Artykuł metodologiczny

Ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej na przekroju

4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65067

⸱

31 marca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Molecular Medicine-Cell Biology, University Medical Center Utrecht, Utrecht University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do zoptymalizowanej korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej opartej na endogennym, fluorescencyjnym znakowaniu jako narzędzie do badania lokalizacji rzadkich białek w odniesieniu do ultrastruktury komórkowej. O sile tego podejścia świadczy ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 w wygłodzonych komórkach bez leczenia bafilomycyną.

Streszczenie

Wizualizacja organelli autofagicznych na poziomie ultrastrukturalnym za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) jest niezbędna do ustalenia ich tożsamości i ujawnienia szczegółów, które są ważne dla zrozumienia procesu autofagicznego. Jednak w metodach EM często brakuje informacji molekularnych, co utrudnia korelację informacji ultrastrukturalnych uzyskanych przez EM z lokalizacją określonych białek autofagii opartą na mikroskopii fluorescencyjnej. Co więcej, rzadkość występowania autofagosomów w niezmienionych warunkach komórkowych utrudnia badania za pomocą EM, który wymaga dużego powiększenia, a tym samym zapewnia ograniczone pole widzenia.

W odpowiedzi na oba wyzwania, zastosowano metodę korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej (CLEM) opartą na znakowaniu fluorescencyjnym, aby skorelować powszechny marker autofagosomalny LC3 z ultrastrukturą EM. Metodę wykorzystano do szybkiego badania przesiewowego komórek w mikroskopii fluorescencyjnej w celu znakowania LC3 w połączeniu z innymi istotnymi markerami. Następnie, za pomocą CLEM, zidentyfikowano podstawowe cechy ultrastrukturalne wybranych plam znakowanych LC3. Metodę zastosowano do wygłodzonych komórek bez dodawania inhibitorów zakwaszenia lizosomalnego.

W tych warunkach, LC3 występował głównie na autofagosomach i rzadko w autolizosomach, w których LC3 ulega szybkiej degradacji. Dane te pokazują zarówno wykonalność, jak i czułość tego podejścia, wykazując, że CLEM może być wykorzystany do uzyskania ultrastrukturalnego wglądu w autofagię za pośrednictwem LC3 w warunkach natywnych - bez leczenia farmakologicznego lub zmian genetycznych. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta stanowi cenne narzędzie do badań lokalizacji ultrastrukturalnej białek autofagii i innych rzadkich antygenów poprzez połączenie mikroskopii świetlnej z danymi EM.

Wprowadzenie

Autofagia jest kluczowym procesem dla oczyszczania i recyklingu białek cytoplazmatycznych i organelli. Proces makroautofagii (zwany dalej autofagią) polega na tworzeniu organelli z podwójną błoną, autofagosomów, które pozwalają komórkom otaczać cząsteczki cytoplazmatyczne i organelle w celu degradacji lizosomalnej. Autofagia zachodzi na poziomie podstawowym w większości komórek i jest regulowana w górę w odpowiedzi na warunki komórkowe, takie jak głód lub stres komórkowy. Autofagia zachodzi albo w sposób specyficzny dla substratu, ukierunkowany na określone struktury lub białka do degradacji, albo jako nieselektywny proces masowy obejmujący części cytozolu. W selektywnej autofagii autofagosomy powstają w wyniku koniugacji białek z rodziny Atg8 (białka związane z mikrotubulami 1A/B, łańcuch lekki 1A/B, 3A/B/C [LC3] i GABARAPs) z błonami pochodzącymi z recyklingu endosomów, Golgiego i/lub retikulum endoplazmatycznego (ER)1. LC3 rozpoznaje ładunek autofagiczny w cytozolu bezpośrednio lub za pośrednictwem selektywnych adapterów autofagii, takich jak P62 / SQSTM. Nowe błony autofagiczne mogą być następnie sprzężone z LC3, rozszerzać się i łączyć, tworząc kompletną podwójną błonę otaczającą ładunek - zwaną autofagosomem. Autofagosom dojrzewa i ostatecznie łączy się z endosomem lub lizosomem, po czym autofagiczny ładunek i adaptery ulegają degradacji2.

Badania nad powstawaniem, dojrzewaniem i fuzją autofagosomów często wykorzystują technologie mikroskopii świetlnej. Mikroskopia fluorescencyjna LC3 jest zwykle stosowana do oceny liczby i lokalizacji komórkowej autofagosomów w różnych warunkach. Ponadto, poprzez sprzężenie LC3 z wrażliwym na pH GFP i stabilnym pH RFP w tak zwanej sondzie tandemowej, całkowity strumień autofagii można zmierzyć w żywych komórkach jako funkcję utraty fluorescencji GFP3. Podejścia te są cennymi narzędziami dla badaczy, którzy pomagają zrozumieć rolę i mechanizm autofagii w różnych warunkach. Kolejnym nieocenionym narzędziem jest mikroskopia elektronowa (EM), która ujawnia ultrastrukturę organelli autofagicznych na różnych etapach autofagii4,5,6,7,8. Do tej pory EM jest nadal metodą z wyboru do identyfikacji dokładnych etapów powstawania autofagosomów poprzez rozróżnianie różnych błon autofagicznych według morfologii: fagofor (podwójna błona nie w pełni zamknięta), autofagosom (zamknięta podwójna błona wokół ładunku cytozolowego) i autolizosom ([częściowa] utrata wewnętrznej błony autofagicznej). Morfologia bez informacji molekularnych może być jednak podatna na błędną identyfikację lub niejednoznaczność. Immuno-EM jest najbardziej wszechstronną metodą jednoczesnej charakterystyki molekularnej i klasyfikacji morfologicznej organelli autofagicznych. Na przykład, znakowanie LC3 za pomocą immunozłota na rozmrożonych kriosekcjach pozwala na ultrastrukturalną lokalizację LC3 i precyzyjną identyfikację organelli oznaczonych LC39.

Wadą EM jest małe pole widzenia, które idzie w parze z dużym powiększeniem wymaganym do obserwacji delikatnej ultrastruktury błon autofagicznych i, w przypadku immuno-EM, do zlokalizowania znacznika oznaczającego interesujące białko. Ze względu na ich niedobór i niski poziom białka na ogół utrudnia to ilościową analizę EM autofagosomów. Aby zwiększyć liczbę autofagosomów, komórki są często głodzone i traktowane bafilomycyną A1 (BafA1), inhibitorem lizosomalnego zakwaszania i degradacji. Bez leczenia BafA1 poszukiwanie autofagosomów przez EM jest czasochłonne ze względu na niedobór tych organelli. Metoda przedstawiona w tym manuskrypcie rozwiązuje ten problem poprzez znakowanie fluorescencyjne i obrazowanie endogennego LC3 na rozmrożonych kriosekcjach w mikroskopie fluorescencyjnym przed dalszym przygotowaniem do EM. Obrazy fluorescencyjne kierują następnie poszukiwaniami struktur znakowanych LC3 w EM. Po zebraniu obrazy EM są korelowane z obrazami fluorescencyjnymi, aby dodać informację molekularną - obecność LC3 - do ultrastruktury komórki. Ta metoda "CLEM na przekroju" znacznie zwiększa zdolność do znajdowania struktur znakowanych LC3, szczególnie w warunkach nieleczonych, w celu późniejszej identyfikacji i klasyfikacji przez EM.

