Ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej na przekroju

Autofagia jest kluczowym procesem dla oczyszczania i recyklingu białek cytoplazmatycznych i organelli. Proces makroautofagii (zwany dalej autofagią) polega na tworzeniu organelli z podwójną błoną, autofagosomów, które pozwalają komórkom otaczać cząsteczki cytoplazmatyczne i organelle w celu degradacji lizosomalnej. Autofagia zachodzi na poziomie podstawowym w większości komórek i jest regulowana w górę w odpowiedzi na warunki komórkowe, takie jak głód lub stres komórkowy. Autofagia zachodzi albo w sposób specyficzny dla substratu, ukierunkowany na określone struktury lub białka do degradacji, albo jako nieselektywny proces masowy obejmujący części cytozolu. W selektywnej autofagii autofagosomy powstają w wyniku koniugacji białek z rodziny Atg8 (białka związane z mikrotubulami 1A/B, łańcuch lekki 1A/B, 3A/B/C [LC3] i GABARAPs) z błonami pochodzącymi z recyklingu endosomów, Golgiego i/lub retikulum endoplazmatycznego (ER)¹. LC3 rozpoznaje ładunek autofagiczny w cytozolu bezpośrednio lub za pośrednictwem selektywnych adapterów autofagii, takich jak P62 / SQSTM. Nowe błony autofagiczne mogą być następnie sprzężone z LC3, rozszerzać się i łączyć, tworząc kompletną podwójną błonę otaczającą ładunek - zwaną autofagosomem. Autofagosom dojrzewa i ostatecznie łączy się z endosomem lub lizosomem, po czym autofagiczny ładunek i adaptery ulegają degradacji².

Badania nad powstawaniem, dojrzewaniem i fuzją autofagosomów często wykorzystują technologie mikroskopii świetlnej. Mikroskopia fluorescencyjna LC3 jest zwykle stosowana do oceny liczby i lokalizacji komórkowej autofagosomów w różnych warunkach. Ponadto, poprzez sprzężenie LC3 z wrażliwym na pH GFP i stabilnym pH RFP w tak zwanej sondzie tandemowej, całkowity strumień autofagii można zmierzyć w żywych komórkach jako funkcję utraty fluorescencji GFP³. Podejścia te są cennymi narzędziami dla badaczy, którzy pomagają zrozumieć rolę i mechanizm autofagii w różnych warunkach. Kolejnym nieocenionym narzędziem jest mikroskopia elektronowa (EM), która ujawnia ultrastrukturę organelli autofagicznych na różnych etapach autofagii^4,5,6,7,8. Do tej pory EM jest nadal metodą z wyboru do identyfikacji dokładnych etapów powstawania autofagosomów poprzez rozróżnianie różnych błon autofagicznych według morfologii: fagofor (podwójna błona nie w pełni zamknięta), autofagosom (zamknięta podwójna błona wokół ładunku cytozolowego) i autolizosom ([częściowa] utrata wewnętrznej błony autofagicznej). Morfologia bez informacji molekularnych może być jednak podatna na błędną identyfikację lub niejednoznaczność. Immuno-EM jest najbardziej wszechstronną metodą jednoczesnej charakterystyki molekularnej i klasyfikacji morfologicznej organelli autofagicznych. Na przykład, znakowanie LC3 za pomocą immunozłota na rozmrożonych kriosekcjach pozwala na ultrastrukturalną lokalizację LC3 i precyzyjną identyfikację organelli oznaczonych LC3⁹.

Wadą EM jest małe pole widzenia, które idzie w parze z dużym powiększeniem wymaganym do obserwacji delikatnej ultrastruktury błon autofagicznych i, w przypadku immuno-EM, do zlokalizowania znacznika oznaczającego interesujące białko. Ze względu na ich niedobór i niski poziom białka na ogół utrudnia to ilościową analizę EM autofagosomów. Aby zwiększyć liczbę autofagosomów, komórki są często głodzone i traktowane bafilomycyną A1 (BafA1), inhibitorem lizosomalnego zakwaszania i degradacji. Bez leczenia BafA1 poszukiwanie autofagosomów przez EM jest czasochłonne ze względu na niedobór tych organelli. Metoda przedstawiona w tym manuskrypcie rozwiązuje ten problem poprzez znakowanie fluorescencyjne i obrazowanie endogennego LC3 na rozmrożonych kriosekcjach w mikroskopie fluorescencyjnym przed dalszym przygotowaniem do EM. Obrazy fluorescencyjne kierują następnie poszukiwaniami struktur znakowanych LC3 w EM. Po zebraniu obrazy EM są korelowane z obrazami fluorescencyjnymi, aby dodać informację molekularną - obecność LC3 - do ultrastruktury komórki. Ta metoda "CLEM na przekroju" znacznie zwiększa zdolność do znajdowania struktur znakowanych LC3, szczególnie w warunkach nieleczonych, w celu późniejszej identyfikacji i klasyfikacji przez EM.

