Odpowiedni model zwierzęcy jest potrzebny do zrozumienia mechanizmów patologicznych leżących u podstaw zwężenia zastawki aortalnej (AVS) i oceny skuteczności interwencji terapeutycznych. Niniejszy protokół opisuje nową procedurę opracowywania modelu królika AVS poprzez bezpośrednie uszkodzenie balonu in vivo.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Model zwężenia zastawki aortalnej królika wywołany bezpośrednim uszkodzeniem balonu
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Modele zwierzęce stają się ważnym narzędziem do zrozumienia mechanizmów patologicznych leżących u podstaw zwężenia zastawki aortalnej (AVS) z powodu braku dostępu do wiarygodnych źródeł chorych ludzkich zastawek aortalnych. Spośród różnych modeli zwierzęcych, modele królików AVS są jednymi z najczęściej stosowanych w badaniach na dużych zwierzętach. Jednak tradycyjne modele królików AVS wymagają długotrwałego okresu suplementacji diety i manipulacji genetycznej w celu wywołania znacznego zwężenia zastawki aortalnej, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach eksperymentalnych. Aby rozwiązać te problemy, zaproponowano nowy model królika AVS, w którym zwężenie jest wywoływane przez bezpośrednie uszkodzenie zastawki aortalnej przez balon. Niniejszy protokół opisuje skuteczną technikę indukowania AVS u królików białych nowozelandzkich (NZW), z procedurami krok po kroku dotyczącymi przygotowania, zabiegu chirurgicznego i opieki pooperacyjnej. Ten prosty i powtarzalny model stanowi obiecujące podejście do badania inicjacji i progresji AVS oraz stanowi cenne narzędzie do badania patologicznych mechanizmów leżących u podstaw choroby.
Wprowadzenie
Coraz częściej uznaje się, że użycie odpowiednich modeli zwierzęcych może przyczynić się do lepszego zrozumienia patologicznych mechanizmów leżących u podstaw zwężenia zastawki aortalnej (AVS) z powodu braku dostępu do wiarygodnych źródeł chorych ludzkich zastawek aortalnych związanych z postępem zwężenia zastawki aortalnej (AS). Spośród różnych modeli zwierzęcych do badania AVS, króliki są jednym z najczęściej używanych modeli AVS dla dużych zwierząt, a model królika AVS jest indukowany albo przez suplementację cholesterolu/witaminy D2, albo przez manipulację genetyczną1,2,3,4.
Chociaż modele AVS dla królików dostarczyły istotnych informacji na temat rozwoju i postępu AVS, nadal pozostaje wyzwaniem do konsekwentnego i powtarzalnego wywoływania AVS, co widać w naszych wstępnych eksperymentach.
Oprócz modeli zwierzęcych uzależnionych od diety i genetycznie podatnych, nowy model AVS został stworzony poprzez bezpośrednie mechaniczne urazy u myszy5,6. Model urazu mechanicznego z powodzeniem indukuje zwężenie zastawki aortalnej i stanowi prosty i powtarzalny model AVS u myszy typu dzikiego. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, nie przeprowadzono wcześniejszych badań oceniających wpływ urazu mechanicznego na zastawkę aortalną w modelach królików. W związku z tym badanie to zapewnia nową procedurę indukowania AVS u samców białych królików nowozelandzkich poprzez bezpośrednie uszkodzenie zastawki aortalnej przez balon, które może dokładnie naśladować stan zastawkowego zwężenia zastawki aortalnej. Protokół ten zawiera opisy krok po kroku preparatu, zabiegu chirurgicznego i opieki pooperacyjnej, które są przydatne do indukowania powtarzalnych modeli królików AVS.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury badawcze na zwierzętach zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z Ustawą o Dobrostanie Zwierząt Laboratoryjnych, Przewodnikiem po Opiece i Użytkowaniu Zwierząt Laboratoryjnych oraz Wytycznymi i Zasadami Eksperymentów na Zwierzętach dostarczonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Kolegium Medycznym Katolickiego Uniwersytetu Korei (numer zatwierdzenia: CUMC-2021-0176-05). W niniejszej pracy wykorzystano 3-miesięczne samce królików nowozelandzkich białych (NZW) o wadze 3,5-4,0 kg, które były utrzymywane w standardowych warunkach w indywidualnych klatkach. Króliki były karmione albo normalną dietą, albo dietą wzbogaconą w 0,5% cholesterolem, uzupełnioną 50 000 U witaminy D2 (patrz tabela materiałów). Projekt eksperymentalny i metody analizy indukcji modelu królika AVS są przedstawione na Rysunek 1.