Ta metoda została zastosowana do komórek HEPG2 10 w celu znalezienia autofagosomów w niezmienionych (tj. bez BafA1) warunkach. Znaleziono stosunkowo niewiele fluorescencyjnych puncta (mniej niż jedna na profil komórki w sekcji 90 nm), co zgadza się z wysokim obrotem LC311. Ta rzadkość LC3-puncta podkreśliła wartość CLEM; wybierając regiony z kilkoma punktami fluorescencyjnymi do obrazowania w EM, znaleziono i scharakteryzowano organelle LC3-dodatnie w znacznie skuteczniejszy sposób niż za pomocą konwencjonalnej immuno-EM. Okazało się, że większość organelli LC3-dodatnich to autofagosomy, zgodnie z ich morfologią, co kontrastuje z wynikami uzyskanymi w komórkach traktowanych BafA1, gdzie autolizosomy są bardziej powszechne9. Dane te pokazują, że w przypadku CLEM w sekcji autofagia może być badana na poziomie ultrastrukturalnym bez konieczności hamowania przepływu autofagicznego.

Protokół

1. Przygotowanie narzędzi i odczynników

UWAGA: Aby uzyskać wymagane odczynniki, i roztwory, zobacz Plik uzupełniający 1 lub 12, aby uzyskać więcej informacji. Szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, odczynników, sprzętu i oprogramowania użytego w tym protokole znajdują się w Tabeli materiałów.

  1. Utrwalacze
    1. Przygotować 0,2 M bufor fosforanowy (PB) lub 0,2 M PIPES, HEPES, EGTA, bufor MgSO4 (PHEM), zgodnie z opisem w pliku uzupełniającym 1, do użycia jako podstawa dla roztworów utrwalających.
      UWAGA: Utrwalacze są rutynowo buforowane w buforze 0,1 M PB lub PHEM w celu buforowania przed zakwaszeniem spowodowanym reakcją aldehydu z materiałem biologicznym.
    2. Ponieważ jakość paraformaldehydu (PFA) jest kluczem do niezawodnego utrwalenia ultrastruktury próbek, należy stosować PFA klasy EM. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, należy użyć 16% roztworów podstawowych, przygotowanych z wysokiej jakości bryłek PFA (patrz plik uzupełniający 1).
      UWAGA: Paraformaldehyd jest niebezpieczną substancją chemiczną (zwroty wskazujące rodzaj zagrożenia H228, H301, H302, H311, H314, H315, H317, H318, H331, H332, H335, H341, H350). Podczas pracy z PFA należy nosić sprzęt ochronny (rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne) i pracować w kapturze chemicznym. Odpady zawierające PFA powinny być zbierane i utylizowane zgodnie z wytycznymi i przepisami instytutów.
    3. Połączyć 10 ml 0,2 M PB, 5 ml 16% PFA (w wodzie demineralizowanej [dH2O]) i 5 mldH 2O, aby przygotować roztwór utrwalający 4% PFA.
    4. Opcjonalnie: Dodanie 0,02%-0,5% aldehydu glutarowego (GA) do roztworu utrwalającego z kroku 1.1.3 poprawia zachowanie ultrastruktury, ale zmniejsza antygenowość próbki w kierunku wielu przeciwciał.
      UWAGA: Gdy pożądane jest mocowanie GA, użyj GA klasy EM od odpowiedniego dostawcy.
      UWAGA: Aldehyd glutarowy jest niebezpieczną substancją chemiczną (zwroty wskazujące rodzaj zagrożenia H301, H302, H314, H317, H330, H332, H334, H335, H400, H411). Pracuj w kapturze chemicznym i noś sprzęt ochronny (rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne) podczas manipulowania GA. Odpady zawierające GA powinny być zbierane i utylizowane zgodnie z wytycznymi i przepisami instytutu.
  2. Narzędzia i materiały
    1. Zarysuj powierzchnię aluminiowych kołków uchwytu próbki i poddaj je sonikacji w etanolu 3 x 10 min, aby usunąć resztki metalu i zapewnić optymalne przyleganie, gdy bloki komórek zatopione w żelatynie są zamontowane na kołkach.
    2. Użyj kanistra do przechowywania odpowiedniego do przechowywania aluminiowych kołków uchwytu próbki wraz z ich próbkami w ciekłym azocie (LN2).
    3. Zrób manipulator, przymocowując pojedyncze włosy lub rzęsy do końca drewnianego szpikulca za pomocą lakieru do paznokci.
    4. Zrób pętlę odbioru. Zegnij drut ze stali nierdzewnej o grubości 0,3 mm wokół okrągłego pręta o średnicy 3 mm i skręć końce razem, tworząc pętlę na jednym końcu. Włóż skręcone końce do końcówki pipety. Włóż drewniany szpikulec z drugiego końca i przymocuj klejem lub żywicą.
      UWAGA: Pętla odbiorcza jest również dostępna w handlu (patrz Tabela materiałów).
    5. Aby przygotować pętle do suszenia na siatce, wykonaj te same czynności, co w przypadku tworzenia pętli odbiorczych: uformuj drut ze stali nierdzewnej w pętli 4 mm i przymocuj do dużej końcówki pipety za pomocą kleju lub żywicy.
    6. Pokryj siatki cienką folią nośną, taką jak formvar (protokół w pliku uzupełniającym 1). Przed użyciem pokryj kratki cienką warstwą węgla.
      UWAGA: Gotowe do użycia siatki są dostępne na rynku (patrz Tabela materiałów). Siatki powlekane formvarem mogą być przechowywane przez czas nieokreślony w temperaturze pokojowej (RT); Kratki pokryte węglem mogą być przechowywane w RT przez kilka miesięcy.
    7. Przygotuj czyste szkiełka podstawowe i duże szkiełka nakrywkowe (24 mm x 24 mm jest idealne do szkiełek o szerokości 25 mm), jak w 13.

