Artykuł metodologiczny

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych o niskiej zawartości endotoksyn pochodzących z linii komórek rakowych

DOI:

10.3791/65062

⸱

17 lutego 2023

 ,  , 
1Department of Clinical Immunology, Jagiellonian University Medical College, 2Doctoral School of Medical and Health Sciences, Jagiellonian University, 3Institute of Veterinary Sciences, University Center of Veterinary Medicine JU-AU, University of Agriculture in Kraków

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proponowany protokół zawiera wytyczne dotyczące unikania zanieczyszczenia endotoksyną podczas izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z supernatantów hodowli komórkowych oraz jak prawidłowo je ocenić.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to niejednorodna populacja pęcherzyków błonowych uwalnianych przez komórki in vitro i in vivo. Ich wszechobecność i znacząca rola jako nośników informacji biologicznej sprawiają, że są intrygującymi obiektami badań, wymagającymi niezawodnych i powtarzalnych protokołów ich izolacji. Wykorzystanie ich pełnego potencjału jest jednak trudne, ponieważ wciąż istnieje wiele przeszkód technicznych związanych z ich badaniami (np. właściwe pozyskiwanie). W pracy przedstawiono protokół izolacji małych EV (zgodnie z nomenklaturą MISEV 2018) z supernatantu hodowli linii komórek nowotworowych w oparciu o wirowanie różnicowe. Protokół zawiera wytyczne, jak uniknąć zanieczyszczenia endotoksynami podczas izolacji pojazdów elektrycznych i jak prawidłowo je ocenić. Zanieczyszczenie endotoksynami pojazdów elektrycznych może znacznie utrudnić późniejsze eksperymenty, a nawet zamaskować ich prawdziwe skutki biologiczne. Z drugiej strony, przeoczona obecność endotoksyn może prowadzić do błędnych wniosków. Ma to szczególne znaczenie w odniesieniu do komórek układu odpornościowego, w tym monocytów, ponieważ monocyty stanowią populację szczególnie wrażliwą na pozostałości endotoksyn. Dlatego zdecydowanie zaleca się badanie EV pod kątem zanieczyszczenia endotoksynami, zwłaszcza podczas pracy z komórkami wrażliwymi na endotoksyny, takimi jak monocyty, makrofagi, komórki supresorowe pochodzenia mieloidalnego lub komórki dendrytyczne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs), zgodnie z nomenklaturą MISEV 2018, to zbiorczy termin opisujący różne podtypy pęcherzyków błoniastych wydzielanych przez komórki, które odgrywają kluczową rolę w licznych procesach fizjologicznych i patologicznych1,2. Co więcej, pojazdy elektryczne są obiecujące jako nowe biomarkery różnych chorób, a także jako środki terapeutyczne i nośniki leków. Jednak wykorzystanie ich pełnego potencjału jest trudne, ponieważ nadal istnieje wiele przeszkód technicznych związanych z ich nabyciem3. Jednym z takich wyzwań jest izolacja pojazdów elektrycznych wolnych od endotoksyn, która w wielu przypadkach została zaniedbana. Jedną z najczęstszych endotoksyn jest lipopolisacharyd (LPS), który jest głównym składnikiem ścian komórkowych bakterii Gram-ujemnych i może powodować ostrą reakcję zapalną ze względu na uwalnianie dużej liczby cytokin zapalnych przez różne komórki4,5. LPS indukuje odpowiedź poprzez wiązanie się z białkiem wiążącym LPS, a następnie interakcję z kompleksem CD14/TLR4/MD2 na komórkach szpikowych. Ta interakcja prowadzi do aktywacji szlaków sygnałowych zależnych od MyD88 i TRIF, co z kolei wyzwala czynnik jądrowy kappa B (NFkB). Translokacja NFkB do jądra inicjuje produkcję cytokin6. Monocyty i makrofagi są bardzo wrażliwe na LPS, a ich ekspozycja na LPS powoduje uwalnianie cytokin zapalnych i chemokin (np. IL-6, IL-12, CXCL8 i TNF-α)7,8. Struktura CD14 umożliwia wiązanie różnych gatunków LPS o podobnym powinowactwie i służy jako koreceptor dla innych receptorów toll-podobnych (TLR) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 i 9)6. Liczba prowadzonych badań nad wpływem EV na monocyty/makrofagi wciąż rośnie9,10,11. Szczególnie z perspektywy badania funkcji monocytów, ich subpopulacji i innych komórek odpornościowych, obecność endotoksyn, a nawet ich zamaskowana obecność w EV ma ogromne znaczenie12. Przeoczone zanieczyszczenie pojazdów elektrycznych endotoksynami może prowadzić do mylących wniosków i ukrywać ich prawdziwą aktywność biologiczną. Innymi słowy, praca z komórkami monocytowymi wymaga pewności co do braku zanieczyszczenia endotoksynami13. Potencjalnymi źródłami endotoksyn mogą być woda, komercyjnie pozyskiwane podłoża i surowice, składniki i dodatki do pożywek, szkło laboratoryjne i wyroby z tworzyw sztucznych5,14,15.

