Artykuł metodologiczny

Charakterystyka gojenia się ran nabłonkowych in vivo przy użyciu parzydełkowego organizmu modelowego Clytia hemisphaerica

DOI:

10.3791/65081

⸱

10 lutego 2023

 ,  , 
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, The University of Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje metodę tworzenia ran w nabłonku żywej Clytia hemisphaerica medusa i obrazowania gojenia ran w wysokiej rozdzielczości in vivo. Dodatkowo przedstawiono technikę wprowadzania barwników i leków w celu zakłócenia procesów sygnalizacyjnych w komórkach nabłonka i macierzy zewnątrzkomórkowej podczas gojenia się ran.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie organy zwierzęce, od skóry przez oczy po jelita, pokryte są arkuszami komórek nabłonkowych, które pozwalają im utrzymać homeostazę, jednocześnie chroniąc je przed infekcją. Nic więc dziwnego, że zdolność do naprawy ran nabłonkowych ma kluczowe znaczenie dla wszystkich metazoanów. Gojenie się ran nabłonkowych u kręgowców obejmuje nakładające się procesy, w tym reakcje zapalne, unaczynienie i reepitelializację. Regulacja tych procesów obejmuje złożone interakcje między komórkami nabłonkowymi, sąsiednimi komórkami i macierzą zewnątrzkomórkową (ECM); ECM zawiera białka strukturalne, białka regulatorowe i aktywne małe cząsteczki. Ta złożoność, w połączeniu z faktem, że większość zwierząt ma nieprzezroczyste tkanki i niedostępne ECM, sprawia, że gojenie się ran jest trudne do zbadania u żywych zwierząt. Wiele prac nad gojeniem się ran nabłonkowych wykonuje się zatem w systemach hodowli tkankowych, w których pojedynczy typ komórek nabłonkowych jest platerowany jako monowarstwa na sztucznej matrycy. Clytia hemisphaerica (Clytia) stanowi unikalne i ekscytujące uzupełnienie tych badań, umożliwiając badanie gojenia się ran nabłonkowych u nienaruszonego zwierzęcia z autentycznym ECM. Nabłonek ektodermalny Clytia jest pojedynczą warstwą dużych płaskonabłonkowych komórek nabłonkowych, umożliwiającą obrazowanie w wysokiej rozdzielczości przy użyciu mikroskopii różnicowego kontrastu zakłócającego (DIC) u żywych zwierząt. Brak migrujących fibroblastów, naczyń krwionośnych lub reakcji zapalnych umożliwia analizę krytycznych zdarzeń w reepitelializacji in vivo. Można analizować gojenie się różnego rodzaju ran, w tym mikroran jednokomórkowych, małych i dużych ran nabłonkowych oraz ran uszkadzających błonę podstawną. W tym systemie można zaobserwować tworzenie się blaszek, kurczenie się sznurka torebki, rozciąganie komórek i zbiorową migrację komórek. Ponadto za pośrednictwem ECM można wprowadzać środki farmakologiczne w celu modyfikowania interakcji komórka:ECM i procesów komórkowych in vivo. Praca ta pokazuje metody tworzenia ran u żywej Clytia, rejestrowania filmów gojenia i badania mechanizmów gojenia poprzez mikrowstrzykiwanie odczynników do ECM.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arkusze komórek nabłonkowych pokrywają zewnętrzną powierzchnię wszystkich metazoanów, wyściełają organy wewnętrzne i dzielą ciało zwierzęcia na odrębne przedziały. Nabłonek oddziela również ciało wewnętrzne od środowiska zewnętrznego i chroni je przed uszkodzeniami i infekcjami. W związku z tym pojawienie się warstw nabłonkowych było istotną częścią ewolucji zwierząt wielokomórkowych, a warstwy nabłonkowe są widoczne u wszystkich zwierząt, od kręgowców po najbardziej podstawowe metazoany1. Nabłonek niektórych narządów jest pojedynczą warstwą, na przykład w workach powietrznych płuc, naczyniach krwionośnych i jelitach2, a także w naskórku bezkręgowców, takich jak planaria i parzydełkowce3. W innych tkankach, takich jak skin4 i cornea5 kręgowców, nabłonek jest warstwowy, co oznacza, że istnieje wiele warstw komórek nabłonka2. We wszystkich przypadkach najbardziej podstawowa warstwa nabłonkowa jest przymocowana do błony podstawnej, arkusza białkowego, który tworzy wyspecjalizowany region macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)6,7,8.

