Artykuł metodologiczny

Przygotowanie 3D bezkomórkowych matryc z mięśni szkieletowych płodu myszy do hodowli komórkowej

DOI:

10.3791/65069

⸱

3 marca 2023

 ,  ,  , 
1Centre for Ecology, Evolution and Environmental Changes and Global Change & Sustainability Institute, Department of Animal Biology, Faculty of Sciences, University of Lisbon

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej pracy zoptymalizowano protokół decelularyzacji w celu uzyskania zdecelularyzowanych matryc mięśni szkieletowych płodu myszy. Mioblasty C2C12 mogą kolonizować te matryce, namnażać się i różnicować. Ten model in vitro może być wykorzystany do badania zachowania komórek w kontekście chorób mięśni szkieletowych, takich jak dystrofie mięśniowe.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) odgrywa kluczową rolę w dostarczaniu strukturalnego wsparcia dla komórek i przekazywaniu sygnałów, które są ważne dla różnych procesów komórkowych. Dwuwymiarowe (2D) modele hodowli komórkowych nadmiernie upraszczają złożone interakcje między komórkami a ECM, ponieważ brak pełnego wsparcia trójwymiarowego (3D) może zmienić zachowanie komórek, czyniąc je niewystarczającymi do zrozumienia procesów in vivo. Braki w składzie ECM i interakcje komórka-ECM są ważnymi czynnikami przyczyniającymi się do wielu różnych chorób.

Jednym z przykładów jest LAMA2-wrodzona dystrofia mięśniowa (LAMA2-CMD), gdzie brak lub zmniejszenie funkcjonalnej lamininy 211 i 221 może prowadzić do ciężkiej hipotonii, wykrywalnej przy urodzeniu lub wkrótce po urodzeniu. Wcześniejsze prace z wykorzystaniem mysiego modelu choroby sugerują, że jej początek następuje podczas miogenezy płodu. Niniejsze badania miały na celu opracowanie modelu 3D in vitro, pozwalającego na badanie interakcji między komórkami mięśniowymi a ECM mięśni płodu, naśladując natywne mikrośrodowisko. Protokół ten wykorzystuje głębokie mięśnie pleców wypreparowane z płodów myszy E18.5, potraktowane buforem hipotonicznym, anionowym detergentem i DNazą. Powstałe matryce bezkomórkowe (dECM) zachowały wszystkie badane białka ECM (laminina α2, lamininy całkowite, fibronektyna, kolagen I i kolagen IV) w porównaniu z tkanką natywną.

Gdy mioblasty C2C12 zostały zasiane na tych dECM, penetrowały i kolonizowały dECM, co wspierało ich proliferację i różnicowanie. Co więcej, komórki C2C12 wytwarzały białka ECM, przyczyniając się do przebudowy swojej niszy w obrębie dECM. Stworzenie tej platformy in vitro stanowi nowe, obiecujące podejście do wyjaśnienia procesów związanych z powstawaniem LAMA2-CMD i ma potencjał, aby zostać zaadaptowanym do innych chorób mięśni szkieletowych, w których braki w komunikacji między ECM a komórkami mięśni szkieletowych przyczyniają się do postępu choroby.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) jest głównym składnikiem tkanek, reprezentującym ich niekomórkowy komponent. Ta trójwymiarowa (3D) struktura nie tylko zapewnia fizyczne wsparcie dla komórek, ale także odgrywa kluczową rolę w procesach biochemicznych związanych z rozwojem organizmów1. Tworzenie specyficznego tkankowo ECM następuje podczas rozwoju, w wyniku złożonych interakcji między komórkami i ich niszami, na które wpływają różne bodźce wewnątrz- i zewnątrzkomórkowe. ECM jest wysoce dynamiczną strukturą, która ulega chemicznym i mechanicznym rearanżacjom w sposób czasowo-przestrzenny i bezpośrednio wpływa na los komórki2. Jedną z najbardziej godnych uwagi cech ECM jest jego różnorodność funkcjonalna, ponieważ każda tkanka ECM wykazuje unikalną kombinację cząsteczek, które zapewniają różne topologie i właściwości, które są dostosowane do zawartych w nim komórek1.

Sygnalizacja i wsparcie ECM są kluczowe dla rozwoju i homeostazy, a gdy są zakłócone, mogą prowadzić do wielu stanów patologicznych3,4. Jednym z przykładów jest wrodzona dystrofia z niedoborem LAMA2 (LAMA2-CMD), która jest najczęstszą postacią wrodzonej dystrofii mięśniowej. Gen LAMA2 koduje łańcuch α2 lamininy, który jest obecny w lamininie 211 i lamininie 221, a po mutacji może prowadzić do LAMA2-CMD5. Laminina 211 jest główną izoformą występującą w błonie podstawnej otaczającej włókna mięśni szkieletowych. Gdy laminina 211 jest nieprawidłowa lub nie ma jej wcale, połączenie między błoną podstawną a komórkami mięśniowymi zostaje przerwane, co prowadzi do wystąpienia choroby6. Pacjenci z LAMA2-CMD wykazują łagodny lub ciężki fenotyp w zależności od rodzaju mutacji w genie LAMA2.

