Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Sieciowa farmakologia, przewidywanie i metabolomika: walidacja mechanizmu działania Fructus Phyllanthi przeciwko hiperlipidemii

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65071

⸱

7 kwietnia 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Health Preservation and Rehabilitation, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2State Administration of Traditional Chinese Medicine Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine, Regimen and Health, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Regimen and Health of Sichuan Province

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje zintegrowaną strategię badania kluczowych celów i mechanizmów Fructus Phyllanthi przeciwko hiperlipidemii w oparciu o przewidywania farmakologiczne sieci i weryfikację metabolomiczną.

Streszczenie

Hiperlipidemia stała się głównym czynnikiem ryzyka chorób sercowo-naczyniowych i uszkodzeń wątroby na całym świecie. Fructus Phyllanthi (FP) jest skutecznym lekiem przeciwko hiperlipidemii w teoriach Tradycyjnej Medycyny Chińskiej (TCM) i Medycyny Indyjskiej, jednak potencjalny mechanizm wymaga dalszych badań. Niniejsze badania mają na celu ujawnienie mechanizmu FP przeciwko hiperlipidemii w oparciu o zintegrowaną strategię łączącą sieciowe przewidywanie farmakologiczne z walidacją metabolomiczną. Model myszy indukowany dietą wysokotłuszczową (HFD) ustalono poprzez ocenę poziomu lipidów w osoczu, w tym cholesterolu całkowitego (TC), trójglicerydów (TG), cholesterolu lipoprotein o niskiej gęstości (LDL-C) i cholesterolu lipoprotein o dużej gęstości (HDL-C). Zastosowano farmakologię sieciową, aby poznać aktywne składniki FP i potencjalne cele przeciwko hiperlipidemii. Przeprowadzono metabolomikę osocza i wątroby w celu zidentyfikowania metabolitów różnicujących i odpowiadających im szlaków w grupie normalnej, grupie modelowej i grupie interwencyjnej. Związek między farmakologią sieciową a metabolomiką został następnie skonstruowany, aby uzyskać kompleksowy obraz procesu FP przeciwko hiperlipidemii. Uzyskane kluczowe białka docelowe zweryfikowano za pomocą dokowania molekularnego. Wyniki te odzwierciedlały, że FP poprawił poziom lipidów w osoczu i uszkodzenie wątroby spowodowane hiperlipidemią wywołaną przez HFD. Wykazano, że kwasem galusowym, kwercetyną i beta-sitosterolem w FP są kluczowe związki aktywne. Stwierdzono, że łącznie 16 i sześć potencjalnych metabolitów różnicowych odpowiednio w osoczu i wątrobie jest zaangażowanych w terapeutyczne działanie FP przeciwko hiperlipidemii za pomocą metabolomiki. Co więcej, analiza integracji wykazała, że efekty interwencji były związane z CYP1A1, AChE i MGAM, a także z dostosowaniem L-kinureniny, kortykosteronu, acetylocholiny i rafinozy, głównie z udziałem szlaku metabolizmu tryptofanu. Dokowanie molekularne pozwoliło na to, że powyższe składniki działające na docelowe białka związane z hiperlipidemią odgrywają kluczową rolę w obniżaniu poziomu lipidów. Podsumowując, badania te dostarczyły nowych możliwości zapobiegania i leczenia hiperlipidemii.

Wprowadzenie

Hiperlipidemia jest powszechną chorobą metaboliczną o poważnym wpływie na zdrowie człowieka, a także głównym czynnikiem ryzyka chorób sercowo-naczyniowych1. Ostatnio obserwuje się tendencję spadkową związaną z wiekiem w przypadku tej choroby, a młodsi ludzie stali się bardziej podatni z powodu długotrwałego, nieregularnego stylu życia i niezdrowych nawyków żywieniowych2. W klinice stosowano różne leki w leczeniu hiperlipidemii. Na przykład jednym z najczęściej stosowanych leków u pacjentów z hiperlipidemią i powiązanymi zaburzeniami miażdżycowymi są statyny. Jednak długotrwałe stosowanie statyn ma skutki uboczne, których nie można lekceważyć, które prowadzą do złego rokowania, takie jak nietolerancja, oporność na leczenie i zdarzenia niepożądane3,4. Niedociągnięcia te stały się dodatkowym bólem dla pacjentów z hiperlipidemią. W związku z tym należy zaproponować nowe metody leczenia w celu uzyskania stabilnej skuteczności obniżania poziomu lipidów i zmniejszenia liczby skutków ubocznych.

Tradycyjna Medycyna Chińska (TCM) jest szeroko stosowana w leczeniu chorób ze względu na jej dobrą skuteczność i niewiele skutków ubocznych5. Fructus Phyllanthi (FP), suszony owoc Phyllanthus emblica Linn. (popularnie znana jako jagoda amla lub agrest indyjski), jest słynnym materiałem homologicznym medycyny i żywności tradycyjnej medycyny chińskiej i indyjskiej6,7. Lek ten był używany do usuwania ciepła, chłodzenia krwi i wspomagania trawienia, zgodnie z teoriami TCM8. Nowoczesne badania farmakologiczne wykazały, że FP jest bogaty w związki bioaktywne, takie jak kwasy galusowe, kwasy elagowe i kwercetyna9, które są odpowiedzialne za szereg wieloaspektowych właściwości biologicznych, działając jako przeciwutleniacz, przeciwzapalny, chroniący wątrobę, przeciwhipolipidemiczny i tak dalej10. Ostatnie badania wykazały również, że FP może skutecznie regulować poziom lipidów we krwi pacjentów z hiperlipidemią. Na przykład Variya i wsp.11 wykazali, że sok owocowy FP i jego główny składnik chemiczny, kwas galusowy, mogą obniżać poziom cholesterolu w osoczu i zmniejszać infiltrację oleju w wątrobie i aorcie. Skuteczność terapeutyczna była związana z regulacją FP w zwiększaniu ekspresji receptora alfa aktywowanego przez proliferatory peroksysomów i zmniejszaniu aktywności lipogennej wątroby. Jednak mechanizm leżący u podstaw FP w poprawie hiperlipidemii powinien być dalej badany, ponieważ jego składniki bioaktywne są dość obszerne. Staraliśmy się zbadać potencjalny mechanizm skuteczności terapeutycznej FP, który może być korzystny dla dalszego rozwoju i stosowania tego leku.