1. Przygotowanie do operacji
- Upewnij się, że wszystkie narzędzia medyczne i chirurgiczne (patrz Tabela materiałów) są wysterylizowane na początku operacji.
- Przygotuj zestaw cewnika balonowego do dylatacji, wykonując poniższe czynności.
- Podłączyć urządzenie do deflacji wypełnione mieszaniną soli fizjologicznej i dostępnego w handlu środka kontrastowego (1:1) do części typu luer lock cewnika balonowego (patrz tabela materiałów).
- Napełnij balon roztworem do napełniania i usuń powietrze z cewnika balonowego.
UWAGA: W niniejszym badaniu roztwór do napełniania składał się z 30% jodiksanolu i 0,9% soli fizjologicznej (patrz tabela materiałów). - Sprawdź prawidłowe napompowanie balonu, przepłukując światło balonu roztworem do napełniania.
2. Zabieg chirurgiczny w przypadku uszkodzenia zastawki aortalnej
- Podać domięśniowe wstrzyknięcie tiletaminy i zolazepamu (15 mg/kg) oraz ksylazyny (5 mg/kg) (patrz Tabela Materiałów) w celu znieczulenia zwierzęcia.
UWAGA: Przed podaniem znieczulenia króliki zostały wstępnie potraktowane podskórnym wstrzyknięciem glikopironolanu (0,05 mg / kg) jako przedznieczulającego środka antycholinergicznego. Odpowiedni poziom znieczulenia określono na podstawie kombinacji kryteriów, w tym braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi i stałej częstości oddechów. - Wprowadzić cewnik dożylny (IV) o sile 24 G do żyły usznej brzeżnej i podłączyć zestaw do infuzji z heparynizowaną solą fizjologiczną (100 j./kg heparyny).
- Podłącz królika do wieloparametrowego monitora weterynaryjnego (patrz tabela materiałów), aby stale monitorować parametry życiowe, takie jak sygnał nasycenia tlenem (SpO2), temperatura i ciśnienie krwi.
UWAGA: Aby monitorować SpO2, przymocuj czujnik SpO2 do języka królika. W celu monitorowania temperatury włóż sondę do odbytnicy królika. W celu monitorowania ciśnienia krwi umieść mankiet na kończynie przedniej. - Umieść królika w pozycji leżącej na plecach na stole operacyjnym wyposażonym we fluoroskopię z ramieniem C (patrz Tabela Materiałów) i usuń włosy z brzusznej okolicy szyi za pomocą maszynki do strzyżenia włosów zwierzęcych (Rysunek 2A).
- Wysterylizuj miejsce nacięcia jodem i przykryj królika ręcznikami chirurgicznymi.
- Umieść serce królika na środku obrazu z ramieniem C.
UWAGA: Wszyscy badacze muszą nosić odzież ochronną z dołączonymi dozymetrami termoluminescencyjnymi (TLD), aby zmniejszyć narażenie na promieniowanie podczas wykonywania operacji pod kontrolą ramienia C.- Włącz ramię C i wybierz tryb fluoroskopii do obrazowania serca.
- Dostosuj pozycję królika, aby upewnić się, że serce znajduje się w środku pola obrazowania.
- Wykonaj podłużne nacięcie o długości około 3 cm w skórze szyi i użyj nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć powięź i tkankę tłuszczową.
- Odsłoń lewą tętnicę szyjną wspólną (LCCA), ostrożnie oddzielając mięśnie, aż około 3-3,5 cm LCCA zostanie odsłonięte (Rysunek 2B).
- Podwiązać LCCA za pomocą jedwabnego szwu 3-0 (patrz Tabela materiałów) na górze i na końcu odsłoniętego LCCA, aby zatrzymać przepływ krwi.
