Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zagęszczenie cząstek wirusa w próbkach wody i ścieków środowiskowych przy użyciu flokulacji mleka odtłuszczonego i ultrafiltracji

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65058

⸱

17 marca 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Civil Engineering, Price Faculty of Engineering, University of Manitoba, 2Department of Microbiology, Faculty of Science, University of Manitoba

W tym artykule

Podsumowanie

Stężenie wirusa z próbek wody i ścieków środowiskowych jest trudnym zadaniem, przeprowadzanym głównie w celu identyfikacji i kwantyfikacji wirusów. Chociaż opracowano i przetestowano kilka metod koncentracji wirusów, tutaj wykazujemy skuteczność ultrafiltracji i flokulacji mleka odtłuszczonego dla wirusów RNA z różnymi typami próbek.

Streszczenie

Epidemiologia oparta na wodzie i ściekach pojawiła się jako alternatywne metody monitorowania i przewidywania przebiegu epidemii w społecznościach. Odzyskiwanie frakcji mikrobiologicznych, w tym wirusów, bakterii i mikroeukariontów ze ścieków i próbek wody środowiskowej jest jednym z najtrudniejszych kroków w tych podejściach. W tym badaniu skupiliśmy się na skuteczności odzyskiwania metod sekwencyjnej ultrafiltracji i flokulacji mleka odtłuszczonego (SMF) przy użyciu opancerzonego RNA jako wirusa testowego, który jest również używany jako kontrola w niektórych innych badaniach. Zastosowano filtrację wstępną z membranowymi filtrami dyskowymi 0,45 μm i 0,2 μm w celu wyeliminowania cząstek stałych przed ultrafiltracją, aby zapobiec zatykaniu się urządzeń ultrafiltracyjnych. Próbki testowe, przetworzone metodą sekwencyjnej ultrafiltracji, odwirowano z dwiema różnymi prędkościami. Zwiększona prędkość skutkowała niższymi wskaźnikami odzyskiwania i pozytywności opancerzonego RNA. Z drugiej strony, SMF skutkowało stosunkowo stałymi wskaźnikami odzyskiwania i pozytywności opancerzonego RNA. Dodatkowe testy przeprowadzone na próbkach wody środowiskowej wykazały przydatność SMF do koncentracji innych frakcji mikrobiologicznych. Podział wirusów na cząstki stałe może mieć wpływ na ogólne wskaźniki odzysku, biorąc pod uwagę etap filtracji wstępnej zastosowany przed ultrafiltracją próbek ścieków. SMF z filtracją wstępną działał lepiej, gdy był stosowany do próbek wody środowiskowej ze względu na niższe stężenia ciał stałych w próbkach, a tym samym niższe szybkości rozdzielania na ciała stałe. W niniejszej pracy pomysł zastosowania sekwencyjnej metody ultrafiltracji zrodził się z konieczności zmniejszenia końcowej objętości koncentratów wirusowych w czasie pandemii COVID-19, kiedy podaż powszechnie stosowanych urządzeń do ultrafiltracji była ograniczona i zaistniała potrzeba opracowania alternatywnych metod zagęszczania wirusów.

Wprowadzenie

Określenie efektywnego stężenia mikroorganizmów w próbkach powierzchniowych i ściekowych do analizy społeczności mikrobiologicznej i badań epidemiologicznych, jest jednym z ważnych kroków do monitorowania i przewidywania przebiegu epidemii w społecznościach1,2. Pandemia COVID-19 unaoczniła znaczenie doskonalenia metod koncentracji. COVID-19 pojawił się pod koniec 2019 r. i od marca 2023 r. nadal stanowi zagrożenie dla zdrowia ludzkiego, życia społecznego i gospodarki. Skuteczne strategie nadzoru i kontroli mające na celu złagodzenie skutków epidemii COVID-19 w społecznościach stały się ważnym tematem badawczym, ponieważ oprócz szybkiej transmisji i rozprzestrzeniania się wirusa, a także niezgłoszonych i niezdiagnozowanych przypadków bezobjawowych, pojawiają się nowe fale i warianty COVID-19, a także niezgłoszone i niezdiagnozowane przypadki bezobjawowe3,4,5. Wykorzystanie epidemiologii COVID-19 opartej na ściekach przez organizacje społeczeństwa obywatelskiego, agencje rządowe oraz publiczne lub prywatne przedsiębiorstwa użyteczności publicznej było pomocne w szybkim dostarczaniu informacji związanych z epidemią i łagodzeniu skutków epidemii COVID-196,7,8,9. Jednak stężenie SARS-CoV-2, wirusa otoczkowego RNA, w próbkach ścieków nadal stanowi wyzwanie10. Na przykład jednym z tych wyzwań jest podział SARS-CoV-2 w ciałach stałych ścieków, co może mieć wpływ na odzysk, gdy ciała stałe są eliminowane podczas koncentracji11. W takim przypadku kwantyfikacja/ocena powinna koncentrować się zarówno na fazie stałej, jak i wodnej próbek wody w środowisku, a nie tylko na fazie wodnej. Ponadto wybór metody zatężania może być modyfikowany w oparciu o dalsze badania i analizy. Koncentracja cząsteczek wirusa i patogenów w próbkach środowiskowych stała się pilnym tematem badawczym dzięki postępom w dziedzinie sekwencjonowania i mikrobiomu.

