Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja globalnych modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu myszy

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65080

⸱

15 września 2023

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Djavad Mowafaghian Centre for Brain Health, University of British Columbia, 2Graduate Program in Neuroscience, Djavad Mowafaghian Centre for Brain Health, University of British Columbia

W tym artykule

Podsumowanie

Ta praca opisuje protokół do kwantyfikacji globalnych modyfikacji histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu. Praca zawiera również protokół izolacji mikrogleju, który został wykorzystany do zebrania danych.

Streszczenie

Kontrola ekspresji genów następuje częściowo poprzez modyfikacje struktury chromatyny, w tym dodawanie i usuwanie modyfikacji potranslacyjnych ogonów histonowych. Modyfikacje potranslacyjne histonów (HPTM) mogą ułatwiać ekspresję genów lub ich represję. Na przykład acetylacja reszt lizyny ogona histonowego neutralizuje ładunek dodatni i zmniejsza interakcje między ogonem a ujemnie naładowanym DNA. Zmniejszenie interakcji ogon-DNA histonu powoduje zwiększoną dostępność leżącego u podstaw DNA, co pozwala na zwiększony dostęp do czynnika transkrypcyjnego. Znacznik acetylacji służy również jako miejsce rozpoznawania aktywatorów transkrypcji zawierających bromodomenę, co razem skutkuje zwiększoną ekspresją genów. Znaczniki histonów mogą być dynamicznie regulowane podczas różnicowania komórek oraz w odpowiedzi na różne środowiska i bodźce komórkowe. Podczas gdy podejścia sekwencjonowania nowej generacji zaczęły charakteryzować lokalizacje genomowe dla poszczególnych modyfikacji histonów, tylko jedna modyfikacja może być badana jednocześnie. Biorąc pod uwagę, że istnieją setki różnych HPTM, opracowaliśmy wysokoprzepustową, ilościową miarę globalnych HPTM, którą można wykorzystać do badań przesiewowych modyfikacji histonów przed przeprowadzeniem bardziej rozległych podejść do sekwencjonowania genomu. Protokół ten opisuje metodę opartą na cytometrii przepływowej do wykrywania globalnych HPTM i może być przeprowadzana przy użyciu komórek w hodowli lub izolowanych komórek z tkanek in vivo. Przedstawiamy przykładowe dane z izolowanego mikrogleju mózgu myszy, aby zademonstrować czułość testu w wykrywaniu globalnych zmian w HPTM w odpowiedzi na bodziec immunologiczny pochodzenia bakteryjnego (lipopolisacharyd). Protokół ten pozwala na szybką i ilościową ocenę HPTM i może być stosowany do dowolnego regulatora transkrypcyjnego lub epigenetycznego, który może być wykryty przez przeciwciało.

Wprowadzenie

Epigenetyka to badanie mechanizmów, które regulują ekspresję genów bez zmiany podstawowej sekwencji DNA. Epigenetyczna regulacja ekspresji genów jest dynamiczna w komórkach i może pozwolić na szybkie i skoordynowane reakcje na różne bodźce środowiskowe. Regulacja dynamiczna zachodzi częściowo z powodu zmian w strukturze chromatyny na poziomie nukleosomu, który składa się z białek histonowych (H2A, H2B, H3, H4) połączonych w rdzeń oktamera ciasno nawinięty przez DNA1. Interakcje między białkami histonowymi a DNA mogą kontrolować dostępność DNA dla maszynerii transkrypcyjnej, która ostatecznie może kontrolować ekspresję genów i inne aspekty biologii chromatyny2. Białka histonowe mają nieustrukturyzowane ogony, które zawierają dodatnio naładowane reszty, które tworzą oddziaływania elektrostatyczne z ujemnie naładowanym szkieletem DNA. Interakcje te skutkują ścisłym upakowaniem DNA i zmniejszoną dostępnością DNA. Kowalencyjne modyfikacje ogonów histonowych, zwane modyfikacjami potranslacyjnymi histonów (HPTM), mogą regulować te interakcje3,4. Niektóre z najlepiej scharakteryzowanych HPTM obejmują acetylację i metylację ogona histonów, które mogą zmienić powinowactwo oddziaływań elektrostatycznych między ogonami histonów a DNA, co skutkuje zróżnicowanym dostępem do leżącego u podstaw DNA i rekrutacją czynników transkrypcyjnych, które rozpoznają te HPTM w określonych miejscach. HPTM są regulowane przez trzy ważne klasy enzymów zwanych czytnikami - które rozpoznają, pisarzami - które osadzają i gumkami - które usuwają HPTM. Tak więc rekrutacja lub rozpuszczenie enzymów czytających, piszących lub wymazujących może ostatecznie zmienić krajobraz HPTM i zarządzać strukturą i funkcją chromatyny, sprawiając, że ich regulacja i odczyt są niezbędne do zrozumienia biologii i funkcji komórkowej3,4.

Komórki w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) są epigenetycznie elastyczne, ponieważ zmieniają swój transkryptom, aby dostosować się do bodźców środowiskowych. Coraz więcej dowodów sugeruje, że zmiany w epigenomie, takie jak metylacja DNA, niekodujące RNA i HPTM, odgrywają istotną rolę w tworzeniu pamięci i funkcji synaptycznej5. Zakłócenie dynamiki HPTM poprzez manipulowanie odpowiednimi czytnikami, pisarzami lub gumkami może blokować lub wzmacniać uczenie się asocjacyjne i długoterminowe wzmocnienie6,7,8. Mikroglej, rezydująca komórka immunologiczna OUN, szybko reguluje swój transkryptom w odpowiedzi na stymulację immunologiczną poprzez dynamiczne zmiany w swoim epigenomie9,10,11. Ten wysoki poziom adaptacji do lokalnego środowiska mózgu sprawia, że są one trudne do zbadania w odizolowanym kontekście, ponieważ badania wykazały, że epigenom i transkryptom mikrogleju ulega zmianie już po kilku godzinach w pożywce hodowlanej po usunięciu ze środowiska mózgu11. Ponadto, ponieważ mikroglej stanowi tylko 10% komórek mózgu, pomiary badające zmiany na poziomie całej tkanki nie są czułe i swoiste12,13. W rezultacie, mikroglej musi zostać szybko wyizolowany w celu zbadania zmian epigenetycznych, takich jak poziomy HPTM, ex vivo.

Metody powszechnie używane do badania HPTM obejmują sekwencjonowanie chromatyno-immunoprecypitacyjne (ChIP-seq) i rozszczepienie pod celami oraz sekwencjonowanie tagmentacji (CUT&Tag-seq)4. Chociaż techniki te są wysoce specyficzne dla poszczególnych HPTM i mogą informować o obecności HPTM w określonym kontekście genomicznym, mogą one badać tylko jeden z wielu możliwych HPTM w ramach jednego eksperymentu11,14 Dlatego przed przystąpieniem do takich eksperymentów, które wymagają znacznych inwestycji czasu i pieniędzy, bardzo cenne jest zawężenie listy potencjalnie interesujących HPTM do dalszego zbadania przez najpierw badając zmiany w globalnych poziomach HPTM. Dwa główne podejścia do badania globalnych poziomów HPTM to immunohistochemia i analiza western blot, ale oba podejścia są tylko częściowo ilościowe, niskoprzepustowe i wymagają dużej liczby skrawków tkanek lub izolowanych komórek15,16. W związku z tym naszym celem było opracowanie wysoce czułej, ilościowej metody, którą można by wykorzystać do szybkiego zbadania globalnych poziomów HPTM na poziomie pojedynczej komórki.

Przedstawiony protokół umożliwia szybkie wykrywanie globalnych poziomów HPTM za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej. Wcześniejsze badania na komórkach nowotworowych uzasadniały znaczenie badania globalnych poziomów z perspektywy klinicznej17,18. Często zdarza się również, że w badaniach wykorzystuje się poziomy globalne jako metodę przesiewową przed oceną lokalizacji genomowej określonych HPTM będących przedmiotem zainteresowania19,20. W przypadku mikrogleju ocena globalnych poziomów po izolacji jest trudna ze względu na niską wydajność komórek; Pan i inni prezentują globalne poziomy HPTM z izolowanego mikrogleju, w którym mikroglej od trzech zwierząt został połączony, aby umożliwić wykrycie poziomu białka za pomocą western blot19. Korzystając z naszego protokołu, jesteśmy w stanie wykryć globalne zmiany przy znacznie mniejszej liczbie danych wejściowych komórek, umożliwiając badanie przesiewowe wielu znaczników na zwierzę i eliminując potrzebę łączenia próbek.

Tutaj opisujemy protokół szybkiego wykrywania poziomów HPTM za pomocą ilościowej wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju. Chociaż skupiamy się w szczególności na kwantyfikacji HPTM ze względu na zwięzłość, protokół ten może być używany w ten sam sposób do ilościowego określania globalnych poziomów enzymów czytających, piszących i gumujących. Protokół składa się z dwóch części: po pierwsze, metody izolacji mikrogleju, a po drugie, metody opartej na cytometrii przepływowej do określania poziomów HPTM. Metoda izolacji pozwala uzyskać komórki, które można wykorzystać zarówno do izolacji RNA, jak i oceny poziomu HPTM, co pozwala na ocenę ekspresji genów i poziomów HPTM z tej samej próbki. Ponadto metoda oceny HPTM może być stosowana na innych typach komórek, jak wskazano w protokole.

Protokół

Wszystkie protokoły opieki nad zwierzętami zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Kolumbijskiego w Vancouver zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami.

