą płytkę reakcyjną lub probówki i delikatnie przemieszaj. Odwirować (1 000 x g przez 15-30 s) płytkę lub probówki do PCR.
  7. Rozpocznij 25 μl RT-qPCR od następujących warunków cyklicznych: odwrotna transkryptaza w temperaturze 45 °C przez 10 minut; aktywacja polimerazy w temperaturze 95 °C przez 10 minut; 45 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 15 s; i wyżarzanie/przedłużanie w temperaturze 60 °C przez 45 s.
  8. Oblicz skuteczność odzyskiwania kontroli mengowirusa zgodnie z raportem Conte et al.38:
    figure-protocol-1 × 100

3. Warianty sekwencjonowania w ściekach i analiza danych

UWAGA: Opisany protokół jest zmodyfikowanym protokołem stworzonym przez Quick et al.39,40. Wykorzystuje dwa zestawy starterów do amplifikacji genomu SARS-CoV-2 za pomocą metodologii PCR tiling - startery ARTIC i startery VarSkip. Kombinacja starterów jest stosowana w celu zagwarantowania najlepszego pokrycia genomu i zminimalizowania możliwości wystąpienia nowych mutacji powodujących awarię starterów jednego typu. Ogólnie rzecz biorąc, protokół jest podzielony na trzy części: odwrotną transkrypcję (RT) i generowanie amplikonów, przygotowanie biblioteki sekwencjonowania oraz sekwencjonowanie i analizę danych.

  1. Odwrotna transkrypcja i generowanie amplikonów
    1. Upewnij się, że próbki wejściowe mają znaną wartość progu cyklicznego qPCR (Ct), aby prawidłowo rozcieńczyć je w wodzie o jakości PCR. Wartość Ct uzyskuje się podczas oznaczania ilościowego za pomocą qPCR. Rozcieńczenia są następujące: jeśli wartość Ct wynosi 12-15, rozcieńczyć próbki w stosunku 1:100; jeżeli wartość Ct wynosi 15-18, rozcieńczyć próbki w stosunku 1:10; jeżeli wartość Ct wynosi 18-35, nie rozcieńczać próbki. Próbki powyżej wartości Ct wynoszącej 35 mają duże prawdopodobieństwo, że nie będą działać.
    2. Na płytce do PCR odpipetować 16 μl każdej próbki do jej pozycji na płytce. Dodać 4 μl mastermix z odwrotną transkrypcją (RT) (5x). Przykryj płytkę i rozpocznij reakcję PCR w następujących warunkach: 25 °C przez 2 min, 55 °C przez 20 min i 95°C przez 1 min.
    3. Przygotować 10 μM rozcieńczeń każdego zestawu podkładów (ARTIC grupa A i grupa B oraz VarSkip grupa A i grupa B). Przygotuj mastermix dla każdego zestawu starterów (ARTIC zestaw A i B oraz VarSkip zestaw A i B), jak w Tabeli 2. Powstaną w ten sposób cztery mastermixy.
    4. Na nowej płytce do PCR odpipetować pipetą 20 μl mastermixu do każdego odpowiedniego dołka. Dodać 5 μl próbki RT do każdej mieszanki.
      UWAGA: Każda próbka będzie miała cztery mieszaniny reakcyjne - pulę ARTIC A i B oraz pulę VarSkip A i B.
    5. Przykryć płytkę i rozpocząć reakcję PCR w następujący sposób: aktywacja polimerazy w temperaturze 98 °C przez 30 s; 35 cykli denaturacji w temperaturze 98 °C przez 15 s; i wyżarzanie/rozciąganie w temperaturze 65 °C przez 4 min. Odwirować płytkę (1 000 x g przez 15-30 s). Połącz pule reakcji ARTIC i oddzielnie połącz pule reakcji VarSkip. Każda próbka będzie miała dwie reakcje amplikonowe o objętości 50 μl.
    6. Dodać 50 μl odczynnika na bazie kulek do oczyszczania PCR do każdego dołka i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
      UWAGA: Przed każdym użyciem energicznie wymieszaj odczynnik do oczyszczania PCR, aby ponownie zawiesić kulki.