Zastosowano różne metody koncentracji wirusów w dziedzinie koncentracji wirusa z próbek wody i ścieków ze środowiska. Niektóre powszechnie stosowane metody to filtracja, flokulacja mleka odtłuszczonego (SMF), adsorpcja/elucja i wytrącanie glikolu polietylenowego12-17. Wśród nich SMF został uznany za tanią i skuteczną metodę, pomyślnie przetestowaną i stosowaną do odzyskiwania wirusów, w tym SARS-CoV-2, ze ścieków i wód powierzchniowych12,15,16,18. Procedura SMF jest stosunkowo nowym podejściem, które zyskało coraz większe uznanie w wielu badaniach środowiskowych jako odpowiednia metodologia jednoczesnego odzyskiwania szerokiej gamy mikroorganizmów, takich jak wirusy, bakterie i pierwotniaki, ze wszystkich rodzajów próbek wody, a mianowicie szlamów, ścieków surowych, ścieków i próbek ścieków19. W porównaniu z innymi znanymi metodologiami odzyskiwania wirusów z próbek środowiskowych, takimi jak ultrafiltracja i elucja alkaliczna glicyny, podejście oparte na liofilizacji lub ultrawirowanie i elucja alkaliczna glicyny, SMF została uznana za najbardziej efektywną metodę o wyższych wskaźnikach odzyskiwania i wykrywania wirusów18,20. W niniejszym badaniu wykorzystaliśmy opancerzony RNA jako wirusa testowego do oceny skuteczności odzyskiwania metod koncentracji wirusa, w tym testów do oceny wyzdrowienia SARS-CoV-221,22.

Tutaj przetestowaliśmy próbki ścieków i wody środowiskowej, aby zademonstrować użyteczność SMF i metody sekwencyjnej ultrafiltracji do koncentracji frakcji mikrobiologicznych do ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR), metagenomiki opartej na sekwencjach i sekwencjonowania głębokiej amplikonu. SMF jest metodą stosunkowo tańszą i optymalną dla większej objętości próbek w porównaniu z metodami ultrafiltracji. Pomysł zastosowania metody ultrafiltracji sekwencyjnej zrodził się z konieczności zmniejszenia końcowej objętości koncentratów wirusowych w czasie pandemii COVID-19, kiedy podaż powszechnie stosowanych urządzeń do ultrafiltracji była ograniczona i zaistniała potrzeba opracowania alternatywnych metod koncentracji wirusów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Porównanie seryjnej ultrafiltracji i flokulacji mleka odtłuszczonego w celu koncentracji wirusów w próbkach ścieków