Dlatego to badanie miało na celu opracowanie protokołu izolacji EV o niskiej zawartości endotoksyn. Protokół zawiera proste wskazówki, jak uniknąć zanieczyszczenia endotoksynami podczas izolacji pojazdów elektrycznych zamiast usuwania endotoksyn z pojazdów elektrycznych. Wcześniej przedstawiono wiele protokołów dotyczących usuwania endotoksyn z, na przykład, zmodyfikowanych nanocząstek stosowanych w nanomedycynie; jednak żaden z nich nie jest przydatny dla struktur biologicznych, takich jak pojazdy elektryczne. Efektywną depirogenizację nanocząstek można przeprowadzić przez płukanie etanolem lub kwasem octowym, ogrzewanie w temperaturze 175 °C przez 3 godziny, γ napromienianie lub obróbkę trytonem X-100; jednak te procedury prowadzą do zniszczenia EVs16,17.

Prezentowany protokół jest pionierskim badaniem skoncentrowanym na unikaniu zanieczyszczeń endotoksynami w EVs, w przeciwieństwie do poprzednich badań nad wpływem EV na monocyty9. Zastosowanie proponowanych zasad w praktyce laboratoryjnej może pomóc w uzyskaniu wiarygodnych wyników badań, co może być kluczowe przy rozważaniu potencjalnego zastosowania EV jako środków terapeutycznych w klinice12.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie probówek do ultrawirówek

  1. Używaj sterylnych probówek jednorazowego użytku. Jeśli nie jest to możliwe, należy ponownie użyć probówek ultrawirówek po umyciu ich detergentem za pomocą sterylnej pipety Pasteura lub innych jednorazowych aplikatorów. Pamiętaj, że probówki do ultrawirówek powinny być dedykowane do jednego rodzaju wirowanego materiału (supernatant do hodowli komórkowych/surowica/osocze) i gatunku (człowiek/mysz/itp.).
  2. Po umyciu detergentem wypłucz probówki ultrawirówki dejonizowaną wodą bez LPS 3x.
    UWAGA: Nie używaj wody niskiej jakości.
  3. Wysuszyć probówki ultrawirówkowe, a następnie napełnić je 70% etanolem. Pozostaw rurki z 70% etanolem do dezynfekcji przez noc. Usuń etanol i ponownie wysusz rurki.
  4. Umieść probówki i nakrętki w opakowaniu do sterylizacji i szczelnie je zamknij. Użyj metody sterylizacji plazmą lub gazem (tlenek etylenu)18,19. Probówki ultrawirówkowe zamknięte w opakowaniu do sterylizacji należy przechowywać w suchym miejscu i zużyć przed upływem terminu ważności.
    UWAGA: Przeprowadzaj comiesięczne monitorowanie poziomu LPS w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i wodzie używanej do izolacji pojazdów elektrycznych. Monitorowanie powinno obejmować również probówki (np. poprzez badanie wody [kontrola mycia], która była przechowywana w probówkach ultrawirówek przez noc w temperaturze pokojowej [RT]).