    7. Umieść płytkę na stojaku do separacji magnetycznej i poczekaj, aż kulki utworzą granulkę, a płyn się usunie (~5 min). Odpipetować i odrzucić supernatant. Trzymaj płytkę PCR na stojaku magnetycznym.
    8. Trzymając płytkę PCR na stojaku magnetycznym, dodaj 200 μl 80% etanolu do każdej próbki, nie dotykając granulki kulki. Usuń etanol.
    9. Powtórz poprzedni krok. Pozostaw płytkę na stojaku magnetycznym odkrytą na 30 sekund, aby etanol mógł odparować.
    10. Wyjmij płytkę ze stojaka magnetycznego i dodaj 15 μl wody klasy PCR do każdej próbki. Zawiesić osad przez pipetowanie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
    11. Umieść talerz z powrotem na stojaku magnetycznym i pozwól, aby koraliki się rozsypały (2 min). Ostrożnie pobrać pipetę 15 μl supernatantu z każdej próbki na nową płytkę do PCR.
    12. Zmierz stężenie każdej próbki za pomocą zestawu do kwantyfikacji fluorometrycznego RNA. Pobrać około 50 ng z każdej próbki w 12,5 μl do następnego etapu. W razie potrzeby rozcieńczyć próbkę w wodzie o czystości PCR.
  2. Przygotowanie biblioteki
    1. Do każdej próbki dodać 1,75 μl buforu reakcyjnego z zestawu do przygotowania biblioteki DNA Illumina i 0,75 μl mieszanki enzymów. Przykryj płytkę, krótko zmieszaj i odwiruj (1 000 x g przez 15-30 s). Inkubować w temperaturze 21°C przez 5 minut i w temperaturze 65°C przez 5 minut.
    2. Na nowej płytce odpipetować 3 μl wody klasy PCR dla każdej próbki na nową płytkę PCR. Dodać 0,75 μl przygotowanych próbek, 1,25 μl kodów kreskowych do przygotowania biblioteki sekwencjonowania oraz 5 μl mastermixu ligazy DNA T4. Dobrze wymieszać pipetując, krótko odwirować (1 000 x g przez 15-30 s) w wirówce i inkubować w temperaturze 21 °C przez 20 minut i w temperaturze 65 °C przez 10 minut
      UWAGA: Jeśli używasz mniej niż 25 próbek, podwój wszystkie objętości na tym etapie.
    3. Zebrać wszystkie próbki razem, dodając 10 μl każdej próbki do tej samej probówki o niskim stopniu wiązania. Weź 480 μl do następnego kroku.
    4. Dodać do puli 192 μl odczynnika na bazie kulek do oczyszczania PCR i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    5. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż supernatant się usunie i utworzy się granulka. Usunąć supernatant. Wyjmij rurkę ze stojaka magnetycznego.
    6. Dodać 700 μl buforu krótkich fragmentów (SFB) i wymieszać pipetując. Umieść z powrotem na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż utworzy się granulka, a płyn się usunie (~5 min). Odpipetować supernatant i wyrzucić go.
    7. Powtórz poprzedni krok. Pozostaw rurkę na stojaku magnetycznym. Dodaj 100 μl 80% etanolu bez dotykania kulki. Odpipetować etanol i pozostawić kulkę do wyschnięcia przez 30 s.
      UWAGA: Nie pozwól, aby koralik wyschł.
    8. Wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego i dodaj 35 μl wody klasy PCR. Wymieszać pipetując i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym i pozwól, aby koralik się osadził, a płyn oczyścił. Pobrać pipetą 35 μl supernatantu do nowej probówki.
    9. Zmierz stężenie RNA w bibliotece połączonej. Odpipetować objętość potrzebną do osiągnięcia ilości 30-50 ng RNA i napełnić ją wodą klasy PCR, aby osiągnąć końcową objętość 30 μl.
    10. Przygotuj mieszaninę reakcyjną ligacji adaptera: 30 μl z biblioteki zbiorczej, 5 μl mieszanki adaptera II, 10 μl buforu reakcji ligacji (5x) i 5 μl ligazy DNA T4. Mieszać przez pipetowanie i odkręcanie (1 000 x g przez 15-30 s). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    11. Dodać 20 μl odczynnika na bazie kulek do oczyszczania PCR i wymieszać przez pipetowanie. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    12. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż utworzy się granulka kulki, a supernatant stanie się bezbarwny. Ostrożnie odpipetować i wyrzucić supernatant.