  1. Przygotowanie próbki
    1. Pobrać 2 l złożonych próbek ścieków surowych (dopływających proporcjonalnie do przepływu) w ciągu 24 godzin. Próbki pobrano z trzech głównych oczyszczalni ścieków (oczyszczalni ścieków) w Winnipeg w Kanadzie latem i jesienią 2020 r. (tabela 1).
    2. Próbki należy przetransportować do laboratorium w odpornych na światło butelkach w pojemniku chłodzącym i przetworzyć je w ciągu 24 godzin. Zebrać dane dotyczące charakterystyki fizykochemicznej i biologicznej ścieków.
  2. Oznaczanie stężenia wirusa
    UWAGA: Sekwencyjna metoda ultrafiltracji i metoda flokulacji organicznej, a mianowicie flokulacja mleka odtłuszczonego (SMF), zostały zastosowane do oceny całkowitej skuteczności odzyskiwania każdej metody przy użyciu opancerzonego RNA jako testowego wirusa23. Inni badacze również wykorzystali opancerzone RNA jako wirusa kontrolnego do oceny metod odzyskiwania koncentracji wirusów otoczkowych, takich jak rodzina Coronaviridae22,24,25,26.
    1. W celu dodania opancerzonego RNA należy ustawić objętości testowe ścieków dla metod ultrafiltracji i SMF odpowiednio na 140 ml i 500 ml. Za pomocą pipetora nabij 5 x 104 kopie opancerzonego RNA do sześciu próbek świeżych ścieków pobranych w jednym dniu i sześciu próbek świeżych ścieków w innym dniu, dla każdej metody ultrafiltracji; ponadto spike six przechowywał (w temperaturze 4 °C) próbki ścieków pobrane w trzecim, późniejszym terminie i przetworzone kilka dni później dla SMF.
      UWAGA: Każdy z sześciu zestawów próbek pobranych w różnych terminach składał się z dwóch próbek z każdej z trzech oczyszczalni ścieków. W naszym badaniu pierwszy zestaw świeżych próbek ścieków został pobrany 8 lipca 2020 r., drugi 30 września 2020 r., a próbki ścieków, które mają być przechowywane dla SMF 14 października 2020 r.
    2. Mieszać przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu zaszczepienia i homogenizacji opancerzonego RNA w próbkach za pomocą mieszadła magnetycznego.
    3. Usuń wszystkie cząstki lub komórki większe niż 0,2 μm i przeprowadź ultrafiltrację.
      1. Przefiltruj wzbogacone próbki ścieków (120 ml z każdej 140 ml wzbogaconej próbki) przez gazę i niskobiałkowe filtry krążkowe o średnicy 0,45 μm i 0,2 μm, 47 mm, aby usunąć duże cząstki, osady, eukarionty i bakterie27. Przefiltrowane próbki należy przetworzyć przy użyciu metod ultrafiltracji opisanych poniżej.
        UWAGA: Próbki ścieków pobrane 8 lipca i 30 września zostały wykorzystane do metod ultrafiltracji o wartości odpowiednio 3 000 x g i 7 500 x g.
      2. W przypadku sekwencyjnej ultrafiltracji przy 3 000 x g (UF-3k x g), należy zagęścić łącznie 120 ml próbki testowej pobranej pierwszego dnia przy 3 000 x g przez 30 minut, ładując 60 ml próbki dwukrotnie do około 5 ml za pomocą urządzenia odśrodkowego marki A, 30 kDa. Następnie zagęścić objętość 5 ml przy 3 000 x g przez 30 minut za pomocą urządzenia odśrodkowego marki B o stężeniu 30 kDa do 500-1 200 μl.
      3. W przypadku sekwencyjnej ultrafiltracji przy 7,500 x g (UF-7,5k x g) należy zmienić prędkość wirowania urządzenia odśrodkowego marki B z 3,000 x g na 7,500 x g, aby uzyskać mniejsze objętości końcowe, zgodnie z zaleceniami producenta, i utrzymać prędkość wirowania urządzenia odśrodkowego marki A na tym samym poziomie.
        UWAGA: Testy przeprowadzono na próbkach pobranych 30 września.
    4. W przypadku formatu SMF wykonaj czynności opisane poniżej.
    5. Próbki ścieków (po 500 ml każda) należy pobrać bezpośrednio do koncentratu za pomocą protokołu SMF16,18, bez filtracji wstępnej za pomocą gazy i niskobiałkowych filtrów membranowych, jak opisano poniżej.
