Kwantyfikacja globalnych modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu myszy

Summary

Ta praca opisuje protokół do kwantyfikacji globalnych modyfikacji histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu. Praca zawiera również protokół izolacji mikrogleju, który został wykorzystany do zebrania danych.

Abstract

Kontrola ekspresji genów następuje częściowo poprzez modyfikacje struktury chromatyny, w tym dodawanie i usuwanie modyfikacji potranslacyjnych ogonów histonowych. Modyfikacje potranslacyjne histonów (HPTM) mogą ułatwiać ekspresję genów lub ich represję. Na przykład acetylacja reszt lizyny ogona histonowego neutralizuje ładunek dodatni i zmniejsza interakcje między ogonem a ujemnie naładowanym DNA. Zmniejszenie interakcji ogon-DNA histonu powoduje zwiększoną dostępność leżącego u podstaw DNA, co pozwala na zwiększony dostęp do czynnika transkrypcyjnego. Znacznik acetylacji służy również jako miejsce rozpoznawania aktywatorów transkrypcji zawierających bromodomenę, co razem skutkuje zwiększoną ekspresją genów. Znaczniki histonów mogą być dynamicznie regulowane podczas różnicowania komórek oraz w odpowiedzi na różne środowiska i bodźce komórkowe. Podczas gdy podejścia sekwencjonowania nowej generacji zaczęły charakteryzować lokalizacje genomowe dla poszczególnych modyfikacji histonów, tylko jedna modyfikacja może być badana jednocześnie. Biorąc pod uwagę, że istnieją setki różnych HPTM, opracowaliśmy wysokoprzepustową, ilościową miarę globalnych HPTM, którą można wykorzystać do badań przesiewowych modyfikacji histonów przed przeprowadzeniem bardziej rozległych podejść do sekwencjonowania genomu. Protokół ten opisuje metodę opartą na cytometrii przepływowej do wykrywania globalnych HPTM i może być przeprowadzana przy użyciu komórek w hodowli lub izolowanych komórek z tkanek in vivo. Przedstawiamy przykładowe dane z izolowanego mikrogleju mózgu myszy, aby zademonstrować czułość testu w wykrywaniu globalnych zmian w HPTM w odpowiedzi na bodziec immunologiczny pochodzenia bakteryjnego (lipopolisacharyd). Protokół ten pozwala na szybką i ilościową ocenę HPTM i może być stosowany do dowolnego regulatora transkrypcyjnego lub epigenetycznego, który może być wykryty przez przeciwciało.

Introduction

Epigenetyka to badanie mechanizmów, które regulują ekspresję genów bez zmiany podstawowej sekwencji DNA. Epigenetyczna regulacja ekspresji genów jest dynamiczna w komórkach i może pozwolić na szybkie i skoordynowane reakcje na różne bodźce środowiskowe. Regulacja dynamiczna zachodzi częściowo z powodu zmian w strukturze chromatyny na poziomie nukleosomu, który składa się z białek histonowych (H2A, H2B, H3, H4) połączonych w rdzeń oktamera ciasno nawinięty przez DNA¹. Interakcje między białkami histonowymi a DNA mogą kontrolować dostępność DNA dla maszynerii transkrypcyjnej, która ostatecznie może kontrolować ekspresję genów i inne aspekty biologii chromatyny². Białka histonowe mają nieustrukturyzowane ogony, które zawierają dodatnio naładowane reszty, które tworzą oddziaływania elektrostatyczne z ujemnie naładowanym szkieletem DNA. Interakcje te skutkują ścisłym upakowaniem DNA i zmniejszoną dostępnością DNA. Kowalencyjne modyfikacje ogonów histonowych, zwane modyfikacjami potranslacyjnymi histonów (HPTM), mogą regulować te interakcje^3,4. Niektóre z najlepiej scharakteryzowanych HPTM obejmują acetylację i metylację ogona histonów, które mogą zmienić powinowactwo oddziaływań elektrostatycznych między ogonami histonów a DNA, co skutkuje zróżnicowanym dostępem do leżącego u podstaw DNA i rekrutacją czynników transkrypcyjnych, które rozpoznają te HPTM w określonych miejscach. HPTM są regulowane przez trzy ważne klasy enzymów zwanych czytnikami - które rozpoznają, pisarzami - które osadzają i gumkami - które usuwają HPTM. Tak więc rekrutacja lub rozpuszczenie enzymów czytających, piszących lub wymazujących może ostatecznie zmienić krajobraz HPTM i zarządzać strukturą i funkcją chromatyny, sprawiając, że ich regulacja i odczyt są niezbędne do zrozumienia biologii i funkcji komórkowej^3,4.

Komórki w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) są epigenetycznie elastyczne, ponieważ zmieniają swój transkryptom, aby dostosować się do bodźców środowiskowych. Coraz więcej dowodów sugeruje, że zmiany w epigenomie, takie jak metylacja DNA, niekodujące RNA i HPTM, odgrywają istotną rolę w tworzeniu pamięci i funkcji synaptycznej⁵. Zakłócenie dynamiki HPTM poprzez manipulowanie odpowiednimi czytnikami, pisarzami lub gumkami może blokować lub wzmacniać uczenie się asocjacyjne i długoterminowe wzmocnienie^6,7,8. Mikroglej, rezydująca komórka immunologiczna OUN, szybko reguluje swój transkryptom w odpowiedzi na stymulację immunologiczną poprzez dynamiczne zmiany w swoim epigenomie^9,10,11. Ten wysoki poziom adaptacji do lokalnego środowiska mózgu sprawia, że są one trudne do zbadania w odizolowanym kontekście, ponieważ badania wykazały, że epigenom i transkryptom mikrogleju ulega zmianie już po kilku godzinach w pożywce hodowlanej po usunięciu ze środowiska mózgu¹¹. Ponadto, ponieważ mikroglej stanowi tylko 10% komórek mózgu, pomiary badające zmiany na poziomie całej tkanki nie są czułe i swoiste^12,13. W rezultacie, mikroglej musi zostać szybko wyizolowany w celu zbadania zmian epigenetycznych, takich jak poziomy HPTM, ex vivo.

Metody powszechnie używane do badania HPTM obejmują sekwencjonowanie chromatyno-immunoprecypitacyjne (ChIP-seq) i rozszczepienie pod celami oraz sekwencjonowanie tagmentacji (CUT&Tag-seq)⁴. Chociaż techniki te są wysoce specyficzne dla poszczególnych HPTM i mogą informować o obecności HPTM w określonym kontekście genomicznym, mogą one badać tylko jeden z wielu możliwych HPTM w ramach jednego eksperymentu^11,14 Dlatego przed przystąpieniem do takich eksperymentów, które wymagają znacznych inwestycji czasu i pieniędzy, bardzo cenne jest zawężenie listy potencjalnie interesujących HPTM do dalszego zbadania przez najpierw badając zmiany w globalnych poziomach HPTM. Dwa główne podejścia do badania globalnych poziomów HPTM to immunohistochemia i analiza western blot, ale oba podejścia są tylko częściowo ilościowe, niskoprzepustowe i wymagają dużej liczby skrawków tkanek lub izolowanych komórek^15,16. W związku z tym naszym celem było opracowanie wysoce czułej, ilościowej metody, którą można by wykorzystać do szybkiego zbadania globalnych poziomów HPTM na poziomie pojedynczej komórki.

Przedstawiony protokół umożliwia szybkie wykrywanie globalnych poziomów HPTM za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej. Wcześniejsze badania na komórkach nowotworowych uzasadniały znaczenie badania globalnych poziomów z perspektywy klinicznej^17,18. Często zdarza się również, że w badaniach wykorzystuje się poziomy globalne jako metodę przesiewową przed oceną lokalizacji genomowej określonych HPTM będących przedmiotem zainteresowania^19,20. W przypadku mikrogleju ocena globalnych poziomów po izolacji jest trudna ze względu na niską wydajność komórek; Pan i inni prezentują globalne poziomy HPTM z izolowanego mikrogleju, w którym mikroglej od trzech zwierząt został połączony, aby umożliwić wykrycie poziomu białka za pomocą western blot¹⁹. Korzystając z naszego protokołu, jesteśmy w stanie wykryć globalne zmiany przy znacznie mniejszej liczbie danych wejściowych komórek, umożliwiając badanie przesiewowe wielu znaczników na zwierzę i eliminując potrzebę łączenia próbek.

Tutaj opisujemy protokół szybkiego wykrywania poziomów HPTM za pomocą ilościowej wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju. Chociaż skupiamy się w szczególności na kwantyfikacji HPTM ze względu na zwięzłość, protokół ten może być używany w ten sam sposób do ilościowego określania globalnych poziomów enzymów czytających, piszących i gumujących. Protokół składa się z dwóch części: po pierwsze, metody izolacji mikrogleju, a po drugie, metody opartej na cytometrii przepływowej do określania poziomów HPTM. Metoda izolacji pozwala uzyskać komórki, które można wykorzystać zarówno do izolacji RNA, jak i oceny poziomu HPTM, co pozwala na ocenę ekspresji genów i poziomów HPTM z tej samej próbki. Ponadto metoda oceny HPTM może być stosowana na innych typach komórek, jak wskazano w protokole.

Protocol

Wszystkie protokoły opieki nad zwierzętami zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami.