    13. Zdejmij z podstawki magnetycznej i dodaj 125 μl SFB. Wymieszaj przez pipetowanie i umieść z powrotem na stojaku magnetycznym, aby oddzielić kulki. Gdy ciecz jest klarowna, odpipetować i wyrzucić supernatant.
    14. Powtórz poprzedni krok. Pozostaw probówkę otwartą na stojaku magnetycznym na 30 sekund, aby część resztek płynu wyparowała.
    15. Zdjąć probówkę ze stojaka magnetycznego i dodać 15 μl buforu elucyjnego. Dobrze wymieszać pipetując i krótko odwirować (1 000 x g przez 15-30 s). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Umieść na stojaku magnetycznym na 2 min.
    16. Odpipetować 15 μl supernatantu do nowej probówki o niskiej zawartości wiązania. To jest ostatnia biblioteka. Zmierz stężenie za pomocą zestawu do fluorometrycznego oznaczania ilościowego DNA.
      UWAGA: W następnym kroku potrzebne jest 12 μL. Jeżeli stężenie jest bardzo wysokie i potrzeba mniej niż 12 μl biblioteki, należy napełnić do 12 μl odczynnikiem buforu elucyjnego.
  3. Ładowanie i sekwencjonowanie komór przepływowych
    1. Wprowadzić komórkę przepływową (R9.4.1) do urządzenia do sekwencjonowania DNA i RNA w czasie rzeczywistym.
    2. Przygotować mieszankę gruntującą, dodając 30 μl odczynnika do płukania (FLT) do probówki z odczynnikiem buforowym do przepłukiwania (FB). Wir do mieszania i wirowania (1,000 x g przez 15-30 s).
    3. Otwórz pokrywę portu zasysającego. Używając pipety o pojemności 1 000 μl, ustaw na 200 μl i włóż końcówkę do portu zasysającego. Obróć pokrętło regulacji głośności i zwiększaj objętość, aż płyn w końcówce będzie widoczny. Wyrzuć końcówkę.
      UWAGA: Obracaj kołem tylko do momentu, gdy w końcówce pojawi się kilka μl płynu. Wyciąganie większych ilości może spowodować uszkodzenie komory przepływowej.
    4. Powoli dodawać 800 μl mieszanki gruntującej do portu zalewowego, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków. Poczekaj 5 minut.
    5. W międzyczasie przygotuj biblioteki do wczytania. Wymieszać 37,5 μl buforu sekwencyjnego, 25,5 μl buforu ładującego i 12 μl biblioteki.
      UWAGA: Wymieszaj bufor ładujący przed pipetowaniem. Koraliki w tym odczynniku osiadają bardzo szybko.
    6. Otwórz pokrywę portów. Odpipetować 200 μl mieszanki gruntującej do portu zasysającego.
      UWAGA: Podczas pipetowania do portu zalewania przy otwartym otworze pokrywy można zauważyć małe krople wydobywające się z portu próbki. Pipetę należy pipetować na tyle wolno, aby port próbki mógł wciągnąć krople bez rozlania.
    7. Przed załadowaniem przygotowanej biblioteki dobrze wymieszaj przez pipetowanie. Używając pipety o pojemności 100 μl i ustawionej na 75 μl, weź bibliotekę i pipetuj kropla po kropli do portu próbki. Nie dotykaj portu i poczekaj, aż każda kropla zostanie wchłonięta przez port przed załadowaniem następnej kropli, aby uniknąć przelania płynu.
    8. Zamknij port pokrywy i port zalewania. Otwórz oprogramowanie i rozpocznij eksperyment sekwencjonowania. Wybierz opcję basecalling On. W przypadku biblioteki z 96 multipleksowanymi próbkami zwykle wystarcza 10-12 godzin sekwencjonowania, aby wygenerować wystarczającą ilość danych.
      UWAGA: Za pomocą oprogramowania można wstawić przykładowy arkusz w .csv formacie. Przykładowy arkusz wymaga następujących danych: flow_cell_id, position_id, sample_id, experiment_id, flow_cell_product_code i zestaw. Potrzebny jest identyfikator kuwety przepływowej (podany z boku celi przepływowej) wraz z używanym zestawem. Do sugerowanego protokołu należy wybrać zestaw LSK109.