Ta metoda została zastosowana do komórek HEPG2 ¹⁰ w celu znalezienia autofagosomów w niezmienionych (tj. bez BafA1) warunkach. Znaleziono stosunkowo niewiele fluorescencyjnych puncta (mniej niż jedna na profil komórki w sekcji 90 nm), co zgadza się z wysokim obrotem LC3¹¹. Ta rzadkość LC3-puncta podkreśliła wartość CLEM; wybierając regiony z kilkoma punktami fluorescencyjnymi do obrazowania w EM, znaleziono i scharakteryzowano organelle LC3-dodatnie w znacznie skuteczniejszy sposób niż za pomocą konwencjonalnej immuno-EM. Okazało się, że większość organelli LC3-dodatnich to autofagosomy, zgodnie z ich morfologią, co kontrastuje z wynikami uzyskanymi w komórkach traktowanych BafA1, gdzie autolizosomy są bardziej powszechne⁹. Dane te pokazują, że w przypadku CLEM w sekcji autofagia może być badana na poziomie ultrastrukturalnym bez konieczności hamowania przepływu autofagicznego.

1. Przygotowanie narzędzi i odczynników

UWAGA: Aby uzyskać wymagane odczynniki, i roztwory, zobacz Plik uzupełniający 1 lub ¹², aby uzyskać więcej informacji. Szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, odczynników, sprzętu i oprogramowania użytego w tym protokole znajdują się w Tabeli materiałów.

1. Utrwalacze
   1. Przygotować 0,2 M bufor fosforanowy (PB) lub 0,2 M PIPES, HEPES, EGTA, bufor MgSO₄ (PHEM), zgodnie z opisem w pliku uzupełniającym 1, do użycia jako podstawa dla roztworów utrwalających.
      UWAGA: Utrwalacze są rutynowo buforowane w buforze 0,1 M PB lub PHEM w celu buforowania przed zakwaszeniem spowodowanym reakcją aldehydu z materiałem biologicznym.
   2. Ponieważ jakość paraformaldehydu (PFA) jest kluczem do niezawodnego utrwalenia ultrastruktury próbek, należy stosować PFA klasy EM. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, należy użyć 16% roztworów podstawowych, przygotowanych z wysokiej jakości bryłek PFA (patrz plik uzupełniający 1).
      UWAGA: Paraformaldehyd jest niebezpieczną substancją chemiczną (zwroty wskazujące rodzaj zagrożenia H228, H301, H302, H311, H314, H315, H317, H318, H331, H332, H335, H341, H350). Podczas pracy z PFA należy nosić sprzęt ochronny (rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne) i pracować w kapturze chemicznym. Odpady zawierające PFA powinny być zbierane i utylizowane zgodnie z wytycznymi i przepisami instytutów.
   3. Połączyć 10 ml 0,2 M PB, 5 ml 16% PFA (w wodzie demineralizowanej [dH₂O]) i 5 ml_{dH 2}O, aby przygotować roztwór utrwalający 4% PFA.
   4. Opcjonalnie: Dodanie 0,02%-0,5% aldehydu glutarowego (GA) do roztworu utrwalającego z kroku 1.1.3 poprawia zachowanie ultrastruktury, ale zmniejsza antygenowość próbki w kierunku wielu przeciwciał.
      UWAGA: Gdy pożądane jest mocowanie GA, użyj GA klasy EM od odpowiedniego dostawcy.
      UWAGA: Aldehyd glutarowy jest niebezpieczną substancją chemiczną (zwroty wskazujące rodzaj zagrożenia H301, H302, H314, H317, H330, H332, H334, H335, H400, H411). Pracuj w kapturze chemicznym i noś sprzęt ochronny (rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne) podczas manipulowania GA. Odpady zawierające GA powinny być zbierane i utylizowane zgodnie z wytycznymi i przepisami instytutu.
2. Narzędzia i materiały
   1. Zarysuj powierzchnię aluminiowych kołków uchwytu próbki i poddaj je sonikacji w etanolu 3 x 10 min, aby usunąć resztki metalu i zapewnić optymalne przyleganie, gdy bloki komórek zatopione w żelatynie są zamontowane na kołkach.
   2. Użyj kanistra do przechowywania odpowiedniego do przechowywania aluminiowych kołków uchwytu próbki wraz z ich próbkami w ciekłym azocie (LN₂).
   3. Zrób manipulator, przymocowując pojedyncze włosy lub rzęsy do końca drewnianego szpikulca za pomocą lakieru do paznokci.
   4. Zrób pętlę odbioru. Zegnij drut ze stali nierdzewnej o grubości 0,3 mm wokół okrągłego pręta o średnicy 3 mm i skręć końce razem, tworząc pętlę na jednym końcu. Włóż skręcone końce do końcówki pipety. Włóż drewniany szpikulec z drugiego końca i przymocuj klejem lub żywicą.
      UWAGA: Pętla odbiorcza jest również dostępna w handlu (patrz Tabela materiałów).
   5. Aby przygotować pętle do suszenia na siatce, wykonaj te same czynności, co w przypadku tworzenia pętli odbiorczych: uformuj drut ze stali nierdzewnej w pętli 4 mm i przymocuj do dużej końcówki pipety za pomocą kleju lub żywicy.
   6. Pokryj siatki cienką folią nośną, taką jak formvar (protokół w pliku uzupełniającym 1). Przed użyciem pokryj kratki cienką warstwą węgla.
      UWAGA: Gotowe do użycia siatki są dostępne na rynku (patrz Tabela materiałów). Siatki powlekane formvarem mogą być przechowywane przez czas nieokreślony w temperaturze pokojowej (RT); Kratki pokryte węglem mogą być przechowywane w RT przez kilka miesięcy.
   7. Przygotuj czyste szkiełka podstawowe i duże szkiełka nakrywkowe (24 mm x 24 mm jest idealne do szkiełek o szerokości 25 mm), jak w ¹³.