2. Utrwalanie i przygotowanie próbki

  1. Utrwalenie
    1. Użyj utrwalacza przygotowanego w kroku 1.1.3 (4% PFA w 0,1 M PB). W przypadku przylegających linii komórkowych hodowla 1-5 × 106 komórek w 6 cm naczyniach. Dodać utrwalacz do pożywki hodowlanej w stosunku 1:1 i inkubować próbkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zastąpić mieszaninę z samym utrwalaczem i inkubować przez 2 godziny w temperaturze RT.
      UWAGA: Dokładna liczba komórek, konfluencja i warunki hodowli mogą się różnić w zależności od używanego systemu modelowego.
    2. Próbki należy przechowywać przez noc lub do 3-4 tygodni w 0,5% PFA w 0,1 M PB w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: GA można dodać do utrwalenia (patrz krok 1.1.4), a długość fiksacji można zmienić, aby znaleźć optymalną równowagę między zachowaniem morfologii a antygenowością, która różni się w zależności od próbki i oznakowania. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz14.
  2. Osadzanie próbek
    1. Umyj naczynie ze stałymi komórkami 3x z PBS przy RT. Następnie zastąp PBS zawierającym 0,15% glicyny i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Zastąp PBS zawierający 0,15% glicyny 1% żelatyną w PBS podgrzanym do temperatury 37 °C, a następnie zeskrobać i przenieść komórki w 1% żelatynie do probówki mikrowirówkowej. Granulować komórki w temperaturze 6 000 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej w mikrowirówce. Następnie usunąć 1% żelatyny bez naruszania osadu i dodać 12% żelatyny podgrzanej do 37 °C. Zawiesić osad komórkowy, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą końcówek do pipet lub szklanych pipet Pasteura podgrzanych do temperatury 37 °C.
    3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut, następnie granulować komórki w temperaturze 6 000 × g przez 1 minutę. Żelatynę zestalać na lodzie przez 30 minut.
    4. Aby usunąć komórki zatopione w żelatynie z tuby, odetnij koniec rurki zawierającej osad od reszty probówki za pomocą żyletki. Następnie, prostopadle do pierwszego cięcia, przeciąć koniec rurki z granulką komórkową na pół.
    5. Inkubować dwie połówki końców rurki zawierające osad komórkowy zatopiony w żelatynie w 2,3 M sacharozie przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Powoduje to, że połówki osadzanych w żelatynie granulek komórkowych nieznacznie się kurczą i wyrywają z plastikowej tuby.
      UWAGA: Granulki komórkowe zatopione w żelatynie powinny być przechowywane w temperaturze 4 °C lub lodowatości tak bardzo, jak to możliwe, aby sacharoza o objętości 2,3 M nie stała się zbyt lepka, a żelatyna zbyt miękka. Podczas manipulowania osadami komórkowymi zatopionymi w żelatynie w kolejnych krokach należy pracować tylko z jedną próbką na raz, a pozostałe trzymać na lodzie lub pracować w zimnym (~4 °C) pomieszczeniu. Unikaj przegrzania osadzanych w żelatynie granulek komórkowych przez światło słoneczne, gorące lampy mikroskopowe lub inne źródła ciepła.
    6. Usunąć połówki probówki z osadem komórkowym zatopionym w żelatynie z 2,3 M sacharozy. Następnie usuń pęsetą połówki komórek zatopione w żelatynie z połówek plastikowej tuby. Ręcznie pokrój śrut na bloki o odpowiedniej wielkości (~1 mm3) za pomocą żyletki. Użyj stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego, aby powiększyć obiekt podczas cięcia.
    7. Zanurzyć w zatopionych żelatynie blokach komórkowych 2,3 M sacharozy przez 3-16 godzin, obracając się od końca do końca w wirniku w temperaturze 4 °C.
    8. Umieść zatopiony w żelatynie blok komórek na aluminiowym trzpieniu uchwytu próbki (patrz krok 1.2.1). Pozostaw wystarczającą ilość sacharozy o objętości 2,3 M wokół krawędzi bloku, aby utworzyła cienki "kołnierz" między blokiem a szpilką. Unikaj zbyt dużej ilości sacharozy o średnicy 2,3 M pokrywającej górną część bloku. Zamrozić zatrzaskowo i przechowywać w LN2.

3. Podział na sekcje

  1. Przycinanie (zobacz też12)
    1. Wyjąć szpilkę z blokiem komórek zatopionych w żelatynie z magazynu LN2 i umieścić ją w kriomikrotomie ustawionym na temperaturę -80 °C.
    2. Przytnij przód bloku, aby spłaszczyć jego powierzchnię i uzyskać odcinki ~250 nm. Zanurz pętlę 3 mm w roztworze do pobierania (1:1 2,3 M sacharozy i 2% metylocelulozy), włóż pętlę do kriokomory mikrotomu i poczekaj, aż w kropli zacznie tworzyć się lód (zwykle 5-7 s). Następnie natychmiast podnieś sekcję, szybko, ale delikatnie dociskając do nich kroplę. Wyjmij pętlę z kriokomory, poczekaj, aż kropla całkowicie się rozmrozi i dociśnij kroplę do szklanego szkiełka.
    3. Sprawdź orientację komórek poprzez barwienie skrawków błękitem toluidyny.
      1. Umieścić kroplę roztworu błękitu toluidynowego (patrz plik uzupełniający 1) na wierzchu sekcji na szkiełku podstawowym i wysuszyć na płycie grzewczej o temperaturze 80 °C, aż krawędzie kropli wyschną.
      2. Zdjąć szkiełko z płyty grzewczej i delikatnie spłukać błękit toluidynowy za pomocą dH2O, zbierając go do odpowiedniego pojemnika na odpady.
      3. Osusz szkiełko podstawowe i sprawdź orientację komórek w sekcjach za pomocą prostego mikroskopu laboratoryjnego.
    4. Przyciąć boki bloku, dzieląc 50-100 μm w bok powierzchni bloku próbki z rogiem noża. Przytnij cztery boki powierzchni bloku próbki, obracając uchwyt próbki o 90° po przycięciu każdej strony, aby utworzyć wystający prostokąt o wymiarach ~250 μm x 375 μm. Zaznacz wystający obszar na podstawie orientacji komórki określonej w poprzednim kroku.
  2. Dzielenie na sekcje i odbiór
    1. Schłodzić kriomikrotom do temperatury -100 °C. Z wystającego prostokąta należy odciąć wstęgę o grubości 70–90 nm i srebrzystozłotym połysku. Odsuń sekcje od krawędzi noża diamentowego za pomocą włosia na patyku (patrz sekcja 1.2.3), aby utworzyć długą (2-5 mm) wstążkę.
    2. Po uformowaniu się odpowiedniej wstążki przerwij sekcję, aby ją podnieść. Zanurz pętlę odbiorczą 3 mm w 2,3 M sacharozie i 2% metylocelulozie zmieszanych w stosunku 1:1, włóż pętlę do kriokomory mikrotomu i poczekaj, aż kropla zacznie zamarzać (zwykle 5-7 s). Następnie natychmiast podnieś sekcje, szybko, ale delikatnie dociskając do nich kroplę. Wyjmij pętlę z kriokomory, poczekaj, aż kropla całkowicie się rozmrozi i dociśnij kroplę do przygotowanej siatki (krok 1.2.6).
      UWAGA: Kratki z sekcjami można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.