    6. Rozpuścić 0,5 g odtłuszczonego mleka w proszku w 50 ml syntetycznej wody morskiej, aby uzyskać 1% (w/v) roztwór mleka odtłuszczonego i ostrożnie dostosować pH roztworu do 3,5 za pomocą 1 N HCl.
      UWAGA: Zakwaszenie sprawia, że wirusy agregują się i wytrącają z wody ze względu na zmianę ich punktu izoelektrycznego16 i poprawia rozpuszczalność mleka w proszku28.
    7. Dodać 5 ml roztworu mleka odtłuszczonego do 500 ml próbek ścieków surowych, aby uzyskać końcowe stężenie mleka odtłuszczonego 0,01% (w/v).
    8. Mieszać próbki przez 8 godzin ze średnią prędkością i pozostawić uformowane kłaczki do osiadania przez kolejne 8 godzin w temperaturze pokojowej.
    9. Ostrożnie usunąć supernatanty za pomocą pipet serologicznych, nie naruszając osadzonych kłaczków. Przenieść końcową objętość 50 ml zawierającą kłaczki do probówek wirowych i odwirować przy 8 000 x g przez 30 minut w temperaturze 8 °C.
    10. Ostrożnie zeskrobać granulki za pomocą wysterylizowanej szpatułki i ponownie zawiesić pozostałe granulki w probówkach w 250 μl 0,2 M buforu fosforanu sodu (pH 7,5) po usunięciu supernatantu. Przenieś zeskrobane i ponownie zawieszone granulki do tych samych 1,5 ml mini-probówek wirówek.
  3. Przeprowadzić ekstrakcję wirusowego RNA z koncentratów wirusowych próbek ścieków i testy wydajności odzyskiwania przy użyciu zestawu do ekstrakcji RNA o stosunku 25:24:1 alkoholu fenolo-chloroformowego:izoamylowego i β-merkaptoetanolu, zgodnie z instrukcjami producenta, w celu poprawy wydajności ekstrakcji. Na koniec eluować RNA w 50 μl buforu elucyjnego.
  4. Ilościowa analiza łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR)
    1. Określ ilościowo opancerzone RNA za pomocą dziesięciokrotnych rozcieńczeń (7,8 x 10,4 do 7,8 kopii genów) syntetycznego jednoniciowego konstruktu DNA lub gBlock. W Tabeli 2 przedstawiono startery i zestawy sond, które wykrywają i określają ilościowo opancerzone RNA.
    2. Zaprojektuj zestawy starterów i sond za pomocą narzędzia do projektowania starterów29 i celuj w region 95 pz (konstrukt gBlock) w genomie opancerzonego RNA.
    3. Uzyskać krzywe kalibracyjne dla każdej serii RT-qPCR. Uwzględnij kontrole ujemne w każdej serii qPCR. Uruchamianie standardów, przykładów i kontrolek innych niż szablony w trzech egzemplarzach.
    4. Przygotuj każde 10 μl mieszaniny RT-qPCR w następującej kolejności: 2,5 μl 4x mieszanki głównej, 400 nM każdego startera, sonda 200 nM i 2,5 μl matrycy, a także ultraczysta woda destylowana wolna od DNAzy/RNAzy.
    5. Przeprowadzaj reakcje z cyklami termicznymi w temperaturze 50 °C przez 5 minut, a następnie 45 cykli w temperaturze 95 °C przez 10 s i 60 °C przez 30 s w systemie PCR w czasie rzeczywistym. Jeśli CT wynosił <40, należy wziąć pod uwagę, że próbka Armored RNA jest dodatnia.
    6. Przeprowadź testy qPCR i RT-qPCR przy użyciu albuminy surowicy bydlęcej z surowymi próbkami ścieków, aby ocenić możliwość inhibitorów lub zanieczyszczeń, takich jak kwasy humusowe24. Nie zaobserwowano istotnych różnic między próbkami z enzymem i bez niego.
  5. Obliczyć stężenia na podstawie krzywej wzorcowej. Obliczyć procent skuteczności odzysku, dzieląc odzyskane stężenie przez stężenie wzbogacone.
  6. Przekształć numery kopii genów przy użyciu funkcji logarytmu10 do analizy. Uruchom ogólny model liniowy przy użyciu narzędzia do analizy statystycznej na danych qPCR. Zastosuj test Tukeya, aby wykryć różnice między metodami i zabiegami. Przyjmij, że wartość p wynosi 0,05, aby był minimalnym poziomem istotności dla testu.