Gdy funkcja białka α2 lamininy jest zaburzona, pacjenci mogą doświadczyć ciężkiej hipotonii mięśniowej po urodzeniu i rozwinąć przewlekłe zapalenie, zwłóknienie i zanik mięśni, co prowadzi do skrócenia oczekiwanej długości życia. Do tej pory nie opracowano żadnych celowanych metod leczenia, a podejścia terapeutyczne ograniczają się do łagodzenia objawów choroby7. Dlatego zrozumienie podstawowych mechanizmów molekularnych związanych z wystąpieniem tej choroby ma kluczowe znaczenie dla opracowania odpowiednich strategii terapeutycznych6,8. Wcześniejsze prace z użyciem dyW mouse9, modelu LAMA2-CMD, sugerują, że początek choroby zaczyna się w macicy, a konkretnie podczas miogenezy płodu10. Lepsze zrozumienie, w jaki sposób pojawia się wada miogenezy płodu, byłoby przełomem w tworzeniu nowych podejść terapeutycznych dla LAMA2-CMD.

Systemy in vitro zapewniają kontrolowane środowisko do badania interakcji komórka-komórka i komórka-ECM, ale modele hodowli 2D nie są tak skomplikowane jak natywne tkanki. Decelularyzacja tkanek wytwarza specyficzne dla tkanek i rozwoju bezkomórkowe rusztowania ECM, które dokładniej naśladują naturalne mikrośrodowisko komórki w porównaniu z modelami 2D i inżynieryjnymi/syntetycznymi rusztowaniami. Matryce bezkomórkowe (dECM) mają potencjał do zachowania molekularnych i mechanicznych wskazówek tkanki gospodarza, co czyni je lepszymi alternatywnymi modelami do zrozumienia procesów in vivo11.

Istnieją różne techniki, odczynniki i warunki, które mogą być używane do decelularyzacji12,13. W tym badaniu protokół decelularyzacji serca płodu myszy, opisany przez Silva i wsp.14,15, jest dostosowany do mięśni szkieletowych płodu myszy i stwierdzono, że zachowuje wszystkie testowane składniki ECM (laminina α2, lamininy całkowite, fibronektyna, kolagen I i kolagen IV). Protokół obejmuje trzy etapy: lizę komórek przez szok osmotyczny (bufor hipotoniczny), rozpuszczenie błony plazmatycznej i dysocjację białek (0,05% dodecylosiarczanu sodu [SDS]) oraz enzymatyczne niszczenie DNA (leczenie DNazą). Według naszej wiedzy jest to pierwszy ustalony protokół decelularyzacji mięśni szkieletowych płodu myszy.

Aby użyć tego systemu 3D in vitro do badania LAMA2-CMD, kluczowe jest utrzymanie łańcucha α2 lamininy po decelularyzacji. W związku z tym wdrożono protokół optymalizacyjny, w którym przetestowano różne detergenty (SDS i Triton X-100) i stężenia (0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2% i 0,5%) (dane nie pokazane). Stwierdzono, że optymalnym wyborem do usuwania komórek i zachowania białka α2 lamininy jest 0,05% SDS. Komórki C2C12, dobrze znana linia komórkowa mioblastów16,17, zostały użyte do zasiewu dECM. Komórki te atakują dECM, namnażają się i różnicują wewnątrz tych rusztowań, syntetyzując nowe białka ECM. Udana produkcja tego modelu 3D in vitro oferuje nowe podejście do zrozumienia procesów molekularnych i komórkowych związanych z miogenezą płodu, początkiem LAMA2-CMD, i może być rozszerzona na inne choroby mięśni, w których komunikacja między ECM a komórkami mięśni szkieletowych jest zakłócona.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane metodologie zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt (ORBEA) Wydziału Nauk Uniwersytetu w Lizbonie oraz Direção Geral de Veterinária (DGAV; ref. 0421/000/000/2022) i są zgodne z Dyrektywą Europejską 2010/63/UE.

1. Przygotowanie i odczynników decelularyzacyjnych

UWAGA: Wszystkie roztwory używane podczas protokołu decelularyzacji powinny być sterylizowane przez autoklawowanie i przechowywane przez okres do 3 miesięcy, chyba że zaznaczono inaczej.