Obecnie farmakologia sieciowa jest uważana za holistyczną i skuteczną technikę badania mechanizmu terapeutycznego TCM. Zamiast szukać pojedynczych genów powodujących chorobę i leków leczących wyłącznie pojedynczy cel, konstruowana jest kompletna sieć leków-składników-genów-chorób, aby znaleźć wielocelowy mechanizm wieloskładnikowego leku w odniesieniu do ich kompleksowego leczenia12. Ta technika jest szczególnie odpowiednia dla TCM, ponieważ ich skład chemiczny jest ogromny. Niestety, farmakologia sieciowa może być wykorzystywana tylko do prognozowania celów, na które wpływają składniki chemiczne w teorii. Należy obserwować endogenne metabolity w modelu choroby w celu potwierdzenia skuteczności farmakologii sieciowej. Metoda metabolomiczna, która pojawiła się wraz z rozwojem biologii systemowej, jest ważnym narzędziem do monitorowania zmian w endogennych metabolitach13. Zmiany metabolitów odzwierciedlają zmiany w stanie stacjonarnym gospodarza, co jest również ważnym wskaźnikiem do badania mechanizmu wewnętrznego. Niektórym badaczom udało się zintegrować farmakologię sieciową i metabolomikę, aby zbadać mechanizm interakcji między lekami a chorobami14,15.

Ten artykuł bada mechanistyczne podstawy FP przeciwko hiperlipidemii, integrując techniki farmakologii sieciowej i metabolomiki. Farmakologia sieciowa została zastosowana do analizy związku między głównymi składnikami aktywnymi FP a celami molekularnymi hiperlipidemii. Następnie przeprowadzono metabolomikę w celu zaobserwowania zmian endogennych metabolitów w modelu zwierzęcym, co może wyjaśnić działanie leku na poziomie metabolicznym. W porównaniu z zastosowaniem samej farmakologii sieciowej lub metabonomiki, ta zintegrowana analiza zapewniła bardziej szczegółowy i wszechstronny mechanizm badawczy. Ponadto wykorzystano strategię dokowania molekularnego do analizy interakcji między składnikami aktywnymi a kluczowymi białkami. Ogólnie rzecz biorąc, to zintegrowane podejście może zrekompensować brak dowodów eksperymentalnych na farmakologię sieciową oraz brak mechanizmu endogennego dla metody metabolomicznej, a także może być wykorzystane do analizy mechanizmów terapeutycznych medycyny naturalnej. Główny schemat blokowy protokołu jest pokazany na Rysunek 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury związane z obchodzeniem się ze zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Tradycyjnej Medycyny Chińskiej Uniwersytetu w Chengdu dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Etyki Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu (numer protokołu 2020-36). W niniejszym badaniu wykorzystano samce myszy C57BL/6 (20 ± 2 g). Myszy uzyskano ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów).

1. Przewidywanie oparte na farmakologii sieciowej

UWAGA: Farmakologia sieciowa służy do przewidywania składników aktywnych i ich kluczowych celów FP przeciwko hiperlipidemii.