Naruszenia w nabłonku muszą być szybko naprawione, aby odtworzyć ciągłą warstwę nabłonka. Uszkodzenie nabłonka następuje podczas naturalnych procesów, takich jak złuszczanie się komórek nabłonka w jelitach,9,10 oraz w wyniku zapalenia lub urazu fizycznego. Kiedy pojedyncza komórka nabłonkowa jest uszkodzona, musi albo sama się naprawić, albo zostać wyeliminowana, aby umożliwić otaczającym komórkom przyczepienie się do siebie i zamknięcie otworu11,12. W ranach większych niż rozmiar pojedynczej komórki komórki nabłonkowe muszą się poruszać, aby dotrzeć do siebie i naprawić arkusz13. Można to osiągnąć poprzez rozprzestrzenianie się komórek, jeśli przerwy są małe lub mogą wymagać migracji komórek nabłonka z brzegów rany w celu zamknięcia szczeliny rany; Ten ostatni proces nazywa się reepitelializacją14,15. W tkankach embrionalnych komórki nabłonkowe rozprzestrzeniają się i migrują, aby zamknąć rany lub są przeciągane przez szczelinę przez skurcz aktomiozyny, które tworzą się między komórkami na brzegu rany, w mechanizmie przypominającym sznurek torebkowy16. W wielu dorosłych tkankach reepitelializacja polega na migracji spójnych arkuszy komórkowych, w których komórki utrzymują swoje połączenia z sąsiednimi komórkami14,17,18. W innych tkankach połączenia komórka:komórka są rozmontowywane, a komórki nabłonkowe zachowują się bardziej jak komórki mezenchymalne, poruszając się w skoordynowany, ale niezależny sposób do obszaru rany podczas reepitelializacji14,19,20,21.

Ruchy komórek nabłonkowych są regulowane przez złożone interakcje między migrującymi komórkami oraz między komórkami a ECM. Chociaż istnieje ogromna ilość literatury eksperymentalnej poświęconej mechanizmom aktywacji ran komórek nabłonka i późniejszej migracji, wiele wciąż pozostaje do odkrycia. Na przykład początkowy sygnał, który aktywuje komórki nabłonka do migracji w odpowiedzi na ranę, nie został ostatecznie zidentyfikowany22, ani nie jest w pełni zrozumiałe, w jaki sposób aktyna jest ponownie wykorzystywana do tworzenia lamellipodia po stronie komórek nabłonka znajdujących się najbliżej rany22,23,24,25,26,27. Zbiorcza migracja komórek wymaga, aby informacje z komórek w miejscu rany były udostępniane komórkom znajdującym się dalej od rany, a ścieżka komunikacji jest nadal niejasna28. Połączenia komórka:komórka i załączniki komórka:ECM muszą zostać zdemontowane i zreformowane, ponieważ komórki w arkuszu zmieniają swoje rozmieszczenie, ale regulacja tego procesu jest słabo zrozumiała14,29. Postęp w tych i innych powiązanych kwestiach jest ważny nie tylko ze względu na podstawowy problem biologiczny, ale także ze względu na kliniczne znaczenie prawidłowego gojenia się ran. Choroby, które upośledzają zdolność komórek nabłonka do prawidłowej migracji, skutkują przewlekłymi ranami; Przykładem jest choroba genetyczna pęcherzowego oddzielania się naskórka, w której geny zaangażowane w przyłączanie się komórek nabłonka do ECM są zmutowane, co powoduje kruchość skóry, która łuszczy się i tworzy pęcherze. Reepitelializacja jest również zagrożona w naturalnie starzejących się tkankach30,31. Lepsze zrozumienie jest zatem niezbędne do opracowania interwencji mających na celu poprawę wyników gojenia się ran.