1. Trawienie mózgu w celu izolacji mikrogleju

figure-protocol-1
Rycina 1: Uproszczony schemat protokołu. Myszom najpierw wykonuje się perfuzję transkardialną z użyciem HBSS, a następnie wycina się mózg. Mózg zostaje następnie dysocjowany poprzez trawienie chemiczne i rozbicie mechaniczne w celu uzyskania homogenatu pojedynczych komórek. Frakcję wzbogaconą w komórki układu odpornościowego izoluje się za pomocą nieciągłego gradientu gęstości, po czym komórki barwi się na P2RY12. Zbarwione komórki są albo 1) sortowane za pomocą fluorescencyjnej aktywowanej sortownicy komórek (FACS) w celu przeprowadzenia analizy RNA lub późniejszej analizy białek i/lub 2) utrwalane, permeabilizowane i barwione na białka wewnątrzjądrowe. Poziom białka jest ilościowo określany na podstawie mediany intensywności fluorescencji w kanale docelowym wyznaczonym za pomocą cytometrii przepływowej. Pola koloru niebieskiego stanowią część kroku protokołu 1) Trawienie mózgu w celu izolacji mikrogleju. Pola koloru czerwonego stanowią część kroku protokołu 2) Wewnątrzjądrowe barwienie przepływowe do analizy ekspresji białek. Utworzone za pomocą BioRender.com. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

  1. Przygotowanie odczynników
    UWAGA: W przypadku planowania ekstrakcji w celu pobrania zarówno RNA, jak i komórek do analizy HPTM, należy zapoznać się z sekcją 1.7.1 w celu wprowadzenia modyfikacji obejmujących dodanie inhibitorów transkrypcji i translacji. Nie jest to jednak wymagane przy ocenie wyłącznie sygnału białkowego, ponieważ komórki utrzymywane w lodzie pozostają w znacznym stopniu w stanie spoczynku.
    1. Bufor do sortowania komórek metodą FACS (20 ml na próbkę): Rozpuścić albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w 1x zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS), aby przygotować 2% roztwór BSA. Rozpuścić EDTA w 2% roztworze BSA do końcowego stężenia 1 mM. Sterylizować poprzez filtrowanie za pomocą 0.2 µm przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia przed użyciem.
    2. Bufor do trawienia (1 ml na próbkę): Przeszczepić papainę z fiolki w roztworze HBSS do stężenia końcowego 20 U/ml w 1 mM L-cysteiny z 0,5 mM EDTA. Aktywować w 37 °C przez co najmniej 10 min lub do momentu rozpoczęcia trawienia tkanki. Bezpośrednio przed użyciem dodać DNazę I do aktywnego roztworu papainy do stężenia końcowego 200 U/mL. Przygotować w dniu eksperymentu; nie przechowywać.
    3. Izotoniczny roztwór gradientu gęstości (5,5 ml na próbkę): Do schłodzonego medium gradientu gęstości dodać 10x HBSS do końcowego stężenia 1x HBSS, aby uzyskać końcową gęstość 1,117 g/ml. Przed użyciem mieszać w vortexie przez co najmniej 30 s. Przechowywać w lodzie do momentu użycia.
    4. roztwór gradientu gęstości 37% (4 ml na próbkę): Do 1x HBSS dodać izotoniczny gradient gęstości, aby uzyskać stężenie końcowe 37% przy gęstości końcowej 1,043 g/ml. Dodać 20 µL czerwieni fenolowej na każdy ml gradientu gęstości 37%, aby uzyskać różowy roztwór umożliwiający wizualizację podczas nakładania warstw. Przed użyciem mieszać na wirówce typu vortex przez co najmniej 30 s. Przechowywać w lodzie do momentu użycia.
    5. roztwór gradientu gęstości 70% (2 ml na próbkę): dodać izotoniczny gradient gęstości do 1x HBSS, aby uzyskać stężenie końcowe 70% i gęstość końcową 1,082 g/ml. Dodać 5 µL trypan blue na każdy ml medium o gęstości 70%, aby przygotować niebieski roztwór do wizualizacji podczas warstwowania. Przed użyciem mieszać w wirówce typu vortex przez co najmniej 30 s. Przechowywać w lodzie do momentu użycia.
  2. Perfuzja i sekcja mózgu
    UWAGA: Protokół perfuzji jest zbliżony do protokołu opisanego przez Posel i wsp. zawiera obraz wideo torakotomii myszy, perfuzji transkardialnej oraz usuwania mózgu21W niniejszej pracy wykorzystujemy dorosłe myszy samce i samice szczepu C57BL/6J (w wieku 10–15 tygodni, masą 20–30 g), jednak niniejszy protokół można zastosować do wykonania torakotomii u każdej myszy. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt muszą zostać zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyki przed rozpoczęciem eksperymentów.
    1. Znieczulenie myszy: Znieczul myszy izofluranem w stężeniu 4% w 100% tlenie, aż do osiągnięcia poziomu znieczulenia chirurgicznego, co można potwierdzić testem uścisku palca (brak odruchu po mocnym ściśnięciu łapy myszy). Połóż mysz na grzbiecie i mocno przymocuj jej cztery łapy do deski sekcyjnej ustawionej pod kątem w plastikowej kuwecie, upewniając się, że nos jest zabezpieczony w stożku do podawania izofluranu. Po przeniesieniu zwierzęcia, przed przystąpieniem do dalszych czynności, upewnij się, że nadal znajduje się ono w stanie znieczulenia chirurgicznego.
    2. Torakotomia u myszy: Chwycić i unieść skórę brzucha za pomocą pęsety, a następnie wykonać płytkie nacięcie skóry i ściany brzucha, aby odsłonić wyrostek mieczowaty, nie uszkadzając aorty zstępującej ani leżących poniżej narządów.
    3. Chwyć wyrostek mieczykowaty pęsetą i wykonaj nacięcia boczne pod klatką piersiową, aby odsłonić przeponę i wątrobę. Za pomocą drobnych nożyczek wykonaj ostrożne, płytkie nacięcia w przeponie wzdłuż klatki piersiowej, a następnie za pomocą nożyczek do tkanek przetnij klatkę piersiową i przypnij mostek do stanowiska chirurgicznego w pobliżu głowy myszy, aby odsłonić serce i płuca do perfuzji transkardialnej.
    4. Perfuzja transkardialna: Przygotować perystaltyczną pompę perfuzyjną i przymocować igłę 26,5G do jednego końca drenu. Przygotować dren do procedury, wkładając jego koniec do fiolki z zimnym 1x HBSS i włączając pompę, aby całkowicie wypełnić dren roztworem 1x HBSS.
    5. Przytrzymując serce pęsetą tępą, wprowadź końcówkę igły 26,5G z podłączonym przewodem perfuzyjnym do lewej komory serca, a następnie wykonaj niewielkie nacięcie w prawym przedsionku. Włącz pompę perfuzyjną, aby ostrożnie przeprowadzić perfuzję myszy z prędkością ok. 2–4 ml/min, stosując co najmniej 15–20 ml zimnego 1x HBSS.
      UWAGA: Pełna perfuzja jest często wskazana w momencie, gdy wątroba zaczyna oczyszczać krew i nabiera takiego samego koloru jak serce.
    6. Wyjęcie mózgu: Odciąć głowę myszy za pomocą nożyczek do preparowania tkanek i wykonać nacięcie w linii środkowej skóry głowy, od karku do nosa. Odsunąć płaty skóry na boki, aby odsłonić czaszkę, a następnie za pomocą nożyczek do preparowania usunąć nadmiar tkanek i kości z tylnego końca czaszki.
    7. Ostrożnie wsuń jedno ramię nożyczek pod czaszkę do otworu wielkiego (foramen magnum), kierując ostrzem w stronę kości, a następnie ostrożnie przetnij wzdłuż linii środkowej w kierunku nosa. Za pomocą nożyczek sekcyjnych wykonaj cięcia boczne u podstawy czaszki oraz w okolicy nosa. Używając pęsety precyzyjnej, unieś czaszkę od linii środkowej na zewnątrz, aby odłamać fragmenty kości i odsłonić mózg. Delikatnie podnieść mózg za pomocą szpatułki i umieścić go na papierze sekcyjnym.
    8. Disekcja mózgu: Umieść mózg na kawałku papieru do sekcji zwilżonym roztworem 1x HBSS, na zamkniętej szalce Petriego wypełnionej lodem. Usuń móżdżek i przedziel półkule mózgu na pół, używając czystego ostrza do golenia.
    9. Usuń pień mózgu, prążkowie oraz białą istotę z każdej półkuli, pozostawiając nienaruszone hipokamp i nakładającą się na niego korę. Przenieś półkule zawierające wyizolowaną korę i tkankę hipokampa do probówki o pojemności 15 ml z 5 ml zimnego 1x HBSS i przechowuj w lodzie.
      UWAGA: Ważne jest, aby przeprowadzić sekcje tak szybko, jak to możliwe, tak aby tkanka pozostała schłodzona, zachowując odstęp nie większy niż 2 min między dekapitacją a końcowym umieszczeniem wypreparowanej tkanki w 1x HBSS w lodzie. W przypadku izolowania mikrogleju od wielu zwierząt, mózgi można przechowywać w lodzie w 1x HBSS przez ok. 1 h przed przystąpieniem do przetwarzania całej grupy zwierząt w celu trawienia itp.
  3. Trawienie i homogenizacja mózgu
    1. Dysocjacja mechaniczna i chemiczna: Tkankę mózgową od każdej myszy oraz 1 ml buforu do trawienia umieścić w osobnych szalkach Petriego na lodzie. Za pomocą czystego ostrza skalpela dokładnie posiekać mózg na małe kawałki (<1 mm).
    2. Odetnij końcówkę plastikowej pipety transferowej i ostrożnie przenieś każdy z posiekanych mózgów do oddzielnych dołków płytki 24-dołkowej umieszczonej na lodzie. Przykryj płytkę przezroczystą elastyczną folią i inkubuj na lodzie przez 30 min.
      UWAGA: Po prawidłowym posiekaniu tkanka mózgowa przypomina drobno zmielony czosnek.
    3. Homogenizacja w homogenizatorze Dounce’a: Przenieść roztwór trawionego mózgu z każdej studni do osobnych szklanych homogenizatorów Dounce’a o pojemności 7 ml, umieszczonych w lodzie i wypełnionych 5 ml zimnego buforu FACS. Każdą próbkę mózgu homogenizować delikatnie za pomocą luźnego tłoka (A), wykonując około 30–40 ruchów, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. Po homogenizacji tłokiem A, delikatnie homogenizować 3–4 razy za pomocą ciasnego tłoka (B), aby zapewnić uzyskanie zawiesiny pojedynczych komórek.
      UWAGA: Nie należy dociskać tłuczka mocniej niż ¾ do samego dołu, aby uniknąć zmiażdżenia tkanki na dnie homogenizatora. Końcowy roztwór powinien być mętny i mleczny.
      UWAGA: W przypadku trawienia wielu mózgów w jednym eksperymencie należy zaplanować czas przeniesienia trawioniny mózgowej do buforu FACS w taki sposób, aby każda próbka znajdowała się w buforze do trawienia przez maksymalnie 30 min. Nadmierne trawienie może prowadzić do odszczepienia białek powierzchniowych, co zmniejsza późniejsze wiązanie przeciwciał i osłabia sygnał.
  4. Uzyskiwanie fragmentu wzbogaconego immunologicznie
    1. Tworzenie gradientu gęstości: Homogenat z każdego mózgu należy przenieść do osobnych polipropylenowych probówek o pojemności 15 ml, dodać 2,125 ml izotonicznego gradientu gęstości i uzupełnić buforem FACS do objętości 8,5 ml, aby uzyskać końcowe stężenie gradientu gęstości wynoszące 25%. Probówki 15 ml należy delikatnie odwrócić 20 razy w celu dokładnego wymieszania.
    2. Za pomocą wąskiej pipety transferowej z podziałką ostrożnie nanieś 4 ml gradientu gęstości 37% do każdej probówki, dbając o utworzenie wyraźnych warstw. Zmień pipetę transferową i ostrożnie nanieś 2 ml gradientu gęstości 70% (Rycina 2A). Przenieś do wirówki schłodzonej do 4 °C i wirować przy 500 x g przez 20 min z rampą hamowania ustawioną na zero.
    3. Zbieranie frakcji wzbogaconej w komórki układu odpornościowego: Za pomocą czystych pipet transferowych ostrożnie odessać mielinę z powierzchni objętości w probówce 15 ml i ją usunąć. Ostrożnie zebrać górną frakcję gradientu gęstości do czystej polipropylenowej probówki 15 ml, używając pipety transferowej.
    4. Ostrożnie zbierz frakcję wzbogaconą w komórki odpornościowe (1,5 ml powyżej i 1,5 ml poniżej miejsca styku warstw gradientu gęstości 70% i 37%) do nowej polipropylenowej probówki o pojemności 15 ml (Rycina 2B). Do próbki wzbogaconej w komórki układu odpornościowego dodać 10 ml buforu FACS w celu rozcieńczenia medium do gradientu gęstości, a następnie delikatnie odwrócić probówkę 20 razy, aby dokładnie wymieszać zawartość.
      UWAGA: Ponieważ komórki mają tendencję do przylegania do ścianek probówki, podczas etapów pobierania należy upewnić się, że zebrano wszystkie komórki z próbki, powoli prowadząc pipetę okrężnie wzdłuż ścianek probówki podczas pobierania cieczy.
    5. Zwiruj komórki w próbce wzbogaconej w komórki odpornościowe, odwirowując probówki o pojemności 15 ml w 4 °C wiruj przy 500 x g przez 10 min przy ustawionym na zero hamulcu rampy zwalniającej. Niezwłocznie po zakończeniu wirowania ostrożnie usunąć nadsącz, pozostawiając około 300 µL cieczy z probówki 15 ml, uważając, aby nie poruszyć osadu (który może być niewidoczny).
    6. Należy zebrać nadsącz do osobnej probówki o pojemności 15 ml, aby upewnić się, że komórki zostały odwirowane w formie osadu (frakcję tę należy odrzucić po zweryfikowaniu liczby komórek w resuspenderowanym osadzie). Po resuspenderowaniu osadu komórkowego w... 300 µL odmierzyć objętość za pomocą pipety P1000, a następnie policzyć komórki przy użyciu hemacytometru, aby oszacować całkowitą liczbę uzyskanych komórek.