  1. Dobór składników aktywnych i kluczowe cele
    1. Wyszukaj słowo kluczowe "Phyllanthi Fructus" w bazie danych farmakologicznych systemu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php) uzyskanie wykazu kandydujących substancji czynnych i celów FP.
      UWAGA: Zwykle tylko składniki o biodostępności po podaniu doustnym (OB) ≥30% i wartościach podobnych do leków (DL) ≥0,18 w bazie danych są uwzględniane jako składniki aktywne.
    2. Wyszukaj słowo kluczowe "hiperlipidemia" w bazie danych GeneCards (https://www.genecards.org/), internetowej bazie danych dziedziczenia mendlowskiego u ludzi (OMIM; https://omim.org/) oraz w bazie danych celów terapeutycznych (TTD; http://db.idrblab.net/ttd/), aby uzyskać odpowiednie potencjalne cele hiperlipidemii. Pobierz arkusze kalkulacyjne z celami chorobowymi. Usuń powtarzające się cele, aby uzyskać listę celów hiperlipidemii.
    3. Skopiuj te listy z kroków 1.1.1 i 1.1.2 do nowego arkusza kalkulacyjnego. Użyj funkcji "Dane - Zidentyfikuj duplikaty" na pasku narzędzi, aby uzyskać cele skrzyżowań. Zaimportuj listę celów przecięć do UniProtKB (http://www.uniprot.org/), aby ustandaryzować nazwy genów i białek.
      UWAGA: Cele te są związane zarówno z FP, jak i hiperlipidemią. Dlatego przewiduj te cele przecięcia jako cele FP przeciwko hiperlipidemii.
  2. Budowa sieci oddziaływań białko-białko
    1. Otwórz bazę danych STRING (https://string-db.org/) 11.5. Wklej listę celów skrzyżowania FP przeciwko hiperlipidemii w oknie dialogowym "Lista nazw". Wybierz Homo sapiens w "Organizmy" i kliknij SZUKAJ > KONTYNUUJ.
      UWAGA: Ludzie i myszy mają bardzo podobne geny. Dlatego dalszą weryfikację eksperymentalną przeprowadza się na myszach.
    2. Gdy wyniki będą dostępne, zaznacz opcję ukryj rozłączone węzły w sieci w "Ustawieniach zaawansowanych". Ustaw najwyższy poziom ufności (0,900) w "minimalnym wymaganym wyniku interakcji", a następnie kliknij przycisk AKTUALIZUJ.
    3. Kliknij Eksporty w pasku tytułu i pobierz krótki tekst tabelaryczny sieci interakcji białko-białko (PPI) w formacie PNG i TSV.
  3. Budowa sieci lek-składnik-choroba-cel
    1. Otwórz Cytoscape 3.9.1 (patrz Tabela materiałów). Zaimportuj plik w formacie TSV z kroku 1.2.3. Zoptymalizuj kolor, czcionkę i bok węzłów sieci za pomocą paska stylów w panelu sterowania.
    2. Użyj funkcji "Analizuj sieć" do analizy topologii sieci. Uzyskaj geny piasty przez CytoHubba w Cytoscape. Ustanów sieć lek-składnik-choroba docelowa.
  4. Analiza wzbogacania GO i KEGG
    1. Otwórz zasoby bioinformatyczne DAVID (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp). Kliknij Rozpocznij analizę i wklej listę celów w lewym oknie dialogowym. Wybierz OFICJALNY SYMBOL GENU w "Wybierz identyfikator". Wybierz Homo sapiens w "Wybierz gatunek". Zaznacz Lista genów w "Typ listy". Kliknij Prześlij listę.
    2. Gdy wyniki będą dostępne, kliknij Analizuj powyższą listę genów za pomocą jednego z narzędzi DAVID. Zaznacz GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT, GOTERM_MF_DIRECT w "Gene Ontology" dla analizy wzbogacania funkcji GO. Zaznacz KEGG_Pathway w polu "Ścieżki", aby przeprowadzić analizę wzbogacania szlaków KEGG.
    3. Kliknij na Functional Annotation Chart, aby wyświetlić wyniki.
      UWAGA: Ustaw próg istotności statystycznej analizy wzbogacenia na p < 0,05.