2. Filtracja i koncentracja wirusów DNA i RNA dla epidemiologii opartej na wodzie

  1. Do zbierania środowiskowych wód powierzchniowych należy pobrać 10 l próbek środowiskowych wód powierzchniowych i użyć 10 l próbek wody dejonizowanej do kontroli tła. Przechowywać wszystkie próbki w pomieszczeniu o temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia w ciągu 24 godzin od pobrania próbki.
  2. Wykonaj koncentrację wirusów z próbek środowiskowych za pomocą SMF, wykonując czynności opisane poniżej.
    1. Wykonaj filtrację kapsułkową i próżniową przy użyciu kapsułek do pobierania próbek wód gruntowych o dużej pojemności i membranowych filtrów dyskowych o rozmiarach 0,45 μm, 0,2 μm i 0,1 μm, aby zminimalizować szum podczas sekwencjonowania metagenomicznego, od większych frakcji, takich jak mikroeukarionty i bakterie, po mniejsze, takie jak wirusy.
    2. Przygotuj 1% wagowo wstępnie flokulowany roztwór odtłuszczonego mleka w 1,32 l syntetycznej wody morskiej z 13,2 g odtłuszczonego mleka w proszku. Doprowadzić pH tej zawiesiny do 3,5 przy użyciu 1 N HCl.
  3. Dostosować pH próbek wód powierzchniowych środowiska do 3,5 przy użyciu 1 N HCl.
  4. Przenieść 100 ml wstępnie flokulowanego, zakwaszonego roztworu mleka odtłuszczonego do 10 l zakwaszonej (pH 3,5) próbki wody środowiskowej (końcowe stężenie mleka odtłuszczonego 0,01% [w/v]).
  5. Za pomocą mieszadła magnetycznego i mieszadła magnetycznego mieszać próbki przez 8 godzin w temperaturze pokojowej i pozostawić kłaczki do osadzania się grawitacyjnie przez dodatkowe 8 godzin. Nie naruszając kłaczków, ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pompy próżniowej.
  6. Podzielić i zrównoważyć pozostałe kłaczki zgodnie z wagą w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml i odwirować je w temperaturze 8 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Odrzucić supernatant i rozpuścić otrzymany osad (który teoretycznie zawiera wirusy będące przedmiotem zainteresowania) w 200 μl 0,2 M buforu fosforanu sodu.
  8. Potraktuj rozpuszczony osad DNazą I i RNazą A, postępując zgodnie z instrukcjami producenta, w celu wyeliminowania wolnego DNA i RNA, które mogą być współwytrącone w wyniku zestawu używanego do ekstrakcji kwasów nukleinowych. Dezaktywuj DNazę I i RNazę A zgodnie z instrukcjami producenta.
  9. Wyekstrahuj całkowitą ilość kwasów nukleinowych z rozpuszczonego osadu za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA/RNA, zgodnie z instrukcjami producenta.
  10. Określić ilościowo całkowitą ilość wyekstrahowanego DNA i RNA z próbek ścieków za pomocą fluorometru. Próbki o stężeniach >1 ng/μl uważa się za optymalne do kwantyfikacji i sekwencjonowania DNA.
  11. Wykonaj analizę qPCR w celu ukierunkowania na interesujące wirusy jelitowe i sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości w celu zidentyfikowania struktury społeczności wirusowej.