1. Trawienie mózgu w celu izolacji mikrogleju

Rysunek 1: Prosty schemat blokowy protokołu. Myszy są najpierw perfundowane przezsercowo za pomocą HBSS, a następnie mózg jest preparowany. Mózg jest następnie dysocjowany poprzez trawienie chemiczne i zakłócenia mechaniczne, w wyniku czego powstaje jednorodność pojedynczej komórki. Frakcja wzbogacona immunologicznie jest zbierana za pomocą nieciągłego gradientu gęstości, po czym komórki są barwione pod kątem P2RY12. Barwione komórki są albo 1) sortowane za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek aktywowanych (FACS) w celu przeprowadzenia analizy RNA lub dalszej analizy białek i/lub 2) utrwalone, przepuszczalne i wybarwione dla białek wewnątrzjądrowych. Poziom białka określa się ilościowo za pomocą mediany intensywności fluorescencji w kanale będącym przedmiotem zainteresowania, określonej za pomocą cytometrii przepływowej. Pola pokolorowane na niebiesko są częścią kroku protokołu 1) Trawienie mózgu w celu izolacji mikrogleju. Pola oznaczone kolorem czerwonym są częścią kroku protokołu 2) Barwienie przepływu wewnątrzjądrowego do analizy ekspresji białek. Stworzony z BioRender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Przygotowanie odczynników
   UWAGA: Jeśli planujesz ekstrakcję w celu pobrania zarówno RNA, jak i komórek do analizy HPTM, zapoznaj się z sekcją 1.7.1, aby zapoznać się z modyfikacjami w celu uwzględnienia inhibitorów transkrypcji i translacji. Nie jest to jednak wymagane, jeśli chodzi tylko o ocenę sygnału białkowego, ponieważ komórki są w dużej mierze spokojne, gdy są trzymane na lodzie.
   1. Bufor do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) (20 ml na próbkę): Rozpuść albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w 1x zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS), aby uzyskać 2% roztwór BSA. Rozpuścić EDTA do końcowego stężenia 1 mM w 2% roztworze BSA. Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia przed użyciem.
   2. Bufor do wytrawiania (1 ml na próbkę): Rozpuść fiolkę z papainą w HBSS do końcowego stężenia 20 U/ml w 1 mM L-cysteiny z 0,5 mM EDTA. Aktywować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 10 minut lub do momentu, gdy tkanka będzie gotowa do strawienia. Tuż przed użyciem dodać DNazę I do aktywowanego roztworu papainy do końcowego stężenia 200 U/ml. Przygotuj to w dniu eksperymentu i nie przechowuj
   .
   3. Roztwór gradientu gęstości izotonicznej (5,5 ml na próbkę): Dodać 10x HBSS do podłoża o zimnym gradiencie gęstości do końcowego stężenia 1x HBSS, co daje końcową gęstość 1,117 g/ml. Mieszaj przez co najmniej 30 sekund przed użyciem. Ułóż na lodzie do czasu użycia.
   4. Roztwór gradientu gęstości 37% (4 ml na próbkę): Dodaj gradient gęstości izotonicznej do 1x HBSS, aby uzyskać końcowe stężenie 37% przy końcowej gęstości 1,043 g/ml. Dodaj 20 μl czerwieni fenolowej na każdy ml gradientu gęstości 37%, aby uzyskać różowy roztwór do wizualizacji podczas nakładania warstw. Wirować przez co najmniej 30 s przed użyciem. Ułóż na lodzie do czasu użycia.
   5. Roztwór gradientu gęstości 70% (2 ml na próbkę): Dodaj gradient gęstości izotonicznej do 1x HBSS, aby uzyskać końcowe stężenie 70% przy końcowej gęstości 1,082 g/ml. Dodaj 5 μl błękitu trypanowego na każdy ml pożywki o gęstości 70%, aby uzyskać niebieski roztwór do wizualizacji podczas nakładania warstw. Wirować przez co najmniej 30 s przed użyciem. Ułóż na lodzie do czasu użycia.
2. Perfuzja i rozwarstwienie mózgu
   UWAGA: Protokół perfuzji jest podobny do Posel et al., który zawiera wideo przedstawiające torakotomię myszy, perfuzję przezsercową i usunięcie mózgu²¹. Tutaj używamy dorosłych samców i samic myszy C57BL/6J (10-15 tygodni, 20-30 g), ale ten protokół można wykorzystać do wykonania torakotomii u dowolnej myszy. Wszystkie procedury na zwierzętach muszą zostać zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyczną przed przeprowadzeniem doświadczeń.
   1. Znieczulenie myszy: Znieczulenie myszy 4% izofluranem w 100% tlenie, aż do momentu przejścia przez płaszczyznę znieczulenia chirurgicznego, co można potwierdzić szczyptaniem palca u nogi lub brakiem odruchu po mocnym uszczypnięciu stopy myszy. Połóż mysz na plecach i mocno przypnij jej cztery łapy do chirurgicznej tablicy preparacyjnej umieszczonej przechylonej w plastikowej tacy, upewniając się, że nos jest zamocowany w stożku nosowym z izofluoranu. Po przeniesieniu, przed kontynuowaniem upewnij się, że zwierzę nadal znajduje się poza chirurgiczną płaszczyzną znieczulenia.
   2. Torakotomia myszy: Chwyć i podnieś skórę brzucha za pomocą kleszczy i wykonaj płytkie nacięcie przez skórę i ścianę brzucha, aby odsłonić ksyloidę bez uszkadzania aorty zstępującej lub jakichkolwiek narządów znajdujących się poniżej.
   3. Chwyć ksyloidę kleszczami i wykonaj boczne nacięcia pod klatką piersiową, aby odsłonić przeponę i wątrobę. Wykonaj ostrożne płytkie nacięcia przez przeponę wzdłuż klatki piersiowej za pomocą drobnych nożyczek i przez klatkę piersiową za pomocą nożyczek do tkanek i przypnij mostek do stacji chirurgicznej w pobliżu głowy myszy, aby odsłonić serce i płuca do perfuzji przezsercowej.
   4. Perfuzja przezsercowa: Przygotuj pompę perfuzyjną perystaltyczną i przymocuj igłę 26,5 G do jednego końca rurki. Zagruntować rurkę do zabiegu, wkładając jeden koniec rurki do fiolki z zimnym 1x HBSS i włączając pompę, aby całkowicie napełnić rurkę 1x HBSS.
   5. Trzymając serce kleszczami, włóż końcówkę igły 26,5G z dołączoną rurką perfuzyjną do lewej komory serca i wykonaj małe nacięcie w prawym przedsionku. Włącz pompę perfuzyjną, aby ostrożnie ukrwić mysz z szybkością ~ 2-4 ml / min z co najmniej 15-20 ml zimnego 1x HBSS.
      UWAGA: Całkowita perfuzja jest często wskazana, gdy wątroba zaczyna oczyszczać krew i staje się tego samego koloru co serce.
   6. Usunięcie mózgu: Odetnij głowę myszy za pomocą nożyczek do preparowania tkanek i wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry głowy od szyi do nosa. Oderwij płaty skóry na boki, aby odsłonić czaszkę i usuń nadmiar tkanki i kości na ogonowym końcu czaszki za pomocą nożyczek preparujących.
   7. Ostrożnie wsuń jedno ostrze nożyczek pod czaszkę do otworu wielkiego ostrą stroną skierowaną do kości i ostrożnie przeciąć linię środkową w kierunku nosa. Wykonuj boczne nacięcia zarówno u podstawy czaszki, jak i w pobliżu nosa za pomocą nożyczek preparujących. Za pomocą cienkich kleszczy ułóż czaszkę od linii środkowej do zewnątrz, aby odłamać kawałki czaszki i odsłonić mózg. Delikatnie unieś mózg szpatułką i umieść na bibule do wypreparowania.
   8. Sekcja mózgu: Umieść mózg na kawałku bibuły do bibuły sekcyjnej zwilżonej 1x HBSS na zamkniętej szalce Petriego wypełnionej lodem. Usuń móżdżek i przetnij półkule mózgu na pół za pomocą czystej żyletki.
   9. Usuń pień mózgu, prążkowie i istotę białą z każdej półkuli, zachowując nienaruszony hipokamp i korę wierzchnią. Przenieś półkule zawierające izolowaną korę i tkankę hipokampa do probówki o pojemności 15 ml z 5 ml zimnego 1x HBSS i trzymaj na lodzie.
      UWAGA: Ważne jest, aby przeprowadzić sekcje tak szybko, jak to możliwe, aby tkanka pozostała zimna nie dłużej niż 2 minuty między dekapitacją a ostatecznym umieszczeniem wypreparowanej tkanki w 1x HBSS na lodzie. W przypadku izolowania mikrogleju od wielu zwierząt, mózgi można przechowywać na lodzie w 1x HBSS przez ~ 1 godzinę przed przystąpieniem do przetwarzania całej kohorty zwierząt do trawienia itp.
3. Trawienie i homogenizacja mózgu
   1. Dysocjacja mechaniczna i chemiczna: Umieść tkankę mózgową każdej myszy i 1 ml buforu trawiennego na osobnych szalkach Petriego na lodzie. Za pomocą czystego ostrza skalpela dokładnie posiekaj mózg na małe kawałki (<1 mm).
   2. Odetnij końcówkę plastikowej pipety transferowej i ostrożnie przenieś każdy z rozdrobnionych mózgów do oddzielnych dołków w 24-dołkowej płytce na lodzie. Przykryć płytkę przezroczystą, elastyczną folią i inkubować na lodzie przez 30 min.
      UWAGA: Prawidłowo posiekana tkanka mózgowa przypomina dobrze zmielony czosnek.
   3. Homogenizacja z odbłąka: Przenieś strawiony roztwór mózgowy z każdej studzienki do pojedynczych szklanych homogenizatorów o pojemności 7 ml na lodzie, z których każdy wypełniony jest 5 ml zimnego buforu FACS. Delikatnie uderz każdy mózg luźnym tłuczkiem (A), około 30-40 razy, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Po zanurzeniu tłuczkiem A, delikatnie zanurz go ciasnym tłuczkiem (B) 3-4 razy, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
      UWAGA: Nie wciskaj tłuczka więcej niż 3/4 długości w dół, aby uniknąć zmiażdżenia tkanki na dnie homogenizatora. Końcowy roztwór powinien być nieprzezroczysty i mleczny.
      UWAGA: W przypadku trawienia wielu mózgów w jednym eksperymencie, należy zaplanować transfer trawienia mózgu do bufora FACS tak, aby każda próbka znajdowała się w buforze trawienia tylko przez 30 minut. Nadmierne trawienie może powodować rozszczepienie białek powierzchniowych, zmniejszając wiązanie przeciwciał i sygnał.
4. Uzyskanie fragmentu wzbogaconego immunologicznie
   1. Ustalanie gradientu gęstości: Przenieś homogenat z każdego mózgu do oddzielnych probówek polipropylenowych o pojemności 15 ml i dodaj 2,125 ml gradientu gęstości izotonicznej i dodaj do 8,5 ml z buforem FACS dla każdego, aby uzyskać końcowe stężenie o 25% gradientzie gęstości. Delikatnie odwróć probówki o pojemności 15 ml 20x, aby dokładnie wymieszać.
   2. Używając pipety do przenoszenia z wąską podziałką, delikatnie nałóż 4 ml gradientu gęstości 37% na każdą probówkę, bardzo ostrożnie, aby utworzyć czyste warstwy. Zamień pipety transferowe i delikatnie nałóż 2 ml o gradiencie gęstości 70% (Rysunek 2A). Przenieść do wirówki schłodzonej do temperatury 4 °C i wirować z prędkością 500 x g przez 20 minut z rampą hamującą ustawioną na zero .
   3. Pobieranie fragmentu wzbogaconego immunologicznie: Za pomocą czystych pipet transferowych delikatnie odessać mielinę od góry objętości w probówce o pojemności 15 ml za pomocą czystej pipety do przenoszenia i wyrzucić. Ostrożnie zebrać górny fragment gradientu gęstości do czystej probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml za pomocą pipety transferowej.
   4. Ostrożnie zbierz fragment wzbogacony immunologicznie (1,5 ml powyżej i 1,5 ml poniżej miejsca, w którym spotykają się warstwy gradientu gęstości 70% i 37%) do nowej probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml (Rysunek 2B). Dodaj 10 ml buforu FACS do próbki wzbogaconej immunologicznie, aby rozcieńczyć pożywkę o gradiencie gęstości i delikatnie odwróć probówkę 20x, aby dokładnie wymieszać.
      UWAGA: Ponieważ komórki mają tendencję do przyklejania się do boków probówki, upewnij się, że zebrałeś wszystkie komórki w próbce podczas etapów pobierania, powoli obracając pipetą wzdłuż boków probówki podczas zbierania cieczy.
   5. Osadzać komórki w próbce wzbogaconej immunologicznie, odwirowując probówki o pojemności 15 ml w wirówce o temperaturze 4 °C przy 500 x g przez 10 minut z hamulcem zjazdowym ustawionym na zero. Natychmiast po zakończeniu wirowania ostrożnie usunąć supernatant, pozostawiając około 300 μl płynu w probówce o pojemności 15 ml, uważając, aby nie naruszyć osadu (który może nie być widoczny).
   6. Zebrać supernatant w innej probówce o pojemności 15 ml, aby upewnić się, że komórki zostały zagnieżdżone w wirowaniu (wyrzucić tę frakcję po przeprowadzeniu weryfikacji z liczbą komórek w zawieszonym osadzie). Po ponownym wymieszaniu osadu komórkowego w objętości 300 μl za pomocą pipety P1000, należy policzyć komórki za pomocą hemacytometru, aby oszacować całkowitą wydajność komórek.