  4. Sekwencjonowanie analizy danych
    1. Wstaw skompresowane odczyty fastq do wf-artic workflow41. Uruchom przepływ pracy oddzielnie z dwoma różnymi schematami wstępnymi (ARTIC/V4.1 i NEB-VarSkip/v1a). Dwa ". primertrimmed.rg.sorted.bam" są tworzone dla każdej próbki.
    2. Scal pliki BAM w jeden plik za pomocą polecenia "samtools merge" 42. Wstaw scalony plik BAM do narzędzia Freyja, pozostawiając ustawienia domyślne, aby odzyskać względną obfitość pochodzenia43.
    3. Aby utworzyć plik FASTA, wstaw scalony plik BAM do narzędzi "samtools mpileup" i "ivar" z ustawieniami domyślnymi44,45. W celu wywołania mutacji załaduj plik FASTA do narzędzia Nextclade46,47.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki podsumowane w Tabeli 3 pokazują przykłady wykrywania i kwantyfikacji RNA SARS-CoV-2 w próbkach ścieków i powietrza przy użyciu metody opisanej w tym artykule. Próbki ścieków pobrano z oczyszczalni ścieków w Hiszpanii i Słowenii i uznano je za dodatnie, jeśli Ct było mniejsze niż 40 w co najmniej dwóch z trzech powtórzeń, przy czym kwantyfikację uznano za ważną, jeśli Ct miało odchylenie mniejsze niż 5%. W Hiszpanii i Portugalii pobrano próbki powietrza w pomieszczeniach i na zewnątrz i zastosowano...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykrywanie i oznaczanie ilościowe drobnoustrojów i wirusów za pomocą metod (RT-)qPCR zyskało powszechną akceptację ze względu na ich niezwykłą czułość. Techniki te napotykają jednak wiele wyzwań podczas analizy próbek środowiskowych. Próbki ścieków zawierają mnóstwo substancji hamujących, które mogą zniekształcać pomiary i generować mylące wyniki. Aby poradzić sobie z tymi ograniczeniami i zwiększyć precyzję, opracowano, zaprojektowano i wdrożono złożony protokół. Protokół ten został opracowany poprzez połączenie protoko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów ekonomicznych ani innych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wykonana dzięki wsparciu finansowemu Rządu Regionalnego Kastylii i León oraz programu FEDER (projekty CLU 2017-09, UIC315 i VA266P20).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Adapter + A25 + A2: D19 + A2: D20 + A2 + A2: D19SekwencjonowanieOxford NanoporeEXP-AMII001
Zestaw AllPrep PowerViral DNA/RNA Zestawekstrakcji RNAQiagen28000-50
AMPure XPBeckman CoulterA63880Oczyszczanie PCR, NGS Oczyszczanie, Czyszczenie PCR
Panel amplikonów ARTIC SARS-CoV-2IDT10011442Amplifikacja genomu SARS-CoV-2
Blunt/TA Ligase Master MixNEBM0367SPrzygotowanie biblioteki
CENTRICON PLUS&nieśmiały; 70 10 kda.Fisher Scientific10296062Filtry stężenia
CORIOLIS KOMPAKTOWY PRÓBNIK POWIETRZABertin Technologies083-DU001Próbnik powietrza
Duran  butelki laboratoryjneButelki do pobierania próbekMerckZ305200-10EA
Komórka przepływowa (R9.4.1)SekwencjonowanieOxford NanoporeFLO-MIN106D
Ogólne materiały eksploatacyjne laboratoryjne (probówki, płytki qPCR itp.)