3. Bezpośrednie wytrącanie i koncentracja frakcji mikrobiologicznych dla epidemiologii opartej na wodzie

  1. Zbierz 2 l próbek wody z chronionych i dotkniętych cieków wodnych. Jeśli próbka zawiera znaczną ilość zanieczyszczeń, użyj gazy, aby je usunąć.
    UWAGA: Zdecydowanie zaleca się pobranie duplikatu biologicznego na próbkę.
  2. Przygotuj 1% (w/v) roztwór odtłuszczonego mleka, rozpuszczając 4,4 g odtłuszczonego mleka w proszku w 440 ml syntetycznej wody morskiej. Doprowadzić pH tej zawiesiny do 3,5 za pomocą 1 N HCl.
  3. Dostosować pH próbek słodkowodnych do 3,5 przy użyciu 1 N HCl.
  4. Dodać 20 ml roztworu mleka odtłuszczonego do próbek słodkowodnych o 2 litrach wcześniej skorygowanego pH (końcowe stężenie mleka odtłuszczonego 0,01% [w/v]). Mieszać próbki w temperaturze pokojowej przez 8 godzin.
  5. Pozostawić kłaczki do osadzania się grawitacyjnie przez kolejne 8 godzin. Ostrożnie usunąć supernatanty za pomocą pompy perystaltycznej. Przenieść osadzone kłaczki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wirować je w temperaturze 8 000 x g przez 30 minut.
  6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki za pomocą 200 μl 0,2 M buforu fosforanu sodu. Przechowuj próbki w temperaturze -20 °C lub wybierz ~ 0,5 g kłaczków do ekstrakcji DNA drobnoustrojów przy użyciu wybranego zestawu do izolacji kwasów nukleinowych, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
  7. Określ stężenie i czystość kwasu nukleinowego DNA za pomocą fluorometru o wysokiej czułości. Próbki o stężeniach >1 ng/μl powinny być optymalne do oznaczania ilościowego i sekwencjonowania DNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ocena metod oznaczania stężenia RNA wirusowego
Wszystkie sześć próbek przetworzonych przy UF-3k x g było dodatnich i wykazało odzysk na poziomie 13,38% ± 8,14% (Rycina 1). Tylko jedna próbka była dodatnia, gdy próbki przetwarzano przy UF-7,5k x g. Wszystkie próbki przetworzone za pomocą SMF były dodatnie i wykazały odzysk na poziomie 15,27% ± 2,65% (Rycina 1). Średnie wskaźniki odzysku dla UF-3K x g oraz SMF były i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jednym z krytycznych etapów tego badania jest eliminacja cząstek stałych poprzez zastosowanie etapu filtracji wstępnej z filtrami membranowymi 0,2 μm i 0,45 μm. Biorąc pod uwagę podział wirusów na cząstki stałe, zwłaszcza wirusy otoczkowe, filtracja wstępna może spowodować znaczne straty w odzyskiwaniu wirusa30. Podczas gdy etap filtracji wstępnej w przypadku metod ultrafiltracji jest prawie zawsze konieczny w przypadku próbek środowiskowych i ścieków, aby zapobiec zatykaniu się urządzeń ultrafilt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie są im znane żadne konkurencyjne interesy finansowe ani powiązania osobiste, które mogłyby mieć wpływ na pracę opisaną w tym artykule.