figure-protocol-2
Rycina 2: Uzyskiwanie frakcji wzbogaconej w komórki odpornościowe za pomocą nieciągłego gradientu gęstości. (A) Homogenat mózgu przygotowuje się w ośrodku o gęstości 25%, pod który nanosi się 4 mL ośrodka o gęstości 37% zabarwionego na różowo czerwienią fenolową oraz 2 mL ośrodka o gęstości 70% zabarwionego na niebiesko błękitem trypanu. (B) Po wirowaniu frakcje uległy rozdzieleniu. Mikroglej osadza się na granicy ośrodków o gęstości 37% i 70%. Frakcja mieliny znajduje się w górnej części probówki 15 mL i zostaje usunięta. Górna frakcja jest zbierana jako zapas na wypadek niepowodzenia wirowania i braku odzyskanych komórek. W takim przypadku gradient można powtórzyć, wykorzystując tę frakcję. Frakcję wzbogaconą w komórki odpornościowe pobiera się z niższej warstwy. Dolna frakcja zawierająca ewentualne erytrocyty pozostaje w probówce i zostaje usunięta. (C) Przykładowy schemat przedstawiający pełne warstwy. Utworzony w BioRender.com. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Barwienie przeciwciałami powierzchniowymi
    1. Blokowanie: Przenieść komórki do płytki 96-dołkowej z okrągłym dnem, utrzymując je w temperaturze lodu, a następnie odwirować z prędkością 500 x g z hamowaniem w celu zpelletowania komórek. Szybko usunąć nadsącz do zlewu, energicznie potrząsając płytką, tak aby pozbyć się nadsączu, pozostawiając pellet komórkowy nienaruszony na dnie dołka.
    2. Resuspender komórki w 50 µL buforu FACS z odczynnikiem blokującym receptor Fc przeciwko mysiemu CD16/32 za pomocą pipety P200 (stężenie końcowe 10 µg/mL, czynnik rozcieńczenia 1:50) w celu zapobieżenia nieswoistemu wiązaniu przeciwciał z monocytami lub innymi komórkami posiadającymi receptory FcR. Inkubować przez 10 min w lodzie.
    3. Barwienie przeciwciałami: Przygotować odpowiednią objętość 2-krotnego roztworu master mix zawierającego P2RY12-allofikocyjaninę (APC; czynnik rozcieńczenia 1:50, stężenie 4 µg/mL dla końcowego stężenia w studzience wynoszącego 1:100, stężenie 2 µg/mL) oraz barwnika Live/Dead Violet 525 (czynnik rozcieńczenia 1:50 dla końcowego stężenia w studzience 1:100). Dodać 50 µL dodaj master mix do barwienia do zawiesiny komórkowej (uzyskanej po blokowaniu w sekcji 1.5.1) i inkubuj płytkę przez 30 min w ciemności na lodzie.
      UWAGA: W niniejszym protokole przedstawiamy barwienie komórek z użyciem P2RY12. Po pierwsze, P2RY12 jest markerem homeostatycznym mikrogleju, którego ekspresja może być obniżona w określonych stanach chorobowych. Na przykład u myszy w modelu choroby Alzheimera 5XFAD obserwuje się obniżony poziom P2RY12, co może utrudniać ich identyfikację.22Alternatywne barwienia, które można wykorzystać do izolacji, obejmują Tmem119, Cd11b oraz CD45.23Po drugie, sprzężony fluorochrom APC można dostosować do pożądanego panelu przeciwciał. Jednakże wybór jasnego fluorochromu, takiego jak APC lub PE, pomoże zapewnić łatwe rozróżnienie populacji pozytywnych i negatywnych.24.
    4. Po barwieniu dodać 200 µL buforu do FACS bezpośrednio do każdej studzienki, aby wypłukać komórki. Wirować z prędkością 500 x g w 4 °C usunięcie supernatantu poprzez szybkie potrząsanie probówką. Resuspendować komórki w 200 µL buforu FACS za pomocą pipety P200, wirować przy 500 x g w 4 °Cnastępnie energicznie potrząsnąć płytką, aby usunąć bufor z dołków.
    5. Przygotowanie kontroli do cytometrii przepływowej: Przed barwieniem, po przeprowadzeniu blokowania w kroku 1.5.1, należy odseparować z każdej próbki objętości komórek niezbędne do przygotowania wymaganych kontroli do cytometrii przepływowej.
      UWAGA: Do każdego eksperymentu wymagane są kontrole cytometryczne w celu ustalenia bramkowania. Kontrole cytometryczne można pobrać od dodatkowego zwierzęcia lub z części zawartości każdej z studni eksperymentalnych. Podczas rozdzielania komórek należy zapewnić odpowiednią ich liczbę w każdej kontroli, ponieważ do wiarygodnego ustalenia bramkowania wymagane jest od 10 000 do 30 000 komórek na kontrolę.
      1. Stosuje się trzy odpowiednie kontrole cytometryczne: kontrolę bez barwienia, kontrolę żywotności (live dead) oraz kontrolę izotypową P2RY12. W przypadku kontroli bez barwienia nie należy dodawać żadnego przeciwciała. W kontroli izotypowej P2RY12 komórki należy traktować barwnikiem do oceny żywotności (1:100) oraz przeciwciałem kontrolnym izotypowym sprzężonym z APC (1:100).
      2. Aby przygotować kontrolę żywe/martwe, odnieść komórki do osobnej studzienki, a następnie przenieść połowę objętości zawiesiny komórkowej do 500 µL probówkę. Umieść 500 µL probówkę do -80 °C zamrażarka na 5 min, a następnie umieszczenie w 37 °C do inkubatora na 5 min w celu zabicia komórek. Alikwot martwych komórek przenieść z powrotem do studzienki kontrolnej live/dead i barwić barwnikiem żywotności wiążącym się z aminami w kanale violet 525 (rozcieńczenie 1:100), aby oznakować martwe komórki.
        UWAGA: Protokół został opracowany dla barwienia na płytce z wykorzystaniem metody odrzucania (flick method) w celu usunięcia naddatku. Wymaga to jednak usunięcia naddatku natychmiast po zakończeniu wirowania, a odrzucanie musi zostać wykonane z wystarczającą siłą, aby szybko usunąć naddatek, nie naruszając osadu. Alternatywnie do barwienia można użyć probówek 1,5 ml wolnych od RNazy/DNazy, wprowadzając następujące modyfikacje: Przenieść komórki do probówki do mikrowirowania o pojemności 1,5 ml i zwirować z prędkością 800 x g przez 5 min w temperaturze 4 °COdssać nadsącz za pomocą pipet. Wskazówka: aby przyspieszyć pracę, można użyć pipety transferowej 5 ml z końcówką do P200, co pozwala na szybkie i dokładne odessanie nadsączu. Podczas odsysania należy kontrolować obecność osadu. Jeśli osad nie jest widoczny, pozostawić 50 µL nadpływu i odpowiednio skorygować obliczenia. Podczas wypłukiwania przeciwciał należy dodać dodatkowy bufor FACS, aby zwiększyć ich rozcieńczenie (1000 µL zamiast 200 µL) aby uwzględnić niepełne usunięcie supernatantu. W zależności od cytometru do sortowania należy używać probówek o pojemności 1,5 ml, co pozwoli ograniczyć ilość zużywanych materiałów.
  2. Sortowanie FACS dla mikrogleju
    1. Przygotowanie: Resuspender zawartość każdej studzienki w 200 µL buforu FACS za pomocą pipety P200 i przenieść do oznakowanych probówek do sortowania przepływowego, a następnie dodać bufor FACS do łącznej objętości 500 µL dla stężenia wynoszącego około 5 x 105 zdarzeń na ml. Przechowywać w ciemności w temperaturze 0°C do momentu analizy. Przygotować probówki do etapu po sortowaniu poprzez dodanie 100 µL buforu FACS w celu stworzenia poduszki dla komórek w probówkach 1,5 ml wolnych od RNazy.
    2. Ustawienia cytometru: Sortowanie komórek przy użyciu sortera komórek do cytometrii przepływowej skonfigurowanego z 100 µm dysza. Sortowanie komórek należy przeprowadzić przy ciśnieniu 18–20 psi.
    3. Gating: Na cytometrze wyznacz bramkę dla wielkości komórek, wykorzystując obszar rozproszenia bocznego (SSC-A) w funkcji wysokości rozproszenia przedniego (FSC-H), posługując się kontrolą bez barwnika w celu odróżnienia zanieczyszczeń; ustaw SSC-A na osi logarytmicznej, aby zwizualizować populację komórek, a następnie precyzyjnie wyznacz bramkę w celu wyselekcjonowania komórek (bramka S1; Rycina 3). Aby usunąć dublety, należy wykreślić zależność FSC-H od FSC-W i wyznaczyć bramkę ściśle wokół populacji komórek, eliminując zanieczyszczenia i dublety (bramka S2). Wykorzystując kontrolę izotypową P2RY12, należy przeanalizować komórki w kanale APC i ustawić bramkę dla autofluorescencji w celu wyznaczenia komórek P2RY12+. Korzystając z kontroli niebarwionej oraz kontroli żywe/martwe, należy wyznaczyć bramkę dla komórek niewykazujących fluorescencji w kanale fioletowym 525 nm jako komórki żywe.
    4. Sortowanie: Wykreślić sygnał z kanału violet 525 nm względem APC i na podstawie kontroli FMO (MG) wyznaczyć populację żywych komórek P2RY12+. Posortowane komórki przenieść do odpowiednio oznakowanej probówki do materiału po sortowaniu (Rycina 3). Końcowy procent sortowania wynosi około 50% wszystkich zdarzeń, przy czym większość całkowitej utraty zdarzeń wynika z usunięcia zanieczyszczeń w bramce S1 (~70% zdarzeń to komórki; Tabela 1).
  3. Izolacja i analiza RNA
    1. Inhibitory transkrypcji i translacji: w przypadku planowania ekstrakcji RNA, aby wyeliminować ryzyko izolacji związanych z nią sygnatur transkrypcyjnych, należy dodać inhibitory translacji i transkrypcji do etapów z użyciem buforu. Koktajl inhibitorów należy przygotować zgodnie z opisem Marsh i wsp. w tym aktynomycynę D, anisomycynę i triptolid25.
      1. Przygotowanie inhibitorów: Zrekonstytuować zapasy inhibitorów i przechowywać w następujący sposób: zrekonstytuować aktynomycynę D w dimetylosulfotlenku (DMSO) do stężenia 5 mg/mL i przechowywać w temperaturze -20 °CRozpuścić triptolide w DMSO do stężenia 10 mM i przechowywać w temperaturze -20 °C, chroniąc przed światłem. Przygotować roztwór Anisomycin w DMSO o stężeniu 10 mg/ml i przechowywać w temperaturze 4 °Cchroniąc przed światłem. Wszystkie roztwory inhibitorów przechowywać nie dłużej niż przez 1 miesiąc od momentu ich reconstitution.
      2. Modyfikacje buforów: Do czterech różnych buforów w protokole należy dodać inhibitory w następujący sposób: Podczas przeprowadzania perfuzji transkardialnej przygotować HBSS z aktynomycyną D (5 µg/mL, 1:1000 z roztworu zapasowego) oraz triptolid (10 µM, 1:1000 z roztworu zapasowego). Po perfuzji przetransportować mózgi do laboratorium w buforze HBSS zawierającym aktynomycynę D (5 µg/mL, 1:1000 z roztworu zapasowego), triptolid (10 µM, 1:1000 z roztworu zapasu) oraz anisomycynę (27.1 µg/mL, 1:368,5 z roztworu zapasowego). Przygotować bufor do FACS z aktynomycyną D (5 µg/mL, 1:1000 z roztworu zapasu), triptolid (10 µM, 1:1000 z roztworu stokowego) oraz anisomycyny (27.1 µg/mL, 1:368,5 z roztworu zapasowego). Przygotować bufor do trawienia z aktynomicyną D (5 µg/mL, 1:1000 z roztworu zapasowego), triptolide (10 µM, 1:1000 z roztworu zapasu) oraz anisomycynę (27.1 µg/mL, 1:368,5 z roztworu zapasu). Przygotować bufor do przemywania po sortowaniu, składający się z HBSS z dodatkiem aktynomycyny D (5 µg/mL, 1:1000 ze stoku), triptolid (10 µM, 1:1000 z roztworu zapasowego) oraz anisomycynę (27.1 µg/mL, 1:368,5 z roztworu zapasowego).
        UWAGA: Inhibitory należy dodawać bezpośrednio przed użyciem, a przygotowane bufory chronić przed światłem podczas pracy. Należy unikać cykli zamrażania i rozmrażania roztworów stokowych.
    2. Przemywanie po sortowaniu: Ponieważ komórki zostały posortowane do probówek 1,5 ml wolnych od RNaz w buforze do FACS, który zakłóca izolację RNA, konieczne jest ich przemycie. Wirować komórki z prędkością 1000 x g w 4 °C przez 5 min, a następnie usunąć nadsącz, pozostawiając około 50 µL cieczy.
    3. Dodaj 200 µL 1x HBSS zawierającego aktynomycynę D (5 µg/mL, 1:1000 ze stężenia zapasowego), triptolid (10 µM, 1:1000 z roztworu zapasowego) oraz anisomycyny (27.1 µg/mL, 1:368,5 z roztworu zapasowego) i wymieszać dokładnie. Powtórzyć wirowanie i usunąć nadsącz, pozostawiając 50 µL cieczy (płukanie 1). Dodać 200 µL buforu do płukania po sortowaniu, dokładnie wymieszać i powtórzyć wirowanie, a następnie usunąć nadsącz, pozostawiając 25 µL cieczy (płukanie 2).
    4. Ekstrakcja RNA: W celu izolacji RNA z komórek mikrogleju należy zastosować zestaw do izolacji RNA z niewielkiej ilości materiału wejściowego, aby uzyskać wysoką i powtarzalną wydajność RNA oraz wartości RIN powyżej 9 (patrz poniżej i Tabela materiałów (w celu rekomendacji produktów). Do osadu komórkowego dodać 350 µL buforu lizującego z zalecanego zestawu + β-merkaptoetanolem (1:100) i dokładnie wymieszać.
      ​UWAGA: Jeśli jest to konieczne, protokół można w tym punkcie przerwać. Próbki można przechowywać w buforze lizującym w temperaturze -80 °C do momentu ekstrakcji RNA. W przypadku ekstrakcji RNA po przechowywaniu, należy rozmrozić lizat na lodzie i postępować zgodnie z instrukcjami zestawu dotyczącymi izolacji.
    5. Przenieś lizat do kolumnowego rozdrabniacza komórek (patrz Tabela materiałów (w celu uzyskania rekomendacji produktów) i wiruj z maksymalną prędkością przy 4 °C przez 2 min. Eluuj w minimalnej ilości 14 µL wody wolnej od RNaz i odpowiednio oznaczyć stężenie. RNA można wykorzystać w dowolnych dalszych zastosowaniach po tym etapie.