2. Utrwalanie i przygotowanie próbki

1. Utrwalenie
   1. Użyj utrwalacza przygotowanego w kroku 1.1.3 (4% PFA w 0,1 M PB). W przypadku przylegających linii komórkowych hodowla 1-5 × 10⁶ komórek w 6 cm naczyniach. Dodać utrwalacz do pożywki hodowlanej w stosunku 1:1 i inkubować próbkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zastąpić mieszaninę z samym utrwalaczem i inkubować przez 2 godziny w temperaturze RT.
      UWAGA: Dokładna liczba komórek, konfluencja i warunki hodowli mogą się różnić w zależności od używanego systemu modelowego.
   2. Próbki należy przechowywać przez noc lub do 3-4 tygodni w 0,5% PFA w 0,1 M PB w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: GA można dodać do utrwalenia (patrz krok 1.1.4), a długość fiksacji można zmienić, aby znaleźć optymalną równowagę między zachowaniem morfologii a antygenowością, która różni się w zależności od próbki i oznakowania. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz¹⁴.
2. Osadzanie próbek
   1. Umyj naczynie ze stałymi komórkami 3x z PBS przy RT. Następnie zastąp PBS zawierającym 0,15% glicyny i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Zastąp PBS zawierający 0,15% glicyny 1% żelatyną w PBS podgrzanym do temperatury 37 °C, a następnie zeskrobać i przenieść komórki w 1% żelatynie do probówki mikrowirówkowej. Granulować komórki w temperaturze 6 000 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej w mikrowirówce. Następnie usunąć 1% żelatyny bez naruszania osadu i dodać 12% żelatyny podgrzanej do 37 °C. Zawiesić osad komórkowy, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą końcówek do pipet lub szklanych pipet Pasteura podgrzanych do temperatury 37 °C.
   3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut, następnie granulować komórki w temperaturze 6 000 × g przez 1 minutę. Żelatynę zestalać na lodzie przez 30 minut.
   4. Aby usunąć komórki zatopione w żelatynie z tuby, odetnij koniec rurki zawierającej osad od reszty probówki za pomocą żyletki. Następnie, prostopadle do pierwszego cięcia, przeciąć koniec rurki z granulką komórkową na pół.
   5. Inkubować dwie połówki końców rurki zawierające osad komórkowy zatopiony w żelatynie w 2,3 M sacharozie przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Powoduje to, że połówki osadzanych w żelatynie granulek komórkowych nieznacznie się kurczą i wyrywają z plastikowej tuby.
      UWAGA: Granulki komórkowe zatopione w żelatynie powinny być przechowywane w temperaturze 4 °C lub lodowatości tak bardzo, jak to możliwe, aby sacharoza o objętości 2,3 M nie stała się zbyt lepka, a żelatyna zbyt miękka. Podczas manipulowania osadami komórkowymi zatopionymi w żelatynie w kolejnych krokach należy pracować tylko z jedną próbką na raz, a pozostałe trzymać na lodzie lub pracować w zimnym (~4 °C) pomieszczeniu. Unikaj przegrzania osadzanych w żelatynie granulek komórkowych przez światło słoneczne, gorące lampy mikroskopowe lub inne źródła ciepła.
   6. Usunąć połówki probówki z osadem komórkowym zatopionym w żelatynie z 2,3 M sacharozy. Następnie usuń pęsetą połówki komórek zatopione w żelatynie z połówek plastikowej tuby. Ręcznie pokrój śrut na bloki o odpowiedniej wielkości (~1 mm³) za pomocą żyletki. Użyj stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego, aby powiększyć obiekt podczas cięcia.
   7. Zanurzyć w zatopionych żelatynie blokach komórkowych 2,3 M sacharozy przez 3-16 godzin, obracając się od końca do końca w wirniku w temperaturze 4 °C.
   8. Umieść zatopiony w żelatynie blok komórek na aluminiowym trzpieniu uchwytu próbki (patrz krok 1.2.1). Pozostaw wystarczającą ilość sacharozy o objętości 2,3 M wokół krawędzi bloku, aby utworzyła cienki "kołnierz" między blokiem a szpilką. Unikaj zbyt dużej ilości sacharozy o średnicy 2,3 M pokrywającej górną część bloku. Zamrozić zatrzaskowo i przechowywać w LN₂.