Podziękowania

Ta praca została wsparta przez NSERC Alliance Covid-19 Grant (Nagroda nr 431401363, 2020-2021, dr Yuan i dr Uyaguari-Díaz). MUD składa serdeczne podziękowania Uczelnianemu Programowi Grantów Badawczych (Nagroda nr 325201). Zarówno JF, jak i JZA są wspierane przez program szkoleniowy dla absolwentów Visual and Automated Disease Analytics (VADA). KY i JF otrzymali stypendia w ramach programu Mitacs Accelerate. MUD i jego członkowie laboratorium (KY, JF, JZA) są wspierani przez NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) oraz grant operacyjny Research Manitoba New Investigator (nr 5385). Specjalne podziękowania dla miasta Winnipeg w prowincji Manitoba. Badania te zostały przeprowadzone na Uniwersytecie Manitoba. Pragniemy potwierdzić, że kampusy Uniwersytetu Manitoba znajdują się na pierwotnych ziemiach ludów Anishinaabeg, Cree, Oji-Cree, Dakota i Dene oraz na terenie ojczyzny narodu Métis.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 M bufor fosforanowo-sodowy o pH 7,5Alfa AesarJ62041APFisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0,2 μ m 47-mm membranowe filtry tarczowe Supor-200VWR66234Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0,45 μ M 47-mm Filtry talerzowe membranowe Supor-200VWR60043Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master MixThermo Fisher Scientific4444432Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Opancerzony RNA Quant IPC-1 Kontrola przetwarzaniaAsuragen49650Asuragen, Austin, TX, USA
Marka A, Urządzenie odśrodkowe Jumbosep, 30 kDaPall OD030C65Pall Corporation, Ann Arbor,
MI Brand B, Urządzenie odśrodkowe Microsep Advance, 30 kDaPallMCP010C46Pall Corporation, Ann Arbor,
Probówki wirówkowe MI (50 ml) Nalgene3119-0050PKThermo Fisher Scientific
DNAse IInvitrogen18047019Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2Invitrogen12027Thermo Fisher Scientific
GWV Kapsułki do pobierania próbek wód gruntowych o dużej pojemności - 0,45 &mikro; mPall12179Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Kwas solny, roztwór wzorcowy 1NThermo Fisher ScientificAC124210025Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Zestaw do izolacji ultra kwasów nukleinowych MagMAX MicrobiomeApplied biosystemsA42358Thermo Fisher Scientific
Woda wolna od nukleazPromegaP1197Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA
Pompa perystaltycznaMasterflex, przyrząd Cole-Parmer7553-20Miernik pH Thermo Fisher Scientific
 Instrument DenverRK-59503-25Cole-Parmer. Ten produkt został wycofany z produkcji
Fenol:chloroform:alkohol izoamylowy 25:24:1Invitrogen15593031Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Zestawy podkładów i sondIDTIntegrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiomekit Qiagen QiagenSciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 PCR w czasie rzeczywistym SystemThermo Fisher ScientificA34322Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Zestaw testowy Qubit 1X dsDNA o wysokiej czułości (HS)InvitrogenQ33231Termo Fisher Scientific
Fluorometr Qubit 4, z WiFiInvitrogenQ33238Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA o wysokiej czułości (HS)InvitrogenQ32855Thermo Fisher Scientific
RNAzywa AInvitrogenEN0531Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome KitQiagen26000-50Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
Odtłuszczone mleko w proszkuDifco (BD Life Sciences)DF0032173Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Bufor fosforanu soduAlfa AesarAlfa Aesar, Ottawa, ON, Kanada
Syntetyczna woda morskaVWR RC8363-1Firma chemiczna RICCA
Syntetyczne jednoniciowe DNA gBlockIDTIntegrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Urządzenia do filtracji próżniowej VacuCap 90 - 0,1 i mikro; m, 90 mm, napromieniowane promieniami gammaPall4621Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Urządzenia do filtracji próżniowej - 0,2 i mikro; m, 90 mm, napromieniowany promieniami gammaPall4622Pall Corporation, Ann Arbor, MI&
beta;-merkaptoetanolGibco21985023Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, Stany Zjednoczone
Zestaw do oznaczania