Rysunek 2: Uzyskanie fragmentu wzbogaconego immunologicznie za pomocą nieciągłego gradientu gęstości. (A) Homogenat mózgu jest wytwarzany do podłoża o gęstości 25%, podkładu 4 ml medium o gęstości 37% zabarwionego na różowo za pomocą czerwieni fenolowej i 2 ml o gęstości 70% średnio zabarwionego na niebiesko za pomocą błękitu trypanowego. (B) Po odwirowaniu frakcje zostały oddzielone. Mikroglej znajduje się na granicy fragmentów mediów o gęstości 37% i 70%. Fragment mieliny znajduje się w górnej części probówki o pojemności 15 ml i zostanie wyrzucony. Górny fragment jest zbierany jako kopia zapasowa na wypadek, gdyby wirowanie się nie powiodło i żadne komórki nie są odzyskiwane. Jeśli tak się stanie, gradient można powtórzyć przy użyciu tej frakcji. Frakcja wzbogacona immunologicznie jest zbierana w dalszej części procesu. Dolna frakcja zawierająca jakiekolwiek czerwone krwinki pozostaje w probówce i jest odrzucana. (C) Przykładowy rysunek przedstawiający całe warstwy. Stworzony z BioRender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Barwienie przeciwciał zewnątrzkomórkowych
   1. Blokowanie: Przenieść komórki na okrągłą płytkę 96-dołkową na lodzie i odwirować przy 500 x g z hamulcem w celu osadzenia komórek. Szybko usuń supernatant ze zlewu, przesuwając płytkę, aby pozbyć się supernatantu, pozostawiając nienaruszoną osadkę komórkową na dnie studzienki.
   2. Ponownie zawiesić komórki w 50 μl buforu FACS za pomocą odczynnika blokującego receptor FC CD16/32 przeciwko myszom za pomocą pipety P200 (stężenie końcowe 10 μg/ml, współczynnik rozcieńczenia 1:50), aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał z monocytami lub innymi komórkami zawierającymi FcR. Inkubować przez 10 minut na lodzie.
   3. Barwienie przeciwciałami: Przygotować odpowiednią objętość 2x mieszanki głównej zawierającej P2RY12- allofikocyjaninę (APC; współczynnik rozcieńczenia 1:50, stężenie 4 μg/ml dla końcowego stężenia studzienki 1:100, stężenie 2 μg/ml) i fioletową 525 żywą martwą plamę (współczynnik rozcieńczenia 1:50 dla końcowego stężenia studzienki 1:100). Dodać 50 μl głównej mieszanki barwiącej do zawiesiny komórek (otrzymanej po zablokowaniu w sekcji 1.5.1) i inkubować płytkę przez 30 minut w ciemności na lodzie.
      UWAGA: W tym protokole przedstawiamy barwienie komórek za pomocą P2RY12. Po pierwsze, P2RY12 jest homeostatycznym markerem mikrogleju, który może być regulowany w dół w niektórych kontekstach chorobowych. Na przykład myszy 5XFAD z chorobą Alzheimera mają obniżony poziom P2RY12, co może utrudniać ich identyfikację²². Alternatywne barwniki, które można zastosować do izolacji, to Tmem119, Cd11b i CD45²³. Po drugie, sprzężony fluorochrom APC można dostosować do pożądanego panelu przeciwciał. Jednak wybór jasnego fluorochromu, takiego jak APC lub PE, pomoże zapewnić, że populacje pozytywne i negatywne będą łatwe do odróżnienia²⁴.
   4. Po zabarwieniu dodaj 200 μl buforu FACS bezpośrednio do każdej studzienki, aby umyć komórki. Wirować przy 500 x g w temperaturze 4 °C, aby usunąć supernatant przez trześnięcie. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu FACS za pomocą pipety P200, wirować w temperaturze 500 x g w temperaturze 4 °C i przesunąć płytkę w celu usunięcia buforu z dołków.
   5. Przygotowanie kontroli przepływu: Przed barwieniem należy oddzielić niezbędne objętości komórek od każdej próbki po zablokowaniu w kroku 1.5.1 w celu uzyskania wymaganych kontroli przepływu.
      UWAGA: Kontrole przepływu są wymagane dla każdego eksperymentu w celu ustalenia bramek. Regulatory przepływu mogą być pobierane z dodatkowego zwierzęcia lub z ułamka każdej z studni doświadczalnych. Podczas dzielenia komórek upewnij się, że przypisujesz wystarczającą liczbę komórek na kontrolę, ponieważ wymagane jest 10 000-30 000 komórek na kontrolę, aby ustanowić bramki z dużą pewnością.
      1. Istnieją trzy istotne kontrole przepływu: brak plam, żywe zwłoki i kontrola izotypu P2RY12. Aby zapobiec powstawaniu plam, nie dodawaj żadnych przeciwciał. W kontroli izotypu P2RY12 potraktuj komórki barwnikiem żywotności (1:100) i przeciwciałem kontrolnym izotypu sprzężonym z APC (1:100).
      2. Aby przygotować żywą martwą kontrolę, należy podzielić komórki na porcje do oddzielnego dołka i przenieść połowę objętości komórki do probówki o pojemności 500 μl. Umieścić probówkę o pojemności 500 μl w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 5 minut, a następnie umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 5 minut w celu zabicia komórek. Włóż podwielokrotność martwych komórek do żywej martwej studzienki kontrolnej i zabarwić barwnikiem żywotności wiążącym aminy na fioletowo 525 (współczynnik rozcieńczenia 1:100), aby oznaczyć martwe komórki.
         UWAGA: Protokół jest napisany dla barwienia płytki metodą flick w celu usunięcia supernatantu. Wymaga to jednak usunięcia supernatantu natychmiast po zakończeniu wirowania, a ruch musi być wykonany z wystarczającą siłą, aby szybko usunąć supernatant bez naruszania osadu. Alternatywnie do barwienia można użyć probówek o pojemności 1,5 ml wolnych od RNAzy/DNaz, z następującymi modyfikacjami: Przenieść komórki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i osadzać przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odsysać supernatant za pomocą pipet. Wskazówka: Aby zapewnić szybkość, pipeta transferowa o pojemności 5 ml z końcówką P200 może szybko i dokładnie zassać supernatant. Podczas zasysania sprawdź, czy nie ma granulki. Jeśli osad nie jest widoczny, pozostawić 50 μl supernatantu i odpowiednio dostosować obliczenia. Podczas wymywania przeciwciał należy dodać dodatkowy FACS, aby zwiększyć rozcieńczenie przeciwciał (1000 μl zamiast 200 μl), aby uwzględnić niepełne usunięcie supernatantu. W zależności od cytometru do sortowania należy używać probówek o pojemności 1,5 ml, zmniejszając ilość wymaganych materiałów eksploatacyjnych.
6. Sortowanie FACS dla mikrogleju
   1. Przygotowanie: Zawiesić każdą studzienkę w 200 μl buforu FACS za pomocą pipety P200 i przenieść do oznakowanych probówek do sortowania przepływowego i dodać bufor FACS do łącznej ilości 500 μl dla stężenia około 5 x 10⁵ zdarzeń na ml. Przechowywać na lodzie w ciemności do czasu analizy. Przygotuj probówki po sortowaniu, dodając 100 μl buforu FACS jako poduszkę dla komórek w probówkach wolnych od RNAzy o pojemności 1,5 ml.
   2. Ustawienia cytometru: Sortuj komórki w sortowniku komórek cytometrii przepływowej wyposażonym w dyszę 100 μm. Sortuj komórki za pomocą 18-20 psi.
   3. Bramkowanie: Na cytometrze, bramka dla rozmiaru komórki za pomocą obszaru rozproszenia bocznego (SSC) w porównaniu z wysokością rozproszenia do przodu (FSC) za pomocą kontroli bez plam, aby pomóc odróżnić szczątki, umieść SSC-A na osi logarytmicznej, aby zwizualizować populację komórek i dokładnie bramkę, aby wybrać komórki (bramka S1; Rysunek 3). Aby usunąć wszelkie dublety, wykreśl FSC-H vs FSC-W i zabramuj blisko populacji komórek, usuwając wszelkie zanieczyszczenia i dublety (bramka S2). Korzystając z kontroli izotypu P2RY12, zbadaj komórki w kanale APC i ustaw bramkę dla autofluorescencji, aby określić komórki P2RY12+. Używając kontroli bez plam i żywych martwych, bramka dla komórek, które nie są fluorescencyjne na fioletowym 525 nm, jako żywe komórki.
   4. Sortowanie: Wykreśl fioletowy 525 nm w porównaniu z APC i określ populację, która jest P2RY12+ i żyje według FMO (MG). Posortuj te komórki do oznaczonej rurki sortowania po (Rysunek 3). Ostateczny procent sortowania wynosi około 50% wszystkich zdarzeń, przy czym większość całkowitych strat zdarzeń to zanieczyszczenia usunięte w bramie S1 (~70% zdarzeń to komórki; Tabela 1).
7. Izolacja i analiza RNA
   1. Inhibitory transkrypcji i translacji: Jeśli planujesz ekstrakcję RNA, aby wyeliminować ryzyko sygnatur transkryptomicznych związanych z izolacją, uwzględnij inhibitory translacji i transkrypcji w etapach buforowania. Przygotuj koktajl inhibitorów zgodnie z opisem Marsha i wsp., w tym aktynomycynę D, anizomycynę i tryptolid²⁵.
      1. Przygotowanie inhibitora: Rozpuścić zapasy inhibitorów i przechowywać w następujący sposób: Rozpuścić aktynomycynę D w dimetylosulfotlenku (DMSO) do 5 mg/ml i przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozpuścić tryptolid w DMSO do 10 mM i przechowywać w temperaturze -20 °C, chronić przed światłem. Anizomycynę należy rozpuścić w DMSO do 10 mg/ml i przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem. Wszystkie zapasy inhibitorów należy przechowywać nie dłużej niż 1 miesiąc po ich rozpuszczeniu.
      2. Modyfikacje buforu: Dodaj inhibitory w czterech różnych w protokole w następujący sposób: Podczas wykonywania perfuzji przezsercowej przygotuj HBSS z aktynomycyną D (5 μg/ml, 1:1000 z zapasu) i tryptolidem (10 μM, 1:1000 z zapasu). Po perfuzji przetransportuj mózgi do laboratorium w HBSS zawierającym aktynomycynę D (5 μg/ml, 1:1000 ze stocku), tryptolid (10 μM, 1:1000 ze stocku) i anisomycynę (27,1 μg/ml, 1:368,5 ze stocku). Przygotuj bufor FACS z aktynomycyną D (5 μg/ml, 1:1000 z magazynu), tryptolidem (10 μM, 1:1000 z zapasu) i anizomycyną (27,1 μg/ml, 1:368,5 z magazynu). Przygotuj bufor wytrawiający z aktynomycyną D (5 μg/ml, 1:1000 z zapasu), tryptolidem (10 μM, 1:1000 z zapasu) i anizomycyną (27,1 μg/ml, 1:368,5 z zapasu). Przygotuj bufor do płukania po sortowaniu, z HBSS zawierającym aktynomycynę D (5 μg/ml, 1:1000 z magazynu), tryptolid (10 μM, 1:1000 z magazynu) i anizomycynę (27,1 μg/ml, 1:368,5 ze standardu).
         UWAGA: Podczas dodawania inhibitorów należy upewnić się, że zostały one dodane bezpośrednio przed użyciem i chronić przygotowane przed światłem podczas użytkowania. Unikaj zamrażania i rozmrażania roztworów podstawowych.
   2. Mycie po sortowaniu: Ponieważ komórki zostały posortowane do 1,5 ml probówek wolnych od RNaz w buforze FACS, które będą zakłócać izolację RNA, konieczne jest umycie komórek. Wirować komórki w temperaturze 1000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant, pozostawiając około 50 μl płynu.
   3. Dodaj 200 μL 1x HBSS zawierającego aktynomycynę D (5 μg/mL, 1:1000 z zapasu), tryptolid (10 μM, 1:1000 z zapasu) i anizomycynę (27,1 μg/ml, 1:368,5 z zapasu) i dokładnie wymieszaj. Powtórzyć wirowanie i usunąć supernatant, pozostawiając 50 μl płynu (przemycie 1). Dodać 200 μl buforu do płukania po sortowaniu, dokładnie wymieszać i powtórzyć wirowanie, a następnie usunąć supernatant pozostawiając 25 μl płynu (przemycie 2).
   4. Ekstrakcja RNA: Do izolacji RNA z komórek mikrogleju należy użyć zestawu do izolacji RNA o niskim wkładzie w celu uzyskania wysokiej i stałej wydajności RNA oraz wyników RIN powyżej 9 (patrz poniżej i tabela materiałów, aby zapoznać się z zaleceniami dotyczącymi produktu). Do osadu komórkowego dodać 350 μl buforu do lizy z zalecanego zestawu + β-merkaptoetanol (1:100) i dobrze wymieszać.
      UWAGA: W razie potrzeby protokół może zostać zawieszony w tym momencie. Próbki można przechowywać w buforze do lizy w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA. W przypadku ekstrakcji RNA po przechowywaniu, rozmrozić lizat na lodzie i postępować zgodnie z instrukcjami dotyczącymi izolacji specyficznymi dla zestawu.
   5. Przenieść lizat do rozdrabniacza komórkowego opartego na kolumnach (patrz tabela materiałów w celu zapoznania się z zaleceniami dotyczącymi produktu) i odwirować z maksymalną prędkością w temperaturze 4 °C przez 2 minuty. Eluować w co najmniej 14 μl wody wolnej od RNaz i odpowiednio oznaczyć stężenie. Po tym momencie RNA może być używany do dowolnego dalszego zastosowania.