2. Projekt eksperymentalny

  1. Preparat ekstraktu wodnego FP
    UWAGA: FP jest przetwarzany w laboratorium profesor Liny Xia na Uniwersytecie TCM8.
    1. Namoczyć wysuszony proszek FP (90 g) w 1 l czystej wody w czystej kolbie miarowej o pojemności 2 l. Użyj leczenia ultradźwiękowego (w łaźni wodnej o temperaturze 4 °C, moc: 250 W, częstotliwość: 35 kHz), aby pomóc rozpuścić się przez 30 minut. Przefiltrować roztwór, aby uzyskać ekstrakt, za pomocą dwuwarstwowej, sterylnej gazy medycznej o wymiarach 1 mm x 1 mm. Powtórz powyższą operację trzy razy, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie FP.
    2. W celu dalszego zagęszczenia należy zastosować metodę odparowywania rotacyjnego. Ustaw prędkość obrotową na 50 obr./min z temperaturą 60 °C na 4 godziny. Skoncentrować ekstrakt wodny do 100 ml.
    3. Podzielić surowy ekstrakt FP (0,9 g/ml) równomiernie na dwie części (50 ml). Jedna część jest używana jako płyn FP o wysokiej dawce (0,9 g/ml). Dodaj 50 ml czystej wody do innej części i potraktuj ją jako płyn FP o niskiej dawce (0,45 g / ml). Do podawania należy stosować roztwory wodne FP o wysokiej i niskiej dawce. Płyn należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  2. Przygotowanie zwierząt
    1. Trzymaj 50 samców myszy C57BL/6 (20 ± 2 g) w dobrze wentylowanym pomieszczeniu w temperaturze pokojowej, z 12-godzinnym cyklem światło-ciemność i swobodnym dostępem do pożywienia i czystej wody.
    2. Losowo przypisz myszy do dwóch grup: nakarm 10 myszy normalną dietą i 40 myszy dietą wysokotłuszczową (patrz tabela materiałów), aby wywołać hiperlipidemię.
      UWAGA: Po karmieniu przez 8 tygodni myszy zostały poddane badaniom przesiewowym pod kątem dalszej interwencji farmakologicznej.
    3. W 8 tygodniu należy pobrać około 200 μl krwi z każdej orbity myszy. Odwirowywać krew przez 10 minut w temperaturze 5,733 x g w temperaturze 4 °C w celu uzyskania próbek osocza. Oznaczyć poziomy TC i TG za pomocą dostępnych na rynku zestawów testowych (patrz Tabela materiałów).
    4. Wybierz sześć myszy z najbardziej normalnym poziomem lipidów jako grupę kontrolną bez leczenia (NC). Wybierz 24 myszy ze znacznie wyższym poziomem lipidów jako grupę diety wysokotłuszczowej i losowo podziel je na cztery grupy: grupę diety wysokotłuszczowej (HFD), grupę niskobiałkową FP (FP_L), grupę wysokodawkową FP (FP_H) i grupę kontroli pozytywnej (PC).
    5. Do grup FP_L i FP_H należy podawać irygację żołądka odpowiednio dwiema dawkami FP (niska dawka 4,5 g/kg i wysoka dawka 9 g/kg); irygację żołądka grupie PC za pomocą tabletek symwastatyny (5 mg/kg; patrz tabela materiałów); oraz irygację żołądka do grup NC i HFD tą samą objętością soli fizjologicznej raz dziennie przez 4 tygodnie.
      UWAGA: W obecnym badaniu do leczenia stosowano wodne roztwory FP i symwastatyny.
    6. W 12 tygodniu, po znieczuleniu 1% pentobarbitalem sodu (30 mg / kg), poświęć myszy ze wszystkich grup. Zbierz ~400 μL próbek krwi z żyły oczodołowej każdej myszy.
      UWAGA: Stymuluj palce u nóg i podeszwy myszy pęsetą. Jeśli nie ma reakcji, oznacza to odpowiednie znieczulenie.
    7. Odwirować krew przez 10 minut w temperaturze 5,733 x g w temperaturze 4 °C w celu uzyskania próbek osocza i oznaczyć poziomy TC, TG, LDL-C i HDL-C za pomocą dostępnych w handlu zestawów testowych (patrz tabela materiałów). Pobrać próbki tkanek wątroby16 i poddać je analizie histopatologicznej. Pozostałe próbki osocza i wątroby należy wykorzystać do analizy metabolomicznej (krok 3).
      UWAGA: Wszystkie próbki są przechowywane w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
  3. Badanie histopatologiczne wątroby
    1. Utrwal świeże tkanki wątroby 4% roztworem paraformaldehydu przez ponad 24 godziny. Wyjmij tkankę z utrwalacza i wygładź docelowe tkanki skalpelem. Umieść chusteczkę i odpowiednią etykietę w suszarce.
    2. Odwodnienie w gradiencie etanolu: 75% alkoholu przez 4 godziny, 85% alkoholu przez 2 godziny, 90% alkoholu przez 2 godziny, 95% alkoholu przez 1 godzinę, etanol absolutny przez 1 godzinę, ksylen przez 30 min. Umieść kasetę z bibułkami w formie do tkanek w wosku parafinowym na trzy mycia po 30 minut16.
    3. Chusteczki nasączone woskiem należy umieścić w urządzeniu do zatapiania tkanek (patrz Tabela Materiałów). Zanim wosk stwardnieje, wyjmij chusteczki z suszarki, włóż je do osadzonego pudełka i przyklej odpowiednią etykietę.
    4. Schłodzić bloki wosku w stole do zamrażania w temperaturze -20 °C, wyjąć je z osadzonej ramy i przyciąć blok wosku.
    5. Pokrój przycięte bloki wosku na odcinki o grubości 3 μm za pomocą mikrotomu (patrz Tabela materiałów). Zanurz sekcje w wodzie o temperaturze 40 °C, zdejmij je ze szkiełek i piecz w piekarniku o temperaturze 60 °C. Po upieczeniu z wodą i suchym woskiem wyjmij go i przechowuj w temperaturze pokojowej.
    6. Kolejno umieść skrawki w ksylenie I na 10 min, ksylenie II na 10 min, ksylenie III na 10 min, absolutnym etanolu I na 5 min, absolutnym etanolu II na 5 min, 75% alkoholu na 5 min i umyj w wodzie16.
    7. Zabarwić skrawki roztworem barwiącym hematoksylinę przez 4 minuty, 1% roztworem alkoholu kwasu solnego (75% alkoholu) w celu różnicowania, 1% roztworem wodnym amoniaku z powrotem na niebiesko i umyć je wodą.