figure-protocol-3
Rycina 3: Strategia bramkowania dla sortowania przepływowego. Zdarzenia są bramkowane pod kątem wielkości komórek na wykresie SSC-A vs FSC-H (S1). Następnie komórki są bramkowane w celu wyodrębnienia singletów na wykresie FSC-H vs FSC-W (S2). Komórki singletowe są sortowane jako żywe, jeśli są negatywne dla Comp-FL8-A::405-526-52 (fioletowy barwnik live/dead 525), oraz jako P2RY12+, jeśli są pozytywne dla Comp-FL32-A::640-671_30 (P2RY12-APC) z zastosowaniem kontroli izotypowej P2RY12. Komórki są oznaczane jako MG i sortowane, jeśli są jednocześnie żywe i P2RY12+. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

POPULACJA WYBRANA (GATING) Częstotliwość rodzicaCzęstość całkowitaLiczba
S168.10%68.10%162186
S2>S193.59%63.70%151707
P2Ry12+ (670+) > S2 > S1 83.05%52.90%125986
Żywe (525-) > S2 > S192.78%59.10%140752
MG (P2RY12+ żywe) >S2>S178.96%50.30%119794

Tabela 1: Przykładowa tabela hierarchii próbek z procentami bramkowania i oczekiwaną liczbą zdarzeń.

2. Intranuklearne barwienie przepływowe do analizy ekspresji białek

UWAGA: Na tym etapie można rozpocząć pracę z innymi typami komórek; niniejszy protokół został przetestowany na komórkach hodowlanych, w tym na komórkach HEK293, komórkach mikroglejopodobnych BV2 oraz ludzkich komórkach mikrogleju pochodzących z iPSC.