Bibliografia

  1. Kumblathan, T., Liu, Y., Uppal, G. K., Hrudey, S. E., Lix, X. F. Wastewater-based epidemiology for community monitoring of SARS-CoV-2: progress and challenges. ACS Environmental Au. 1, 18-31 (2021).
  2. Lu, D., Huang, Z., Luo, J., Zhang, X., Sha, S. Primary concentration-The critical step in implementing the wastewater based epidemiology for the COVID-19 pandemic: A mini-review. The Science of The Total Environment. 747, 141245(2020).
  3. Bi, Q. Insights into household transmission of SARS-CoV-2 from a population-based serological survey. Nature Communications. 12, 3643(2021).
  4. Day, M. Covid-19: identifying and isolating asymptomatic people helped eliminate virus in Italian village. British Medical Journal. 368, 1165(2020).
  5. Ing, A. J., Cocks, C., Green, J. P. COVID-19: in the footsteps of Ernest Shackleton. Thorax. 75 (8), 693-694 (2020).
  6. Bivins, A., et al. Wastewater-based epidemiology: global collaborative to maximize contributions in the fight against COVID-19. Environmental Science & Technology. 54 (13), 7754-7757 (2020).
  7. Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
  8. Thompson, J. R., et al. Making waves: Wastewater surveillance of SARS-CoV-2 for population-based health management. Water Research. 184, 116181(2020).
  9. Wu, F., et al. SARS-CoV-2 RNA concentrations in wastewater foreshadow dynamics and clinical presentation of new COVID-19 cases. The Science of the Total Environment. 805, 150121(2022).
  10. Kantor, R. S., Nelson, K. L., Greenwald, H. D., Kennedy, L. C. Challenges in measuring the recovery of SARS-CoV-2 from wastewater. Environmental Science & Technology. 55 (6), 3514-3519 (2021).
  11. Chik, A. H. S., et al. Comparison of approaches to quantify SARS-CoV-2 in wastewater using RT-qPCR: Results and implications from a collaborative inter-laboratory study in Canada. Journal of Environmental Sciences. 107, 218-229 (2021).
  12. Hjelmsø, M. H., et al. Evaluation of methods for the concentration and extraction of viruses from sewage in the context of metagenomic sequencing. PLoS One. 12 (1), e0170199(2017).
  13. Philo, S. E., et al. A comparison of SARS-CoV-2 wastewater concentration methods for environmental surveillance. The Science of the Total Environment. 760, 144215(2021).
  14. Ahmed, W., Harwood, V. J., Gyawali, P., Sidhu, J. P. S., Toze, S. Comparison of concentration methods for quantitative detection of sewage-associated viral markers in environmental waters. Applied and Environmental Microbiology. 81 (6), 2042-2049 (2015).
  15. Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47 (8), 2797-2810 (2013).
  16. Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
  17. Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115 (1), 1-11 (2013).
  18. Calgua, B., et al. New methods for the concentration of viruses from urban sewage using quantitative PCR. Journal of Virological Methods. 187 (2), 215-221 (2013).
  19. Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
  20. Assis, A. S. F., et al. Optimization of the skimmed-milk flocculation method for recovery of adenovirus from sludge. The Science of the Total Environment. 583, 163-168 (2017).
  21. Goncharova, E. A., et al. One-step quantitative RT-PCR assay with armored RNA controls for detection of SARS-CoV-2. Journal of Medical Virology. 93 (3), 1694-1701 (2021).
  22. Yu, X. F., et al. Preparation of armored RNA as a control for multiplex real-time reverse transcription-PCR detection of influenza virus and severe acute respiratory syndrome coronavirus. Journal of Clinical Microbiology. 46 (3), 837-841 (2008).
  23. Alygizakis, N., et al. Analytical methodologies for the detection of SARS-CoV-2 in wastewater: Protocols and future perspectives. Trends in Analytical Chemistry. 134, 116125(2021).
  24. Garcia, A., et al. Quantification of human enteric viruses as alternative indicators of fecal pollution to evaluate wastewater treatment processes. PeerJ. 10, e12957(2022).
  25. Gonzalez, R., et al. COVID-19 surveillance in Southeastern Virginia using wastewater-based epidemiology. Water Research. 186, 116296(2020).
  26. Hietala, S. K., Crossley, B. M. Armored RNA as virus surrogate in a real-time reverse transcriptase PCR assay proficiency panel. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 67-70 (2006).
  27. Uyaguari-Diaz, M. I., et al. A comprehensive method for amplicon-based and metagenomic characterization of viruses, bacteria, and eukaryotes in freshwater samples. Microbiome. 4 (1), 20(2016).
  28. Meena, G. S., Singh, A. K., Gupta, V. K., Borad, S., Parmar, P. T. Effect of change in pH of skim milk and ultrafiltered/diafiltered retentates on milk protein concentrate (MPC70) powder properties. Journal of Food Science and Technology. 55 (9), Geneious. https://www.geneious.com. 3526-3537 (2018).
  29. Geneious. , Available from: https://www.geneious.com (2021).
  30. Ye, Y., Ellenberg, R. M., Graham, K. E., Wigginton, K. R. Survivability, partitioning, and recovery of enveloped viruses in untreated municipal wastewater. Environmental Science & Technology. 50 (10), 5077-5085 (2016).
  31. Philo, S. E., et al. Development and validation of the skimmed milk pellet extraction protocol for SARS-CoV-2 wastewater surveillance. Food and Environmental Virology. 14 (4), 355-363 (2022).
  32. Monteiro, S., et al. Recovery of SARS-CoV-2 from large volumes of raw wastewater is enhanced with the inuvai R180 system. Journalof Environmental Management. 304, 114296(2022).
  33. Yanaç, K., Adegoke, A., Wang, L., Uyaguari, M., Yuan, Q. Detection of SARS-CoV-2 RNA throughout wastewater treatment plants and a modeling approach to understand COVID-19 infection dynamics in Winnipeg, Canada. The Science of The Total Environment. 825, 153906(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Koncentracja wirus wmetoda ultrafiltracjirodowiskowe pr bki wodyepidemiologia ciek wRNA w otoczce bia kowejtechnika przedfiltracjiekstrakcja wirusowego RNAanaliza RT qPCRodzysk drobnoustroj w
Zagęszczenie cząstek wirusa w próbkach wody i ścieków środowiskowych przy użyciu flokulacji mleka odtłuszczonego i ultrafiltracji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.