    8. Zabarwić skrawki roztworem barwiącym eozynę przez 2 minuty i umyć je wodą.
    9. Obserwuj przekroje za pomocą mikroskopu optycznego o powiększeniu 200x i 400x.
  4. Chromatografia cieczowa-spektrometria mas )LC-MS)
    1. Identyfikacja składnika FP
      UWAGA: Analizę przeprowadza się przy użyciu ultra-wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z hybrydową kwadrupolowo-orbitrapową spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-Q-Orbirap HRMS, LC-MS; patrz tabela materiałów).
      1. Dokładnie odmierzyć 1 g suszonego proszku FP i umieścić go w czystej kolbie miarowej o pojemności 50 ml.
      2. Dodaj 25 ml 70% metanolu do kolby miarowej i dokładnie zważ. Stosować leczenie ultradźwiękowe (w łaźni wodnej o temperaturze 4 °C, moc: 250 W, częstotliwość: 35 kHz) przez 30 minut, aby ułatwić rozpuszczenie. Dokładnie zważyć ponownie, aby precyzyjnie określić ubytek po rozpuszczeniu, i użyć 70% metanolu, aby uzupełnić ubytek.
        UWAGA: Nie mierz objętości, ponieważ skala kolby miarowej nie jest dokładna, zwłaszcza po kąpieli wodnej o temperaturze 4 °C.
      3. Wstrząśnij, aby całkowicie wymieszać. Do filtracji użyj mikroporowatej membrany 0,22 μm.
    2. Przygotowanie próbki osocza
      1. Dokładnie dodać 100 μl osocza (krok 2.2.7) do podwójnej objętości (200 μl) acetonitrylu w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować go za pomocą wibratora wirowego przez co najmniej 30 sekund. Postępuj zgodnie z tą procedurą dla wszystkich próbek.
      2. Odwirować wszystkie próbki o masie 17 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu przenieść supernatanty do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wysuszyć supernatanty w azocie. Rozpuścić w 200 μl rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (acetonitryl:woda = 4:1 [v/v]).
      3. Rozpuszczony roztwór należy mieszać przez co najmniej 30 s i stosować obróbkę ultradźwiękową przez 10 minut (w łaźni wodnej o temperaturze 4 °C, moc: 250 W, częstotliwość: 35 kHz). Wirować przy 17 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
      4. Przefiltrować supernatanty za pomocą membran filtracyjnych o wielkości 0,22 μm i utrzymywać je w temperaturze 4 °C do analizy.
    3. Przygotowanie próbki wątroby
      1. Homogenizować 90 mg tkanki wątroby (etap 2.2.7) przez 1 minutę w lodowatej wodzie z metanolem (1:1, v/v, 1 ml) i odwirować przy 21 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Postępuj zgodnie z tą procedurą dla wszystkich próbek.
      2. Ponownie wyekstrahować osady, postępując zgodnie z tą samą procedurą, i połączyć supernatanty w nowych probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Wysuszyć supernatanty w azocie. Rozpuścić w 300 μl rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (metanol:woda = 4:1 [v/v]).
      3. Rozpuszczony roztwór należy mieszać przez co najmniej 30 s i stosować obróbkę ultradźwiękową przez 10 minut (w łaźni wodnej o temperaturze 4 °C, moc: 250 W, częstotliwość: 35 kHz). Wirować przy 17 200 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
      4. Przefiltrować supernatanty za pomocą membran filtracyjnych 0,22 μm i utrzymywać je w temperaturze 4 °C do analizy.
        UWAGA: Zbiorcze próbki kontroli jakości (QC) przygotowano przez zmieszanie 10 μl podwielokrotności z każdej próbki osocza i wątroby (jedna na sześć próbek).
    4. Parametry analizy LC-MS
      UWAGA: Faza ruchoma składa się z 0,1% kwasu mrówkowego (rozpuszczalnik A) i acetonitrylu (rozpuszczalnik B). Przenieś te rozpuszczalniki do czystej szklanej butelki i połącz je z systemem LC-MS.
      1. Ustaw programy gradientu próbek plazmy w "pliku wlotowym" systemu LC-MS w następujący sposób: 1% B (0-1,5 min), 1%-60% B (1,5-13,0 min), 60%-99% B (13,0-20,0 min), utrzymuj na poziomie 99% B (20,0-25,0 min), 99%-1% B (25,0-25,1 min) i utrzymuj 1% B do 27 min.
      2. Ustaw warunki automatycznego podajnika próbek osocza w "pliku wlotowym" systemu LC-MS w następujący sposób: objętość wstrzyknięcia, 2 μL; i natężenie przepływu, 0,3 ml/min, dla każdej analizy.
      3. Ustaw program gradientu próbek wątroby w "pliku wlotowym" systemu LC-MS w następujący sposób: 1% B (0-1 min), 1%-53% B (1-15 min), 53%-70% B (15-30 min), 70%-90% B (30-32 min), 90%-95% B (32-40 min), 95%-1% B (40-42 min) i utrzymuj na poziomie 1% B do 45 min.
      4. Ustawić warunki automatycznego pobierania próbek wątroby w "pliku wlotowym" systemu LC-MS w następujący sposób: objętość wstrzyknięcia, 5 μl; i natężenie przepływu, 0,3 ml/min, dla każdej analizy.
      5. Ustaw warunki wykrywania stwardnienia rozsianego zarówno dla próbek osocza, jak i wątroby w "MS tune file" systemu LC-MS. Wykonaj akwizycję MS przy użyciu zarówno trybu jonizacji dodatniej, jak i ujemnej.
        UWAGA: Parametry jonizacji elektrorozpylania po podgrzaniu są następujące: napięcie natrysku: 3,5 kV dla jonizacji dodatniej i 3,8 kV dla jonizacji ujemnej; Przepływ gazu w osłonie: 55 ARB; pomocniczy przepływ gazu: 15 arb; temperatura grzałki sondy: 300 °C; i temperatura kapilarnej: 350 °C.
      6. Zaimportuj zebrane surowe dane do oprogramowania Compound Discoverer i ustaw szablon metody zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).