4. Etykietowanie i mikroskopia świetlna

  1. Etykietowania
    1. Umieść siatki z sekcjami (Rysunek 1A) sekcją do dołu na ~ 1 ml PBS w małym naczyniu lub płytce wielodołkowej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.
      UWAGA: Ten krok usuwa żelatynę, która znajduje się między komórkami; Żelatyna nie jest potrzebna po podziale i koliduje z pozostałym protokołem.
    2. Przetwarzaj siatki przekrojem do dołu na kropelkach ~ 75 μL na parafilmie (patrz Rysunek 1B). Zacznij od PBS + 0,15% przemycia glicyną (3 x 2 min) w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować siatki z 0,1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA)-c + 0,5% żelatyną ze skóry ryb (FSG) w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej jako etap blokujący. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w 0,1% BSA-c + 0,5% FSG w PBS i inkubować siatki na ~10 μL kropelkach tego roztworu przez 1 godzinę w RT (Rysunek 1C).
    3. Umyj kratki w 0,1% BSA w PBS 5x przy RT. Następnie rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe i 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI; 10 μg / ml) w 0,1% BSA-c + 0,5% FSG w PBS i inkubować siatki na ~ 10 μL kropelkach tego roztworu przez 30+ min w RT (Figura 1C). Umyj kratki w PBS 5x w RT.
      UWAGA: Opcjonalnie przeciwciało drugorzędowe można znakować cząstkami złota koloidalnego o długości fali 5, 10, 15 lub 20 nm sprzężonymi z białkiem A (PAG) w celu lokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania w EM. Jeśli jest to pożądane, inkubować siatki z PAG przez 20 minut w temperaturze pokojowej po wykonaniu kroku 4.1.3. Następnie przemyj 5x PBS w temperaturze pokojowej. Unikaj jednoczesnego stosowania wielu przeciwciał pierwszorzędowych i zwróć uwagę na reaktywność PAG na IgG różnych gatunków, aby zapobiec niepożądanym reakcjom krzyżowym. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz12.
  2. Mocowanie próbek do mikroskopii świetlnej
    1. Zanurz siatki w 50% glicerolu w dH2O 2 x 5 min w temperaturze pokojowej. Umieść kratki między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym w 50% glicerolu, po jednej siatce na szkiełko nakrywkowe, z sekcjami skierowanymi do szkiełka nakrywkowego (Rysunek 1D).
      UWAGA: Jakość etykietowania może ulec pogorszeniu, gdy kratki są zamontowane w 50% glicerolu przez ponad 30 minut. Dlatego zaleca się zamontowanie i zobrazowanie dwóch lub trzech siatek na raz, a pozostałe pozostawienie na wtórnym roztworze do etykietowania.
  3. Mikroskopia świetlna
    1. Weź szklane szkiełko z siatkami warstwowymi do mikroskopu szerokokątnego ze zautomatyzowanym stolikiem. Wybierz obiektyw olejowy o dużym powiększeniu (63x lub 100x). Utwórz zestaw kafelków obrazu składający się z (części) wstążki sekcji (Rysunek 1E).
      UWAGA: Niektóre przeciwciała drugorzędowe mogą tworzyć agregaty fluorescencyjne na siatkach, zwłaszcza wokół fałd lub rozdarć w sekcjach. Dodatkowo niektóre typy komórek i tkanek zawierają struktury autofluorescencyjne. Jeśli spodziewane są takie problemy, zaleca się dołączenie siatki kontroli ujemnej, która nie jest inkubowana z przeciwciałem pierwszorzędowym.
  4. Demontaż i kontrastowanie EM
    1. Dodać 10 μl dH2O z boku szklanego szkiełka nakrywkowego i poczekać, aż działanie kapilarne wypełni powierzchnię styku szkiełka nakrywkowego. Ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe, nie mieszając oleju immersyjnego z glicerolem. Wyjmij kratki za pomocą pęsety i zanurz w dH2O 3x w temperaturze pokojowej, aby zmyć 50% glicerolu.
      UWAGA: Olej może zakłócać barwienie uranylu i pogarszać kontrast EM.
    2. Ostrożnie osusz tylną część siatki niestrzępiącą się bibułą.
      UWAGA: Jeśli próbka była również oznaczona koloidalnymi cząstkami złota, wykonaj następujące czynności: umieść siatkę z sekcjami do dołu na kropelkach PBS i umyj 2x w RT. Postfix w 1% GA przez 5 minut w RT (patrz uwaga ostrzegawcza pod 1.1.4). Prać w PBS 2x w temperaturze pokojowej.
    3. Ułóż kratki przekrój do dołu na kropelkach dH2O i umyj 8x w temperaturze RT.
    4. Aby zabarwić skrawki pod kątem kontrastu w EM, inkubuj z octanem uranylu (UA), pH 7, przez 5 minut w temperaturze RT (Rysunek 1F).
    5. Przed umieszczeniem kratek schłodzić UA:metylocelulozę o pH 4, umieszczając kropelki na parafolii na metalowej płytce na lodzie. Następnie umyj kratki lodowatym UA:metylocelulozą, pH 4, 2x i inkubuj z lodowatym UA:metylocelulozą, pH 4, przez 10 minut (Rysunek 1F).
      UWAGA: Octan uranylu jest niebezpieczną substancją chemiczną (zwroty wskazujące rodzaj zagrożenia H300, H330, H373, H411). W czynnościach wymagających UA pracuj w kapturze chemicznym i noś sprzęt ochronny (fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary ochronne). Zbieraj i utylizuj odpady zawierające UA zgodnie z wytycznymi i przepisami instytutów.
    6. Zapętlić siatki, wkładając pętlę do suszenia siatki do kropli UA:metylocelulozy poniżej siatki i delikatnie podnosząc ją, aż siatka zostanie ściągnięta z kropli12. Zetrzyj nadmiar UA: metylocelulozy, dotykając pętli pod kątem ~ 60° (sekcje skierowane w dół) na niestrzępiącą się bibułę filtracyjną (patrz Tabela materiałów) i przeciągając ją powoli wzdłuż papieru, aż nie zostanie już wchłonięta UA: metyloceluloza. Następnie umieść pętlę z siatką w odpowiednim stojaku i pozostaw do wyschnięcia na >10 minut w temperaturze RT (Rysunek 1G).

5. EM

  1. Skorzystaj z przeglądu uzyskanego za pomocą mikroskopii świetlnej, aby zlokalizować obszar zainteresowania (ROI) do obrazowania w transmisyjnym mikroskopie elektronowym (TEM; Rysunek 1H). Opisz zwrot z inwestycji w zestawie danych mikroskopii świetlnej. Po wybraniu regionu uzyskaj zestaw kafelków obrazu w powiększeniu od 20 000x-50 000x w TEM. Zrekonstruuj zestaw kafelków obrazu w oprogramowaniu do postprocessingu15,16.

6. Korelacja i analiza

  1. Załaduj zestaw danych z mikroskopii świetlnej i EM do odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazu, takiego jak ImageJ/Fiji17, wtyczka ec-CLEM w Icy18 lub Photoshop. Przytnij i obróć zestaw danych mikroskopii świetlnej, aby dopasować go do zestawu klocków EM.
    1. Przeprowadź korelację na podstawie sygnału DAPI we fluorescencji i konturach jądrowych w EM (Rysunek 1I). Przesuń obrazy, aby precyzyjnie je nałożyć i dokładnie wykonać ręczną korelację. Aby podejście było bardziej precyzyjne, zastosuj korelację opartą na punktach orientacyjnych, na przykład za pomocą wtyczki ec-CLEM w Icy lub wtyczki BigWarp w ImageJ, aby skorelować obrazy poprzez ręczny wybór odpowiednich punktów. Dostępny jest szczegółowy protokół korelacji krok po kroku z ec-CLEM19.
      UWAGA: To podejście działa również dobrze przy użyciu bimodalnych sond powierniczych20,21.
  2. Przeanalizuj skorelowane obrazy, wybierając ROI na podstawie sygnału fluorescencyjnego w odpowiednim programie (np. ImageJ). W przypadku analizy ilościowej utwórz kolekcję ROI dla wszystkich oznakowanych organelli. Następnie sprawdź odpowiednią ultrastrukturę poszczególnych ROI i sklasyfikuj je na podstawie elementów morfologicznych.

Wyniki

Zoptymalizowany protokół immuno-EM dla znakowania złotem LC3 na ultracienkich krioprzestrojach został niedawno opublikowany przez De Maziere i wsp.9. Badanie to obejmowało warunki głodzenia bez BafA1, w których LC3 występowało, lecz było stosunkowo rzadkie i trudne do zlokalizowania za pomocą EM. W osobnym badaniu wprowadzono metodę CLEM na przekroju, która wykorzystuje czułość znakowania fluorescencyjnego do wizualizacji stosunkowo rzadkich i słabo wyrażonych białek endogennych oraz korelacji tych danych z ultrastrukturą EM14. W niniejszej pracy oba te podejścia zostają połączone poprzez zastosowanie zoptymalizowanego protokołu znakowania LC3 jako części metody CLEM.