  1. Fiksacja i barwienie komórek
    UWAGA: W poniższym protokole należy zastosować zestaw do barwienia wewnątrzkomórkowego zoptymalizowany pod kątem barwienia jąder. Zalecenia dotyczące produktów znajdują się w Tabeli materiałów.
    1. Przenieść komórki zabarwione zewnątrzkomórkowo z sekcji 1.5.2 do płytki 96-dołkowej w aliquotach (5 x 104- 1 x 106 komórek). Wirować komórki przez 5 min przy 500 x g w temperaturze 4 °C i usunąć bufor FACS poprzez lekkie uderzenie w dno płytki.
      UWAGA: Aby uzyskać dane z wysoką pewnością co do poziomów mediany, należy użyć minimum 10 000 komórek na dołek. Choć nie określono zalecanego maksimum, najlepiej utrzymać stałą liczbę komórek w całym eksperymencie, aby uniknąć istotnego wpływu różnych współczynników zmienności (CV).
    2. Fiksacja i permeabilizacja: Dodać 200 µL 1x koncentratu fiksacyjnego i delikatnie wymieszać za pomocą pipety P200, aby resuspendować komórki. Inkubować w ciemności przez 45-60 min. Odwirować płytkę przez 5 min przy 500 x g w temperaturze pokojowej (RT) i usunąć nadsącz poprzez lekkie uderzenie w dno płytki.
      UWAGA: W razie potrzeby protokół można w tym momencie przerwać. Po usunięciu nadsączu resuspendować komórki w buforze do długoterminowego przechowywania komórek immunologicznych (zalecenia dotyczące produktów w Tabeli materiałów). Próbki można przechowywać w 4 °C przez 12-18 h, chroniąc je przed światłem i przykrywając przezroczystą folią, aby zapobiec odparowywaniu buforu.
    3. Dodać 200 µL 1x buforu do permeabilizacji do każdego dołka i wymieszać za pomocą pipety P200. Odwirować płytkę przez 5 min przy 500 x g w RT i usunąć nadsącz. Powtórzyć płukanie buforem do permeabilizacji łącznie 3x.
    4. Przygotowanie kontroli do cytometrii: Podzielić objętość komórek z każdej próbki na wymagane kontrole przepływowe (wystarczy 10 000-30 000 komórek na dołek kontrolny).
      1. Aby przygotować kontrolę bez barwienia, ufiksować komórki niebarwione z sortowania lub przenieść aliquoty niebarwionych komórek do oddzielnego dołka, do którego nie zostanie dodane żadne przeciwciało.
      2. Aby przygotować kontrolę FMO (fluorescence minus one), przenieść aliquoty komórek dla każdego z przeciwciał w panelu z wyjątkiem tego w danym kanale.
      3. Dla odpowiednich kanałów do bramkowania w FMO należy dołączyć przeciwciało kontrolne izotypowe. Na przykład w panelu zawierającym P2RY12-APC i H3K27Ac-AlexaFluor568 powinny znajdować się dwie kontrole FMO: (1) APC-FMO, która zawiera tylko H3K27Ac-AlexaFluor568 i izotypowe przeciwciało kontrolne dla P2RY12 oraz (2) 568-FMO, która zawiera tylko P2RY12-APC, izotypowe przeciwciało pierwotne oraz przeciwciało wtórne 568.
        UWAGA: Niniejszy protokół przedstawiono dla badania jednego HPTM, jednak można opracować panele zawierające wiele HPTM sprzężonych z różnymi fluoroforami.
    5. Barwienie przeciwciałem pierwotnym: Dodać 50 µL 1x buforu do permeabilizacji z odpowiednim stężeniem przeciwciała pierwotnego do każdego dołka. Inkubować przez 30 min w RT w ciemności. Płukać 2x 200 µL 1x buforu do permeabilizacji.
      UWAGA: Stężenia przeciwciał stosowanych dla każdego HPTM znajdują się w Tabeli materiałów. Stężenie określono poprzez testowanie różnych stężeń przeciwciał na komórkach hodowlanych traktowanych stymulantem wywołującym gwałtowny wzrost, np. inhibitorem HDAC dla znaczników acetylacji, upewniając się, że zarówno komórki nietraktowane, jak i traktowane mieściły się w zakresie detekcji (powyżej kontroli izotypowej i poniżej maksymalnego zakresu detekcji cytometru). Optymalne stężenie przeciwciał dla HPTM powinno dawać średnią medianę intensywności fluorescencji w kanale fluoroforu między 5 x 104 a 1 x 105.
    6. Barwienie przeciwciałem wtórnym: Blokować 200 µL 1x buforu do permeabilizacji z 2% normalnym surowicą osła (NDS) przez 10 min w RT. Wirować przez 5 min przy 500 x g w RT i usunąć nadsącz.
    7. Dodać 50 µL 1x buforu do permeabilizacji z 2% NDS i odpowiednim stężeniem przeciwciała wtórnego, a następnie inkubować przez 30 min w RT w ciemności. Dodać do dołków 200 µL 1x buforu do permeabilizacji w celu rozcieńczenia, odwirować płytkę przez 5 min przy 500 x g w RT i usunąć nadsącz. Płukać komórki 2x 200 µL 1x buforu do permeabilizacji.
      UWAGA: W razie potrzeby przerwać protokół w tym punkcie. Resuspendować komórki w 200 µL buforu do długoterminowego przechowywania komórek immunologicznych za pomocą pipety P200 (zalecenia w Tabeli materiałów) i przechowywać w 4 °C przez 12-24 h w ciemności.
    8. Przygotowanie do cytometrii przepływowej: Odwirować płytkę przez 5 min przy 500 x g w RT i usunąć nadsącz. Resuspendować komórki w 200 µL buforu FACS za pomocą pipety P200 do analizy cytometrycznej. Uszczelnić przezroczystą folią na czas transportu do cytometru.
  2. Cytometria przepływowa
    1. Aby przeanalizować proponowany panel przeciwciał, należy upewnić się, że cytometr jest wyposażony w co najmniej cztery lasery, w tym fioletowy (405 nm), niebieski (488 nm), żółty (561 nm) i czerwony (633 nm). Cytometr musi posiadać filtry do detekcji FITC (niebieski-525 nm), KRO (fioletowy-525 nm), PE (żółty-585 nm) i APC (czerwony-660 nm). Dodać dodatkowe przeciwciała w zależności od wybranego cytometru.
    2. Kalibracja i standaryzacja: Na początku każdego eksperymentu należy przeprowadzić analizę tęczowych kulek fluorescencyjnych i dostosować napięcie lampy fotopowielaczowej (PMT), aż piki kulek będą porównywalne z wartościami docelowymi z poprzednich eksperymentów. Ta metoda standaryzacji pozwala na uwzględnienie dryftu aparatury w czasie.
    3. Kompensacja: Po ustawieniu napięcia i wzmocnienia PMT dla danego eksperymentu, należy użyć kulek kompensacyjnych z wychwyconymi przeciwciałami, aby ustalić macierz kompensacji dla panelu przeciwciał. Obliczenie to zapewni, że fluorofory nie przyczyniają się do zmian sygnału w innych kanałach. Jest to szczególnie istotne przy multipleksowaniu wielu przeciwciał.
    4. Bramkowanie wielkości: Na wykresie kropkowym nanieść SSC-A na skali logarytmicznej względem FSC-H na skali liniowej. Wykluczyć debris i wybrać odpowiednią wielkość komórek za pomocą bramki S1. Wybrać komórki pojedyncze (singlety) na wykresie kropkowym FSC-W względem FSC-H i wyznaczyć bramkę S2 (Rycina 4).
    5. Ustalanie bramek fluoroforów: Korzystając z odpowiedniej kontroli FMO dla każdego kanału fluoroforu, ustalić bramki w celu określenia sygnału pozytywnego w każdym kanale za pomocą histogramów jednoparametrowych (Rycina 4).
    6. Pomiar próbek: Uważnie zarejestrować próbki zgodnie z ustaloną strategią bramkowania. Zidentyfikować mikroglej na podstawie sygnału P2RY12+, a następnie określić ekspresję białka w odpowiednich kanałach wyłącznie dla mikrogleju.
  3. Analiza danych z cytometrii przepływowej
    1. Ustalanie bramek analitycznych: Stosując powyższe kroki w interfejsie użytkownika oprogramowania analitycznego, do analizy należy użyć tych samych bramek, które zostały zastosowane podczas rejestracji danych.
    2. Wyznaczenie wartości MFI za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej (zalecenia w Tabeli materiałów): Powtórzyć strategię bramkowania cytometru dla analizy przepływowej. Korzystając z funkcji dodawania statystyk, wybrać medianę dla populacji interesującej (np. 568+) na wysokości skompensowanego kanału. Za pomocą edytora tabel wyeksportować wartości średniej intensywności fluorescencji (MFI) dla odpowiednich kanałów do arkusza kalkulacyjnego, aby przejść do analizy statystycznej (Tabela 2).
      UWAGA: Plik uzupełniający S1 zawiera przykładowe dane z myszy wstrzykniętych lipopolisacharydem (LPS) i solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) oraz przykładowy plik analizy ze strategią bramkowania i wartościami MFI.
    3. Analiza wartości MFI w celu określenia krotności zmiany poziomu białka: Po uzyskaniu wartości MFI obliczyć krotność zmiany MFI względem populacji kontrolnej lub nietraktowanej (Równanie 1). Krotność zmiany MFI odzwierciedla krotność zmiany poziomu białka. Na podstawie wartości krotności zmiany ocenić zmianę ekspresji i obliczyć istotność statystyczną za pomocą testu t lub ANOVA.
      figure-protocol-4    Równanie 1

figure-protocol-5
Rycina 4: Strategia bramkowania dla oceny MFI białek. Zdarzenia są najpierw bramkowane pod kątem wielkości komórek na wykresie SSC-A vs FSC-H (S1). Następnie komórki są bramkowane w celu wyłonienia singletów na wykresie FSC-H vs FSC-W (S2). Komórki singletowe są następnie identyfikowane jako mikroglej na podstawie sygnału P2RY12-APC (APC+), przy czym brama została ustalona na podstawie fluorescencji w kontroli APC-FMO zawierającej przeciwciało kontrolne izotypowe. Następnie komórki są bramkowane pod kątem sygnału H3K27Ac-AlexaFluor568 na Comp-FL5-A::Y610-mCherry. Intensywność fluorescencji komórek 610+ jest określana jako wskaźnik ekspresji białka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wyniki