3. Podział na sekcje

1. Przycinanie (zobacz też¹²)
   1. Wyjąć szpilkę z blokiem komórek zatopionych w żelatynie z magazynu LN₂ i umieścić ją w kriomikrotomie ustawionym na temperaturę -80 °C.
   2. Przytnij przód bloku, aby spłaszczyć jego powierzchnię i uzyskać odcinki ~250 nm. Zanurz pętlę 3 mm w roztworze do pobierania (1:1 2,3 M sacharozy i 2% metylocelulozy), włóż pętlę do kriokomory mikrotomu i poczekaj, aż w kropli zacznie tworzyć się lód (zwykle 5-7 s). Następnie natychmiast podnieś sekcję, szybko, ale delikatnie dociskając do nich kroplę. Wyjmij pętlę z kriokomory, poczekaj, aż kropla całkowicie się rozmrozi i dociśnij kroplę do szklanego szkiełka.
   3. Sprawdź orientację komórek poprzez barwienie skrawków błękitem toluidyny.
      1. Umieścić kroplę roztworu błękitu toluidynowego (patrz plik uzupełniający 1) na wierzchu sekcji na szkiełku podstawowym i wysuszyć na płycie grzewczej o temperaturze 80 °C, aż krawędzie kropli wyschną.
      2. Zdjąć szkiełko z płyty grzewczej i delikatnie spłukać błękit toluidynowy za pomocą dH₂O, zbierając go do odpowiedniego pojemnika na odpady.
      3. Osusz szkiełko podstawowe i sprawdź orientację komórek w sekcjach za pomocą prostego mikroskopu laboratoryjnego.
   4. Przyciąć boki bloku, dzieląc 50-100 μm w bok powierzchni bloku próbki z rogiem noża. Przytnij cztery boki powierzchni bloku próbki, obracając uchwyt próbki o 90° po przycięciu każdej strony, aby utworzyć wystający prostokąt o wymiarach ~250 μm x 375 μm. Zaznacz wystający obszar na podstawie orientacji komórki określonej w poprzednim kroku.
2. Dzielenie na sekcje i odbiór
   1. Schłodzić kriomikrotom do temperatury -100 °C. Z wystającego prostokąta należy odciąć wstęgę o grubości 70–90 nm i srebrzystozłotym połysku. Odsuń sekcje od krawędzi noża diamentowego za pomocą włosia na patyku (patrz sekcja 1.2.3), aby utworzyć długą (2-5 mm) wstążkę.
   2. Po uformowaniu się odpowiedniej wstążki przerwij sekcję, aby ją podnieść. Zanurz pętlę odbiorczą 3 mm w 2,3 M sacharozie i 2% metylocelulozie zmieszanych w stosunku 1:1, włóż pętlę do kriokomory mikrotomu i poczekaj, aż kropla zacznie zamarzać (zwykle 5-7 s). Następnie natychmiast podnieś sekcje, szybko, ale delikatnie dociskając do nich kroplę. Wyjmij pętlę z kriokomory, poczekaj, aż kropla całkowicie się rozmrozi i dociśnij kroplę do przygotowanej siatki (krok 1.2.6).
      UWAGA: Kratki z sekcjami można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.