Komórki HEPG2, pochodzące z wątroby i charakteryzujące się stosunkowo wysokim poziomem podstawowej autofagii2, poddano głodzeniu w medium minimalnym (zbilansowany roztwór soli Earle'a [EBSS]) przez 2 h przed utrwaleniem w 4% PFA. Następnie przygotowano próbki metodą ultracienkiego mrożenia i sekcjonowania Tokuyasu (przekroje 1-3; patrz Slot i Geuze12), która jest wysoce kompatybilna z techniką CLEM wykonywaną bezpośrednio na przekroju14,23. Rozmrożone krioprzekroje oznakowano fluorescencyjnie (sekcja 4 protokołu i Rycina 1) przy użyciu mysiego przeciwciała pierwszorzędowego anty-LC39. Dodatkowo, w celu wskazania endolizosomów, zastosowano królicze przeciwciało anty-LAMP1, a następnie przeciwciała wtórne anty-mysie AlexaFluor48 oraz anty-królicze AlexaFluor568. Siatki umieszczono pomiędzy szkiełkiem nakrywką a szkiełkiem przedmiotowym i obrazowano w temperaturze pokojowej za pomocą mikroskopu szerokopolowego (obiektyw olejowy 10x 1,47 NA, kamera sCMOS).

Przewagą znakowania fluorescencyjnego cienkich sekcji nad konwencjonalną immunofluorescencją (IF) całych komórek jest zwiększona rozdzielczość w osi Z, ponieważ fizyczna grubość sekcji wynosi 60-90 nm. Dzięki tej poprawionej rozdzielczości Z, znakowanie fluorescencyjne LC3 i LAMP1 na cienkich sekcjach wykazuje bardzo niską kolokalizację (Rycyna 2A). W komórkach traktowanych inhibitorami lizosomalnymi, takimi jak BafA1, występuje wysoka kolokalizacja, ponieważ LC3 zamknięty w lizosomach nie ulega degradacji9. W komórkach nietraktowanych LC3 ulega szybkiej degradacji po kontakcie z enzymatycznie aktywnymi, LAMP1-dodatnimi lizosomami, dlatego w tych warunkach kolokalizacja zdarza się rzadko. Zazwyczaj obserwowano mniej niż jeden punkt LC3 na profil komórki. Wskazuje to, że nawet w warunkach głodzenia obrót autofagosomów jest szybki, co utrzymuje niską liczbę autofagosomów. Podkreśla to również znaczenie wykorzystania CLEM do znajdowania rzadkich struktur znakowanych LC3, dzięki dużemu polu widzenia zapewnianemu przez mikroskopię świetlną. Ponadto wyższa czułość znakowania fluorescencyjnego w porównaniu ze znakowaniem złotem umożliwia identyfikację większej liczby organelli LC3-dodatnich niż w konwencjonalnej immuno-EM, co dodatkowo wspomaga ich charakteryzację.

Po uzyskaniu pełnego zestawu kafelków z taśmy przekrojów, siateczki wyjęto z mikroskopu i poddano barwieniu pokontrastowemu do EM, stosując UA oraz metodę „loop-out” (kroki protokołu 4.4-4.6; Rycina 1F,G). Metoda „loop-out” zapewnia pozostanie na siateczce cienkiej warstwy UA:metylocelulozy, co pozwala uzyskać pożądany kontrast w EM. Grubość tej warstwy zależy od prędkości i kąta, pod jakim UA:metyloceluloza jest odsączana na papier filtracyjny. Zbyt szybkie przeciąganie pętli może spowodować pozostanie zbyt dużej ilości UA:metylocelulozy na siateczce, co doprowadzi do zbyt ciemnego obrazu przekrojów w EM. Zbyt wolne przeciąganie może z kolei usunąć zbyt wiele UA:metylocelulozy, co skutkuje zbyt słabym barwieniem i złą morfologią, a także stwarza ryzyko wypadnięcia siateczki z pętli. Barwienie przypominające „tłustą plamę” (Rycina 1G) na suchych siateczkach wskazuje na odpowiednią grubość warstwy UA:metylocelulozy.

Po usunięciu pętli i wysuszeniu, siatki obrazowano za pomocą TEM w obszarach zainteresowania (ROI) wybranych na podstawie fluorescencji. Zbiory danych IF i EM skorelowano poprzez nałożenie sygnału DAPI na kontury jąder widocznych w EM, tworząc zintegrowany obraz zawierający informacje z obu modalności.

Znalezienie w EM tego samego obszaru, który wybrano w IF, może być trudne. Zaleca się zatem, aby podczas poszukiwań w EM mieć pod ręką obraz poglądowy zestawu kafelków IF. Użytkownicy powinni szukać rozpoznawalnych cech w obu modalnościach, takich jak fałdy lub rozdarcia w przekrojach, pręty siatki lub rozmieszczenie jąder komórkowych. Należy również pamiętać, że próbka w EM może wydawać się obrócona lub odbita lustrzanie. W celu ułatwienia korelacji można zastosować „siatki pomocnicze” (finder grids) z charakterystycznymi cechami służącymi do identyfikacji obszarów (patrz:  Tabela materiałów).

Korelacja organelli wykazujących pozytywną reakcję z LC3 z ultrastrukturą EM wykazała, że poszczególne punkty (puncta) reprezentowały różne etapy autofagii (Rycina 2B). Chociaż zachowanie ultrastruktury autofagosomów w krioprzekrojach jest trudne, często obserwowano organelle z treścią cytoplazmatyczną i podwójnymi błonami (Rycina 2C, strzałki w organellach 1-5; Rycina uzupełniająca S1), co stanowi definiujące cechy morfologiczne autofagosomów. Co ciekawe, dość słabe punkty fluorescencyjne zostały zidentyfikowane w EM jako autolizosomy pozytywne pod kątem LC3 (Rycina 2C, organella 6; treść autofagiczna zaznaczona symbolem *), charakteryzujące się gęstą zawartością i pęcherzykami wewnątrzświetlnymi. Wykazało to, że w IF ultracienkich krioprzekrojów widoczne są bardzo małe ilości LC3 i wskazało, że pomimo środowiska degradacyjnego, część LC3 jest wykrywalna w autolizosomach w stanie stacjonarnym. Jednak większość punktów pozytywnych pod kątem LC3 reprezentowała autofagosomy, podczas gdy autolizosomy występowały bardzo rzadko. Jest to sprzeczne z wynikami dla komórek traktowanych BafA1, w których kumulują się głównie autolizosomy, a nie autofagosomy9.

Podsumowując, niniejszy protokół opisuje metodę CLEM na sekcjach, służącą do powiązania informacji molekularnych uzyskanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z ultrastrukturą w mikroskopii elektronowej (EM). Metoda ta zwiększa czułość immuno-EM, ponieważ do znakowania wykorzystuje się wyłącznie fluorofory, które zazwyczaj generują silniejszy sygnał niż sondy EM. Metoda ta jest szczególnie odpowiednia do stosowania ultracienkich kriosekcji, w których można uzyskać wysoki poziom specyficznej fluorescencji przy pomijalnym zabarwieniu tła. Dzięki wykorzystaniu fluorescencji do przesiewania rzadkich struktur lub zdarzeń oraz korelacji wybranych obszarów zainteresowania (ROI) z EM, czas pracy z mikroskopem elektronowym oraz związane z tym koszty mogą zostać znacznie zredukowane. Czułość i wykonalność tej metody wykazano poprzez wizualizację LC3 w niepoddanych działaniu leków, zagłodzonych komórkach, co pokazało, że w tych warunkach LC3 wiąże się głównie z autofagosomami, natomiast bardzo niskie poziomy są widoczne w autolizosomach.