Rysunek 3: Strategia bramkowania dla sortowania przepływowego. Zdarzenia są bramkowane dla rozmiaru komórki na SSC-A vs FSC-H (S1). Następnie komórki są bramkowane tak, aby były podkoszulkami na FSC-H vs FSC-W (S2). Komórki singletowe są sortowane jako żywe, jeśli są ujemne na Comp-FL8-A::405-526-52 (fioletowa 525 żywa martwa plama) i jako P2RY12+, jeśli są dodatnie na Comp-FL32-A::640-671_30 (P2RY12-APC) przy użyciu kontroli izotypu P2RY12. Komórki są oznaczone jako MG i posortowane, jeśli są żywe i P2RY12+. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

ZAMKNIĘTE OSIEDLE	Częstotliwość rodzica	Częstotliwość występowania ogółem	hrabia
S1	68,10%	68,10%	162186
S2>S1	93,59%	63,70%	151707
P2Ry12+ (670+) > S2 > S1	83,05%	52,90%	125986
Na żywo (525-) > S2 > S1	92,78%	59,10%	140752
MG (P2RY12+ na żywo) >S2>S1	78,96%	50,30%	119794

Tabela 1: Przykładowa przykładowa tabela pochodzenia z procentami bramkowania i oczekiwanymi liczbami zdarzeń.