4. Etykietowanie i mikroskopia świetlna

1. Etykietowania
   1. Umieść siatki z sekcjami (Rysunek 1A) sekcją do dołu na ~ 1 ml PBS w małym naczyniu lub płytce wielodołkowej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.
      UWAGA: Ten krok usuwa żelatynę, która znajduje się między komórkami; Żelatyna nie jest potrzebna po podziale i koliduje z pozostałym protokołem.
   2. Przetwarzaj siatki przekrojem do dołu na kropelkach ~ 75 μL na parafilmie (patrz Rysunek 1B). Zacznij od PBS + 0,15% przemycia glicyną (3 x 2 min) w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować siatki z 0,1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA)-c + 0,5% żelatyną ze skóry ryb (FSG) w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej jako etap blokujący. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w 0,1% BSA-c + 0,5% FSG w PBS i inkubować siatki na ~10 μL kropelkach tego roztworu przez 1 godzinę w RT (Rysunek 1C).
   3. Umyj kratki w 0,1% BSA w PBS 5x przy RT. Następnie rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe i 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI; 10 μg / ml) w 0,1% BSA-c + 0,5% FSG w PBS i inkubować siatki na ~ 10 μL kropelkach tego roztworu przez 30+ min w RT (Figura 1C). Umyj kratki w PBS 5x w RT.
      UWAGA: Opcjonalnie przeciwciało drugorzędowe można znakować cząstkami złota koloidalnego o długości fali 5, 10, 15 lub 20 nm sprzężonymi z białkiem A (PAG) w celu lokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania w EM. Jeśli jest to pożądane, inkubować siatki z PAG przez 20 minut w temperaturze pokojowej po wykonaniu kroku 4.1.3. Następnie przemyj 5x PBS w temperaturze pokojowej. Unikaj jednoczesnego stosowania wielu przeciwciał pierwszorzędowych i zwróć uwagę na reaktywność PAG na IgG różnych gatunków, aby zapobiec niepożądanym reakcjom krzyżowym. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz¹².
2. Mocowanie próbek do mikroskopii świetlnej
   1. Zanurz siatki w 50% glicerolu w dH₂O 2 x 5 min w temperaturze pokojowej. Umieść kratki między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym w 50% glicerolu, po jednej siatce na szkiełko nakrywkowe, z sekcjami skierowanymi do szkiełka nakrywkowego (Rysunek 1D).
      UWAGA: Jakość etykietowania może ulec pogorszeniu, gdy kratki są zamontowane w 50% glicerolu przez ponad 30 minut. Dlatego zaleca się zamontowanie i zobrazowanie dwóch lub trzech siatek na raz, a pozostałe pozostawienie na wtórnym roztworze do etykietowania.
3. Mikroskopia świetlna
   1. Weź szklane szkiełko z siatkami warstwowymi do mikroskopu szerokokątnego ze zautomatyzowanym stolikiem. Wybierz obiektyw olejowy o dużym powiększeniu (63x lub 100x). Utwórz zestaw kafelków obrazu składający się z (części) wstążki sekcji (Rysunek 1E).
      UWAGA: Niektóre przeciwciała drugorzędowe mogą tworzyć agregaty fluorescencyjne na siatkach, zwłaszcza wokół fałd lub rozdarć w sekcjach. Dodatkowo niektóre typy komórek i tkanek zawierają struktury autofluorescencyjne. Jeśli spodziewane są takie problemy, zaleca się dołączenie siatki kontroli ujemnej, która nie jest inkubowana z przeciwciałem pierwszorzędowym.
4. Demontaż i kontrastowanie EM
   1. Dodać 10 μl dH₂O z boku szklanego szkiełka nakrywkowego i poczekać, aż działanie kapilarne wypełni powierzchnię styku szkiełka nakrywkowego. Ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe, nie mieszając oleju immersyjnego z glicerolem. Wyjmij kratki za pomocą pęsety i zanurz w dH₂O 3x w temperaturze pokojowej, aby zmyć 50% glicerolu.
      UWAGA: Olej może zakłócać barwienie uranylu i pogarszać kontrast EM.
   2. Ostrożnie osusz tylną część siatki niestrzępiącą się bibułą.
      UWAGA: Jeśli próbka była również oznaczona koloidalnymi cząstkami złota, wykonaj następujące czynności: umieść siatkę z sekcjami do dołu na kropelkach PBS i umyj 2x w RT. Postfix w 1% GA przez 5 minut w RT (patrz uwaga ostrzegawcza pod 1.1.4). Prać w PBS 2x w temperaturze pokojowej.
   3. Ułóż kratki przekrój do dołu na kropelkach dH₂O i umyj 8x w temperaturze RT.
   4. Aby zabarwić skrawki pod kątem kontrastu w EM, inkubuj z octanem uranylu (UA), pH 7, przez 5 minut w temperaturze RT (Rysunek 1F).
   5. Przed umieszczeniem kratek schłodzić UA:metylocelulozę o pH 4, umieszczając kropelki na parafolii na metalowej płytce na lodzie. Następnie umyj kratki lodowatym UA:metylocelulozą, pH 4, 2x i inkubuj z lodowatym UA:metylocelulozą, pH 4, przez 10 minut (Rysunek 1F).
      UWAGA: Octan uranylu jest niebezpieczną substancją chemiczną (zwroty wskazujące rodzaj zagrożenia H300, H330, H373, H411). W czynnościach wymagających UA pracuj w kapturze chemicznym i noś sprzęt ochronny (fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary ochronne). Zbieraj i utylizuj odpady zawierające UA zgodnie z wytycznymi i przepisami instytutów.
   6. Zapętlić siatki, wkładając pętlę do suszenia siatki do kropli UA:metylocelulozy poniżej siatki i delikatnie podnosząc ją, aż siatka zostanie ściągnięta z kropli¹². Zetrzyj nadmiar UA: metylocelulozy, dotykając pętli pod kątem ~ 60° (sekcje skierowane w dół) na niestrzępiącą się bibułę filtracyjną (patrz Tabela materiałów) i przeciągając ją powoli wzdłuż papieru, aż nie zostanie już wchłonięta UA: metyloceluloza. Następnie umieść pętlę z siatką w odpowiednim stojaku i pozostaw do wyschnięcia na >10 minut w temperaturze RT (Rysunek 1G).