  1. Przygotować 10 razy sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (10 x PBS), dodając chlorek sodu (NaCl) o stężeniu 137 mM, chlorek potasu (KCl) o stężeniu 2,68 mM, diwodorofosforan potasu (KH2PO4) o stężeniu 8,1 mM i dwuwodny fosforan sodu (Na2HPO4) o stężeniu 1,47 mM do wody zdemineralizowanej (dH2O) i doprowadzić pH do 6,8. Dodaj 100 ml 10x PBS do 900 ml zdemineralizowanego H2O, aby uzyskać 1 x PBS. Autoklaw i przechowywanie w temperaturze pokojowej (RT). Przed użyciem dodać sterylny roztwór podstawowy penicyliny/streptomycyny (10 000 j./ml penicyliny i 10 mg/ml streptomycyny [pióro/paciorkowiec]) do końcowego stężenia 1%.
  2. Przygotować bufor hipotoniczny rozpuszczając 1,21 g tris(hydroksymetylo)aminometanu (zasada Tris) i 1 g kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w 1 ldH2O(10 mM zasada Tris 0,1% EDTA). Użyj mieszadła magnetycznego aż do rozpuszczenia i dostosuj pH do 7,8 za pomocą NaOH/HCl. Sterylizuj w autoklawie i przechowuj w temperaturze pokojowej. Przed użyciem dodaj wstrzykiwacz/paciorkowiec do końcowego stężenia 1%.
  3. Przygotować hipotoniczny, rozpuszczając 1,21 g zasady Tris w 1 l dH2O (10 mM zasady Tris). Użyj mieszadła magnetycznego aż do rozpuszczenia i dostosuj pH do 7,8 za pomocą NaOH/HCl. Autoklaw i przechowuj w temperaturze pokojowej. Przed użyciem dodaj wstrzykiwacz/paciorkowiec do 1%.
  4. Przygotować anionowy detergent, dodając 0,05 g dodecylosiarczanu sodu (SDS) do 100 ml hipotonicznego buforu do płukania, aby uzyskać 0,05% roztwór do traktowania SDS. Przefiltrować przez filtr membranowy 0,22 μm. Przechowywać w RT do 1 miesiąca.
    UWAGA: Roztworu SDS nie należy sterylizować w autoklawie, ponieważ SDS wytrąca się i rozkłada podczas autoklawowania.
  5. Przygotować roztwór do traktowania DNazy, rozpuszczając 1,21 g zasady Tris w 0,5 ml dH2O i dodając 1 ml 1 M chlorku magnezu (MgCl2). Doprowadzić pH do 7,8 za pomocą NaOH/HCl. Autoklaw i przechowywać w temperaturze pokojowej. Przed użyciem dodać DNazę I (50 U/ml).

2. Pobieranie próbek

UWAGA: W badaniu wykorzystano myszy C57/BL6 typu dzikiego. Wszystkie techniki przeprowadzono w okapie z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.

  1. Poddać eutanazji dorosłe ciężarne samice myszy w 18,5 dniu ciąży w embrionalnym dniu (E) ciąży za pomocą inhalacji izofluranu, a następnie zwichnięcia szyjki macicy. Poddaj myszy terminalnej sekcji w celu wydobycia płodów.
    1. Spryskaj brzuch myszy 70% etanolem.
    2. Za pomocą kleszczy chirurgicznych i nożyczek unieś fałd skóry w dolnej części brzucha i wykonaj nacięcie w kształcie litery U, aby odsłonić jamę brzuszną18.
    3. Zbierz rogi macicy zawierające płody E18.5, przecinając jajowody i szyjkę macicy i natychmiast przenieś je na szalkę Petriego z lodowatym 1x PBS z 1% pen/strep18.
    4. Szybko usuń płody z macicy i tkanek pozaembrionalnych i poddaj je eutanazji przez dekapitację za pomocą nożyczek18.
  2. Przenieś jeden płód na raz na szalkę Petriego z lodowatym 1x PBS. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego usuń skórę i odetnij kończyny. Od strony brzusznej przeciąć klatkę piersiową i usunąć mostek oraz leżące poniżej narządy.
  3. Odwróć tułów płodu grzbietem do góry. Usuń szyjną część kręgosłupa, grzbietowe złogi tłuszczu i tkankę łączną na wierzchu głębokich mięśni pleców.
  4. Użyj kleszczy chirurgicznych, aby zakotwiczyć klatkę piersiową i ostrożnie zeskrob i odłącz głębokie mięśnie pleców od otaczających tkanek za pomocą mikro skalpela10. Procedura ta powoduje izolację dwóch części mięśni na płód (lewego i prawego), oba składające się głównie z mięśni najdłuższych i biodrowo-żebrowych, z uwzględnieniem niektórych mięśni poprzeczno-rdzeniowych i dźwigacza współstarum.
  5. Przechowuj próbki mięśni w 1x PBS z 1% wstrzykiwaczem/paciorkowcami w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego przechowywania (<1 tydzień) lub w temperaturze -80 °C przez dłuższy czas.
    UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, użyj świeżo pobranych próbek. Próbki zamrożone przez dłuższy czas (>3 miesiące) wykazują niższą wydajność decelularyzacji i większą degradację białek. Do eksperymentów z decelularyzacją wykorzystano masy mięśni osiowych, ale inne mięśnie (np. mięśnie kończyn) mogą być przetwarzane w celu decelularyzacji przy użyciu tego samego protokołu.

3. Decelularyzacja mięśni szkieletowych płodu

UWAGA: Wszystkie techniki były przeprowadzane w okapie z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach. Aby uzyskać szczegółową reprezentację schematyczną, zobacz Rysunek 1A. Wszystkie etapy wykonywano z mieszaniem w wytrząsarce orbitalnej o średnicy 120 mm (165 obr./min) w temperaturze 25 °C, chyba że zaznaczono inaczej. Dodaj 1% wstrzykiwacza/paciorkowca do roztworów przed użyciem. Podczas wyjmowania roztworów należy je zasysać ostrożnie, aby uniknąć uwięzienia próbki w pipecie.