- Wprowadzić cewnik dożylny 22 G do LCCA i wprowadzić drut prowadnik (0,016 cala, patrz Tabela materiałów) do lewej komory (LV) przez cewnik dożylny, upewniając się, że końcówka cewnika jest prawidłowo umieszczona w polu obrazowania ramienia C.
UWAGA: Podczas zakładania cewnika dożylnego ostrożnie poluzuj szew ligaturowy w drodze w dół do zastawki aortalnej, aby umożliwić przesunięcie cewnika. - Wyjmij cewnik dożylny, pozostawiając przewód doprowadzający i umieść osłonę 4-F (patrz Tabela materiałów) na przewodzie doprowadzającym do LCCA, aby wprowadzić cewnik balonowy (Rysunek 2C).
UWAGA: Po wymianie cewnika dożylnego na osłonę, wszelkie uwięzione powietrze należy usunąć z urządzenia osłonowego. - Ostrożnie wprowadzić cewnik balonowy 8 mm przez prowadnik do zastawki aortalnej pod kontrolą fluoroskopową ramienia C (Rysunek 2D).
- Umieść końcówkę cewnika balonowego około 1-2 cm dystalnie do zastawki aortalnej i napompuj balon, przedmuchując roztwór do napełniania inflatorem o ciśnieniu 6 atm.
- Wsuń balon do wierzchołka LV i wciągnij go z powrotem do wylotu LV . Powtórz tę procedurę pięć razy, a następnie opróżnij balon (Rysunek 2E, F).
- Powtórz kroki 2.8-2.9 trzy razy, aby zapewnić odpowiednie uszkodzenie zaworu.
- Wyjmij cewnik balonowy i prowadnik. Powoli wyjmij osłonkę z LCCA i natychmiast zawiąż LCCA ze szwem w drodze w dół do zastawki aortalnej.
- Oczyść obszar nacięcia solą fizjologiczną, aby usunąć skrzepy krwi i sprawdź miejsce nakłucia pod kątem krwawienia z tętnic.
- Zamknij mięsień i skórę niewchłanialnym szwem 3-0 i wysterylizuj wszystkie boki rany jodem.
3. Opieka pooperacyjna
- Usuń plastry i klipsy monitorujące i trzymaj królika w inkubatorze intensywnej terapii.
UWAGA: Po operacji króliki były ściśle obserwowane przez 1 dzień w inkubatorze intensywnej terapii, a następnie przeniesione do klatki domowej. - Radzić sobie z bólem pooperacyjnym za pomocą tramadolu w dawce 5 mg/kg i ketoprofenu w dawce 3 mg/kg oraz podawać antybiotyki (4 mg/kg gentamycyny) dwa razy dziennie przez 3 dni we wstrzyknięciu podskórnym (patrz tabela materiałów).
UWAGA: Leczenie bólu pooperacyjnego powinno być zgodne z wytycznymi weterynaryjnymi i IACUC (np. opioidy, NLPZ, znieczulenie miejscowe lub kombinacja). - Podawaj dietę wzbogaconą o 0,5% cholesterolu w 50 000 U witaminy D2 (HC + VitD2) przez 8 tygodni.
4. Echokardiografia
- Po 8 tygodniach od uszkodzenia balonu znieczulij królika, stosując tę samą procedurę, która została opisana w kroku 2.1.
- Wizualizuj zastawki aortalne za pomocą dwuwymiarowych widoków przezklatkowych i rejestruj obrazy w trybie M w widokach krótko- i długoosiowych.
- Ułóż królika w pozycji leżącej na stole do echa.
- Ogol klatkę piersiową za pomocą maszynki do strzyżenia i kremu do depilacji.
- Nałóż żel do przetwornika ultradźwiękowego (patrz Tabela materiałów) na klatkę piersiową.
- Wyreguluj przetwornik, aby uzyskać przymostkowy widok długiej osi i przymostkowy widok krótkiej osi zastawki aortalnej.