U dorosłych myszy przeprowadzono perfuzję przezsercową, a następnie uśmiercono zwierzęta w celu izolacji mikrogleju. Mikroglej izolowano w temperaturze 0°C i barwiono przeciwciałami P2RY12-APC oraz barwnikiem żywotności violet 525. Komórki wykazujące pozytywny wynik dla P2RY12 i negatywny dla barwnika żywotności violet 525 sortowano jako żywe komórki mikrogleju. Średnia wydajność izolacji mikrogleju z wypreparowanego mózgu myszy wyniosła 1,28 x 105 ± 0,05 (średnia ± błąd standardowy średniej (SEM), N=100). Nie stwierdzono różnic w wydajności izolacji mikrogleju u myszy samic (1,25 x 105 ± 0,09 [średnia ± SEM, N=46]) i samców (1,32 x 105 ± 0,07 [średnia ± SEM, N=54]) (t(98)=0,6365, p=0,526). W przypadku izolacji z konkretnych obszarów mózgu, średnia wydajność mikrogleju z kory mózgu myszy wynosiła 8,3 x 104 ±  0,08 (średnia ± SEM, N=15), a z hipokampa myszy 4,1 x 104 ± 0,02 (średnia ± SEM, N=16). Zgodnie z oczekiwaniami, odnotowano istotną różnicę w wydajności izolacji mikrogleju z poszczególnych regionów mózgu (F(2, 128)=25,25, P<0,0001). Po izolacji mikrogleju z wydzielonych komórek wyekstrahowano RNA przy użyciu zestawu do izolacji RNA z niewielkiej ilości materiału wejściowego. Wskaźnik integralności RNA (RIN) był konsekwentnie powyżej 9,0 (9,62 ± 0,05), a średnia wydajność RNA na komórkę wyniosła 0,25 ± 0,01 pg (średnia ± SEM, N=32; Supplementary File S2).

Dorosłe myszy otrzymały dożylnie wewnątrzbrzusznymi 1 mg/kg lipopolisacharydu (LPS) na 24 h przed ubojem. Myszy poddano perfuzji transkardialnej za pomocą HBSS, a mikroglej wyizolowano z całego mózgu zgodnie z opisanym protokołem (Rysunek 5A). Do każdego panelu przeciwciał przeznaczono od 20 000 do 30 000 komórek na każde barwienie. Globalne poziomy acetylacji lizyny 27 histony 3 (H3K27Ac) w wyizolowanym mikrogleju oceniono za pomocą cytometrii przepływowej. U myszy samców i samic traktowanie LPS indukowało wzrost H3K27Ac po normalizacji MFI w obrębie płci (t(6)=9,676, p<0,0001; Rysunek 5B). Analiza histogramów dla zabarwionych komórek wykazała, że populacje pozostają rozłożone normalnie przy podobnej wariancji; jednak komórki przesunęły się w stronę zwiększonej fluorescencji, co skutkuje wzrostem MFI (Rysunek 5C). Analiza H3K9Ac przy tym samym traktowaniu wykazała podobny wzrost H3K9Ac (t(6)=7,299, p=0,0003; Rysunek 5D,E), jednak krotność zmiany sygnału H3K9Ac dla LPS w stosunku do PBS jest mniejsza niż w przypadku sygnału H3K27Ac.

figure-results-1
Rysunek 5: Globalne zmiany acetylacji histonów w izolowanej mikroglei. (A) Myszy otrzymały dożylnie wstrzyknięty roztwór soli fosforanowej (PBS) lub 1 mg/kg lipopolisacharydu (LPS) na 24 h przed ubojem. Mikrogleję pobrano z frakcji wzbogaconej w komórki odpornościowe i utrwalono do analizy cytometrią przepływową oraz oceny globalnych potranslacyjnych modyfikacji histonów. Mediana intensywności fluorescencji została oceniona jako wskaźnik ekspresji białka. Stworzono za pomocą BioRender.com. (B) Globalne poziomy H3K27Ac wzrosły w odpowiedzi na traktowanie LPS. Krotność zmiany względem PBS znormalizowana w ramach eksperymentu i płci. Nieparzysty dwustronny test t, t(6)=9,676, p<0,0001. Wykres słupkowy przedstawia średnią ± SEM. N=8 zwierząt; po 2 na warunki w 2 niezależnych eksperymentach. (C) Przykładowe histogramy przedstawiające przesunięcie intensywności fluorescencji H3K27Ac. Panel przedstawia histogramy z myszy wstrzykniętych PBS w porównaniu z myszami wstrzykniętymi LPS. (D) Przykładowe histogramy przedstawiające przesunięcie intensywności fluorescencji H3K9Ac. Panel przedstawia histogramy z myszy wstrzykniętych PBS w porównaniu z myszami wstrzykniętymi LPS. (E) Globalne poziomy H3K9Ac wzrosły w odpowiedzi na traktowanie LPS. Krotność zmiany względem PBS znormalizowana w ramach eksperymentu i płci. Nieparzysty dwustronny test t, t(6)=7,299, p=0,0003. Wykres słupkowy przedstawia średnią ± SEM. N=8 zwierząt; po 2 na warunki w 2 niezależnych eksperymentach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Aby potwierdzić, że opisana metoda była porównywalna z innymi stosowanymi wcześniej metodami ilościowego oznaczania globalnych modyfikacji histonów, postanowiliśmy wykorzystać immunoblotting jako narzędzie porównawcze. Jednakże wydajność uzyskiwana z izolowanej mikroglei jest zbyt niska, aby umożliwić rzetelną ocenę. Dlatego w celu porównania metody cytometrii przepływowej wewnątrzkomórkowej z metodą Western blot (WB) wykorzystaliśmy hodowlę komórek BV2. Komórki BV2 hodowano w pożywce kompletnej (DMEMF12, 10% FBS, 1x penicylina/streptomycyna oraz 1x L-glutamina) w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Komórki pasażowano przy użyciu 0,25% trypsyny-EDTA i wysiewano w gęstości 250 000 komórek/dołek, a następnie inkubowano w pożywce z obniżoną zawartością surowicy (DMEM F12, 2% FBS, 1x penicylina/streptomycyna oraz 1x L-glutamina), pozwalając im na regenerację przez 12 h w 37 °C i 5% CO2. Przed utrwaleniem (opisanym powyżej) lub lizą w buforze do lizy WB, komórki traktowano 25 ng/mL LPS przez 24 h. Sygnał H3K27Ac oznaczano obiema metodami, przyjmując GAPDH jako kontrolę ładowania dla WB. Dla każdej grupy wyznaczono analizę znormalizowanej intensywności fluorescencji w porównaniu z kontrolą PBS (Rycina 6A). Badając zmianę znormalizowanego sygnału H3K27Ac za pomocą WB, odnotowano 1,527-krotny wzrost w warunkach traktowania LPS w stosunku do kontroli H2O, co uznano za istotne statystycznie w nieparzystym teście t (t=3,024, df=5; p=0,0293). W analizie z wykorzystaniem cytometrii przepływowej odnotowano 1,482-krotny wzrost w warunkach traktowania LPS, co również uznano za istotne (t=7,843, df=10; p<0,0001). Stosując dwuczynnikową analizę wariancji (2-way ANOVA) do porównania metod, stwierdzono istotny wpływ traktowania (F(1,15)=45,21, p<0,0001), ale brak istotnego wpływu metody (F(1,15)=0,05545, p=0,8697) lub interakcji (F(1,15)=0,02785, p=0,8697). Ponadto weryfikujemy tutaj, że nie zachodzi zmiana poziomu histonu H3 zarówno w metodzie Western blot, jak i cytometrii przepływowej, ponieważ 2-way ANOVA nie wykazała istotnego wpływu traktowania LPS (F(1,7)=0,02170, p=0,8870), metody (F(1,7)=0,01191, p=0,9162) ani interakcji (F(1,7=0,01191, p=0,9162; Rycina 6B). Przedstawiono również przykładowe bloty oraz przesunięcia histogramów dla tych danych (Rycina 6C,D).

figure-results-2
Rysunek 6: Porównanie metod ilościowego oznaczania zmian globalnych modyfikacji histonów za pomocą cytometrii przepływowej i western blotu. (A) Komórki BV2 poddano działaniu 25 ng/mL lipopolisacharydu (LPS) lub H2O przez 24 h przed analizą. Intensywność fluorescencji H3K27Ac przedstawiono jako krotność zmiany względem kontroli nośnika, soli fizjologicznej (PBS), zarówno dla cytometrii przepływowej, jak i western blotu. Dwuczynnikowa analiza wariancji (2-way ANOVA) wykazała istotny wpływ traktowania LPS (F(1,15)=45.21, p<0.0001), ale nie metody (F(1,15)=0.05545, p=0.8697) ani interakcji (F(1,15)=0.02785, p=0.8697). Dla reszt zastosowano korektę Tukeya dla wielokrotnego testowania hipotez. * oznacza 0.0332, ** oznacza 0.0021. (B) Intensywność fluorescencji dla histonu H3 przedstawiono jako krotność zmiany względem PBS zarówno dla cytometrii przepływowej, jak i western blotu. Dwuczynnikowa analiza wariancji (2-way ANOVA) nie wykazała istotnego wpływu traktowania LPS (F(1,7)=0.02170, p=0.8870), metody (F(1,7)=0.01191, p=0.9162) ani interakcji (F(1,7=0.01191, p=0.9162). (C) Przedstawiono przykładowe bloty oraz (D) przesunięcia w cytometrii przepływowej. Wielkość histogramu została znormalizowana do wartości procentowej w oparciu o liczbę komórek obecnych przy modalnej intensywności fluorescencji. Wykres słupkowy przedstawia średnią ± SEM. n=2 niezależne eksperymenty, po 2 na warunek w każdym eksperymencie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Podsumowując, wyniki te pokazują, że technikę tę można wykorzystać do ilościowej oceny globalnych poziomów HPTM w izolowanej mikroglei. Dodatkowo wykazano, że metoda ta jest porównywalna z poprzednimi technikami, lecz wymaga znacznie mniejszej liczby komórek. Ponadto, choć nie zostało to przedstawione, przy zastosowaniu odpowiedniej kompensacji, obecna technika może być używana z wieloma przeciwciałami w jednym panelu do oceny różnych HPTM.