3. Walidacja metabolomiczna

UWAGA: Dane profilowania metabolomicznego metabolitów w osoczu i wątrobie są importowane do oprogramowania Compound Discoverer w celu przeprowadzenia ekstrakcji cech metabolicznych poprzez przyjęcie algorytmu ekstrakcji cech molekularnych. Ustaw parametry w następujący sposób: odchylenie masy, 5 x 10-6; zakres masy, 100-1,500; próg stosunku sygnału do szumu (SNR), 3; i odchylenie czasu retencji, 0,05. Oceń stabilność i powtarzalność metabolomiki za pomocą względnego odchylenia standardowego (RSD) obszarów pików kontroli jakości.

  1. Użyj oprogramowania SIMCA-P (patrz tabela materiałów) do wielowymiarowej analizy statystycznej wartości całkowych uzyskanych z wyników LC-MS. Ortogonalna częściowa analiza dyskryminacyjna metodą najmniejszych kwadratów (OPLS-DA) służy do wyznaczania danych wyśrodkowanych na średniej i modelowania klas próbek.
  2. Po przeprowadzeniu testu OPLS-DA należy rozważyć metabolity o całkowym znaczeniu o zmiennym znaczeniu w projekcji (VIP) wynoszącym >1 i wartości p <0,05 z testu t Studenta jako potencjalne metabolity różnicowe.
  3. Identyfikacja zaburzonych metabolitów i szlaków metabolicznych za pomocą otwartych źródeł baz danych, w tym Human Metabolome (HMDB; http://www.hmdb.ca/), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG; https://www.kegg.jp/) i MetaboAnalyst5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/).
  4. Wizualizacja widoków wyników przez MetaboAnalyst5.0 i platformę "Wu Kong" (https://www.omicsolution.com/wkomics/main/).

4. Dokowanie molekularne

  1. Pobierz strukturę 3D wybranych składników FP z bazy danych TCMSP, odpowiednio. Wyszukaj nazwy składników w polu wyszukiwania "Nazwa chemiczna" i pobierz odpowiednie pliki struktury 3D w formacie mol2.
  2. Pobierz struktury krystaliczne kluczowych celów z bazy danych AlphaFold Protein Structure Database (Alphafold DB;, https://alphafold.ebi.ac.uk/). Wyszukaj nazwy docelowe w polu wyszukiwania i pobierz odpowiednie pliki struktur krystalicznych w formacie pdb.
  3. Zaimportuj plik składników i struktur docelowych do oprogramowania AutoDockTools. Kliknij Edytuj > Usuń wodę, aby usunąć cząsteczki wody. Kliknij Edytuj > Wodory > Dodaj, aby dodać wodór. Ustaw składniki jako "ligand" i wykonaj dokowanie na ślepo, wybierając całe cele jako "receptor"17.
  4. Wprowadź wartość w polu za "środkiem" i "rozmiarem", aby dostosować nowo powstałą przestrzeń, dzięki czemu możliwe jest pełne objęcie liganda i receptora. Zapisz pliki liganda i receptora w formacie pdbqt.
  5. Użyj AutoDock Vina, aby wykonać dokowanie molekularne. Ustaw pasek "Receptor" na nazwę "receptor.pdbqt", a pasek "Ligand" na nazwę "ligand.pdbqt". Uzyskaj optymalną lokalizację do wiązania liganda z receptorem. Zapisz wartość energii wiązania w optymalnym położeniu.
    UWAGA: Proces dokowania został obliczony przez algorytm genetyczny14. Wszystkie opcje uruchamiania dokowania były wartościami domyślnymi. Ramki dokowania zostaną automatycznie uszeregowane od najwyższej do najniższej energii wiązania.
  6. Zaimportuj pliki dokowania do PILP (Protein-ligand Interaction Profiler' https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index), aby uzyskać wizualny model systemu. Pobierz pliki modelu w formacie pse i zaimportuj je do programu PyMOL (patrz Tabela Materiałów) w celu skonstruowania dalszej wizualizacji.

5. Analiza statystyczna

UWAGA: Użyj oprogramowania statystycznego SPSS (patrz Tabela materiałów) do analizy danych. Uznajmy, że wartość p < 0,05 jest statystycznie istotna.