- Obrazowanie w trybie M umożliwia rejestrowanie obrazów zastawki aortalnej zarówno w widoku długiej, jak i krótkiej, a następnie zapisywanie obrazów do późniejszej analizy.
5. Analiza histologiczna
- Po badaniu echokardiograficznym należy poddać królika eutanazji, podając dożylnie wstrzyknięcie chlorku potasu (KCl, 3 g/20 ml, 1 ml).
- Otwórz klatkę piersiową, zbierz serce za pomocą aorty wstępującej7 i umieść je na lodzie w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
- Natychmiast zanurz serce w 4% roztworze paraformaldehydu (PFA) i zanurz je w bloku parafinowym (patrz Tabela Materiałów).
- Pokrój zatopiony w parafinie blok serca na sekcje o grubości 4 μm za pomocą mikrotomu i zabarwij skrawki trichromem Massona (MT), czerwienią alizarynową i von Kossa (patrz tabela materiałów), aby ocenić odpowiednio osadzanie kolagenu i zwapnienie zastawki8,9.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Króliczy model AVS indukowany uszkodzeniem zastawki aortalnej
W celu indukowania króliczego modelu AVS w badaniu wykorzystano samce królików rasy NZW o masie 3,5-4,0 kg. Zgodnie z procedurami chirurgicznymi opisanymi w kroku 2 (Rysunek 2), model AVS ustanowiono poprzez uszkodzenie zastawki aortalnej, co doprowadziło do mechanicznej degeneracji i zwapnienia zastawki aortalnej. Grupa kontrolna obejmowała króliki karmione dietą wzbogaconą o 0,5% cholesterolu (wysokocholeste...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zwierzęce modele AVS są powszechnie stosowane do badania patologicznych aspektów AVS, w tym inicjacji i progresji AVS. Protokół ten wprowadza nowy model AVS królika wywołany bezpośrednim uszkodzeniem zastawki aortalnej przez balon. W tym badaniu model uszkodzenia zastawki aortalnej wykazał znaczne pogrubienie i zwapnienie płatka. W porównaniu z łagodnym modelem AVS indukowanym suplementacją diety, zastawka aortalna w modelu bezpośredniego uszkodzenia balonu była selektywnie uszkodzona, co prowadziło do pogrubienia guzków...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby zadeklarować w związku z tą pracą.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez grant Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowany przez rząd koreański (MSIT) (nr 2020R1A4A3079570), Ministerstwo Edukacji (nr 2021R1I1A1A01051425) oraz Program Rozwoju Technologii Strategicznych Przemysłu (nr 20014873) finansowany przez Ministerstwo Handlu, Przemysłu i Energii, Republika Korei.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 3-0 Szew jedwabny | AILEE | SK312 | |
| 4% paraformaldehyd (PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| Czerwony alizaryn Roztwór | Millpore | TMS-008-C | |
| ASAHI SION NIEBIESKI | Przewód doprowadzający | ASAHI | |
| Tylna osłona stołu | Yuhan kimberly | 80101-30 | |
| Urządzenie do opróżniania balonów | Demax Medical | DID30s | |
| BIONET | BM3 VET | ||
| C-Arm | SIEMENS Healthcare GmbH | Cios alpha | |
| Certyfikowana dieta dla królików | Purina | 5322 | 4,7% uwodorniony olej kokosowy, 0,5% cholesterol i 1% Inteligentny inkubator do melasy |
| Curadle | Autoelex | CS-CV206 | Oddział Intensywnej Terapii (OIOM) |
| Ergokalcyferol | Sigma-aldrich | E5750 | Witamina D2 |
| Kleszcze spojówkowe Fechtnera tytan | WORLD PRECISSION Instrument | WP1820 | |
| Kleszcze | HEBU | HB203 | |
| Gentamycyna | Shin Poong | ||
| Glikopirolan | SamChunDang | ||
| Greenflex NS | DAI HAN PHARM | Sól fizjologiczna normalna 500 ml | |
| roztwór hematoksyliny | Sigma-aldrich | HT1079-1 ZESTAW | |
| Heparyna | JW farmaceutyczna | 25 000 U | |
| Zestaw infuzyjny do jednorazowego użytku | SWOON MEDICAL | ||
| Jod | Zielony farmaceutyczny | ||
| Jodixanol | GE Healthcare | Visipaque | Roztwór do inflacji (środek kontrastowy) |