2. Barwienie przepływu wewnątrzjądrowego do analizy ekspresji białek

UWAGA: Inne typy komórek mogą być uruchomione w tym momencie, ten protokół jest testowany na hodowanych komórkach, w tym komórkach HEK293, komórkach podobnych do mikrogleju BV2 i ludzkim mikrogleju pochodzącym z IPSC.

1. Utrwalanie i barwienie komórek
   UWAGA: W przypadku poniższego protokołu użyj zestawu do barwienia wewnątrzkomórkowego, który jest zoptymalizowany pod kątem barwienia jądrowego. Zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się z zaleceniami dotyczącymi produktów.
   1. Podwielokrotność komórek wybarwionych zewnątrzkomórkowo z sekcji 1.5.2 do płytki 96-dołkowej (5 x 10^4-1 x 10⁶ komórek). Obracaj komórki przez 5 minut w temperaturze 500 x g w temperaturze 4 °C i przesuwaj, aby usunąć bufor FACS.
      UWAGA: Aby uzyskać dane z dużą pewnością co do średnich poziomów, należy użyć co najmniej 10 000 komórek na studzienkę. Chociaż nie ma zalecanego maksimum, najlepiej jest utrzymać stałą liczbę komórek przez cały czas trwania eksperymentu, aby upewnić się, że nie ma znaczącego wpływu różnych współczynników zmienności (CV).
   2. Utrwalanie i przepuszczalność: Dodaj 200 μl 1x koncentratu fix i delikatnie wymieszaj pipetą P200 w celu ponownego zawieszenia komórek. Inkubować w ciemności przez 45-60 minut. Odwirowywać płytkę przez 5 minut przy 500 x g w temperaturze pokojowej (RT) i przesuwać, aby usunąć supernatant.
      UWAGA: W razie potrzeby protokół może zostać zawieszony w tym momencie. Po odrzuceniu supernatantu należy ponownie zawiesić komórki w buforze do długoterminowego przechowywania komórek odpornościowych (zalecenia dotyczące produktu znajdują się w Tabeli materiałów). Próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 12-18 godzin, chronić przed światłem i przykrywać przezroczystą folią w celu ochrony przed parowaniem buforu.
   3. Dodaj 200 μl 1x buforu permeabilizacyjnego do każdej studzienki i odpipetuj P200 do wymieszania. Odwirowywać płytkę przez 5 minut przy 500 x g w temperaturze pokojowej i przesuwać, aby usunąć supernatant. Powtórzyć płukanie buforem przepuszczalnym w sumie 3x.
   4. Przygotowanie kontroli przepływu: Podziel objętość komórek z każdej próbki dla wymaganych kontroli przepływu (wystarczy 10 000-30 000 komórek na studzienkę kontrolną).
      1. Aby przygotować kontrolę bez barwienia, umieść komórki bez barwienia z sortu lub podwielokrotności niebarwionych komórek w oddzielnej studzience, która nie otrzyma żadnego przeciwciała.
      2. Aby przygotować kontrolę fluorescencji minus jeden (FMO), podwielokrotne komórki dla każdego z przeciwciał na panelu z wyjątkiem przeciwciała w tym kanale.
      3. Dla odpowiednich kanałów należy uwzględnić przeciwciało kontrolne izotypu w FMO do bramkowania. Na przykład w panelu zawierającym P2RY12-APC i H3K27Ac-AlexaFluor568 - powinny być dwa FMOS: (1) APC-FMO, który zawiera tylko H3K27Ac-AlexaFluor568 i przeciwciało kontrolne izotypu P2RY12 oraz (2) 568-FMO, który zawiera tylko P2RY12-APC oraz kontrolną izotyp pierwszorzędową i 568 wtórną.
         UWAGA: Ten protokół jest przedstawiany w celu przetestowania pojedynczego HPTM, jednak można ustalić panele, które zawierają wiele HPTM sprzężonych z różnymi fluoroforami.
   5. Barwienie przeciwciałami pierwotnymi: Do każdej studzienki dodać 50 μl 1x buforu permeabilizacyjnego o odpowiednim stężeniu przeciwciała pierwszorzędowego. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Przemyć 2x 200 μL 1x buforu do przepuszczalności.
      UWAGA: Stężenie przeciwciał stosowanych dla każdego HPTM jest zawarte w Tabeli Materiałów. Stężenie określa się poprzez testowanie różnych stężeń przeciwciał na hodowanych komórkach traktowanych stymulantem, który spowodowałby dramatyczny wzrost, np. inhibitorem HDAC dla śladów acetylacji i upewnieniem się, że zarówno komórki nieleczone, jak i leczone znajdowały się w zakresie wykrywania (powyżej kontroli izotypu i poniżej maksymalnego zakresu wykrywania cytometru). Optymalne stężenie przeciwciał dla HPTM powinno mieć średnią medianę intensywności fluorescencji w kanale fluoroforowym między 5 x 10⁴ a 1 x 10⁵.
   6. Wtórne barwienie przeciwciałami: Blokuj 200 μl 1x buforu permeabilacyjnego z 2% normalną surowicą osła (NDS) przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wiruj przez 5 minut przy 500 x g przy RT i przesuwaj, aby usunąć supernatant.
   7. Dodać 50 μL 1x buforu permeabilizacji z 2% NDS i odpowiednim stężeniem przeciwciała drugorzędowego i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Dodać 200 μl 1x buforu permeabilizacji do studzienek w celu rozcieńczenia, odwirować płytkę przez 5 minut przy 500 x g w temperaturze pokojowej i strzepnąć do odrzucenia supernatantu. Przemyć komórki 2x 200 μL 1x buforu permeabilizacyjnego.
      UWAGA: W tym momencie zawieś protokół. Zawiesić komórki w 200 μl buforu do długotrwałego przechowywania komórek odpornościowych za pomocą pipety P200 (zalecenia znajdują się w tabeli materiałów) i przechowywać w temperaturze 4 °C przez 12-24 godziny, chroniąc przed światłem.
   8. Przygotowanie do cytometrii przepływowej: Odwirować płytkę przez 5 minut przy 500 x g w temperaturze pokojowej i przetrzeć, aby usunąć supernatant. Zawiesić komórki w 200 μl buforu FACS za pomocą pipety P200 do cytometrii przepływowej. Uszczelnić przezroczystą folią do transportu do cytometru.
2. Cytometria przepływowa
   1. Aby przeanalizować proponowany panel przeciwciał, upewnij się, że cytometr jest wyposażony w co najmniej cztery lasery, w tym fioletowy (405 nm), niebieski (488 nm), żółty (561 nm) i czerwony (633 nm). Cytometr potrzebuje filtrów do wykrywania FITC (niebieski-525 nm), KRO (fioletowy-525 nm), PE (żółty-585 nm) i APC (czerwony-660 nm). Dodaj dodatkowe przeciwciała w zależności od wybranego cytometru.
   2. Kalibracja i standaryzacja: Na początku każdego eksperymentu uruchom tęczowe kulki fluorescencyjne i dostosuj napięcie lampy fotopowielacza (PMT), aż szczyty koralików będą porównywalne z wartościami docelowymi przebiegu poprzednich eksperymentów. Ta metoda standaryzacji pozwala na dostosowanie się do dryfu sprzętu w czasie.
   3. Kompensacja: Po ustawieniu napięcia i wzmocnienia PMT dla eksperymentu, użyj kulek kompensacyjnych wychwyconych przez przeciwciała, aby ustalić matrycę kompensacyjną dla panelu przeciwciał. Obliczenia te zapewnią, że fluorofory nie przyczyniają się do zmian sygnału w innych kanałach. Jest to coraz bardziej konieczne w przypadku multipleksowania wielu przeciwciał.
   4. Bramkowanie rozmiaru: Na wykresie kropkowym wykreśl SSC-A na logarytmie vs FSC-H na liniowym. Usuń zanieczyszczenia i wybierz rozmiar komórki za pomocą bramki S1. Wybierz dla komórek singletowych na wykresie kropkowym FSC-W vs FSC-H i bramki jako S2. (Rysunek 4).
   5. Ustalanie bramek fluoroforowych: Korzystając z odpowiedniego FMO dla każdego kanału fluoroforowego, ustal bramki, aby określić, co jest sygnałem dodatnim w każdym kanale, używając histogramów z jednym parametrem (Rysunek 4).
   6. Pomiar próbek: Starannie zapisz próbki zgodnie z ustaloną strategią bramkowania. Zidentyfikuj mikroglej za pomocą sygnału P2RY12 +, określ ekspresję białka w odpowiednich kanałach tylko dla mikrogleju.
3. Analiza danych cytometrii przepływowej
   1. Ustanawianie bramek analizy: Wykonując powyższe kroki dla cytometru w interfejsie użytkownika oprogramowania analitycznego, użyj tych samych bramek, które są używane do nagrywania do analizy.
   2. Uzyskaj wartości MFI za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej (zalecenia znajdują się w Tabeli materiałów): Podsumuj strategię bramkowania cytometrem do analizy przepływu. Korzystając z funkcji dodawania statystyk, wybierz medianę dla interesującej populacji (np. 568+) na wysokości kanału z kompensacją. Korzystając z edytora tabel, wyeksportuj medianę wartości natężenia fluorescencji (MFI) dla odpowiednich kanałów do arkusza kalkulacyjnego, aby kontynuować analizę statystyczną (Tabela 2).
      UWAGA: Plik uzupełniający S1 zawiera przykładowe dane z myszy z wstrzykniętymi lipopolisacharydami (LPS) i roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) oraz przykładowy plik analizy ze strategią bramkowania i wartościami MIF.
   3. Analiza wartości MFI w celu zmiany fałdowania białka: Po uzyskaniu wartości MFI oblicz zmianę krotności MFI w stosunku do populacji kontrolnej lub nieleczonej (równanie 1). Zmiana fałdowania MFI odzwierciedla zmianę fałdowania poziomów białka. Korzystając z wartości zmiany krotności, oceń zmianę wyrażenia i oblicz istotność statystyczną za pomocą testu t lub ANOVA.
      Równanie 1