Migracja komórek nabłonkowych w procesie gojenia ran została zbadana przy użyciu zarówno metod in vitro, jak i organizmów modelowych. Większość badań nad gojeniem się ran i mechanizmami migracji komórek przeprowadzono w hodowli tkankowej, w której monowarstwy pojedynczego typu komórek nabłonkowych są hodowane na podłożu zastępującym ECM. Monowarstwy komórek są albo drapane, albo hodowane za pomocą szablonów, aby utworzyć przerwy o określonych kształtach i rozmiarach, a następnie obserwowane32,33,34. Model in vitro pozwala na idealną wizualizację zachowania komórek, a także na zmianę właściwości substratu, wystawienie komórek na działanie leków oraz czynników abiotycznych i biotycznych oraz na transfekcję komórek z konstruktami, które wyrażają lub tłumią różne interesujące geny. Jednak to redukcjonistyczne podejście może nie uchwycić niektórych ważnych parametrów związanych z zachowaniem komórek nabłonkowych w kontekście in vivo, w tym komunikacji między różnymi typami komórek i zdarzeń sygnalizacyjnych, które występują w klasie ECM11. Modele in vivo zapewniają autentyczny kontekst rany, z wieloma typami komórek, nakładającymi się szlakami sygnałowymi i złożonym ECM35. Jednym z takich modeli do badań nad gojeniem się ran jest mouse19, w którym ostatnie osiągnięcia pozwoliły naukowcom obserwować komórki naskórka podczas gojenia się ran pełnej grubości u żywych zwierząt36. Mysz i inne systemy in vivo stanowią jednak wyzwanie dla badań nad ponownym nabłonkowaniem. Po pierwsze, wielką zaletą obserwacji zachowania komórek w naturalnym kontekście jest złożoność czasowo nakładających się na siebie zdarzeń, które zachodzą podczas gojenia się ran kręgowców, w tym krzepnięcia krwi, rekrutacji komórek odpornościowych i stanu zapalnego, rekrutacji fibroblastów i dedyferencjacji komórek, rewaskularyzacji i przebudowy ECM. Ponadto nieprzezroczyste tkanki utrudniają obrazowanie. Larwy Drosophila i systemy naskórka danio pręgowanego37,38 przezwyciężyły niektóre z tych trudności ze względu na ich względną prostotę39.

Nasze laboratorium niedawno wprowadziło nowy model do badania gojenia się ran nabłonkowych: meduza (meduza) forma hydrozoan cnidarian Clytia hemisphaerica (Clytia)40. Clytia jest wyłaniającym się organizmem modelowym z w pełni zsekwencjonowanym i opisanym genomem41, transkryptomem pojedynczej komórki RNAseq class42 oraz protokołami modyfikacji genomu (mutageneza i transgeneza)43,44,45. Parzydełkowców są jedną z najstarszych istniejących linii, które mają warstwy nabłonkowe, więc zrozumienie gojenia się ran parzydełkowców daje wgląd w ścieżki przodków, które zapewniały integralność nabłonka. Dla tych ścieżek, które zostały zachowane w całym drzewie życia, Clytia oferuje ekscytujący nowy system do badania dynamiki komórek nabłonkowych i funkcjonalnej regulacji gojenia się ran in vivo.

Nabłonek pokrywający górną powierzchnię Clytia medusa (exumbrella) to monowarstwa przezroczystych, płaskonabłonkowych komórek nabłonkowych o szerokości około 50 μm i grubości 1-2 μm (Rysunek 1). Są one podłączone do ECM zwanego mezogleą - "galaretką" meduzy. Mezoglea jest składowo podobna do ECM występującego u innych zwierząt46,47,48 w tym kręgowce, ma błonę podstawną40 i jest całkowicie przezroczysta. Warstwa nabłonkowa w Clytia medusa może być łatwo zarysowana lub zraniona (patrz poniżej). Prostota i przezroczystość nabłonka i ECM pozwala na obrazowanie komórek i ich ruchów w wysokiej rozdzielczości podczas gojenia. Ostatnio Kamran i wsp. szczegółowo scharakteryzowali gojenie się małych ran w nabłonku Clytia40. Wykazano, że gojenie u Clytia następuje poprzez pełzanie po komórkach oparte na blamelipodiach, rozprzestrzenianie się komórek i zbiorową migrację komórek, a także zamykanie sznurka torebki, co jest bardziej typowe dla systemów embrionalnych (chociaż wcześniej obserwowano w strukturach dorosłych zwierząt, takich jak rogówka49). Gojenie się ran Clytia jest niezwykle szybkie, co zaobserwowano w innych systemach, które nie wykazują reakcji zapalnej40,50. Gojenie w exumbrella Clytia jest całkowicie zależne od ruchów istniejących komórek nabłonka - żadne komórki nie namnażają się ani nie migrują przez ECM do miejsca rany (film uzupełniający 1). Wszystkie te odkrycia sugerują, że Clytia jest użytecznym systemem modelowym do badania gojenia się ran nabłonkowych. Rzeczywiście, łatwość obrazowania komórek nabłonkowych w Clytia podczas gojenia się ran doprowadziła do odkrycia, że blaszki komórek nabłonka rozciągają się i rozprzestrzeniają na obszarach odsłoniętego ECM, o ile istnieje nienaruszona błona podstawna; Jeśli błona podstawna jest uszkodzona, gojenie nabłonka przełącza się na mechanizm sznurka torebkowego40. Była to pierwsza demonstracja mechanizmu leżącego u podstaw decyzji o zamknięciu za pomocą pełzania opartego na lamellipodiach w porównaniu z zamknięciem sznurka torebki, podkreślając znaczenie określonych interakcji komórka:ECM w leczeniu i obserwacji komórek w ich naturalnym kontekście.