  1. Dzień 1 - Przygotuj około 2 mm x 1 mm x 1 mm (~3,5 mg) fragmenty tkanki z masy mięśni osiowych. Dodać 3 ml hipotonicznego buforu z 1% wstrzykiwaczem/paciorkowcami do każdego dołka 12-dołkowej płytki i dodać jeden cały fragment tkanki mięśniowej na dołek.
    1. Inkubować fragmenty tkanek w buforze hipotonicznym z mieszaniem przez 18 godzin (przez noc) (O/N).
  2. Dzień 2 - Odessać bufor hipotoniczny za pomocą pipety z cienką końcówką i przemyć próbki 3 x 1 h 3 ml 1x PBS za każdym razem z mieszaniem.
    1. Próbki inkubować przez 24 godziny w 3 ml 0,05% roztworu detergentu SDS z mieszaniem.
      UWAGA: (PUNKT KONTROLNY) Po inkubacji SDS próbki powinny mieć przezroczysty wygląd. Próbki mają konsystencję podobną do żelatyny i dlatego są bardziej podatne na przywieranie do pipety podczas usuwania płynów.
  3. Dzień 3 - Usunąć roztwór detergentu SDS za pomocą pipety z cienką końcówką i przemyć fragmenty tkanek 3 x 20 min 3 ml hipotonicznego buforu do przemywania za każdym razem z mieszaniem.
    UWAGA: (PUNKT PAUZY) Próbki można przechowywać w hipotonicznym buforze do płukania w temperaturze 4 °C przez 18 godzin (O/N). Upewnij się, że SDS jest dobrze usunięty podczas etapów prania, ponieważ resztki SDS mogą być cytotoksyczne.
    1. Inkubować fragmenty tkanek przez 3 godziny z 2 ml roztworu DNazy z mieszaniem w temperaturze 37 °C.
    2. Usunąć roztwór DNazy za pomocą pipety z cienką końcówką i przemyć fragmenty tkanki 3 x 20 minut 3 ml 1x PBS za każdym razem z mieszaniem. Na koniec umyć O/N z mieszadłem (60 obr./min).
      UWAGA: Po poddaniu działaniu DNazy dECM stają się lepkie z powodu obecności reszt DNA. Dlatego konieczne jest staranne mycie.
    3. Przechowywać dECM w 1x PBS z 1% wstrzykiwaczem/paciorkowcami w temperaturze 4 °C do czasu recelularyzacji (<1 tydzień). Do innych zastosowań przechowywać w temperaturze -80 °C.

4. Ocena jakości decelularyzacji

UWAGA: Kwantyfikacja DNA, barwienie DAPI/zielenią metylową i barwienie falloidyną zostały przeprowadzone w celu oceny obecności resztkowej zawartości komórek po decelularyzacji. Przeprowadzono immunohistochemię i analizy western blot w celu oceny retencji kluczowych białek ECM po decelularyzacji.