2. Przygotowanie płodowej surowicy bydlęcej o niskiej zawartości endotoksyn (EE-FBS)

  1. Upewnij się, że używasz FBS o bardzo niskiej zawartości endotoksyny (dostępnej w handlu; patrz tabela materiałów; <0,1 EU/ml).
  2. Umieścić butelkę FBS o bardzo niskiej zawartości endotoksyny w łaźni wodnej i inkubować w temperaturze 56 °C przez 30 minut. Ten krok jest wymagany do dezaktywacji układu dopełniacza.
  3. Odpipetować inaktywowany FBS do ultrawirówek i odwirować go przy 100 000 x g przez 4 godziny w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant do sterylnych probówek o pojemności 50 ml, upewniając się, że nie przekracza to 45 ml na probówkę, aby uniknąć zanieczyszczenia nakrętki i zwilżenia pierścienia probówki.
  4. Tak przygotowaną surowicę EE-FBS przechowywać w temperaturze -20 °C. Sprawdzić stężenie LPS w EE-FBS (krok 6). Stężenie LPS powinno być na tym samym poziomie, co przed ultrawirowaniem.

3. Hodowla komórkowa

  1. W tym badaniu posiewu linie komórkowe SW480 i SW620 w zmodyfikowanej pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 4,5 g / L glukozy, L-glutaminą, pirogronianem sodu i gentamycyną (50 μl / ml) uzupełniono odpowiednio 10% EE-FBS w kolbach hodowlanych o długości 75 cm2 przy użyciu techniki aseptycznej. Wysiewaj prawie 4,5 x 106 komórek i 6,5 x 106 komórek na kolbę odpowiednio dla SW480 i SW620.
  2. Zbieraj supernatanty dwa razy w tygodniu (~10 ml na kolbę), gdy komórki osiągną pełną konfluencję (~13,5 x 106 i 20 x 106 komórek na kolbę odpowiednio dla SW480 i SW620) i podziel. Upewnij się, że żywotność komórek jest nie mniejsza niż 99 % i że komórki są hodowane w temperaturze 37 °C w atmosferze 5 % CO2 .
  3. Zebrać supernatanty z hodowli komórkowej do odpowiednio oznakowanych probówek o pojemności 15 ml. Odwirować zebrane supernatanty przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia resztek komórek.
  4. Zebrać sklarowane substancje nad osadem ostrożnie, unikać zasysania zanieczyszczeń, umieścić w oznakowanych probówkach i ponownie odwirować przy 3 200 x g przez 12 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Zebrać supernatanty z drugiego etapu wirowania do sterylnych, oznakowanych probówek o pojemności 50 ml. Unikaj zwilżania krawędzi rur. Upewnij się, że objętość supernatantu nie przekracza 45 ml i że probówki są trzymane pionowo.
  6. Owinąć nakrętkę probówki sterylną przezroczystą folią i przechowywać supernatanty w pozycji pionowej w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Przeprowadzaj comiesięczną kontrolę Mycoplasma spp. oraz zanieczyszczenie LPS w świeżych supernatantach (etap 6). Jeśli poziom endotoksyny w supernatantach przekracza 0,05 EU/ml, należy sprawdzić, na jakim etapie mogło dojść do zanieczyszczenia i wznowić proces od początku. W przypadku zanieczyszczenia hodowli komórkowej przez Mycoplasma spp. zostanie wykryte, należy przerwać izolację EV od takich supernatantów.

4. Izolacja EV od supernatantów z hodowli komórkowych

  1. Przygotować filtry strzykawkowe 0,22 μm i strzykawki o odpowiedniej objętości. Przygotować dwie probówki z supernatantami do hodowli (90 ml).
  2. Napełnić strzykawkę supernatantem i podłączyć filtr do łącznika igły. Umieścić napełnioną strzykawkę z filtrem nad probówką o pojemności 50 ml. Wcisnąć kołnierz tłoka i zebrać ~90 ml filtratu.
  3. Odpipetować filtrat (7 ml) do probówek ultrawirówek (upewniając się, że ta sama objętość jest pipetowana do każdej probówki w celu uzyskania właściwej równowagi) i odwirować przy 100 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Wydajność granulowania EV zależy od wielu czynników (np. typu wirnika, jego współczynnika k, długości ścieżki migracji, lepkości medium itp.), które należy zoptymalizować w celu lepszego odzysku EVs20.
  4. Odrzucić supernatant za pomocą sterylnej pipety Pasteura. Zbierz pozostałe granulki za pomocą długich, przefiltrowanych końcówek pipet i umieść je w dwóch probówkach ultrawirówek. Napełnij je do 7 ml przefiltrowanym, wolnym od endotoksyn PBS, aby wypłukać EV.
  5. Odwirować zawieszone pelety PBS przy 100 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Całkowicie usunąć supernatant za pomocą sterylnej pipety Pasteura i dodać 200 μl przefiltrowanego, wolnego od endotoksyn PBS do obu probówek w celu ponownego zawieszenia EV. Delikatnie odpipetuj granulki EVs, aby zebrać wszystkie EVs.
  6. Przenieś zawiesinę EVs do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml (jeśli to możliwe, użyj probówki o niskiej zawartości białka). Zachować 10 μl zawiesiny EV w celu przygotowania rozcieńczenia do analizy śledzenia nanocząstek (NTA) oraz do innych celów (np. pomiaru stężenia białka).
  7. Rozcieńczyć EV filtrowanym PBS (1:1,000) do pomiarów przez NTA, zgodnie z instrukcjami producenta. Zabezpiecz rurki EV, owijając nakrętkę sterylną przezroczystą folią. Przechowuj pojazdy elektryczne w temperaturze -80 °C.