Zestaw do sekwencjonowania ligacjiOxford NanoporeSQK-LSK109Sekwencjonowanie
LunaScript  Zestaw RT SuperMix NEBE3010  Synteza cDNA
Zestaw do kontroli ekstrakcji mengowirusaBiom é rieuxKMGKontrola koncentracji
Nalgene Ogólne długoterminowe przechowywanie Probówki kriogeniczneThermofisher5011-0012Przechowywanie próbek
Natywne rozszerzenie kodów kreskowych 1-12 (bez PCROxford NanoporeEXP-NBD104Kod kreskowy
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEBE7595Naprawa DNA
NEBNext VarSkip Krótkie mieszanki podkładowe SARS-CoV-2NEBE7658Amplifikacja genomu SARS-CoV-2
NEBNext  Bufor reakcyjny do szybkiej ligacjiSekwencjonowanie NEBB6058S 
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiMerckP4474Bufor zbiorczy
Sola fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, 1X), sterylnie filtrowanaThermofisherJ61196. APElucja próbek powietrza
Q5  Hot Start High-Fidelity 2X Master MixNEBM0494Sgorący start Polimeraza DNA
Zestaw testowy Qubit RNA HS ThermofisherQ32852Kwantyfikacja RNA
SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer i Zestaw sondIDT10006713Mieszanka startera-sondy i kontrola pozytywna qPCR
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master MixThermofisherA15299Zestaw RT-qPCR
do

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naming the Coronavirus Disease (COVID-19) and the Virus that Causes it. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/naming-the-coronavirus-disease-(cover-2019)-and-the-virus-that-causes-it (2020).
  2. Lab Workplace Safety. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/lab-safety-practices.html (2020).
  3. Gonçalves, J., et al. Centralized and decentralized wastewater-based epidemiology to infer COVID-19 transmission - A brief review. One Health. 15, 100405(2022).
  4. Dawood, F. S., et al. Estimated global mortality associated with the first 12 months of 2009 pandemic influenza A H1N1 virus circulation: a modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 12 (9), 687-695 (2012).
  5. Gonçalves, J., Koritnik, T., Paragi, M. Assessment of weather and atmospheric pollution as a co-factor in the spread of SARS-CoV-2. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 92 (3), e2021094(2021).
  6. Gonçalves, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA in hospital wastewater from a low COVID-19 disease prevalence area. The Science of The Total Environment. 755, 143226(2021).
  7. Mizumoto, K., Kagaya, K., Zarebski, A., Chowell, G. Estimating the asymptomatic proportion of coronavirus disease 2019 (COVID-19) cases on board the Diamond Princess cruise ship, Yokohama, Japan, 2020. Eurosurveillance. 25 (10), 2000180(2020).
  8. Polo, D., et al. Making waves: Wastewater-based epidemiology for COVID-19 - approaches and challenges for surveillance and prediction. Water Research. 186, 116404(2020).
  9. Shmueli, G., Burkom, H. Statistical challenges facing early outbreak detection in biosurveillance. Technometrics. 52 (1), 39-51 (2010).
  10. Simonsen, L., et al. Global mortality estimates for the 2009 influenza pandemic from the GLaMOR project: A modeling study. PLoS Medicine. 10 (11), e1001558(2013).
  11. Oran, D. P., Topol, E. J. Prevalence of asymptomatic SARS-CoV-2 infection: a narrative reivew. Annals of Internal Medicine. 173, 362-367 (2020).
  12. Daughton, C., Jones-Lepp, T. Pharmaceuticals and Personal Care Products in the Environment: Scientific and Regulatory Issues. ACS Symposium Series. , American Chemical Society. Washington, DC. (2001).
  13. Zuccato, E., et al. Cocaine in surface waters: a new evidence-based tool to monitor community drug abuse. Environmental Health. 4, 14(2005).
  14. Aguiar-Oliveira, M. deL., et al. Wastewater-based epidemiology (WBE) and viral detection in polluted surface water: A valuable tool for COVID-19 surveillance-a brief review. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 9251(2020).
  15. García-Encina, P. A. Wastewater-based epidemiology (WBE). Water and Environment Journal. 35 (4), 1162-1163 (2021).
  16. Mao, K., Zhang, H., Pan, Y., Yang, Z. Biosensors for wastewater-based epidemiology for monitoring public health. Water Research. 191, 116787(2021).
  17. Shereen, M. A., Khan, S., Kazmi, A., Bashir, N., Siddique, R. COVID-19 infection: Origin, transmission, and characteristics of human coronaviruses. Journal of Advanced Research. 24, 91-98 (2020).
  18. Chia, P. Y., et al. Detection of air and surface contamination by SARS-CoV-2 in hospital rooms of infected patients. Nature Communications. 11 (1), 2800(2020).
  19. Lei, H., et al. SARS-CoV-2 environmental contamination associated with persistently infected COVID-19 patients. Influenza and Other Respiratory Viruses. 14 (6), 688-699 (2020).