figure-results-1
Rycina 1: Schematyczny przegląd metody CLEM na skrawkach. (A) Krioskrawki z komórek zatopionych w żelatynie są zbierane na miedzianej siatce pokrytej formvarem. (B) Siatki są przetwarzane w pozycji skierowanej skrawkiem w dół na kroplach odpowiednich roztworów. (C) Siatki są znakowane przeciwciałami pierwszorzędowymi i fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi. (D) Siatki są umieszczane pomiędzy szkiełkiem podstawowym a nakrywek w 50% glicerolu. (E) Obrazy fluorescencyjne są rejestrowane w mikroskopie szerokopolowym. (F) Siatki są zdejmowane z szkiełka podstawowego i poddawane dalszej obróbce poprzez barwienie octanem uranylu do EM. (G) Po wysuszeniu siatki mogą być obrazowane za pomocą TEM. (H) Zestaw kafelków obrazów TEM o wysokim powiększeniu jest pozyskiwany z obszaru wybranego na podstawie danych z fluorescencji. (I) Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej i EM są korelone i nakładane na siebie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rycina 2: CLEM dla LC3 i LAMP1 w głodzonych komórkach HEPG2. Komórki HEPG2 były głodzone przez 2 h w EBSS przed utrwaleniem 4% PFA przez 2 h. (A) Obrazowanie IF dla LC3 (zielony) i LAMP1 (czerwony) na skrawkach wykazuje stosunkowo niewielką liczbę punktów LC3 i małą kolokalizację z LAMP1. (B) Powiązanie informacji molekularnych z IF (panel lewy) z informacjami ultrastrukturalnymi uzyskanymi w EM (panel środkowy) poprzez nałożenie obu modalności obrazowania na podstawie DAPI i konturów jąder (linie przerywane, panel prawy). Ultrastruktura poszczególnych przedziałów znakowanych LC3, zilustrowana w ramce 1 (panel prawy), przedstawiona jest w C. (C) Ultrastruktura przedziałów LC3-dodatnich. Obrazy CLEM pokazano po lewej stronie, a pseudokolorowe (beżowe) obrazy EM po prawej (niekolorowe obrazy EM znajdują się w Rycinią uzupełniającej S1). Wewnętrzne i zewnętrzne błony autofagosomu zaznaczono odpowiednio białymi i czarnymi grotami strzałek. Zawartość autofagiczna wewnątrz autolizosomu w przykładzie 6 zaznaczono symbolem *. Paski skali = 10 µm (A), 1 µm (B), 20 nm (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina uzupełniająca S1: Niekolorowane obrazy EM organelli wykazujących obecność LC3. (A-F) Niekolorowane obrazy EM przykładów 1-6, przedstawionych w formie pseudokolorowej na Rycinie 2C. Organelle wybrano na podstawie fluorescencji LC3, zgodnie z opisem dla Ryciny 2. Wewnętrzne i zewnętrzne błony autofagosomu zaznaczono odpowiednio białymi i czarnymi grotami strzałek. Treść autofagiczna wewnątrz autolizosomu w przykładzie 6 zaznaczona jest symbolem *. Paski skali = 20 nm. Skróty: AL = autolizosom; AP = autofagosom; M = mitochondrium. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Bufory i roztwory użyte w niniejszym badaniu. Ten plik uzupełniający zawiera przepisy i protokoły niezbędne do przygotowania buforów i roztworów użytych w niniejszym badaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje najnowsze osiągnięcia w dziedzinie kriosekcji na podstawie CLEM - wysoką czułość znakowania IF i dokładną (błąd <100 nm) korelację między FM i EM14,24. W ten sposób uzyskuje się metodę z czułością na znakowanie fluorescencyjnie rzadkich, endogennych białek i możliwością nakładania jej z dużą precyzją na ultrastrukturę EM. W ten sposób metoda ta pozwala uniknąć (nad)ekspresji egzogennie znakowanych białek i stosowania mniej czułych znaczników EM. Wykonalność metody pokazują przykłady CLEM na endogennym LC3 w wygłodzonych komórkach, bez użycia inhibitorów lizosomalnych.

Rozmrożone kriosekcje uzyskane metodą Tokuyasu są idealnymi próbkami dla immuno-EM, ponieważ w przeciwieństwie do skrawków żywicznych są przepuszczalne dla przeciwciał. W połączeniu z łagodnymi procedurami fiksacji i kontrastowania, daje to na ogół doskonałą skuteczność znakowania w porównaniu z innymi metodami bez uszczerbku dla szczegółowej ultrastruktury i doskonale wizualizuje błony komórkowe 12,25,26. Co więcej, kriosekcje są wysoce kompatybilne z mikroskopią fluorescencyjną, co czyni je cennymi substratami dla CLEM. Zarówno klasyczne znakowanie immunozłotem, jak i CLEM na kriosekcjach dostarczyły przełomowych spostrzeżeń w zrozumieniu organizacji subkomórkowej 14,27,28,29,30.

Obecnie zastosowania CLEM na rozmrożonych kriosekcjach stają się coraz bardziej powszechne, w wyniku ciągłego rozwoju i optymalizacji 14,20,24,31,32,33,34, które poprawiły jakość, możliwość zastosowania i dokładność podejścia. Teraz, dzięki dokładnej korelacji dużych zestawów obrazów IF i EM, technika ta ułatwia badania przesiewowe pod kątem ultrastruktury znakowanych fluorescencyjnie endogennych składników komórkowych 14,32,33. Jest to przewaga nad klasycznym immuno-EM, gdzie poszukiwanie struktur znakowanych złotem zazwyczaj wymaga dużego powiększenia, a przez to jest bardziej pracochłonne i czasochłonne. Z tego powodu lokalizacja LC3 w ultrastrukturze jest bardzo korzystna dla CLEM. Organelle LC3-dodatnie są powszechne, gdy klirens autofagiczny jest zablokowany (tj. Gdy komórki są traktowane BafA1 lub środkami podnoszącymi pH), podczas gdy organelle autofagiczne są szybko usuwane w niezmienionych lub wygłodzonych komórkach, co skutkuje bardzo niskimi poziomami w stanie ustalonym. W takich warunkach znalezienie organelli znakowanych LC3 przy użyciu klasycznej immuno-EM może być trudne, a CLEM oferuje wyraźną przewagę.

Wcześniej CLEM na skrawkach żywicy stosowano w badaniach z wykorzystaniem ektopowej ekspresji LC3-GFP lub sondy tandemowej LC3-GFP-RFP 35,36,37,38,39. W tych badaniach obrazowanie fluorescencyjne wykonano przed zatopieniem lub bezpośrednio w sekcjachżywicy akrylowej 40, a następnie próbki poddano badaniu przesiewowemu za pomocą EM. Istnieje kilka zalet zatapiania żywicy; Ultrastruktura autofagosomalna jest na ogół dobrze zachowana, zwłaszcza jeśli materiał jest zamrażany pod wysokim ciśnieniem40. Co więcej, kontrast materiału zatopionego w żywicy barwionej metalami ciężkimi jest na ogół wyraźniejszy niż w przypadku kriosekcji barwionych uranylem. Sekcje osadzone w żywicy są kompatybilne z wolumetrycznymi metodami EM, takimi jak tomografia matrycowa, FIB-SEM lub szeregowy blok SEM, podczas gdy kriosekcje nie są. W podejściach, które wykonują obrazowanie przed osadzeniem, obrazowanie żywych komórek jest opcją41, która nie jest dostępna w CLEM w przypadku kriosekcji. Kluczową przewagą CLEM w kriosekcjach nad tymi alternatywami jest wysoki sygnał IF, pozwalający na immunolokalizację rzadkich białek bez konieczności przenikania błony lub nadekspresji. Pozwala to uniknąć potencjalnej ekstrakcji błony, artefaktów nadekspresji42 i modyfikacji genetycznej obiektu, co w połączeniu z możliwością korelacji dużych obszarów w IF i EM, sprawia, że jest to doskonałe narzędzie do badania LC3 i autofagii.