  1. Kwantyfikacja DNA obecnego w dECM
    UWAGA: Wartości dECM należy porównać z tkanką natywną w celu wykrycia obecności DNA.
    1. Przed decelularyzacją zważ 1,5 ml probówki mikrowirówkowej na precyzyjnej wadze cyfrowej. Przed przeniesieniem próbki mięśni do probówki usuń wszystkie pozostałe 1x PBS za pomocą ręcznika papierowego. Zważyć probówkę z próbką. Obliczyć mokrą masę próbek, stosując równanie (1):
      Próbkao mokrej masie =waga probówki z próbkami -waga pustej probówki (1)
    2. Decelularyzacja próbek odbywa się zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 3.
    3. Umieścić próbki w probówkach do mikrowirówek o pojemności 2 ml.
      UWAGA: Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu ekstrakcji DNA i kwantyfikacji.
    4. Wykonaj ekstrakcję DNA z dECM i próbek tkanek natywnych za pomocą zestawu opartego na kolumnie wirowej. Dodać bufor do wytrawiania zgodnie z instrukcjami producenta.
    5. Homogenizować próbki w młynie perełkowym dwa razy przez 2,5 minuty za każdym razem (odwracając mocowania) za pomocą jednej kulki z węglika wolframu na rurkę (używać mocowań rurki ze schłodzeniem).
    6. Dodać proteinazę K i inkubować O/N z powolnym mieszaniem w temperaturze 56 °C.
    7. Postępuj zgodnie z protokołem zgodnie z opisem w instrukcjach producenta.
    8. Elucję za pomocą buforu dostarczonego przez producenta i odwirować 2 x 1 min w ≥6 000 x g, za każdym razem w temperaturze 4 °C w celu zwiększenia wydajności DNA.
      UWAGA: DNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu oznaczania ilościowego.
    9. Określ ilościowo DNA obecne w próbkach za pomocą fluorescencyjnego zestawu do wykrywania dsDNA zgodnie z instrukcjami producenta.
    10. Znormalizować zawartość DNA jako nanogramy DNA na miligram pierwotnej mokrej masy próbki.
    11. Przeanalizuj dane za pomocą dwustronnego testu t-Studenta i wyraź jako średnią ± błąd standardowy średniej (SEM).
  2. Immunohistochemia
    UWAGA: Roztwory 1, 2 i 3 oraz roztwór utrwalający należy przygotować przed użyciem i można je przechowywać w stanie zamrożonym do 6 miesięcy. Wszystkie użyte przeciwciała i barwniki oraz odpowiednie rozcieńczenia wymieniono w tabeli 1.
    1. Przygotowanie roztworów
      1. Przygotować roztwór utrwalający, dodając 2 g paraformaldehydu (PFA), 8 g sacharozy i 24 μl 1 M CaCl2 do 77 ml 0,2 M Na2HPO4 i 23 ml 0,2 M NaH2PO4, do końcowej objętości 200 ml przez dodanie dH2O. Dostosuj pH do 7,4.
      2. Przygotować 0,12 M bufor fosforanowy, dodając 13,5 g Na2HPO4 i 3,2 g NaH2PO4 do 1 l dH2O. Dostosować pH do 7,4.
      3. Przygotować roztwór 1, dodając 4 g sacharozy do 100 ml 0,12 M buforu fosforanowego.
      4. Przygotować roztwór 2, dodając 15 g sacharozy do 100 ml 0,12 M buforu fosforanowego.
      5. Przygotować roztwór 3, dodając 15 g sacharozy i 7,5 g żelatyny do 100 ml 0,12 M buforu fosforanowego. Podgrzewać w temperaturze 37 °C, aż żelatyna się rozpuści.
      6. Przygotować roztwór podstawowy zieleni metylowej (2% zielony metylowy proszek rozpuszczony w dH2O)19.
    2. Detekcja immunologiczna
      1. Utrwalać próbki roztworem utrwalającym przez co najmniej 4 godziny w temperaturze 4 °C.
      2. Przemyć próbki 2x przez 10 minut za pomocą 1x PBS.
      3. Przechowywać O/N lub przez 1 dzień w roztworze 1 w temperaturze 4 °C.
      4. Przemyć i przechowywać O/N lub ponad 1 dzień w roztworze 2 w temperaturze 4 °C. Pozwól próbkom ogrzać się do temperatury pokojowej.
      5. Inkubować przez 3 godziny w roztworze 3 w temperaturze 37 °C. Zachować dodatkowy roztwór 3 w temperaturze 37 °C do późniejszego wykorzystania.
      6. Małe pojemniki (2 cm x 1 cm x 1 cm) formować w folię aluminiową. Umieść cienką warstwę roztworu 3 w uformowanym pojemniku i pozwól mu stężeć. Umieścić próbki na zestalonym roztworze 3 i przykryć ciepłym roztworem 3. Zorientuj próbki i pozwól im zastygnąć. Zaznacz miejsce na zestalonym roztworze 3 kolorowym pisakiem.
      7. Zamrozić, umieszczając pojemniki na powierzchni izopentanu chłodzonego suchym lodem lub ciekłym azotem.
      8. Używając związku o optymalnej temperaturze cięcia (O.C.T.), przymocuj zamrożone kostki żelatyny zawierające próbki do mocowania kriostatu.
      9. Posiekaj zamrożone kostki żelatyny i przenieś skrawki tkanki na szkiełka. Pozostaw do wyschnięcia na 60 minut.
      10. Użyj markera hydrofobowego, aby narysować linię wokół sekcji.
      11. Umyj szkiełka 3 x 10 min w 1x PBS.
      12. Przykryj skrawki 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA), 1% surowicą kozią i 0,05% Triton X-100 rozcieńczonym w 1x PBS (roztwór blokujący) przez 30 minut (etap blokowania).
      13. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w roztworze blokującym i przykryć skrawki. Inkubować O/N w temperaturze 4 °C w zamkniętym pudełku, z wilgotnym papierem, aby zapobiec wysychaniu skrawków.
      14. Umyj szkiełka 3 x 10 min za pomocą 1x PBS.
      15. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w roztworze blokującym i przykryć skrawki. Inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.
        UWAGA: Unikaj ekspozycji na światło, aby zapobiec degradacji fluoroforu.
      16. Umyj szkiełka 3 x 10 min za pomocą 4x PBS.
        UWAGA: Wyższe stężenie PBS można zastosować, gdy obecne jest silne tło.
      17. Zanurz szkiełka w roztworze DAPI (5 μg/ml 1,4-diazabicyklo-2,2,2-oktanu w 0,1% Triton X-100/1x PBS) na 30 s każda.
      18. Spłucz w 1x PBS.