  20. Razzini, K., et al. SARS-CoV-2 RNA detection in the air and on surfaces in the COVID-19 ward of a hospital in Milan, Italy. The Science of The Total Environment. 742, 140540(2020).
  21. da Silva, P. G., Gonçalves, J., Nascimento, M. S. J., Sousa, S. I. V., Mesquita, J. R. Detection of SARS-CoV-2 in the indoor and outdoor areas of urban public transport systems of three major cities of Portugal in 2021. International Journal of Environmental Research and Public Health. 19 (10), 5955(2022).
  22. Barbieri, P., et al. Molecular detection of SARS-CoV-2 from indoor air samples in environmental monitoring needs adequate temporal coverage and infectivity assessment. Environmental Research. 198, 111200(2021).
  23. Lednicky, J., et al. Earliest detection to date of SARS-CoV-2 in Florida: Identification together with influenza virus on the main entry door of a university building, February 2020. PLoS One. 16 (1), 0245352(2021).
  24. Santarpia, J. L., et al. Aerosol and surface contamination of SARS-CoV-2 observed in quarantine and isolation care. Scientific Reports. 10 (1), 12732(2020).
  25. Chirizzi, D., et al. SARS-CoV-2 concentrations and virus-laden aerosol size distributions in outdoor air in north and south of Italy. Environment International. 146, 106255(2021).
  26. Hadei, M., et al. Presence of SARS-CoV-2 in the air of public places and transportation. Atmospheric Pollution Research. 12 (3), 302-306 (2021).
  27. Moreno, T., et al. Tracing surface and airborne SARS-CoV-2 RNA inside public buses and subway trains. Environment International. 147, 106326(2021).
  28. Mouchtouri, V. A., et al. Environmental contamination of SARS-CoV-2 on surfaces, air-conditioner and ventilation systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 230, 113599(2020).
  29. Setti, L., et al. Airborne transmission route of COVID-19: why 2 meters/6 feet of inter-personal distance could not be enough. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 2932(2020).
  30. SARS-CoV-2 Transmission. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/science/science-briefs/sars-cov-2-transmission.html (2021).
  31. Coronavirus Disease (COVID-19): How is it Transmitted. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/q-a-detail/coronavirus-disease-covid-19-how-is-it-transmitted (2021).
  32. Dinoi, A., et al. A review on measurements of SARS-CoV-2 genetic material in air in outdoor and indoor environments: Implication for airborne transmission. The Science of the Total Environment. 809, 151137(2022).
  33. Bosch, A., et al. Analytical methods for virus detection in water and food. Food Analytical Methods. 4, 4-12 (2011).
  34. Gonçalves, J., et al. Surveillance of human enteric viruses in coastal waters using concentration with methacrylate monolithic supports prior to detection by RT-qPCR. Marine Pollution Bulletin. 128, 307-317 (2018).
  35. La Rosa, G., Muscillo, M. Molecular detection of viruses in water and sewage. Viruses in Food and Water. , Woodhead Publishing. 97-125 (2013).
  36. Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
  37. CDC - 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Fact Sheet for Healthcare Providers. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/85028 (2020).
  38. Conte, M. Airborne concentrations of SARS-CoV-2 in indoor community environments in Italy. Environmental Science and Pollution Research International. 29 (10), 13905-13916 (2022).
  39. Quick, J. nCoV-2019 sequencing protocol v3 (LoCost). protocols.io. , Available from: https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing-protocol-v3-locost-bh42j8ye (2020).
  40. Tyson, J. R. Improvements to the ARTIC multiplex PCR method for SARS-CoV-2 genome sequencing using nanopore. , (2020).
  41. ARTIC SARS-CoV-2 Workflow. , Available from: https://github.com/epi2me-labs/wf-artic (2022).
  42. Li, H., et al. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  43. Freyja. , Available from: https://github.com/andersen-lab/Freyja (2022).
  44. Li, H. A statistical framework for SNP calling, mutation discovery, association mapping and population genetical parameter estimation from sequencing data. Bioinformatics. 27 (21), 2987-2993 (2011).