W tym przypadku zastosowanie CLEM w sekcji do wygłodzonych komórek HEPG2 ujawniło, że LC3 jest głównie zlokalizowany w strukturach zidentyfikowanych jako autofagosomy. Dodatkowo w autolizosomach znaleziono kilka słabo fluorescencyjnych plamek. Jest to bezpośrednie przeciwieństwo komórek traktowanych BafA19 i odzwierciedla szybką degradację białek autofagosomalnych po połączeniu autofagosomu z lizosomami. Ogólnie rzecz biorąc, dane wykazały, że CLEM rozmrożonych kriosekcji może dostarczyć informacji na temat autofagii za pośrednictwem LC3 w warunkach natywnych. Dane podkreślają również czułość technologii, ponieważ LC3 wykryto nawet w autolizosomach, które zawierają tylko niski poziom nienaruszonych epitopów LC3. Dalsze zastosowanie tej techniki poprzez obrazowanie LC3 w różnych modelach i warunkach poprawi naszą wiedzę na temat autofagii i innych procesów biologicznych, w których pośredniczy LC3, takich jak fagocytoza związana z LC3 lub koniugacja ATG8 z pojedynczymi błonami.

Poza autofagią, CLEM w sekcji może być stosowany do innych rzadkich zdarzeń lub struktur, takich jak podział komórek, infekcja, rzadkie typy komórek w tkankach, kinetochory, rzęski pierwotne lub organelle specyficzne dla typu komórki. Skuteczne badania przesiewowe dla interesującego nas tematu przez IF mogą znacznie ułatwić ultrastrukturalne badanie tych rzadkości. Ponadto wykazano14 , że technika ta może być stosowana do lokalizacji białek w bardziej czuły sposób niż klasyczny immuno-EM. Dostosowanie długości fiksacji może jeszcze bardziej zwiększyć tę czułość, umożliwiając ultrastrukturalną lokalizację białek o bardzo niskiej liczebności lub słabo antygenowych. Wreszcie, metoda CLEM na sekcji ułatwia szybką selekcję ilościowej liczby organelli, ułatwiając bardziej rzetelną analizę rozkładu ultrastrukturalnego danego białka.

CLEM w kriosekcjach wymaga sprzętu i wiedzy specjalistycznej do kriosekcji. W grupach z dostępem do tych narzędzi (np. kriomikrotomów) wdrożenie CLEM w sekcji jest proste i wymaga jedynie dostępności zautomatyzowanego mikroskopu szerokokątnego, do którego większość laboratoriów ma dostęp. Co więcej, metoda jest dostępna w zakładach EM na całym świecie. Ponieważ CLEM w sekcji łączy w sobie zastosowanie uznanych metod IF i EM, metoda ta jest łatwa do dostosowania i może być łączona na przykład z tomografią 20,33,43, seryjną objętością przekroju EM o ograniczonej liczbie sekcji44 lub mikroskopią superrozdzielczą45. Ta wszechstronność metody wspiera zastosowania w szerokim zakresie zagadnień biologicznych.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie ma konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy naszym kolegom z Centrum Medycyny Molekularnej Uniwersyteckiego Centrum Medycznego w Utrechcie za owocne dyskusje i opinie. Dziękujemy byłym i obecnym kolegom z laboratorium Klumperman za ciągłe doskonalenie naszych technologii mikroskopowych. Infrastruktura EM wykorzystana do tych prac jest częścią programu badawczego National Roadmap for Large-Scale Research Infrastructure (NEMI) finansowanego przez Holenderską Radę ds. Badań Naukowych (NWO), numer projektu 184.034.014 dla JK.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemikalia i odczynniki
Przeciwciało osioł anty-mysz Alexa Fluor 488Life Technologies#A21202użyj 1:250
Przeciwciało osła anty-królika Alexa Fluor 568Life TechnologiesA#10042użyj 1:250
Przeciwciało myszy anty-LC3Cosmo BioCTB-LC3-2-IC1:100
królik anty-LAMP1Sygnalizacja komórkowa9091zastosowanie 1:250
Surowica bydlęca Albumina, frakcja VSigma-AldrichA-9647
BSA-cAurion900.099
BSA-sprzężone złotoRdzeń mikroskopii komórkowej, UMC UtrechtBSAG 5 nm
Bezwodny chloroformMerck1.02447.0500
DAPIInvitrogen10184322Stosować przy stężeniu końcowym 10 &mikro; g/ml
EGTASigma-AldrichE4378
Żelatyna ze skóry rybiejSigma-AldrichG7765
Żelatyna spożywczaMerckG1890
Formvar, Vinylec ESPI02492-RA
Aldehyd gluterowyServa23115.01Patrz UWAGA Uwaga
WysięgnikglicerolowyMBAK 7044.1000
GlicynaMerck1042010250
HEPESSigma-AldrichH3375
Metyloceluloza, 25 centypuazówSigma-AldrichM-6385
MgSO4Riedel-de Haen12142
Na2HPO4 (PB składnik A)Merck106580-0500
NaBH4Merck806373
NaH2PO4 (PB składnik B)Merck106346
NH4OHSigma-Aldrich221228-0025
Kwas szczawiowyMerck100495
Granulki paraformaldehyduSigma-Aldrich441244Patrz UWAGA
UWAGA RURYMerck110220
Białko-A sprzężone złotoRdzeń do mikroskopii komórkowej, UMC UtrechtPAG 5, 10, 15 lub 20 nm
Sacharoza D(+)VWR27483294
octan uranyluSPI020624-ABPatrz UWAGA
Narzędzia i materiały eksploatacyjne
Pętla odbioruMikroskopia elektronowa Nauki70944
Bibuła filtracyjna, jakościowa, średnio-szybkaLLG6.242 668
Siatki szukaczaTed PellaG100F1
Siatki Mikroskop komórkowy Core, UMC UtrechtCU 100 siatkowe
mikroskopy
Leica Thunder Mikroskop szerokokątnyLeicaKomponenty: 100x, obiektyw 1.47 NA TIRF; Kamera fotometryczna 95B sCMOS; Oprogramowanie LAS X;
Ultrakriomikrotom Leica UC7Leica
Tecnai T12FEIKomponenty: Aparat Veleta VEL-FEI-TEC12-TEM; Oprogramowanie
SerialEMSoftware
ec-CLEM w lodowatymotwartym kodzie źródłowymPaul-Gilloteaux i in., 2017
Fidżiopen sourceSchindelin i in., 2012
IMODopen sourceMastronarde i in., 2017
PhotoshopAdobe
SerialEMotwarte źródłoMastronarde i wsp., 2018
użyj przeciwciała Uwaga