  1. Wartości należy wyrazić jako średnią ± odchylenia standardowego (SD).
  2. Wykonaj jednoczynnikową ANOVA, a następnie post hoc najmniej istotną różnicę (LSD), Dunnetta (w przypadku równej wariancji) lub T3 Dunnetta (w przypadku nierównej wariancji), aby przetestować istotność statystyczną między grupami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Farmakologia sieciowa
Łącznie przesiano 18 potencjalnych składników FP zgodnie z ich właściwościami farmakokinetycznymi i farmakodynamicznymi na podstawie bazy danych oraz analizy LC-MS (całkowite chromatogramy jonowe przedstawiono na Rysunku uzupełniającym 1). Z literatury przedmiotu wynika, że zawartość kwasu galusowego jest znacznie wyższa niż pozostałych składników i wykazuje on skuteczność w obniżaniu poziomu lipidów9,11...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W ostatnich latach częstość występowania hiperlipidemii wzrasta, głównie z powodu długotrwałych niezdrowych nawyków żywieniowych. TCM i jego składniki chemiczne mają różne działania farmakologiczne, które zostały szeroko zbadane w ostatnich latach37,38. FP jest rodzajem zasobu owocowego, stosowanego zarówno jako lek, jak i żywność, i ma istotny potencjał w leczeniu hiperlipidemii. Jednak potencjalny mechanizm terapeutyczny FP przeciwko hiperlipidemii wymaga dalsz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Zespół ds. Rozwoju i Innowacji Produktu TCM Health Preservation and Rehabilitation (2022C005) oraz Research on New Business Cross-border Integration of "Health Preservation and Rehabilitation+".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
101-3B PiekarnikLuyue Fabryka instrumentów i wyposażenia\
80312/80302 SzkiełkoJiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD\
80340-1630 Szkiełko nakrywkoweJiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD\
AccucoreTM C18 (3 mm & razy; 100 mm, 2. 6 μ m)Thermo Fisher Scientific\
AcetonitrylFisher ChemicalA998Wersja 1.5.6
ACQUITY UPLC HSS T3 Kolumna (2,1 mm i razy; 100 mm, 1,8 i mu; m)Thermo Fisher Scientific\
AethanolFisher ChemicalA995Wersja 3.0
Roztwór amoniakuChengdu Cologne Chemicals Co., LTD1336-21-6Wersja 3.9.1
AutoDockToolsScripps Institution of Oceanography\
BS-240VT W pełni automatyczny system wykrywania biochemicznego zwierzątShenzhen Mindray Bio-Medical Elektronika Co., Sp. z o.o.\
Compound DiscovererThermo Fisher Scientific\
CytoscapeCytoscape Consortium\
DM500 Mikroskop optycznyLeica\
LtdT15A63
Alkohol etylowyChengdu Cologne Chemicals Co., LTD64-17-5
Kwas mrówkowyFisher ChemicalA118
Zestaw testowy HDL-CInstytut Bioinżynierii Nanjing JianchengA112-1-1
Roztwór do barwienia hematoksylinyBiosharpBL700B
Dieta wysokotłuszczowaENSIWEIER202211091031
Wirówka Hitachi CT15E/CT15REHitachi., Ltd.\
HomogenizatorOulaibo Technology Co., Ltd\
Kwas solnyChengdu Cologne Chemicals Co., LTD7647-01-0
System tworzenia obrazuLIOO\
JB-L5 ZamrażarkaWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JB-L5 Osadzacz tkanekWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JK-5/6 MicrotomeWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JT-12S HydroextractorWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
KQ3200E Myjka ultradźwiękowaKun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd\
LDL-C Zestaw testowyNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA113-1-1
Męski C57BL/6 Myszy  SBF Biotechnology Co., Sp. z o.o.\Wersja 2.3.2
Neutralny balsamShanghai Yiyang Instrument Co., Ltd10021190865934
Pure WaterGuangzhou Watson's Food & Beverage Co., LtdGB19298
PyMOLDeLano Scientific LLC\Wersja 14.1
RE-3000 Parownik obrotowyYarong Fabryka instrumentów biochemicznych ., Ltd\
RM2016 Patological MicrotomeShanghai Leica Instruments Co., Ltd\Wersja 26.0
SIMCA-PUmetrics AB\
SimvastatinMerck Ostry i Dohme., Ltd14202220051
SPSSInternational Business Machines Corporation\
TC Zestaw testowyInstytut Bioinżynierii Nanjing JianchengA111-1-1
TGInstytut Bioinżynierii Nanjing JianchengA110-1-1
UPLC-Q-Eksaktywna kwadrupolowa spektrometria mas z orbitalnym polem elektrostatycznym hydrazyny o wysokiej rozdzielczościThermo Fisher Scientific\
Wibrator wirowyBeijing PowerStar Technology Co., Ltd.LC-Vortex-P1
KsylenChengdu Cologne Chemicals Co., LTD1330-20-7
DV215CD Waga elektroniczna Ohaus Corporation., Zestaw testowy