      19. Zamontuj sekcje w podłożu zapobiegającym blaknięciu (50 mg / ml galusanu n-propylu w 1x PBS: glicerol [1:9]) i uszczelnij szkiełkiem nakrywkowym. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu obserwacji i uzyskania obrazu w mikroskopie fluorescencyjnym20.
        UWAGA: W przypadku eksperymentów immunohistochemicznych in toto zastosowano ten sam protokół (patrz kroki 4.2.2.12-4.2.2.18), z wyjątkiem tego, że próbki zostały wcześniej utrwalone w 4% PFA rozcieńczonym w 1x PBS przez 3 godziny w RT. Barwienie DNA przeprowadzono przez dodanie zieleni metylowej do roztworu przeciwciała drugorzędowego. Wszystkie użyte przeciwciała i barwniki oraz ich odpowiednie rozcieńczenia są wymienione w tabeli 1. Próbki zostały następnie umieszczone w podłożu zapobiegającym blaknięciu między dwoma szkiełkami nakrywkowymi oddzielonymi stalowymi pierścieniami, sklejonymi ze sobą woskiem pszczelim, a stosy obrazów o wielkości 100 μm uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego21.
  3. Analiza Western blot
    UWAGA: Wszystkie użyte przeciwciała i odpowiednie rozcieńczenia są wymienione w Tabeli 1.
    1. Przygotowanie roztworów
      1. Przygotuj bufor ładujący 2x SDS-PAGE, dodając 20 ml glicerolu, 4 g SDS i 0,2 ml błękitu bromofenolowego do 80 ml 100 mM roztworu zasadowego Tris. Dostosuj pH do 6,8. Przed użyciem dodać świeży ditiotreitol (DTT).
      2. Przygotować buforowany bufor do przemywania solą fizjologiczną Tris z roztworem Tween 20 (TBST), dodając 2,4 g zasady Tris, 8,8 g NaCl i 1 ml Tween-20 do dH2O do końcowej objętości 1 l. Dostosuj pH do 7,4-7,6 za pomocą HCl.
      3. Przygotuj 10x bufor do biegania (RB), dodając 30,2 g zasady Tris, 144,2 g glicyny i 10 g SDS do 1 l dH2O. Przed użyciem dodać 100 ml 10x RB do 900 ml dH2O, aby przygotować 1x RB (roztwór roboczy).
        UWAGA: Podczas gdy 10x RB może być przechowywane w RT przez kilka miesięcy, 1x RB może być ponownie wykorzystany w różnych przebiegach.
      4. Przygotować bufor transferowy (TB), dodając 5,82 g zasady Tris, 2,93 g glicyny i 0,5 g SDS do 800 ml dH2O. Po rozpuszczeniu składników dodać 200 ml metanolu. Schłodzić w temperaturze 4 °C.
        UWAGA: TB należy przygotować na świeżo przed każdym użyciem.
    2. Ekstrakcja białek
      1. Zbierz mięśnie osiowe od myszy E18.5 i natychmiast umieść je w probówce mikrowirówkowej (2 ml) zawierającej 2x bufor ładujący SDS-PAGE ze świeżo dodanym DTT (100 mM DTT). Przetwarzaj E18.5 dECM w ten sam sposób.
      2. Dodaj jedną kulkę z węglika wolframu na rurkę. Homogenizować 2x w młynku do perełek przez 2,5 minuty za każdym razem (odwrócić mocowania).
      3. Sonikować próbki przez 5 minut w kąpieli ultradźwiękowej.
      4. Podgrzewać próbki przez 10 minut w temperaturze 50 °C.
      5. Odwirować próbki o masie 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
      6. Przenieść supernatant do świeżej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
      7. Określić ilościowo białko za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.
      8. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
    3. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym
      1. Użyj prefabrykowanego żelu gradientowego akryloamidu (4%-20%)
      2. Zamontuj żel w zbiorniku do elektroforezy. Ostrożnie wyjmij grzebień. Dodaj 1x RB, aż linia pojawi się w zbiorniku do elektroforezy. Upewnij się, że studzienki są wypełnione RB.
      3. Załadować 100 μg białka na próbkę do studzienek. Załaduj 12 μl wzorca białka o wysokiej masie cząsteczkowej.
      4. Praca przez łącznie 100 minut przy stałym napięciu (10 minut przy 150 V i 90 minut przy 185 V).
    4. przelać
      1. Namocz wkłady filtracyjne i gąbki w schłodzonej gruźlicy (4 °C) podczas pracy żelu.
      2. Przyciąć membrany z polifluorku winylidenu do rozmiaru żelu. Aktywuj je metanolem i umyj dH2O. Namocz w gruźlicy.
      3. Zamontuj kasetę transferową z gąbkami, wkładkami filtrującymi, żelami i aktywowanymi membranami zgodnie z instrukcjami producenta.
      4. Umieść kasetę w zbiorniku do elektroforezy zawierającym schłodzoną gruźlicę (na podłożu lodowym). Dodaj jednostkę chłodzącą. Działa przez 90 minut przy napięciu 100 V.
      5. Po przeniesieniu zabarwić niebieskim substytutem Coomassie, aby ocenić jakość transferu.
    5. Detekcja immunologiczna
      1. Przygotować roztwór blokujący (TBST z 5% mlekiem o niskiej zawartości tłuszczu). Inkubować błony z mieszaniem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      2. Płukać 3 x 5 s łyżką stołową.
      3. Inkubować błony O/N z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w TBST z 2% BSA i 0,02% azydkiem sodu (3 ml na membranę) w zimnej komorze (4 °C) z mieszaniem.
      4. Następnego dnia umyj 3 x 5 min TBST.
      5. Inkubować błony z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (HRP) rozcieńczonymi w TBST z 5% mlekiem o niskiej zawartości tłuszczu (5 ml na każdą błonę) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      6. Umyj membrany TBST 3 x 5 min. Trzymaj w TBST do momentu detekcji.
      7. Wizualizacja białka za pomocą dostępnego na rynku zestawu do wywoływania. Dodaj odczynniki detekcyjne zgodnie z instrukcjami producenta. Zdobądź obrazy pasm.
      8. Aby przetestować więcej niż jedno przeciwciało na membranę, po etapie wykrywania, usuń poprzednie przeciwciała trzema płukaniami (5 minut każde) za pomocą TBST i powtórz kroki 4.3.5.2-4.3.5.7.