5. EM

1. Skorzystaj z przeglądu uzyskanego za pomocą mikroskopii świetlnej, aby zlokalizować obszar zainteresowania (ROI) do obrazowania w transmisyjnym mikroskopie elektronowym (TEM; Rysunek 1H). Opisz zwrot z inwestycji w zestawie danych mikroskopii świetlnej. Po wybraniu regionu uzyskaj zestaw kafelków obrazu w powiększeniu od 20 000x-50 000x w TEM. Zrekonstruuj zestaw kafelków obrazu w oprogramowaniu do postprocessingu^15,16.

6. Korelacja i analiza

1. Załaduj zestaw danych z mikroskopii świetlnej i EM do odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazu, takiego jak ImageJ/Fiji¹⁷, wtyczka ec-CLEM w Icy¹⁸ lub Photoshop. Przytnij i obróć zestaw danych mikroskopii świetlnej, aby dopasować go do zestawu klocków EM.
   1. Przeprowadź korelację na podstawie sygnału DAPI we fluorescencji i konturach jądrowych w EM (Rysunek 1I). Przesuń obrazy, aby precyzyjnie je nałożyć i dokładnie wykonać ręczną korelację. Aby podejście było bardziej precyzyjne, zastosuj korelację opartą na punktach orientacyjnych, na przykład za pomocą wtyczki ec-CLEM w Icy lub wtyczki BigWarp w ImageJ, aby skorelować obrazy poprzez ręczny wybór odpowiednich punktów. Dostępny jest szczegółowy protokół korelacji krok po kroku z ec-CLEM¹⁹.
      UWAGA: To podejście działa również dobrze przy użyciu bimodalnych sond powierniczych^20,21.
2. Przeanalizuj skorelowane obrazy, wybierając ROI na podstawie sygnału fluorescencyjnego w odpowiednim programie (np. ImageJ). W przypadku analizy ilościowej utwórz kolekcję ROI dla wszystkich oznakowanych organelli. Następnie sprawdź odpowiednią ultrastrukturę poszczególnych ROI i sklasyfikuj je na podstawie elementów morfologicznych.

Zoptymalizowany protokół immuno-EM do znakowania LC3 metodą immuno-gold na ultracienkich kriosekcjach został niedawno opublikowany przez De Maziere et al.9. Badanie to obejmowało warunki głodowe bez BafA1, w których LC3 był obecny, ale stosunkowo rzadki i trudny do znalezienia przez EM. Metoda CLEM na przekroju została wprowadzona w osobnym badaniu, w którym wykorzystano czułość znakowania fluorescencyjnego do wizualizacji stosunkowo rzadkich i nisko eksprymowanych białek endogennych i skorelowano to z ultrastrukturą EM14. W tym przypadku te dwa podejścia są połączone poprzez zastosowanie zoptymalizowanego protokołu etykietowania LC3 w ramach podejścia CLEM.

Komórki HEPG2, komórki pochodzące z wątroby o stosunkowo wysokim poziomie bazalnej autofagii22, były głodzone w minimalnym roztworze soli (zrównoważony roztwór soli Earle'a [EBSS]) przez 2 godziny przed utrwaleniem w 4% PFA. Następnie przygotowano próbkę metodą ultracienkiej kriosekcji Tokuyasu (sekcje 1-3; patrz Slot i Geuze12), która jest wysoce kompatybilna z on-section CLEM14,23. Rozmrożone kriosekcje znakowano fluorescencyjnie (sekcja protokołu 4 i Rysunek 1) przy użyciu mysiego przeciwciała pierwszorzędowego anty-LC39. Dodatkowo do wskazania endo-lizosomów użyto króliczego anty-LAMP1, a następnie przeciwciał drugorzędowych anty-mysich AlexaFluor488 i anty-króliczych AlexaFluor568. Siatki umieszczono między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem podstawowym i zobrazowano w świetle widzenia rentgenowskim na mikroskopie szerokokątnym (obiektyw olejowy 100x 1,47 NA, kamera sCMOS).