Rysunek 4: Strategia bramkowania dla oceny MFI białek. Zdarzenia są najpierw bramkowane dla rozmiaru komórki na SSC-A i FSC-H (S1). Komórki są następnie bramkowane w celu uzyskania pojedynczych punktów na FSC-H vs FSC-W (S2). Komórki singletowe są następnie identyfikowane jako mikroglej za pomocą sygnału P2RY12-APC (APC+) z bramką ustaloną na podstawie fluorescencji w kontroli APC-FMO, która zawiera przeciwciało kontrolne izotypu. Komórki są następnie bramkowane dla sygnału H3K27Ac-AlexaFluor568 na Comp-FL5-A::Y610-mCherry. Intensywność fluorescencji komórek 610+ jest określana jako wskaźnik ekspresji białka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Results

Dorosłe myszy zostały przekrwione przezsercowo i poświęcone w celu izolacji mikrogleju. Mikroglej wyizolowano na lodzie i wybarwiono P2RY12-APC i fioletowymi 525 żywymi martwymi przeciwciałami. Komórki, które uznano za dodatnie dla P2RY12 i ujemne dla fioletowej 525 żywej martwej barwie, zostały posortowane jako żywy mikroglej. Średnia wydajność mikrogleju z wypreparowanego mózgu myszy wynosiła 1,28 x 10⁵ ± 0,05 (średnia ± błąd standardowy średniej (SEM), N=100). Nie ma różnicy w wydajności mikrogleju u samic (1,25 x 10⁵ ± 0,09 [średnia ± SEM, N = 46]) i samców (1,32 x 10⁵ ± 0,07 [średnia ± SEM, N = 54]) myszy (t(98) = 0,6365, p = 0,526). Podczas izolacji od określonych obszarów mózgu średnia wydajność mikrogleju z kory myszy wynosi 8,3 x 10⁴ ± 0,08 (średnia ± SEM, N = 15), a z hipokampa myszy wynosi 4,1 x 10⁴ ± 0,02 (średnia ± SEM, N = 16). Zgodnie z oczekiwaniami istnieje znacząca różnica w wydajności mikrogleju z każdego regionu mózgu (F(2, 128)=25,25, P<0,0001). Po wyizolowaniu mikrogleju RNA wyekstrahowano z izolowanych komórek za pomocą zestawu do izolacji RNA o niskim wkładzie wejściowym. Konsekwentnie wynik integralności RNA (RIN) wynosił powyżej 9,0 (9,62 ± 0,05), a średnia wydajność RNA na komórkę wynosiła 0,25 ± 0,01 pg (średnia ± SEM, N = 32; Plik uzupełniający S2).

Dorosłym myszom wstrzyknięto dootrzewnowo 1 mg/kg lipopolisacharydu (LPS) na 24 godziny przed uśmierceniem. Myszy poddano transcardialnej perfuzji HBSS, a mikroglej wyizolowano z całego mózgu zgodnie z opisanym protokołem (Figura 5A). Dla każdego barwnika 20 000-30 000 komórek przydzielono do każdego panelu przeciwciał. Globalne poziomy acetylacji histonu 3 lizyny 27 (H3K27Ac) oceniano w izolowanym mikrogleju za pomocą cytometrii przepływowej. W przypadku samców i samic myszy leczenie LPS wywołało wzrost H3K27Ac, gdy MFI jest znormalizowane w obrębie płci (t(6)=9,676, p<0,0001; Rysunek 5B). Podczas badania histogramów dla wybarwionych komórek, populacje pozostają normalnie rozmieszczone z podobną zmiennością; jednak komórki przesunęły się do zwiększonej fluorescencji, co spowodowało wzrost MFI (Rysunek 5C). Podczas badania H3K9Ac w tym samym leczeniu obserwuje się podobny wzrost H3K9Ac (t(6)=7,299, p=0,0003; Rysunek 5D,E) jednak zmiana zagięcia LPS w stosunku do PBS sygnału H3K9Ac jest mniejsza niż w przypadku sygnału H3K27Ac.

Rysunek 5: Globalne zmiany w acetylacji histonów w izolowanym mikrogleju. (A) Myszom wstrzykuje się dootrzewnowo buforowaną solą fizjologiczną (PBS) lub 1 mg/kg lipopolisacharydu (LPS) na 24 godziny przed uśmierceniem. Mikroglej zbiera się z frakcji wzbogaconej immunologicznie i utrwala do cytometrii przepływowej i globalnej oceny potranslacyjnej modyfikacji histonów. Mediana intensywności fluorescencji jest oceniana jako wskaźnik zastępczy dla ekspresji białka. Stworzony z BioRender.com. (B) Globalny poziom H3K27Ac wzrósł w odpowiedzi na leczenie LPS. Zmiana fałdy na PBS znormalizowana w eksperymencie i płci. Niesparowany dwustronny test t, t(6)=9,676, p<0,0001. Wykres słupkowy przedstawia średnią ± SEM. N=8 zwierząt; 2 na warunek w 2 niezależnych eksperymentach. (C) Przykładowe histogramy przedstawiające przesunięcie natężenia fluorescencji H3K27Ac. Modal przedstawia histogramy myszy z wstrzyknięciem PBS w porównaniu z myszami, którym wstrzyknięto LPS. (D) Przykładowe histogramy przedstawiające przesunięcie natężenia fluorescencji H3K9Ac. Modal przedstawia histogramy myszy z wstrzyknięciem PBS w porównaniu z myszami, którym wstrzyknięto LPS. (E) Globalny poziom H3K9Ac wzrósł w odpowiedzi na leczenie LPS. Zmiana fałdy na PBS znormalizowana w eksperymencie i płci. Niesparowany dwustronny test t, t(6)=7,299, p=0,0003. Wykres słupkowy przedstawia średnią ± SEM. N=8 zwierząt; 2 na warunek w 2 niezależnych eksperymentach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby potwierdzić, że opisana metoda jest porównywalna z innymi poprzednio stosowanymi metodami globalnej modyfikacji histonów, chcieliśmy użyć immunoblot jako narzędzia porównawczego. Jednak wydajność z wyizolowanego mikrogleju jest po prostu zbyt niska, aby umożliwić rozsądną ocenę. Dlatego użyliśmy hodowanych komórek BV2 do porównania metody cytometrii przepływu wewnątrzkomórkowego z Western blot (WB). Komórki BV2 hodowano w kompletnych pożywkach (DMEMF12, 10% FBS, 1x penicylina/streptamycyna i 1x L-glutamina) w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . Komórki pasażowano 0,25% trypsyną-EDTA i posiano w gęstości 250 000 komórek / studzienkę i traktowano zredukowaną pożywką surowicy (DMEM F12, 2% FBS, 1x penicylina/streptamycyna i 1x L-glutamina) i pozostawiono do odzyskania przez 12 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . Komórki traktowano 25 ng / ml LPS przez 24 godziny przed utrwaleniem, jak opisano powyżej, lub lizą buforem do lizy WB. Sygnał H3K27Ac został zrealizowany obiema metodami, przy czym GAPDH został użyty jako kontrola obciążenia dla WB. Analizę znormalizowanej intensywności fluorescencji w porównaniu z kontrolą PBS określono dla każdej grupy (Rysunek 6A). Badając zmianę znormalizowanego sygnału H3K27Ac przez WB, nastąpił 1,527-krotny wzrost stanu leczonego LPS w stosunku do kontroli_H2O, który został określony jako istotny za pomocą niesparowanego testu t (t = 3,024, df = 5; p = 0,0293). Podczas badania zmiany za pomocą cytometrii przepływowej stwierdzono 1,482-krotny wzrost stanu leczonego LPS, który określono jako istotny (t = 7,843, df = 10; p<0,0001). Używając dwukierunkowej ANOVA do porównania metod, stwierdzono istotny wpływ leczenia (F(1,15)=45,21,p<0,0001), ale nie metody (F(1,15)=0,05545, p=0,8697) lub interakcji (F(1,15)=0,02785, p=0,8697). Ponadto weryfikujemy tutaj, że nie ma zmian w poziomach histonów H3 zarówno za pomocą Western blot, jak i cytometrii przepływowej, ponieważ 2-kierunkowa ANOVA nie wykazała istotnego wpływu leczenia LPS (F(1,7)=0,02170,p=0,8870), metody (F(1,7)=0,01191, p=0,9162) lub interakcji (F(1,7=0,01191, p=0,9162; Rysunek 6B). Pokazane są również przykładowe plamy i przesunięcia histogramu dla tych danych (Rysunek 6C,D).