Tabela 1: Przeciwciała i barwniki stosowane w immunohistochemii i analizie western blot oraz odpowiednie rozcieńczenia. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.10,22

5. Hodowla komórkowa w matrycach bezkomórkowych

UWAGA: Wszystkie techniki zostały wykonane w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym. Wszystkie inkubacje przeprowadzono w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 .

  1. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych, pożywkę Dulbecco's Modified Eagle Medium o wysokiej zawartości glukozy ze stabilną glutaminą i pirogronianem sodu (DMEM), uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% wstrzykiwaczem/paciorkowcami (kompletna pożywka hodowlana).
  2. Umieść dECM na szalce Petriego w 1x PBS z 1% długopisem/paciorkowcami w okapie z przepływem laminarnym i podziel je na kawałki o wymiarach około 500 μm x 500 μm x 250 μm, za pomocą mikroskalpela i pęsety.
    UWAGA: dECM mają miękką teksturę, dlatego często łatwiej jest użyć pęsety, aby podzielić je na mniej więcej te same kawałki niż ciąć je mikroskalpelem.
  3. Przenieść fragmenty na 96-dołkową płytkę (trzy lub cztery sztuki na studzienkę) z 200 μl kompletnej pożywki hodowlanej, uprzednio podgrzanej do temperatury 37 °C. Inkubować przez 2 godziny w inkubatorze.
  4. Dodaj 500 μl trypsyny do kolby T25 wysianej sub-konfluentnymi (~70%) komórkami C2C12. Zawiesić w 1 ml kompletnego podłoża.
  5. Dodać 10 μl zawiesiny do 10 μl niebieskiego barwnika trypanowego i załadować do hemocytometru. Policz i oblicz liczbę komórek i potwierdź żywotność komórki.
  6. Odessać pożywkę z 96-dołkowej płytki zawierającej dECM i dodać 200 μl kompletnej pożywki hodowlanej zawierającej 50 000 żywotnych komórek C2C12.
  7. Inkubować przez 2 dni, a następnie, za pomocą pęsety, przenieść dECM (wraz z komórkami) na 48-dołkową płytkę z 400 μl kompletnej pożywki hodowlanej. Co 2 dni ostrożnie odsysać pożywkę za pomocą mikropipety, aby zapobiec odklejaniu się dECM od dna studzienki i dodawać świeżą pożywkę do dnia 8,
    UWAGA: Matryce są przechowywane przez 2 dni na płytkach 96-dołkowych w celu promowania adhezji komórek C2C12 do dECM, a następnie są przenoszone na płytkę 48-dołkową, aby umożliwić dostęp do większej objętości pożywki ze składnikami odżywczymi. DECM powinny przylegać do dna studzienek.
  8. W eksperymencie różnicowania należy zastąpić kompletną pożywkę hodowlaną pożywką różnicującą (DMEM uzupełnioną 2% surowicą końską i 1% kojcą / paciorkowcem) w dniu 8, a następnie inkubację w pożywce różnicującej przez 4 dni do dnia 12.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem protokołu decelularyzacji jest wyprodukowanie dECM, które bardzo przypominają skład natywnej tkanki. Aby określić skuteczność procesu decelularyzacji, zastosowano różne metody, w tym badanie morfologii tkanek, pomiar poziomu DNA, barwienie na obecność F-aktyny oraz analizę kluczowych składników ECM za pomocą immunohistochemii i technik western blotting. W szczególności przeanalizowano pięć głównych składników ECM tkanek mięśni szkieletowych.