5. Wykrywanie specyficznych markerów przez western blotting

  1. Oznaczyć poziom białka w próbkach (np. za pomocą testu Bradforda) i przygotować próbki (20 μg) z buforem ładującym. Przygotować bufor ładujący, mieszając 5 μl buforu do próbki (4x) i 2 μl środka redukującego próbkę (10x) do całkowitej objętości 20 μl. Inkubować próbki w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
  2. Przygotuj żele poliakrylamidowe z SDS (10%-14%) i załaduj 20 μg EV do każdej studzienki.
  3. Uruchomić elektroforezę z buforem do biegania (30 g Tris, 144 g glicyny, 10% SDS na 1 l) przez 45 minut przy napięciu 150 V.
  4. Przeprowadzić półsuchy transfer białek z żelu na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) w maszynie transferowej z buforem Towbin (1,51 g Tris, 7,2 g glicyny, 10% metanolu na 0,5 l) przy napięciu 25 V przez 1 godzinę.
  5. Umieścić membranę w buforze TBST (1 ml Tween, 100 ml soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS 10x) na 1 l) w celu zablokowania z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w buforze TBST i inkubować przez 1 godzinę na bujaku w temperaturze pokojowej.
  6. Dodać rozcieńczone (1:1,000) przeciwciała, anty-CD91 (klon#D8O1A) lub anty-Alix1 (klon#3A9), w 1% BSA i inkubować z membraną przez noc w temperaturze 4 °C na kołysce. Usunąć przeciwciała i przemyć membranę 3x 10 ml 1x TBST przez 10 minut.
  7. Dodać kozie przeciwciało anty-królicze lub kozie anty-mysie (rozcieńczenie: 1:2,000) sprzężone z peroksydazą chrzanową, w zależności od pierwszorzędowego przeciwciała na błonie, i inkubować przez 1 godzinę na kołysce w temperaturze RT. Usunąć przeciwciała i przemyć membranę 3x 10 ml 1x TBST przez 10 minut.
  8. Wymieszać podłoże i luminol w stosunku 1:1, aby uzyskać 1 ml roztworu. Wlej roztwór na membranę. Umieść membranę natychmiast w komorze pomiarowej systemu obrazowania, wybierz moduł chemiluminescencji i zwizualizuj pasma białkowe na ekranie.

6. Pomiar poziomu endotoksyn za pomocą testu lizatu amebocytów limulusa (LAL)

  1. Wykonać chromogenny pomiar LAL poziomu endotoksyn, zgodnie z zaleceniem producenta. Krótko mówiąc, zastosuj metodę opartą na interakcji endotoksyny z lizatem amebocytów limulusa (LAL). Granica wykrywalności tej metody wynosi 0,005 EU/mL.
    UWAGA: Test LAL, pomimo swoich ograniczeń, pozostaje obecnie standardową metodą wykrywania i ilościowego określania zanieczyszczenia endotoksynami w różnego rodzaju roztworach i innych produktach stosowanych w nauce lub medycynie8. Czynnikiem ograniczającym ten zestaw jest stabilność odtworzonego roztworu lizatu amebocen, który jest stabilny tylko przez 1 tydzień w temperaturze -20 °C, jeśli zostanie zamrożony natychmiast po rozpuszczeniu.
  2. Stosować dziesięciokrotne rozcieńczenie EV i innych próbek oraz 50-krotne rozcieńczenie surowicy. Do dalszych eksperymentów należy używać wyłącznie odczynników o niskiej zawartości endotoksyn, takich jak EE-FBS, DMEM, PBS, RPMI (<0,005 EU/ml) i supernatanty hodowlane wolne od LPS.