| Cewnik dożylny 22 G | BD | ||
| Cewnik dożylny 24 G | BD | 382412 | |
| Ketoprofen | SamChunDang | ||
| Luer-Lok 10 ml | Becton Dickinson Medical | ||
| Luer-Lok strzykawka 3 ml | Becton Dickinson Mikroskop medyczny | ||
| OLYMPUS | SZ61 | ||
| Mikrotom | ThermoFisher Scientific | HM 325 | |
| MT zestaw do barwienia | Sigma-aldrich | HT15-1kt | |
| Uchwyt na igły | Solco | 009-1304 | |
| Uchwyt na igłę z zamkiem i szwem | JEUNGDO BIO & PLANT | H-1222-18 | |
| Parafina | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Chlorek potasu 40 | Daihan Pharm | KCl | |
| Prelude Idealna osłona hydrofilowa | MERIT MEDICAL | PID4F11018SS | Osłona 4F |
| PTA Cewnik dylatacyjny balonowy | Boston Scientific | H749-3903280208-0 | Cewnik balonowy 8,0 mm |
| Rompun | Elanco | Xylaxine | |
| sterylna Gaza | DAE HAN Medical | 10 cm x 20 cm | |
| Rękawice chirurgiczne | Fartuch chirurgiczny Ansell | Ansell | |
| Yuhan kimberly | 90002-02 | ||
| Nożyczki chirurgiczne | Nopa, Niemcy | AC020/16 | |
| Taśma chirurgiczna | 3M micopore | 1530-1 | |
| Strzykawka 1 ml | Shin Chang Medical | ||
| 10 ml | Shin Chang Medical | ||
| Kaseta na tkanki | Scilav korea | Cas3003 | |
| Żel przetwornika | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Tridol | Yuhan Corp. | Tramadol HCl | |
| Philps | Affiniti 50 | ||
| Von Kossa zestaw do barwienia | Abcam | ab105689 | |
| Zoletil 50 | Virbac korea | Tiletamina & zolazepam |
Bibliografia
- Aliev, G., Burnstock, G. Watanabe rabbits with heritable hypercholesterolaemia: A model of atherosclerosis. Histology and Histopathology. 13 (3), 797-817 (1998).
- Cimini, M., Boughner, D. R., Ronald, J. A., Aldington, L., Rogers, K. A. Development of aortic valve sclerosis in a rabbit model of atherosclerosis: An immunohistochemical and histological study. Journal of Heart Valve Disease. 14 (3), 365-375 (2005).
- Drolet, M. C., Couet, J., Arsenault, M. Development of aortic valve sclerosis or stenosis in rabbits: role of cholesterol and calcium. Journal of Heart Valve Disease. 17 (4), 381-387 (2008).
- Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310(2011).
- Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (2), 270-278 (2014).
- Niepmann, S. T., et al. Graded murine wire-induced aortic valve stenosis model mimics human functional and morphological disease phenotype. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 847-856 (2019).
- Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; A versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172(2014).
- Wirrig, E. E., Gomez, M. V., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. COX2 inhibition reduces aortic valve calcification in vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (4), 938-947 (2015).
- Jung, S. H., et al. Spatiotemporal dynamics of macrophage heterogeneity and a potential function of Trem2(hi) macrophages in infarcted hearts. Nature Communications. 13 (1), 4580(2022).
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: Pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111 (24), 3316-3326 (2005).
- Lindman, B. R., et al. Calcific aortic stenosis. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16006(2016).
- Cuniberti, L. A., et al. Development of mild aortic valve stenosis in a rabbit model of hypertension. Journal of the American College of Cardiology. 47 (11), 2303-2309 (2006).
- Marechaux, S., et al. Identification of tissue factor in experimental aortic valve sclerosis. Cardiovascular Pathology. 18 (2), 67-76 (2009).
- Hara, T., et al. Progression of calcific aortic valve sclerosis in WHHLMI rabbits. Atherosclerosis. 273, 8-14 (2018).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