W trakcie trwania protokołu, próbki zmieniają ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ECM to złożona sieć makrocząsteczek, która jest obecna we wszystkich tkankach i odgrywa kluczową rolę w regulacji zachowania i funkcji komórek2. ECM działa jak fizyczne rusztowanie, do którego komórki mogą się przyczepić, i dostarcza wskazówek, które aktywnie modulują procesy komórkowe, takie jak proliferacja, ruchliwość, różnicowanie i apoptoza. Tak więc prawidłowe tworzenie i utrzymywanie ECM jest niezbędne zarówno dla rozwoju, jak i homeostazy1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon; numer umowy 23049), projekt MATRIHEALTH oraz jednostkę finansującą cE3c UIDB/00329/2020. Chcielibyśmy podziękować naszemu darczyńcy Henrique Meirellesowi, który zdecydował się wesprzeć projekt MATRIHEALTH. Prace te skorzystały z infrastruktury Zakładu Mikroskopii Wydziału Nauk, węzła Portugalskiej Platformy BioObrazowania (numer referencyjny PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), a my dziękujemy Luísowi Marquesowi za pomoc w pozyskiwaniu i przetwarzaniu obrazów. Na koniec dziękujemy Marcie Palmie za wsparcie techniczne i naszemu zespołowi badawczemu za hojny wkład.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
12-dołkowa płytka do hodowli komórkowych, płaska, TC, sterylnaAbdos LabwareP21021
4′,6-dichlorowodorek dimidyno-2-fenyloindoluMerckD8417
4– 20% Mini-PROTEAN TGX Prefabrykowany żelBio-Rad4561093
48-dołkowa płytka do hodowli komórkowych, płaska, TC, sterylnaAbdos LabwareP21023
96-dołkowa płytka do hodowli komórkowych, płaska, TC, sterylnaAbdos LabwareP21024
Albumina surowicy bydlęcej, frakcja VNZYtechMB04601
BX60Olympus
Cryostat CM1860 UVLeica
DithiothreitolThermoFisherR0862
DMEM wysoka glukoza ze stabilną glutaminą z pirogronianem soduBiowestL0103-500
DNaza IPanReac AppliChemA3778
DNeasy Blood & Zestaw tkanek Qiagen69506
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Merck108418
Surowica bydlęcapłodu BiowestS1560-500
Pipeta transferowa z cienką końcówkąThermoFisher15387823
Surowica koziaBiowestS2000-100
Hera Guard Szafka przepływowaHeraeus
Inkubator CO2 Heracell 150Thermo Scientific
HiMark Wstępnie barwione białko StandardInvitrogen
Serum dla koni, pochodzenie z Nowej ZelandiiGibco16050122
HRP-α- IgG królikaabcamab205718
HRP-α- IgG szczuraabcamab205720
HRP-α- Mysz IgGabcamab205719
ImageJ v. 1.53t
Methyl GreenSigma-Aldrich67060
MM400 Tissue LyserRetsch
NanoDrop ND-1000 Spektrofotometr ThermoFisher
Paraformaldehyd, 16% w/v aq. soln., bez metanoluAlfa Aesar043368-9M
Penicylina-Streptomycyna (100x) GRiSPGTC05.0100
Phalloidin Alexa 488 Thermo Fisher Sci.A12379
Polistyrenowa szalka Petriego 60x15mm z otworami wentylacyjnymi (sterylna)Greiner Bio-One628161
Qubit Zestaw DSDN HSThermo ScientificQ32851
Qubit™ 3 FluorometrInvitrogen15387293
S6E Zoom Mikroskop stereoskopowyDodecyl sodu Leica
Merck11667289001
SuperFrost® Szkiełka adhezyjne PlusThermo Scientific631-9483
SuperSignal West Pico PLUS Podłoże chemiluminescencyjneThermo Scientific15626144
Mikroskop konfokalny TCS SPELeica
Tris-(hidroximetil) aminometano (zasada Tris) ≥ 99%VWR Chemicals28811.295
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%Gibco15250061
Trypsina-EDTA (0,05%) w DPBS (1X)GRiSPGTC02.0100
TWEEN 20 (50% roztwór)ThermoFisher3005
WesternBright PVDF-CL w rolce membranowej (0,22&mikro; m)AdvanstaL-08024-001
α-Kolagen Iabcamab21286
α-Kolagen IVMilliporeAB756P
α-Kolagen IVSanta Cruz Biotechnologysc-398655
α-FibronectinSigmaF-3648
α-Laminin α 2 SigmaL-0663
α-MHCD.S.H.B.MF20
Sondy molekularneMouse Alexa 488A11017
Sondy molekularneMouse Alexa 568A11019
α-pan-LamininSigmaL-9393
α-fosfo-histon 3Merk Millipore06-570
α-Rabbit Alexa 568Sondy molekularneA21069
α-Rabbit Alexa 488Sondy molekularneA11070
α-Rat Alexa 488Sondy molekularneA11006
Mikroskop fluorescencyjny α-α-

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
  2. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  3. Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Genetic disorders of the extracellular matrix. Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).
  4. Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 142(2020).
  5. Tome, F. M., et al. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences. Serie III, Sciences de la Vie. 317 (4), 351-357 (1994).
  6. Gawlik, K. I., Durbeej, M. Skeletal muscle laminin and MDC1A: pathogenesis and treatment strategies. Skeletal Muscle. 1 (1), 9(2011).
  7. van Ry, P. M., et al. ECM-related myopathies and muscular dystrophies: pros and cons of protein therapies. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1519-1536 (2017).
  8. Gawlik, K. I., Durbeej, M. A family of laminin α2 chain-deficient mouse mutants: advancing the research on LAMA2-CMD. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 59(2020).
  9. Kuang, W., et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 844-852 (1998).
  10. Nunes, A. M., et al. Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).
  11. McCrary, M. W., Bousalis, D., Mobini, S., Song, Y. H., Schmidt, C. E. Decellularized tissues as platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues. Acta Biomaterialia. 111, 1-19 (2020).
  12. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  13. Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine. Biomaterials. 283, 121436(2022).
  14. Silva, A. C., et al. Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies. Journal of Visualized Experiments. (145), e56924(2019).
  15. Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
  16. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
  17. Burattini, S., et al. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).
  18. Murphy, D. Caesarean section and fostering. Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).
  19. Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-specific stain methyl green in the fluorescent labeling of embryos. Journal of Visualized Experiments. (99), e52769(2015).
  20. Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
  21. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  22. Paulsson, M. A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins. The Laminins. , 1-26 (1994).
  23. Fedecostante, M., et al. Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening. Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).
  24. Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
  25. Brouki Milan, P., et al. Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery. Methods. 171, 62-67 (2020).
  26. Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Collagen VI disorders: Insights on form and function in the extracellular matrix and beyond. Matrix Biology. 71, 348-367 (2018).
  27. Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
  28. White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
  29. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences. Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).
  30. Ma, X., et al. Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells. Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101(2017).
  31. Wu Young, M. Y., et al. Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss. Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tkanka mi niowa p odowego myszymacierz zewn trzkom rkowamacierz zewn trzkom rkowa mi ni szkieletowychr nicowanie kom rek mi niowychmioblasty C2C12laminina alfa 2kolagen Itraktowanie DNaz

Powiązane artykuły