7. Wykrywanie prokariotycznego genu 16S rRNA w próbkach EV

  1. Wyizoluj DNA z próbek EV. Staraj się, aby odczynniki i miejsce izolacji były aseptyczne. Zmierzyć stężenie i jakość DNA (np. za pomocą spektrofotometru).
  2. Przeprowadź reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), jak opisano wcześniej21. Przygotuj 1,5% żel agarozowy z bromkiem etydyny lub zielenią SYBR, aby uwidocznić produkty PCR w świetle ultrafioletowym (UV).
  3. Przeprowadzić elektroforezę próbki i markera masy z buforem TRIS-acetat-EDTA pod napięciem 75 V przez 45 minut. Wizualizacja prążków DNA za pomocą systemu obrazowania.

8. Wyznaczanie efektywnego stężenia LPS do stymulacji w ludzkim modelu monocytów

  1. Przygotuj 2 x 106 monocytów/ml zawiesiny monocytów w RPMI 1640 uzupełnionej L-glutaminą, glukozą i 2% EE-FBS. Dodać 50 μl zawiesiny do dołka 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej22.
  2. Dodać odpowiednią objętość LPS lub pożywki hodowlanej, aby uzyskać następujące stężenia końcowe: 0 pg/ml (kontrola), 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/ml i 100 ng/ml w 100 μl całkowitej objętości zawiesiny komórek. Wykonać trzy egzemplarze każdego stężenia LPS.
  3. Hodować komórki przez 18 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Zebrać supernatant.
  4. Odwirowywać supernatant o stężeniu 2 000 x g przez 5 minut. Przenieść supernatanty do nowych probówek. Zmierz stężenie TNF8,23 i IL-1023 w pobranych supernatantach za pomocą zestawu cytokin ludzkich z matrycą koralików cytometrycznych (CBA), zgodnie z procedurą producenta, za pomocą cytometru przepływowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Warunkiem wstępnym lub obowiązkowym krokiem dla tego protokołu jest wykluczenie możliwego zanieczyszczenia endotoksynami z odczynników. Wszystkie używane odczynniki, takie jak FBS, DMEM, RPMI, PBS, a nawet probówki ultrawirówkowe, muszą być wolne od endotoksyn (<0,005 EU/ml). Utrzymanie reżimu braku zanieczyszczenia endotoksynami nie jest łatwe, ponieważ na przykład zwykła/standardowa surowica do hodowli komórkowych może być jej bogatym źródłem (0,364 EU/ml; patrz tabela 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich kilku lat coraz większego znaczenia nabierają metody prawidłowej izolacji pojazdów elektrycznych, umożliwiające ich dalsze wiarygodne analizy, na przykład w kontekście uzyskania wiarygodnych danych omicznych i funkcjonalnych24. Na podstawie dotychczasowych doświadczeń badawczych wydaje się, że nie tylko rodzaj metody izolacji, ale także inne warunki podczas tej procedury mogą mieć znaczenie. Stosowanie FBS zubożonych w EV jest powszechnie uznawane za konieczność...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodowe Centrum Nauki, Polska, numer grantu 2019/33/B/NZ5/00647. Dziękujemy prof. Tomaszowi Gosiewskiemu i Agnieszce Krawczyk z Zakładu Molekularnej Mikrobiologii Medycznej Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego za nieocenioną pomoc w wykrywaniu bakteryjnego DNA w pojazdach elektrycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  Alix (3A9) Mysz mAb Technologia sygnalizacji komórkowej2171
Filtr 1250ul Uniwersalne końcówki do pipet, przezroczyste, polipropylenowe, niepirogenneGoogLab ScientificGBFT1250-R-NS
BD FACSCanto II Cytometr przepływowyBD Biosciences
CBA Ludzki zestaw cytokin Th1/Th2 IIBD Biosciences551809
CD9 (D8O1A) Technologiasygnalizacji komórkowej13174
System obrazowania ChemiDocBio-Rad Laboratories, Inc. 
DMEM (Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni) Corning10-013-CV
ELX800NB, Uniwersalny czytnik mikropłytekBIO-TEK INSTRUMENTS, INC
Surowica bydlęcapłodu Gibco16000044
Surowica bydlęca płodu Ameryka Południowa Ultra niska endotoksyna  Biowest  S1860-500
Gentamycyna, 50 mg/ml  PAN – BiotechP06-13100
Kozia anty-mysia IgG- HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2004
Kozia anty-królicza IgG- HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2005
Membrana Immun-Blot PVDFBio-Rad Laboratories, Inc. 
LPS z Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE)  Enzo Nauki Przyrodnicze, Inc.ALX-581-009-L002
Mini Trans-Blot Elektroforetyczne ogniwo transferoweBio-Rad Laboratories, Inc. 
Analiza śledzenia nanocząstek Malvern Instruments Ltd
Bufor próbki NuPAGE LDS (4X)  Invitrogen  NP0007
Środek redukujący próbki NuPAGE (10x)  InvitrogenNP0004
ParafilmSigma AldrichP7793przezroczysta folia
Perfect 100-1000 bp DNA LadderEURxE3141-01 
PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant KitThermo ScientificA39552
PP Oak Ridge Tube z zaślepkami ThermoScientific3929, 03613
RPMI 1640RPMI-1640 (Gibco)11875093
SimpliAmp Thermal CyclerApplied BiosystemA24811
Wirówka Sorvall wX+ ULTRA SERIES z wirnikiemT-1270Thermo Scientific75000100
Sub-Cell GT Poziomy system elektroforezyBio-Rad Laboratories, Inc. 
Podłoże chemiluminescencyjne SuperSignal West Pico PLUSThermo Scientific34577
SW480Kolekcja kultur typu amerykańskiego (ATCC)
Linia komórkowa SW480Kolekcja kultur typu amerykańskiego (ATCC)
Filtr strzykawkowy 0,22 umTPP99722
Trans-Blot SD Półsucha komórkatransferowaBio-Rad Laboratories, Inc. 1703940Maszyna transferowa
Pipeta transferowa, 3,5 mlSARSTEDT86.1171.001
mAb królika 17001401162017717039301704401 Linia komórkowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  2. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066(2015).
  3. van Niel, G., et al. Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).
  4. Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Giα dependent PI-3 kinase signalling. Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).
  5. Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells. PLOS ONE. 9 (12), 113840(2014).
  6. Zanoni, I., Granucci, F. Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32(2013).
  7. Takashiba, S., et al. Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB. Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).
  8. Schwarz, H., et al. Biological activity of masked endotoxin. Scientific Reports. 7, 44750(2017).
  9. Danesh, A., et al. Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients. Frontiers in Immunology. 9, 956(2018).
  10. Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles. The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).
  11. Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells. Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).
  12. Soekmadji, C., et al. The future of Extracellular Vesicles as Theranostics - an ISEV meeting report. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766(2020).
  13. Gioannini, T. L., et al. Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).
  14. Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test. Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).
  15. Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization. Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).
  16. Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. Hot EVs - How temperature affects extracellular vesicles. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).
  17. Osteikoetxea, X., et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Organic & Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).
  18. Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216(2019).
  19. Shintani, H. Ethylene oxide gas sterilization of medical devices. Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).
  20. Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  21. Salamon, D., et al. Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome. Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).
  22. Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes. Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).
  23. Chaiwut, R., Kasinrerk, W. Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes. BMC Research Notes. 15 (1), 42(2022).
  24. Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858(2014).
  25. Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061(2021).
  26. Pham, C. V., et al. Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when 'exosome-depleted serum' is utilised. Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963(2021).
  27. Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).
  28. Álvarez, E., et al. A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins. Frontiers in Immunology. 8, 915(2017).
  29. Busatto, S., et al. Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid. Cells. 7 (12), 273(2018).
  30. Gałuszka, A., et al. Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227(2020).
  31. Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies. Critical Care. 10 (1), 27(2006).
  32. Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zanieczyszczenie endotoksynamiwirowanie r nicoweledzenie nanocz stekWestern blottest LALstymulacja monocyt wmarker CD9marker Alix

Powiązane artykuły