Zaletą znakowania fluorescencyjnego cienkich odcinków w porównaniu z konwencjonalnym IF całej komórki jest zwiększona rozdzielczość w Z, ponieważ fizyczna grubość przekroju wynosi 60-90 nm. Dzięki tej ulepszonej rozdzielczości Z, znakowanie fluorescencyjne LC3 i LAMP1 na cienkich odcinkach ujawnia bardzo małą kolokalizację (Rysunek 2A). W komórkach traktowanych inhibitorami lizosomalnymi, takimi jak BafA1, występuje wysoka kolokalizacja, ponieważ LC3 zamknięty w lizosomach pozostaje niezdegradowany9. W nieleczonych komórkach LC3 ulega szybkiej degradacji w kontakcie z enzymatycznie aktywnymi, LAMP1-dodatnimi lizosomami, a zatem kolokalizacja jest rzadka w tych warunkach. Ogólnie rzecz biorąc, zaobserwowano mniej niż jeden LC3 punctum na profil komórkowy. Oznacza to, że nawet w warunkach głodu rotacja autofagosomów jest szybka, co utrzymuje niską liczbę autofagosomów. Podkreśla również znaczenie wykorzystania CLEM do znalezienia rzadkich struktur znakowanych LC3, przy użyciu dużego pola widzenia zapewnianego przez mikroskopię świetlną. Co więcej, wyższa czułość znakowania fluorescencyjnego w porównaniu do znakowania złotem umożliwia identyfikację większej liczby organelli LC3-dodatnich niż w konwencjonalnym immuno-EM, co dodatkowo pomaga w ich charakteryzacji.

Po uzyskaniu pełnego zestawu wstęg sekcji, siatki zostały pobrane z mikroskopu i wybarwione pod kątem EM za pomocą UA i metody loop-out (kroki protokołu 4.4-4.6; Rysunek 1F,G). Ta metoda "loop-out" zapewnia, że cienka warstwa UA:metylocelulozy pozostaje na siatce, co tworzy pożądany kontrast w EM. Grubość warstwy zależy od prędkości i kąta, pod jakim UA:metyloceluloza jest usuwana na bibułę filtracyjną. Zbyt szybkie przeciągnięcie pętli może pozostawić zbyt dużo UA:metylocelulozy na siatce i przyciemnić wygląd sekcji w EM. Zbyt wolne przeciąganie może odciągnąć zbyt dużo UA:metylocelulozy, co skutkuje zbyt małym zabarwieniem i słabą morfologią, a także grozi wypadnięciem siatki z pętli. Barwienie "plamy oleju" (Rysunek 1G) na suchych siatkach wskazuje na odpowiednią grubość warstwy metylocelulozy UA.

Po wyprowadzeniu pętli i wysuszeniu, siatki zostały zobrazowane w TEM przy ROI wybranych przez fluorescencję. Zestawy danych IF i EM skorelowano poprzez nałożenie sygnału DAPI na kontury jąder widocznych w EM, generując zintegrowany obraz zawierający informacje o obu modalnościach.

Znalezienie tego samego obszaru w EM, który został wybrany w IF, może być trudne. W związku z tym zaleca się, aby podczas wyszukiwania w EM, mieć pod ręką obraz poglądowy zestawu kafelków IF. Użytkownicy powinni szukać rozpoznawalnych cech w obu modalnościach, takich jak fałdy lub rozdarcia w sekcjach, paski siatki lub układ jąder. Ważne jest również, aby pamiętać, że próbka może wyglądać na obróconą i odbitą w lustrze w EM. W celu ułatwienia korelacji można wykorzystać "siatki szukacza" ze specjalnymi funkcjami do identyfikacji obszarów (zob. tabela materiałów).

Korelacja organelli LC3-dodatnich z ultrastrukturą EM ujawniła, że różne puncta reprezentowały różne etapy autofagii (Rysunek 2B). Chociaż zachowanie autofagosomalnej ultrastruktury jest trudne w kriosekcjach, często obserwowano organelle z zawartością cytoplazmatyczną i podwójnymi błonami (Ryc. 2C, strzałki w organellach 1-5; Rysunek uzupełniający S1), które definiują cechy morfologiczne autofagosomów. Co ciekawe, raczej słabe plamki fluorescencyjne zostały zidentyfikowane przez EM jako autolizosomy LC3-dodatnie (Rysunek 2C, organelle 6; zawartość autofagiczna jest oznaczona *), charakteryzujące się gęstą zawartością i pęcherzykami śródświetlnymi. Wykazało to, że bardzo małe ilości LC3 są widoczne w IF ultracienkich kriosekcji i wskazało, że pomimo środowiska degradacji, część LC3 jest wykrywalna w autolizosomach w stanie ustalonym. Jednak większość LC3-dodatnich puncta reprezentowała autofagosomy, podczas gdy autolizosomy były bardzo rzadkie. Jest to przeciwieństwo komórek traktowanych BafA1, które przede wszystkim gromadzą autolizosomy, a nie autofagosomy9.