Bibliografia

  1. Hu, Y., Reggiori, F. Molecular regulation of autophagosome formation. Biochemical Society Transactions. 50 (1), 55-69 (2022).
  2. Reggiori, F., Ungermann, C. Autophagosome maturation and fusion. Journal of Molecular Biology. 429 (4), 486-496 (2017).
  3. Kimura, S., Noda, T., Yoshimori, T. Dissection of the autophagosome maturation process by a novel reporter protein, tandem fluorescent-tagged LC3. Autophagy. 3 (5), 452-460 (2007).
  4. Baba, M., Takeshige, K., Baba, N., Ohsumi, Y. Ultrastructural analysis of the autophagic process in yeast: detection of autophagosomes and their characterization. The Journal of Cell Biology. 124 (6), 903-913 (1994).
  5. Takeshige, K., Baba, M., Tsuboi, S., Noda, T., Ohsumi, Y. Autophagy in yeast demonstrated with proteinase-deficient mutants and conditions for its induction. The Journal of Cell Biology. 119 (2), 301-311 (1992).
  6. De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28, 435-492 (1966).
  7. Arstila, A. U., Trump, B. F. Studies on cellular autophagocytosis. The formation of autophagic vacuoles in the liver after glucagon administration. The American Journal of Pathology. 53 (5), 687-733 (1968).
  8. Eskelinen, E. L., Reggiori, F., Baba, M., Kovács, A. L., Seglen, P. O. Seeing is believing: The impact of electron microscopy on autophagy research. Autophagy. 7 (9), 935-956 (2011).
  9. De Mazière, A., et al. An optimized protocol for immuno-electron microscopy of endogenous LC3. Autophagy. 18 (12), 3004-3022 (2022).
  10. López-Terrada, D., Cheung, S. W., Finegold, M. J., Knowles, B. B. Hep G2 is a hepatoblastoma-derived cell line. Human Pathology. 40 (10), 1512-1515 (2009).
  11. Tanida, I., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. Lysosomal turnover, but not a cellular level, of endogenous LC3 is a marker for autophagy. Autophagy. 1 (2), 84-91 (2005).
  12. Slot, J. W., Geuze, H. J. Cryosectioning and immunolabeling. Nature Protocols. 2 (10), 2480-2491 (2007).
  13. Waterman-Storer, C. M. Microtubule/organelle motility assays. Current Protocols in Cell Biology. 13 (1), (2001).
  14. vander Beek, J., de Heus, C., Liv, N., Klumperman, J. Quantitative correlative microscopy reveals the ultrastructural distribution of endogenous endosomal proteins. The Journal of Cell Biology. 221 (1), e202106044(2022).
  15. Mastronarde, D. N. Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM. Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).
  16. Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Paul-Gilloteaux, P., et al. EC-CLEM: Flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nature Methods. 14 (2), 102-103 (2017).
  19. Heiligenstein, X., Paul-Gilloteaux, P., Raposo, G., Salamero, J. eC-CLEM: A multidimension, multimodel software to correlate intermodal images with a focus on light and electron microscopy. Methods in Cell Biology. 140, 335-352 (2017).
  20. Fermie, J., et al. Bimodal endocytic probe for three-dimensional correlative light and electron microscopy. Cell Reports Methods. 2 (5), 100220(2022).
  21. Fokkema, J., et al. Fluorescently labelled silica coated gold nanoparticles as fiducial markers for correlative light and electron microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 13625(2018).
  22. Czaja, M. J., et al. Functions of autophagy in normal and diseased liver. Autophagy. 9 (8), 1131(2013).
  23. Robinson, J. M., Takizawa, T., Pombo, A., Cook, P. R. Correlative fluorescence and electron microscopy on ultrathin cryosections: Bridging the resolution gap. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (7), 803-808 (2001).
  24. Mohammadian, S., et al. High accuracy, fiducial marker-based image registration of correlative microscopy images. Scientific Reports. 9 (1), 3211(2019).
  25. Tokuyasu, K. T. A study of positive staining of ultrathin frozen sections. Journal of Ultrasructure Research. 63 (3), 287-307 (1978).
  26. Slot, J. W., Geuze, H. J. A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry. European Journal of Cell Biology. 38 (1), 87-93 (1985).
  27. Klumperman, J., Raposo, G. The complex ultrastructure of the endolysosomal system. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (10), a016857(2014).
  28. Geuze, H. J., Slot, J. W., Strous, G. J., Lodish, H. F., Schwartz, A. L. Intracellular site of asialoglycoprotein receptor-ligand uncoupling: Double-label immunoelectron microscopy during receptor-mediated endocytosis. Cell. 32 (1), 277-287 (1983).
  29. Biazik, J., Ylä-Anttila, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. Ultrastructural relationship of the phagophore with surrounding organelles. Autophagy. 11 (3), 439-451 (2015).
  30. Fahimi, H. D., Reich, D., Völkl, A., Baumgart, E. Contributions of the immunogold technique to investigation of the biology of peroxisomes. Histochemistry and Cell Biology. 106 (1), 105-114 (1996).
  31. Vicidomini, G., et al. A novel approach for correlative light electron microscopy analysis. Microscopy Research and Technique. 73 (3), 215-224 (2010).
  32. Vicidomini, G., et al. High data output and automated 3D correlative light-electron microscopy method. Traffic. 9 (11), 1828-1838 (2008).
  33. Cortese, K., et al. 3D HDO-CLEM: cellular compartment analysis by correlative light-electron microscopy on cryosection. Methods in Cell Biology. 111, 95-115 (2012).
  34. van Rijnsoever, C., Oorschot, V., Klumperman, J. Correlative light-electron microscopy (CLEM) combining live-cell imaging and immunolabeling of ultrathin cryosections. Nature Methods. 5 (11), 973-980 (2008).
  35. Razi, M., Chan, E. Y. W., Tooze, S. A. Early endosomes and endosomal coatomer are required for autophagy. The Journal of Cell Biology. 185 (2), 305-321 (2009).
  36. Ligeon, L. A., Barois, N., Werkmeister, E., Bongiovanni, A., Lafont, F. Structured illumination microscopy and correlative microscopy to study autophagy. Methods. 75, 61-68 (2015).
  37. Biazik, J., Vihinen, H., Anwar, T., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. The versatile electron microscope: An ultrastructural overview of autophagy. Methods. 75, 44-53 (2015).
  38. Gudmundsson, S., Kahlhofer, J., Baylac, N., Kallio, K., Eskelinen, E. L. Correlative light and electron microscopy of autophagosomes. Methods in Molecular Biology. 1880, 199-209 (2019).
  39. Kriel, J., et al. Correlative light and electron microscopy (CLEM): bringing together the best of both worlds to study neuronal autophagy. Imaging and Quantifying Neuronal Autophagy. 171, 135-147 (2022).
  40. Largeau, C., Legouis, R. Correlative light and electron microscopy to analyze LC3 proteins in Caenorhabditis elegans embryo. Methods in Molecular Biology. 1880, 281-293 (2019).
  41. Fermie, J., et al. Single organelle dynamics linked to 3D structure by correlative live-cell imaging and 3D electron microscopy. Traffic. 19 (5), 354-369 (2018).
  42. Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: Caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
  43. Ladinsky, M. S., Howell, K. E. Electron tomography of immunolabeled cryosections. Methods in Cell Biology. 79, 543-558 (2007).
  44. Oorschot, V., Lindsey, B. W., Kaslin, J., Ramm, G. TEM, SEM, and STEM-based immuno-CLEM workflows offer complementary advantages. Scientific Reports. 11 (1), 899(2021).
  45. Franke, C., et al. Correlative single-molecule localization microscopy and electron tomography reveals endosome nanoscale domains. Traffic. 20 (8), 601-617 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Lokalizacja LC3organelle autofagicznemikroskopia fluorescencyjnaautofagosomyznakowanie immunozłotemautolizosomyultrastrukturalna lokalizacja białektransmisyjna mikroskopia elektronowa
Ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej na przekroju
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.