Rysunek 6: Porównanie metod do ilościowego oznaczania globalnej zmiany modyfikacji histonów między cytometrią przepływową a western blot. (A) Komórki BV2 są traktowane lipopolisacharydem o stężeniu 25 ng/ml (LPS) lub_H2Oprzez 24 godziny przed analizą. Intensywność fluorescencji H3K27Ac jest przedstawiana jako zmiana krotności w kontroli nośnika, soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), zarówno dla cytometrii przepływowej, jak i western blot. 2-kierunkowa ANOVA ujawniła istotny wpływ leczenia LPS (F(1,15)=45,21, p<0,0001), ale nie metody (F(1,15)=0,05545, p=0,8697) lub interakcji (F(1,15)=0,02785, p=0,8697). Poprawka Tukeya do testowania wielu hipotez została zastosowana dla reszt. * przedstawia 0,0332, ** przedstawia 0,0021. (B) Intensywność fluorescencji histonu H3 jest przedstawiona jako zmiana fałdowania PBS zarówno dla cytometrii przepływowej, jak i western blot. 2-kierunkowa ANOVA nie wykazała istotnego wpływu leczenia LPS (F(1,7)=0,02170, p=0,8870) lub metody (F(1,7)=0,01191, p=0,9162) lub interakcji (F(1,7=0,01191, p=0,9162). (C) Przedstawiono przykładowe przesunięcia cytometrii przepływowej i (D) cytometrii przepływowej. Rozmiar histogramu jest normalizowany do procentów na podstawie liczby komórek obecnych przy natężeniu fluorescencji w trybie. Wykres słupkowy przedstawia średnią SEM. n=2 niezależne eksperymenty, po 2 na warunek na eksperyment. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Podsumowując, te wyniki pokazują, że ta technika może być użyta do ilościowej oceny globalnych poziomów HPTM w izolowanym mikrogleju. Ponadto wykazano, że metoda ta jest porównywalna z poprzednimi technikami, ale wymaga znacznie mniejszej liczby danych wejściowych z komórek. Ponadto, chociaż nie pokazano, przy odpowiedniej kompensacji, obecna technika może być stosowana z wieloma przeciwciałami na tym samym panelu oceniającym różne HPTM.

Plik uzupełniający S1: Przykładowe pliki analizy. Plik ten zawiera plik analizy wsp i 7 plików fcs, w tym bez plamy, P2RY12FMO, 568FMO, dwa zwierzęta poddane działaniu PBS i dwa zwierzęta poddane działaniu LPS barwione H3K27Ac. Celem tego pliku jest zademonstrowanie analizy i bramkowania w eksperymencie, który może zobrazować, jak wyglądał udany eksperyment. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający S2: Dane izolacyjne. Dołączony plik zawiera odpowiednie dane sortowania po mikrogleju, które zawierają plon mikrogleju i RNA z opisanego protokołu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

ZAMKNIĘTE OSIEDLE	Częstotliwość rodzica	Częstotliwość występowania ogółem	hrabia
S1	89,00%	89,00%	Numer katalogowy: 25672
S2>S1	88,73%	78,97%	Numer katalogowy: 22779
APC+ > S2 > S1	76,61%	60,50%	Numer katalogowy: 17452
610+ > APC+ > S2 > S1	99,56%	60,24%	Numer katalogowy: 17376

Tabela 2: Przykładowy przykładowy wykres pochodzenia przedstawia procentowe liczby zdarzeń wymagane do dokładnego wykrywania białek.

Discussion

Przedstawiony protokół umożliwia ilościową ocenę globalnych poziomów HPTM za pomocą cytometrii przepływowej. Chociaż protokół ten przedstawia nowatorską metodę, poprzednie badania przeprowadzały ilościową ocenę białek przy użyciu podobnego podejścia²⁶. Poprzednie metody stosowane do oceny globalnych poziomów HPTM obejmują immunohistochemię i western blot 16,17,19,20. Przedstawiona metoda oparta na cytometrii przepływowej jest metodą łatwo mierzalną, podczas gdy western blot i immunohistochemia są półilościowe i mają niższą przepustowość. Western blot opiera się na lizie komórek, a zatem wymaga zarówno normalizacji białka, jak i białka kontrolnego obciążenia, które zakłada się, że jest niezmienione w warunkach eksperymentalnych²⁷. Immunohistochemia jest półilościowa i bardzo niskoprzepustowa, ponieważ trudno jest ilościowo ocenić ilość białka bez badania na poziomie pojedynczej komórki¹⁶. Podobnie w przypadku izolowanego mikrogleju stosowanie metody cytometrii przepływowej jest korzystne ze względu na ograniczoną wydajność, ponieważ western blot wymaga znacznie większego wkładu białka¹⁹. Wymagania dotyczące niskiej liczby komórek pozwalają na przeprowadzenie wielu paneli barwiących z tego samego zwierzęcia.

Jednak, podobnie jak w przypadku każdej innej metody, istnieją ograniczenia tej techniki, w tym koszt i dostępność przeciwciał, ponieważ nie wszystkie przeciwciała działają dobrze w warunkach cytometrii przepływowej. Ponadto, w porównaniu z immunoblotem, wymagane stężenie przeciwciał jest znacznie wyższe. Podczas gdy multipleksowanie pozwala na użycie wielu przeciwciał na tym samym panelu komórek, komórki nie mogą być pozbawione przeciwciała po analizie, co ogranicza użycie komórek do jednego na gatunek przeciwciał. Różni się to od immunoblot, w którym ten sam blot może być używany wielokrotnie. Jednak w zależności od dostępności przeciwciał i liczby kanałów detekcyjnych na cytometrze, możliwe byłoby badanie do kilkunastu znaczników jednocześnie.

Obecna metoda obejmuje tylko globalne poziomy ekspresji białek, a nie konkretną lokalizację genomu, a zmiany w poziomach globalnych mogą nie odzwierciedlać zmian w poszczególnych loci genomu. Podobnie, brak zmian na poziomach globalnych może nie oznaczać, że żadne loci genomowe nie ulegają zmianom, po prostu że globalne zmiany sumują się do zera różnic między terapiami. W związku z tym technika ta ma być używana jako badanie przesiewowe do identyfikacji HPTM będących przedmiotem zainteresowania do analizy genomowej. Ponadto metoda ta nie pozwala na porównanie różnych znaczników białkowych, z wyjątkiem sytuacji, gdy jest oceniana jako zmiana fałdowania w celu kontroli. W związku z tym jest to ograniczone w porównaniu ze standardową metodą opartą na krzywej, taką jak ELISA do oznaczania białek.

Przedstawiony protokół oferuje strategię izolowania żywego mikrogleju mózgu. Protokół ten opiera się na ekspresji białka P2RY12 do izolacji mikrogleju. Jednak P2RY12 jest markerem homeostatycznym w mikrogleju i może być regulowany w dół w modelach choroby, takich jak 5XFAD²². Dlatego używając zwierzęcia modelowego choroby, należy wybrać inne białka markerowe, takie jak TMEM119, CD11b lub CD45, aby pomóc w izolacji mikrogleju²³. Podobnie przedstawiamy ten protokół jako izolację od hipokampa i/lub kory mózgowej. Protokół ten działałby w celu wyizolowania mikrogleju z innych regionów mózgu, w tym regionów istoty białej, jednak do uzyskania wystarczającej ilości mikrogleju może być potrzebnych wiele zwierząt, w zależności od wielkości obszarów zainteresowania.

Przedstawiony protokół może solidnie izolować żywy mikroglej mózgu, ale na etapie izolacji istnieje kilka etapów, opisanych poniżej, które mogą zmniejszyć wydajność komórek, jeśli zostaną wykonane nieprawidłowo.

Perfuzje dla tego protokołu powodują wyższy procent mikrogleju we fragmencie wzbogaconym immunologicznie, co skróci czas spędzony w sortowniku. Perfuzja nie jest jednak wymagana, a w razie potrzeby można zastosować inne metody eutanazji.

Podczas izolacji mikrogleju mielina powinna zostać całkowicie usunięta. Cytometry przepływowe opierają się na tym, że komórki są w stanie przemieszczać się przez wąskie rurki w szybkim tempie. Ze względu na swoją lepkość i skłonność do zbrylania się mielina powoduje problemy z cytometrami, często powodując zatkanie, które może zarówno uszkodzić sprzęt, jak i zniszczyć próbkę, drastycznie zmniejszając wydajność. Zachowaj ostrożność, aby usunąć całą mielinę podczas pobierania fragmentów wzbogaconych w układ odpornościowy, aby uniknąć problemów w dalszej części procesu.