Podsumowując, ten protokół opisuje metodę CLEM na przekroju do łączenia informacji molekularnej uzyskanej przez mikroskopię fluorescencyjną z ultrastrukturą EM. Ta metoda zwiększa czułość immuno-EM, ponieważ do znakowania używa się tylko fluoroforów, które na ogół dają więcej sygnału niż sondy EM. Metoda ta jest szczególnie przydatna do stosowania ultracienkich kriosekcji, w których można uzyskać wysoki poziom fluorescencji właściwej przy znikomym barwieniu tła. Wykorzystując fluorescencję do badań przesiewowych pod kątem rzadkich struktur lub zdarzeń i korelując wybrane zwroty z inwestycji z EM, można znacznie skrócić czas operacji EM i związane z tym koszty. Czułość i wykonalność metody wykazano poprzez wizualizację LC3 w nieleczonych, wygłodzonych komórkach, pokazując, że LC3 głównie wiąże się z autofagosomami w tych warunkach, z bardzo niskimi poziomami widocznymi w autolizosomach.

Rysunek 1: Schematyczny przegląd CLEM w przekroju. (A) Kriosekcje z komórek zanurzonych w żelatynie są pobierane na miedzianej siatce pokrytej formvarem. (B) Siatki są przetwarzane przekroje w dół na kropelkach odpowiednich roztworów. (C) Siatki są znakowane pierwszorzędowymi i fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi. (D) Kratki umieszcza się między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem podstawowym w 50% glicerolu. (E) Obrazy fluorescencyjne są zbierane w mikroskopie szerokokątnym. (F) Siatki są pobierane ze szkiełka i dalej przetwarzane przez barwienie uranylem dla EM. (G) Po wysuszeniu siatki można zobrazować za pomocą TEM. (H) Zestaw kafelków obrazu TEM o dużym powiększeniu jest uzyskiwany z obszaru wybranego z danych fluorescencyjnych. (I) Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej i EM są skorelowane i nałożone na siebie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: CLEM LC3 i LAMP1 w wygłodniałych komórkach HEPG2. Komórki HEPG2 były głodzone przez 2 godziny w EBSS przed utrwaleniem 4% PFA przez 2 godziny. (A) Obrazowanie IF LC3 (zielony) i LAMP1 (czerwony) na odcinkach ujawnia stosunkowo mało punktów LC3 i niewielką kolokalizację z LAMP1. (B) Powiązanie informacji molekularnej z IF (lewy panel) z informacją ultrastrukturalną uzyskaną w EM (panel środkowy) poprzez nałożenie dwóch modalności obrazowania opartych na DAPI i konturach jądrowych (linie przerywane, prawy panel). Ultrastruktura poszczególnych komór oznaczonych LC3, zilustrowana w ramce 1 (prawy panel), pokazano w C. (C) Ultrastruktura przedziałów LC3-dodatnich. Obrazy CLEM są pokazane po lewej stronie, a pseudokolorowe (beżowe) obrazy EM po prawej (niekolorowe obrazy EM są pokazane na rysunku uzupełniającym S1). Wewnętrzne i zewnętrzne błony autofagosomalne są oznaczone odpowiednio białymi i czarnymi grotami strzałek. Zawartość autofagiczna wewnątrz autolizosmu w przykładzie 6 jest oznaczona *. Podziałka = 10 μm (A), 1 μm (B), 200 nm (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający S1: Niekolorowe obrazy EM organelli LC3-dodatnich. (A-F) Niekolorowe obrazy EM pseudokolorowych przykładów 1-6 pokazane w Rysunek 2C. Organelle zostały wybrane za pomocą fluorescencji LC3, zgodnie z opisem dla Rysunek 2. Wewnętrzne i zewnętrzne błony autofagosomalne są oznaczone odpowiednio białymi i czarnymi grotami strzałek. Zawartość autofagiczna wewnątrz autolizosmu w przykładzie 6 jest oznaczona *. Podziałka = 200 nm. Skróty: AL = autolizosom; AP = autofagosom; M = mitochondrium. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: i roztwory użyte w tym badaniu. Ten plik uzupełniający zawiera receptury i protokoły potrzebne do sporządzenia i roztworów użytych w tym badaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy deklarują, że nie ma konfliktu interesów.