Bibliografia

  1. Nelson, R. H. Hyperlipidemia as a risk factor for cardiovascular disease. Primary Care: Clinics in Office Practice. 40 (1), 195-211 (2013).
  2. Mach, F., et al. 2019 ESC/EAS Guidelines for the management of dyslipidaemias: lipid modification to reduce cardiovascular risk: the Task Force for the management of dyslipidaemias of the European Society of Cardiology (ESC) and European Atherosclerosis Society (EAS). European Heart Journal. 41 (1), 111-188 (2020).
  3. Oesterle, A., Laufs, U., Liao, J. K. Pleiotropic effects of statins on the cardiovascular system. Circulation Research. 120 (1), 229-243 (2017).
  4. Last, A. R., Ference, J. D., Menzel, E. R. Hyperlipidemia: drugs for cardiovascular risk reduction in adults. American Family Physician. 95 (2), 78-87 (2017).
  5. Wu, S., et al. Recent advances of tanshinone in regulating autophagy for medicinal research. Front Pharmacol. 13, 1059360(2022).
  6. Mirunalini, S., Krishnaveni, M. Therapeutic potential of Phyllanthus emblica (amla): the ayurvedic wonder. Journal of Basic and Clinical Physiology and Pharmacology. 21 (1), 93-105 (2010).
  7. Zhao, H. J., et al. Fructus phyllanthi tannin fraction induces apoptosis and inhibits migration and invasion of human lung squamous carcinoma cells in vitro via MAPK/MMP pathways. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (6), 758-768 (2015).
  8. Yan, X., et al. Current advances on the phytochemical composition, pharmacologic effects, toxicology, and product development of Phyllanthi Fructus. Frontiers in Pharmacology. 13, 1017628(2022).
  9. Yang, F., et al. Chemical constituents from the fruits of Phyllanthus emblica L. Biochemical Systematics and Ecology. 92, 104122(2020).
  10. Wu, L., et al. Phytochemical analysis using UPLC-MSn combined with network pharmacology approaches to explore the biomarkers for the quality control of the anticancer tannin fraction of Phyllanthus emblica L. habitat in Nepal. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 6623791(2021).
  11. Variya, B. C., Bakrania, A. K., Chen, Y., Han, J., Patel, S. S. Suppression of abdominal fat and anti-hyperlipidemic potential of Emblica officinalis: Upregulation of PPARs and identification of active moiety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 108, 1274-1281 (2018).
  12. Gertsch, J. Botanical drugs, synergy, and network pharmacology: forth and back to intelligent mixtures. Planta Medica. 77 (11), 1086-1098 (2011).
  13. Nicholson, J. K., Wilson, I. D. Understanding 'global' systems biology: metabonomics and the continuum of metabolism. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 668-676 (2003).
  14. Li, T., et al. Integrated metabolomics and network pharmacology to reveal the mechanisms of hydroxysafflor yellow A against acute traumatic brain injury. Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 1002-1013 (2021).
  15. Wang, F., et al. Network pharmacology combined with metabolomics to investigate the anti-hyperlipidemia mechanism of a novel combination. Journal of Functional Foods. 87, 104848(2021).
  16. Adams, J. M., Jafar-Nejad, H. Determining bile duct density in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. (146), e59587(2019).
  17. Wang, J. Y., et al. Use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus A16. Journal of Visualized Experiments. (149), e59920(2019).
  18. Wu, L. F., Liang, W. Y., Zhang, L. Z. Determination of main components of Tibetan medicine Phyllanthus emblica L. World Science and Technology-Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica. 22 (8), 2857-2863 (2022).
  19. El-Hussainy, E. H. M., Hussein, A. M., Abdel-Aziz, A., El-Mehasseb, I. Effects of aluminum oxide (Al2O3) nanoparticles on ECG, myocardial inflammatory cytokines, redox state, and connexin 43 and lipid profile in rats: possible cardioprotective effect of gallic acid. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 94 (8), 868-878 (2016).
  20. Huang, W. Y., et al. Quercetin, hyper, and chlorogenic acid improve endothelial function by antioxidant, antiinflammatory, and ACE inhibitory effects. Journal of Food Science. 82 (5), 1239-1246 (2017).
  21. Lu, T. M., et al. Hypocholesterolemic efficacy of quercetin rich onion juice in healthy mild hypercholesterolemic adults: a pilot study. Plant Foods for Human Nutrition. 70 (4), 395-400 (2015).
  22. Witkowska, A. M., et al. Dietary plant sterols and phytosterol-enriched margarines and their relationship with cardiovascular disease among polish men and women: The WOBASZ II cross-sectional study. Nutrients. 14 (13), 2665(2022).
  23. Turini, E., et al. Efficacy of plant sterol-enriched food for primary prevention and treatment of hypercholesterolemia: a systematic literature review. Foods. 11 (6), 839(2022).
  24. Alamro, S. A., et al. Fermented camel milk enriched with plant sterols improves lipid profile and atherogenic index in rats fed high-fat and-cholesterol diets. Heliyon. , e10871(2022).
  25. Gao, P., Wen, X., Ou, Q., Zhang, J. Which one of LDL-C/HDL-C ratio and non-HDL-C can better predict the severity of coronary artery disease in STEMI patients. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 318(2022).
  26. Sun, T., et al. Predictive value of LDL/HDL ratio in coronary atherosclerotic heart disease. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 273(2022).
  27. Maegawa, K., et al. Dietary raffinose ameliorates hepatic lipid accumulation induced by cholic acid via modulation of enterohepatic bile acid circulation in rats. British Journal of Nutrition. 127 (11), 1621-1630 (2022).
  28. Antony, B., Merina, B., Sheeba, V. AmlamaxTM in the management of dyslipidemia in humans. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences. 70 (4), 504(2008).
  29. Antony, B., Benny, M., Kaimal, T. N. B. A pilot clinical study to evaluate the effect of Emblica officinalis extract (Amlamax™) on markers of systemic inflammation and dyslipidemia. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 23 (4), 378-381 (2008).
  30. Nambiar, S. S., Shetty, N. P. Phytochemical profiling and assessment of low-density lipoprotein oxidation, foam cell-preventing ability and antioxidant activity of commercial products of Emblica officinalis fruit. Journal of Food Biochemistry. 39 (3), 218-229 (2015).
  31. Gopa, B., Bhatt, J., Hemavathi, K. G. A comparative clinical study of hypolipidemic efficacy of Amla (Emblica officinalis) with 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme-A reductase inhibitor simvastatin. Indian Journal of Pharmacology. 44 (2), 238(2012).
  32. Jung, T. W., et al. Administration of kynurenic acid reduces hyperlipidemia-induced inflammation and insulin resistance in skeletal muscle and adipocytes. Molecular and Cellular Endocrinology. , 518(2020).
  33. Dong, Y., Li, X., Liu, Y., Gao, J., Tao, J. The molecular targets of taurine confer anti-hyperlipidemic effects. Life Sciences. 278, 119579(2021).
  34. Huang, B., Bao, J., Cao, Y. R., Gao, H. F., Jin, Y. Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) catalyzes lipid peroxidation of oleic acid-induced HepG2 cells. Biochemistry. 83 (5), 595-602 (2018).
  35. Xia, H., et al. Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Biomedicine & Pharmacotherapy. 118, 109287(2019).
  36. Dai, Z., et al. Protective effects of α-galacto-oligosaccharides against a high-fat/western-style diet-induced metabolic abnormalities in mice. Food & Function. 10 (6), 3660-3670 (2019).
  37. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).
  38. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl(2)-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).
  39. Noor, F., et al. Network pharmacology approach for medicinal plants: review and assessment. Pharmaceuticals. 15 (5), 572(2022).
  40. Li, X., et al. Role of potential bioactive metabolites from traditional Chinese medicine for type 2 diabetes mellitus: An overview. Front Pharmacol. 13, 1023713(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mechanizm hiperlipidemiidieta wysokot uszczowapoziom lipid w w osoczudokowanie molekularnemetabolizm tryptofanusie oddzia ywa bia kowychmetabolity r nicowe
Sieciowa farmakologia, przewidywanie i metabolomika: walidacja mechanizmu działania Fructus Phyllanthi przeciwko hiperlipidemii
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.