Barwienie płytek a barwienie w probówkach: W tym protokole opisaliśmy dwie opcje barwienia komórek w probówkach o pojemności 1,5 ml lub na płytce 96-dołkowej. Przypadek użycia dla każdego z nich zależy od eksperymentu; Jednak ogólnie rzecz biorąc, barwienie probówek wiąże się z mniejszym ryzykiem wpływu na wydajność niż barwienie płytek, ponieważ pstryknięcie grozi utratą komórek, jeśli zostanie wykonane nieprawidłowo. Barwienie płytek jest znacznie szybsze, ponieważ zasysanie supernatantu do każdej probówki jest czasochłonne. Przed utrwaleniem (do sortowania itp.) należy użyć barwienia w probówkach, aby zmaksymalizować wydajność i zmniejszyć ryzyko strat. Jednak w przypadku analizy HPTM, po utrwaleniu komórek do barwienia wewnątrzjądrowego, osad jest bardziej stabilny i zmniejsza się ryzyko utraty przy miażdżeniu.

Ustalanie nieciągłego gradientu gęstości: Podczas ustanawiania warstw, prawidłowe ułożenie warstw jest niezbędne do uzyskania frakcji wzbogaconej immunologicznie. Jeśli warstwy są zakłócone lub wymieszane i wydają się mętne, komórki nie posortują się do pożądanego miejsca i wystąpią trudności w uzyskaniu frakcji komórkowej wzbogaconej w układ odpornościowy. Jeśli tak się stanie, odwirować z podłożem o gęstości, aby usunąć mielinę, a następnie zebrać całe pozostałe frakcje, rozcieńczyć 3 ml buforu FACS do 1 ml pożywki o gęstości i dobrze wymieszać (będzie to wymagało wielu probówek). Wirować z prędkością 500 x g przez 10 minut z hamulcem ustawionym na 0. Odrzucić supernatant, pozostawiając tylko ~300 μl roztworu. Zebrać całą próbkę i wybarwić ją. Spowoduje to zmniejszenie procentu sortowania i większą ilość czasu spędzonego przy cytometrze, ale wydajność nadal może być porównywalna.

W przypadku stosowania metody izolacji korzystna jest możliwość pobierania komórek do RNA i oceny HPTM z tego samego mózgu myszy. W tej sytuacji, po posortowaniu żywego mikrogleju, komórki można podzielić, aby przydzielić część do oceny RNA (minimalna liczba komórek wejściowych do uzyskania przyzwoitej wydajności RNA to 75 000 komórek) i część do dalszej analizy cytometrii przepływowej (minimum 10 000 komórek na studzienkę dla dobrego określenia MFI). W takim przypadku wymagane jest sortowanie cytometrem przepływowym. Jednak w przypadku planowania wykorzystania komórek tylko do analizy HPTM, sortowanie nie jest wymagane, a frakcja immunologiczna może być barwiona przeciwciałem P2RY12 i przeciwciałem HPTM. Bramkowanie na cytometrze można następnie ustawić dla mikrogleju P2RY12 +, tak jak w przypadku sortowania przepływowego, aby analizować tylko sygnał HPTM w mikrogleju. Wyeliminowanie sortowania pozwala na szybsze i bardziej opłacalne działanie protokołu. Ponadto, w przypadku oceny HPTM z hodowanych komórek, wystarczy rozpocząć od protokołu barwienia i nie są wymagane przeciwciała przeciwko markerom komórkowym, jak pokazano na rysunku 6. Protokół oceny HPTM może być stosowany w przypadku wielu typów komórek, w tym komórek hodowlanych, pierwotnych i pochodzących z IPSC.

Wreszcie, chociaż przedstawiliśmy tylko dwa potencjalne zastosowania mikrogleju po izolacji, istnieje wiele innych, w tym techniki epigenetyczne, takie jak ChIP, CUT&Tag i CUT&RUN. W przypadku genomowych technik epigenetycznych, w których interesujące jest scharakteryzowanie zmian w określonych loci, należy wybrać specyficzne inhibitory dla autorów i eraserów znaczników chromatyny¹¹ dostosowane do eksperymentów, aby zapewnić, że wszelkie profilowane modyfikacje epigenetyczne mikrogleju nie są artefaktami technicznymi z żadnych etapów procedury izolacji, takich jak trawienie enzymatyczne. Podczas oceny zmian w globalnych poziomach znaczników epigenetycznych, na przykład przy użyciu ilościowej cytometrii przepływowej, nie oczekuje się, że jakiekolwiek zmiany wywołane procedurą będą tak duże, aby można je było wykryć na poziomie globalnym.

Ogólnie rzecz biorąc, omówione metody zapewniają nowatorską, jednokomórkową metodę ilościowego określania globalnych poziomów modyfikacji histonów i innych zmian epigenetycznych za pomocą cytometrii przepływowej. Wykazaliśmy, że ta metoda jest wystarczająco czuła, aby wykryć globalne zmiany markera wzmacniającego H3K27ac w mikrogleju w odpowiedzi na LPS in vivo. Jest to zgodne z wcześniejszym sekwencjonowaniem ChIP H3K27ac po stymulacji LPS, które wykazało dramatyczną przebudowę wzmacniaczy reagujących na LPS²⁸. Zastosowania tej metody pozwolą na zbadanie globalnych zmian epigenetycznych w różnych typach komórek mózgowych w trakcie rozwoju i choroby.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,5 M EDTA	Invitrogen	AM9260G
15 ml probówki wirówkowe Falcon, polipropylen, sterylne	Falcon	352196
24-dołkowe przezroczyste, nieobrobione płytki	Costar	3738
2-merkaptoetanol	Gibco	21985023
96 Well Clear Polistyren Microplate, przezroczyste okrągłe dno, nieobrobiona powierzchnia	Corning	3788
Acetylohiston 3 K9 (C5B11)	Technologia sygnalizacji komórkowej	9649S	Rozcieńczenie: 1:100
Acetyl Histone H4 K8 (2594)	Technologia sygnalizacji komórkowej	2594S	Rozcieńczenie: 1:100
Acetylo-histon H3 K27 (D5E4)	Technologia sygnalizacji komórkowej	8173S	Rozcieńczenie: 1:100
Acetylo-histon H3 Lys27 (MA523516)	Invitrogen	MA523516	Rozcieńczenie: 1:100
Aktynomycyna D	New England Biolabs	15021S
Anisomycyna	New England Biolabs	2222S
Anty-Histone H3 (tri metylo K4)	Abcam	ab213224	Rozcieńczenie: 1:100
Przeciwciało anty-laktylo-histonowe H4 (Lys 12) mAb królika	PTM Biolabs	PTM-1411RM	Rozcieńczenie: 1:250
Anty-L-Laktylolizyna PAb	królika PRM Biolabs	PTM-1401RM	Rozcieńczenie: 1:250
Przeciwciało anty-P2RY12 Apc, klon: S16007D	BioLegend	848006
BSA	Tocris	5217
Cyto-Last Buffer	BioLegend	422501
dimetylosulfotlenek, sterylny	Technologia sygnalizacji komórkowej	12611S
DNAza I	STEMCELL Technologies	07900
Osioł Anty Mysz AlexaFluor488	Jackson ImmunoResearch	715-546-150	Rozcieńczenie: 1:500
Osioł Anty Królik AlexaFluor488	ABklonalny	AS035	Rozcieńczenie: 1:500
Donkey Anti Rabbit AlexaFluor568	Invitrogen	A10042	Rozcieńczenie: 1:500
Donkey Anti Rabbit Brilliant Violet 421	BioLegend	406410	Rozcieńczenie: 1:500
Fisherbrand Jednorazowe pipety z podziałką	Fisherbrand	13-711-9AM
Fisherbrand Jednorazowy filtr PES, 250mL	Fisherbrand	FB12566502
Przeciwciało poliklonalne H3K18ac	Invitrogen	720095	Rozcieńczenie: 1:100
HBSS (10X), bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej	Gibco	14185052
HBSS, bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej	Gibco	14175103
Histone 3 Trimethyl K27 (ab6002)	Abcam	ab6002	Rozcieńczenie: 1:100
KONTES Młynki do tkanek Dounce 125mm 7mL	VWR	885300-0007
Lactyl-Histone H3 (Lys 18) MAb królika	PTM BIolabs	PTM-1406RM	Rozcieńczenie: 1:250
Lipopolisacharyd	Sigma-Aldrich	L5418
Normalna surowica osła	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Koraliki kompensacyjne OneComp eBeads	Invitrogen	01-1111-41
Zestaw PDS, fiolka z papainą - Worthington Biochemical	Cedarlane	LK003178
Percoll	Sigma-Aldrich	GE17-0891-02
Czerwień fenolowa	VWR
QIAshredder	Qiagen	79656
Tęczowe cząstki fluorescencyjne, 1 pik (3,0-3,4 uM -		BioLegend
1,5 ml	Invitrogen	AM12400
Rneasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
Probówki polipropylenowe z okrągłym dnem i nakrętkami, 5 ml	Corning	352063
Triptolide	New England Biolabs	97539
Zestaw prawdziwych jądrowych czynników transkrypcyjnych	BioLegend	424401
TruStain FcX PLUS (anty-mysie CD16/32)	BioLegend	156604
Trypan Blue	VWR	97063-702
Zestaw do naprawy Zombie Aqua BioLegend		423102