Plik uzupełniający S1: Przykładowe pliki analizy. Plik ten zawiera plik analizy wsp oraz 7 plików fcs, w tym próbkę bez barwienia, P2RY12FMO, 568FMO, próbki od dwóch zwierząt traktowanych PBS oraz dwóch zwierząt traktowanych LPS, zabarwionych przeciwciałem H3K27Ac. Celem tego pliku jest zademonstrowanie analizy i procesu bramkowania na przykładzie eksperymentu, który obrazuje prawidłowy przebieg badania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający S2: Dane dotyczące izolacji. Dołączony plik zawiera odpowiednie dane po sortowaniu mikrogleju, obejmujące liczbę komórek mikrogleju oraz wydajność RNA uzyskaną zgodnie z opisanym protokołem. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

POPULACJA WYBRANA (GATED) Częstotliwość rodzicielskaCzęstość całkowitaLiczba
S189.00%89.00%25672
S2>S188.73%78.97%22779
APC+ > S2 > S1 76.61%60.50%17452
610+ > APC+ > S2 > S199.56%60.24%17376

Tabela 2: Przykładowy schemat pochodzenia próbek przedstawia procent oraz liczbę zdarzeń wymaganych do dokładnej detekcji białek.

Dyskusja

Przedstawiony protokół umożliwia ilościową ocenę globalnych poziomów HPTM za pomocą cytometrii przepływowej. Chociaż protokół ten przedstawia nowatorską metodę, poprzednie badania przeprowadzały ilościową ocenę białek przy użyciu podobnego podejścia26. Poprzednie metody stosowane do oceny globalnych poziomów HPTM obejmują immunohistochemię i western blot 16,17,19,20. Przedstawiona metoda oparta na cytometrii przepływowej jest metodą łatwo mierzalną, podczas gdy western blot i immunohistochemia są półilościowe i mają niższą przepustowość. Western blot opiera się na lizie komórek, a zatem wymaga zarówno normalizacji białka, jak i białka kontrolnego obciążenia, które zakłada się, że jest niezmienione w warunkach eksperymentalnych27. Immunohistochemia jest półilościowa i bardzo niskoprzepustowa, ponieważ trudno jest ilościowo ocenić ilość białka bez badania na poziomie pojedynczej komórki16. Podobnie w przypadku izolowanego mikrogleju stosowanie metody cytometrii przepływowej jest korzystne ze względu na ograniczoną wydajność, ponieważ western blot wymaga znacznie większego wkładu białka19. Wymagania dotyczące niskiej liczby komórek pozwalają na przeprowadzenie wielu paneli barwiących z tego samego zwierzęcia.

Jednak, podobnie jak w przypadku każdej innej metody, istnieją ograniczenia tej techniki, w tym koszt i dostępność przeciwciał, ponieważ nie wszystkie przeciwciała działają dobrze w warunkach cytometrii przepływowej. Ponadto, w porównaniu z immunoblotem, wymagane stężenie przeciwciał jest znacznie wyższe. Podczas gdy multipleksowanie pozwala na użycie wielu przeciwciał na tym samym panelu komórek, komórki nie mogą być pozbawione przeciwciała po analizie, co ogranicza użycie komórek do jednego na gatunek przeciwciał. Różni się to od immunoblot, w którym ten sam blot może być używany wielokrotnie. Jednak w zależności od dostępności przeciwciał i liczby kanałów detekcyjnych na cytometrze, możliwe byłoby badanie do kilkunastu znaczników jednocześnie.

Obecna metoda obejmuje tylko globalne poziomy ekspresji białek, a nie konkretną lokalizację genomu, a zmiany w poziomach globalnych mogą nie odzwierciedlać zmian w poszczególnych loci genomu. Podobnie, brak zmian na poziomach globalnych może nie oznaczać, że żadne loci genomowe nie ulegają zmianom, po prostu że globalne zmiany sumują się do zera różnic między terapiami. W związku z tym technika ta ma być używana jako badanie przesiewowe do identyfikacji HPTM będących przedmiotem zainteresowania do analizy genomowej. Ponadto metoda ta nie pozwala na porównanie różnych znaczników białkowych, z wyjątkiem sytuacji, gdy jest oceniana jako zmiana fałdowania w celu kontroli. W związku z tym jest to ograniczone w porównaniu ze standardową metodą opartą na krzywej, taką jak ELISA do oznaczania białek.

Przedstawiony protokół oferuje strategię izolowania żywego mikrogleju mózgu. Protokół ten opiera się na ekspresji białka P2RY12 do izolacji mikrogleju. Jednak P2RY12 jest markerem homeostatycznym w mikrogleju i może być regulowany w dół w modelach choroby, takich jak 5XFAD22. Dlatego używając zwierzęcia modelowego choroby, należy wybrać inne białka markerowe, takie jak TMEM119, CD11b lub CD45, aby pomóc w izolacji mikrogleju23. Podobnie przedstawiamy ten protokół jako izolację od hipokampa i/lub kory mózgowej. Protokół ten działałby w celu wyizolowania mikrogleju z innych regionów mózgu, w tym regionów istoty białej, jednak do uzyskania wystarczającej ilości mikrogleju może być potrzebnych wiele zwierząt, w zależności od wielkości obszarów zainteresowania.

Przedstawiony protokół może solidnie izolować żywy mikroglej mózgu, ale na etapie izolacji istnieje kilka etapów, opisanych poniżej, które mogą zmniejszyć wydajność komórek, jeśli zostaną wykonane nieprawidłowo.

Perfuzje dla tego protokołu powodują wyższy procent mikrogleju we fragmencie wzbogaconym immunologicznie, co skróci czas spędzony w sortowniku. Perfuzja nie jest jednak wymagana, a w razie potrzeby można zastosować inne metody eutanazji.

Podczas izolacji mikrogleju mielina powinna zostać całkowicie usunięta. Cytometry przepływowe opierają się na tym, że komórki są w stanie przemieszczać się przez wąskie rurki w szybkim tempie. Ze względu na swoją lepkość i skłonność do zbrylania się mielina powoduje problemy z cytometrami, często powodując zatkanie, które może zarówno uszkodzić sprzęt, jak i zniszczyć próbkę, drastycznie zmniejszając wydajność. Zachowaj ostrożność, aby usunąć całą mielinę podczas pobierania fragmentów wzbogaconych w układ odpornościowy, aby uniknąć problemów w dalszej części procesu.

Barwienie płytek a barwienie w probówkach: W tym protokole opisaliśmy dwie opcje barwienia komórek w probówkach o pojemności 1,5 ml lub na płytce 96-dołkowej. Przypadek użycia dla każdego z nich zależy od eksperymentu; Jednak ogólnie rzecz biorąc, barwienie probówek wiąże się z mniejszym ryzykiem wpływu na wydajność niż barwienie płytek, ponieważ pstryknięcie grozi utratą komórek, jeśli zostanie wykonane nieprawidłowo. Barwienie płytek jest znacznie szybsze, ponieważ zasysanie supernatantu do każdej probówki jest czasochłonne. Przed utrwaleniem (do sortowania itp.) należy użyć barwienia w probówkach, aby zmaksymalizować wydajność i zmniejszyć ryzyko strat. Jednak w przypadku analizy HPTM, po utrwaleniu komórek do barwienia wewnątrzjądrowego, osad jest bardziej stabilny i zmniejsza się ryzyko utraty przy miażdżeniu.

Ustalanie nieciągłego gradientu gęstości: Podczas ustanawiania warstw, prawidłowe ułożenie warstw jest niezbędne do uzyskania frakcji wzbogaconej immunologicznie. Jeśli warstwy są zakłócone lub wymieszane i wydają się mętne, komórki nie posortują się do pożądanego miejsca i wystąpią trudności w uzyskaniu frakcji komórkowej wzbogaconej w układ odpornościowy. Jeśli tak się stanie, odwirować z podłożem o gęstości, aby usunąć mielinę, a następnie zebrać całe pozostałe frakcje, rozcieńczyć 3 ml buforu FACS do 1 ml pożywki o gęstości i dobrze wymieszać (będzie to wymagało wielu probówek). Wirować z prędkością 500 x g przez 10 minut z hamulcem ustawionym na 0. Odrzucić supernatant, pozostawiając tylko ~300 μl roztworu. Zebrać całą próbkę i wybarwić ją. Spowoduje to zmniejszenie procentu sortowania i większą ilość czasu spędzonego przy cytometrze, ale wydajność nadal może być porównywalna.

W przypadku stosowania metody izolacji korzystna jest możliwość pobierania komórek do RNA i oceny HPTM z tego samego mózgu myszy. W tej sytuacji, po posortowaniu żywego mikrogleju, komórki można podzielić, aby przydzielić część do oceny RNA (minimalna liczba komórek wejściowych do uzyskania przyzwoitej wydajności RNA to 75 000 komórek) i część do dalszej analizy cytometrii przepływowej (minimum 10 000 komórek na studzienkę dla dobrego określenia MFI). W takim przypadku wymagane jest sortowanie cytometrem przepływowym. Jednak w przypadku planowania wykorzystania komórek tylko do analizy HPTM, sortowanie nie jest wymagane, a frakcja immunologiczna może być barwiona przeciwciałem P2RY12 i przeciwciałem HPTM. Bramkowanie na cytometrze można następnie ustawić dla mikrogleju P2RY12 +, tak jak w przypadku sortowania przepływowego, aby analizować tylko sygnał HPTM w mikrogleju. Wyeliminowanie sortowania pozwala na szybsze i bardziej opłacalne działanie protokołu. Ponadto, w przypadku oceny HPTM z hodowanych komórek, wystarczy rozpocząć od protokołu barwienia i nie są wymagane przeciwciała przeciwko markerom komórkowym, jak pokazano na rysunku 6. Protokół oceny HPTM może być stosowany w przypadku wielu typów komórek, w tym komórek hodowlanych, pierwotnych i pochodzących z IPSC.