  45. Grubaugh, N. D., et al. An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar. Genome Biology. 20 (1), 8(2019).
  46. Hadfield, J., et al. Nextstrain: real-time tracking of pathogen evolution. Bioinformatics. 34 (23), 4121-4123 (2018).
  47. Aksamentov, I., Roemer, C., Hodcroft, E. B., Neher, R. A. Nextclade: clade assignment, mutation calling and quality control for viral genomes. Journal of Open Source Software. 6 (67), 3773(2021).
  48. Markt, R., et al. Detection and stability of SARS-CoV-2 fragments in wastewater: impact of storage temperature. Pathogens. 10 (9), 1215(2021).
  49. Kocamemi, B. A., et al. First Data-Set on SARS-CoV-2 Detection for Istanbul Wastewaters in Turkey. MedRxiv. , (2020).
  50. Randazzo, W., et al. SARS-CoV-2 RNA in wastewater anticipated COVID-19 occurrence in a low prevalence area. Water Research. 181, 115942(2020).
  51. Hoorfar, J., et al. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays. Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1863-1868 (2004).
  52. Parshionikar, S. U., Cashdollar, J., Shay Fout, G. Development of homologous viral internal controls for use in RT-PCR assays of waterborne enteric viruses. Journal of Virological Methods. 121, 39-48 (2004).
  53. Nalla, A. K. Comparative performance of SARS-CoV-2 detection assays using seven different primer-probe sets and one assay kit. Journal of Clinical Microbiology. 58 (6), 00557(2020).
  54. Hirotsu, Y., Mochizuki, H., Omata, M. Double-quencher probes improve detection sensitivity toward Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in a reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. Journal of Virological Methods. 284, 113926(2020).
  55. Ahmed, W. First confirmed detection of SARS-CoV-2 in untreated wastewater in Australia: A proof of concept for the wastewater surveillance of COVID-19 in the community. The Science of The Total Environment. 728, 138764(2020).
  56. Bar-Or, I., et al. Detection of SARS-CoV-2 variants by genomic analysis of wastewater samples in Israel. The Science of the Total Environment. 789, 148002(2021).
  57. La Rosa, G., Bonadonna, L., Lucentini, L., Kenmoe, S., Suffredini, E. Coronavirus in water environments: Occurrence, persistence and concentration methods - A scoping review. Water Research. 179, 115899(2020).
  58. Wu, F., et al. SARS-CoV-2 titers in wastewater are higher than expected from clinically confirmed cases. mSystems. 5, 00614(2020).
  59. Wurtzer, S., et al. Evaluation of lockdown effect on SARS-CoV-2 dynamics through viral genome quantification in waste water, Greater Paris, France, 5 March to 23 April 2020. European Communicable Disease Bulletin. 25 (50), 2000776(2020).
  60. VATar COVID-19 | Caso de Exito - Ministerio para la Transición Ecologica y el Reto Demografico. , Available from: https://esri.es/es-es/descubre-los-gis/casos-de-exito/administracion-/vatar-covod19-miteco-cs (2022).
  61. Nemudryi, A., et al. Temporal detection and phylogenetic assessment of SARS-CoV-2 in municipal wastewater. Cell Reports. Medicine. 1 (6), 100098(2020).
  62. Rios, G., et al. Monitoring SARS-CoV-2 variants alterations in Nice neighborhoods by wastewater nanopore sequencing. The Lancet Regional Health. Europe. 10, 100202(2021).
  63. Gomes da Silva, P. Environmental dissemination of SARS-CoV-2 in a University Hospital during the COVID-19 5th wave Delta variant peak in Castile-León, Spain. International Journal of Environmental Research and Public Health. 20, 1574(2023).
  64. Gonçalves, J., et al. Exposure assessment of SARS-CoV-2 and Nov GII/GII in aerosols generated by a municipal wastewater treatment plant. , (2022).
  65. Lednicky, J. A., et al. Isolation of SARS-CoV-2 from the air in a car driven by a COVID patient with mild illness. International Journal of Infectious Diseases. 108, 212-216 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

epidemiologia ciek wpobieranie pr bek powietrzailo ciowe oznaczanie RNA wirusasekwencjonowanie ca ego genomuRT qPCRzag szczanie ciek wekstrakcja kwas w nukleinowychseparacja magnetycznanadz r rodowiskowy

Powiązane artykuły