Wreszcie, chociaż przedstawiliśmy tylko dwa potencjalne zastosowania mikrogleju po izolacji, istnieje wiele innych, w tym techniki epigenetyczne, takie jak ChIP, CUT&Tag i CUT&RUN. W przypadku genomowych technik epigenetycznych, w których interesujące jest scharakteryzowanie zmian w określonych loci, należy wybrać specyficzne inhibitory dla autorów i eraserów znaczników chromatyny11 dostosowane do eksperymentów, aby zapewnić, że wszelkie profilowane modyfikacje epigenetyczne mikrogleju nie są artefaktami technicznymi z żadnych etapów procedury izolacji, takich jak trawienie enzymatyczne. Podczas oceny zmian w globalnych poziomach znaczników epigenetycznych, na przykład przy użyciu ilościowej cytometrii przepływowej, nie oczekuje się, że jakiekolwiek zmiany wywołane procedurą będą tak duże, aby można je było wykryć na poziomie globalnym.

Ogólnie rzecz biorąc, omówione metody zapewniają nowatorską, jednokomórkową metodę ilościowego określania globalnych poziomów modyfikacji histonów i innych zmian epigenetycznych za pomocą cytometrii przepływowej. Wykazaliśmy, że ta metoda jest wystarczająco czuła, aby wykryć globalne zmiany markera wzmacniającego H3K27ac w mikrogleju w odpowiedzi na LPS in vivo. Jest to zgodne z wcześniejszym sekwencjonowaniem ChIP H3K27ac po stymulacji LPS, które wykazało dramatyczną przebudowę wzmacniaczy reagujących na LPS28. Zastosowania tej metody pozwolą na zbadanie globalnych zmian epigenetycznych w różnych typach komórek mózgowych w trakcie rozwoju i choroby.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Podziękowania dla Yanyang Bai za pomoc w leczeniu immunoblot na rysunku 5. Prace te były wspierane przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem [CRC-RS 950-232402 do AC]; Kanadyjska Rada ds. Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii [RGPIN-2019-04450, DGECR-2019-00069 do AC]; Fundacja Charytatywna Rytu Szkockiego [21103 do AC] oraz Fundacja Brain Canada [AWD-023132 do AC]; Stypendium dla absolwentów Aborygenów Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej (6481 do MT); Stypendium dla absolwentów Kolumbii Brytyjskiej (6768 do MT); Nagroda Kanadyjskiej Platformy Otwartej Neuronauki dla Studentów Stypendysty (10901 dla JK); Czteroletnie stypendium doktoranckie Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej (6569 do JK). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5 M EDTAInvitrogenAM9260G
15 ml probówki wirówkowe Falcon, polipropylen, sterylne Falcon352196
24-dołkowe przezroczyste, nieobrobione płytkiCostar3738
2-merkaptoetanolGibco21985023
96 Well Clear Polistyren Microplate, przezroczyste okrągłe dno, nieobrobiona powierzchniaCorning3788
Acetylohiston 3 K9 (C5B11)Technologia sygnalizacji komórkowej9649SRozcieńczenie: 1:100
Acetyl Histone H4 K8 (2594)Technologia sygnalizacji komórkowej2594SRozcieńczenie: 1:100
Acetylo-histon H3 K27 (D5E4)Technologia sygnalizacji komórkowej8173SRozcieńczenie: 1:100
Acetylo-histon H3 Lys27 (MA523516)InvitrogenMA523516Rozcieńczenie: 1:100
Aktynomycyna DNew England Biolabs15021S
AnisomycynaNew England Biolabs2222S
Anty-Histone H3 (tri metylo K4) Abcamab213224Rozcieńczenie: 1:100
Przeciwciało anty-laktylo-histonowe H4 (Lys 12) mAb królikaPTM BiolabsPTM-1411RMRozcieńczenie: 1:250
Anty-L-Laktylolizyna PAbkrólika PRM BiolabsPTM-1401RMRozcieńczenie: 1:250
Przeciwciało anty-P2RY12 Apc, klon: S16007DBioLegend848006
BSATocris5217
Cyto-Last BufferBioLegend422501
dimetylosulfotlenek, sterylnyTechnologia sygnalizacji komórkowej12611S
DNAza ISTEMCELL Technologies07900
Osioł Anty Mysz AlexaFluor488Jackson ImmunoResearch715-546-150Rozcieńczenie: 1:500
Osioł Anty Królik AlexaFluor488ABklonalnyAS035Rozcieńczenie: 1:500
Donkey Anti Rabbit AlexaFluor568InvitrogenA10042Rozcieńczenie: 1:500
Donkey Anti Rabbit Brilliant Violet 421BioLegend406410Rozcieńczenie: 1:500
Fisherbrand Jednorazowe pipety z podziałkąFisherbrand13-711-9AM
Fisherbrand Jednorazowy filtr PES, 250mL FisherbrandFB12566502
Przeciwciało poliklonalne H3K18acInvitrogen720095Rozcieńczenie: 1:100
HBSS (10X), bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowejGibco14185052
HBSS, bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowejGibco14175103
Histone 3 Trimethyl K27 (ab6002)Abcamab6002Rozcieńczenie: 1:100
KONTES Młynki do tkanek Dounce 125mm 7mL VWR885300-0007
Lactyl-Histone H3 (Lys 18) MAb królikaPTM BIolabsPTM-1406RMRozcieńczenie: 1:250
Lipopolisacharyd Sigma-AldrichL5418
Normalna surowica osłaJackson ImmunoResearch017-000-121
Koraliki kompensacyjne OneComp eBeadsInvitrogen01-1111-41
Zestaw PDS, fiolka z papainą - Worthington BiochemicalCedarlaneLK003178
PercollSigma-AldrichGE17-0891-02
Czerwień fenolowaVWR
QIAshredderQiagen 79656
Tęczowe cząstki fluorescencyjne, 1 pik (3,0-3,4 uM -BioLegend
1,5 mlInvitrogenAM12400
Rneasy Plus Micro KitQiagen 74034
Probówki polipropylenowe z okrągłym dnem i nakrętkami, 5 mlCorning352063
TriptolideNew England Biolabs97539
Zestaw prawdziwych jądrowych czynników transkrypcyjnychBioLegend424401
TruStain FcX PLUS (anty-mysie CD16/32)BioLegend156604
Trypan BlueVWR97063-702
Zestaw do naprawy Zombie Aqua BioLegend423102
RC57004 Probówki do mikrofug bez RNaz 422905 o średniej intensywności,

Bibliografia

  1. Miller, J. L., Grant, P. A. The Role of DNA Methylation and Histone Modifications in Transcriptional Regulation in Humans. Epigenetics: Development and Disease. 61, 289-317 (2013).
  2. Kouzarides, T. Chromatin Modifications and Their Function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  3. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  4. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  5. Vogel Ciernia, A., LaSalle, J. The landscape of DNA methylation amid a perfect storm of autism aetiologies. Nature Reviews. Neuroscience. 17 (7), 411-423 (2016).
  6. Keiser, A. A., et al. Systemic HDAC3 inhibition ameliorates impairments in synaptic plasticity caused by simulated galactic cosmic radiation exposure in male mice. Neurobiology of Learning and Memory. 178, 107367(2021).
  7. McQuown, S. C., et al. HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31 (2), 764-774 (2011).
  8. Barrett, R. M., et al. Hippocampal Focal Knockout of CBP Affects Specific Histone Modifications, Long-Term Potentiation, and Long-Term Memory. Neuropsychopharmacology. 36 (8), 1545-1556 (2011).
  9. Datta, M., et al. Histone Deacetylases 1 and 2 Regulate Microglia Function during Development, Homeostasis, and Neurodegeneration in a Context-Dependent Manner. Immunity. 48 (3), 514.e6-529.e6 (2018).
  10. Belhocine, S., et al. Context-dependent transcriptional regulation of microglial proliferation. Glia. 70 (3), 572-589 (2022).
  11. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science (New York, N.Y.). 356 (6344), eaal3222(2017).
  12. Kettenmann, H., Hanisch, U. -K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of Microglia. Physiological Reviews. 91 (2), 461-553 (2011).
  13. Sullivan, O., Ciernia, A. V. Work hard, play hard: how sexually differentiated microglia work to shape social play and reproductive behavior. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 16, 989011(2022).
  14. Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. Chromatin immunoprecipitation assay. BioTechniques. 37 (6), 961-969 (2004).
  15. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  16. Crowe, A., Yue, W. Semi-quantitative Determination of Protein Expression Using Immunohistochemistry Staining and Analysis: An Integrated Protocol. BIO-PROTOCOL. 9 (24), (2019).
  17. Seligson, D. B., et al. Global histone modification patterns predict risk of prostate cancer recurrence. Nature. 435 (7046), 1262-1266 (2005).
  18. Liu, B., et al. Global Histone Modification Patterns as Prognostic Markers to Classify Glioma Patients. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 19 (11), 2888-2896 (2010).
  19. Pan, R. Y., et al. Positive feedback regulation of microglial glucose metabolism by histone H4 lysine 12 lactylation in Alzheimer's disease. Cell Metabolism. 34 (4), 634.e6-648.e6 (2022).
  20. Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
  21. Pösel, C., Möller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain. Journal of Visualized Experiments. (108), 53658(2016).
  22. Oblak, A. L., et al. Comprehensive Evaluation of the 5XFAD Mouse Model for Preclinical Testing Applications: A MODEL-AD Study. Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 713726(2021).
  23. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and Culture of Microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), e70(2019).
  24. McKinnon, K. M. Multiparameter Conventional Flow Cytometry. Flow Cytometry Protocols. 1678, 139-150 (2018).
  25. Marsh, S. E., et al. Dissection of artifactual and confounding glial signatures by single-cell sequencing of mouse and human brain. Nature Neuroscience. 25 (3), 306-316 (2022).
  26. Wang, L., Gaigalas, A. K., Marti, G., Abbasi, F., Hoffman, R. A. Toward quantitative fluorescence measurements with multicolor flow cytometry. Cytometry Part A. 73A (4), 279-288 (2008).
  27. Rumbaugh, G., Miller, C. A. Epigenetic changes in the brain: measuring global histone modifications. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 670, 263-274 (2011).
  28. Xavier, A. M., et al. Systematic delineation of signaling and epigenomic mechanisms underlying microglia inflammatory activity in acute and chronic brain pathologies. BioRvix. , (2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Modyfikacje histon wizolacja mikroglejustruktura chromatynybarwienie przeciwcia amigradient g sto cikontrola ekspresji gen wacetylacja lizyny
Kwantyfikacja globalnych modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.