Poniżej opisane są protokoły tworzenia i obrazowania mikroran jednokomórkowych, małych ran, które zamykają się głównie przez rozprzestrzenianie się komórek, oraz dużych ran, które wymagają zbiorowej migracji komórek do zamknięcia. Ponadto opisano protokół wprowadzania małych cząsteczek do ECM i komórek nabłonkowych, co pozwala na eksperymentalne zakłócenia przypuszczalnych szlaków regulacyjnych gojenia się ran.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kultura zwierząt

  1. Utrzymuj kolonie polipów Clytia na szkiełkach mikroskopowych i meduzy w sztucznej wodzie morskiej (ASW) w temperaturze 18 °C w systemie danio pręgowanego, z 2 litrowymi zbiornikami na danio pręgowany dla kolonii polipów i wykonanymi na zamówienie 5 litrowymi zbiornikami pseudo-kreisel dla meduz (rysunek uzupełniający 1)51. ASW składa się z 4% Instant Ocean w dejonizowanym (DI) H2O.
  2. Codziennie karm zwierzęta 2-3-dniową artemią zgodnie z opisem51.
    UWAGA: Obrazowanie gojenia się ran jest łatwiejsze, jeśli zwierzęta nie były ostatnio karmione, ponieważ mniej zanieczyszczeń jest uwalnianych z jelit do pola widzenia.
  3. W razie potrzeby zbierz młode meduzy z założonych kolonii polipów, umieszczając je w 2-litrowej zlewce wypełnionej 1 litrem ASW na noc. Używaj 2-3-tygodniowych samic meduz do wszystkich eksperymentów z gojeniem ran. Rozmnażanie Clytia zostało szczegółowo opisane w innym miejscu51.

2. Ranienie

  1. Tworzenie mikroran wewnątrz i między komórkami (20-500μm2)
    1. Utwórz zmodyfikowaną pipetę transferową, przecinając końcówkę nożyczkami, aby uzyskać większy otwór (średnica 0,5-0,7 cm).
      UWAGA: Otwór w pipecie powinien być wystarczająco szeroki, aby uniknąć uszkodzenia zwierzęcia.
    2. Używając zmodyfikowanej pipety do przenoszenia, umieść meduzę na szkiełku depresyjnym z parasolem meduzy skierowanym do góry, z wystarczającą ilością ASW, aby przykryć zwierzę.
    3. Natychmiast nałóż szkiełko nakrywkowe na zwierzę i zdjęcie (opis obrazowania znajduje się poniżej). Szkiełko nakrywkowe ściska mezogleę, a odbicie ściśniętej tkanki wytwarza siłę, która lekko odpycha komórki52. Natychmiast pojawia się to jako przerwy między każdą komórką i uszkodzenia w niektórych komórkach (Rysunek 1B,B', Rysunek 2, oraz Rysunek 3A-C).
  2. Tworzenie małych ran nabłonkowych (0,02-0,125 mm2)
    1. Używając zmodyfikowanej pipety transferowej (jak powyżej), umieść meduzę na szkiełku depresyjnym z parasolem medusa skierowanym do góry.
    2. Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl delikatnie podrapać powierzchnię meduzy. Delikatne drapanie może również powodować rozdarcia w błonie podstawnej, które są łatwo widoczne22. Przykryj zwierzę szkiełkiem nakrywkowym w celu obrazowania. Alternatywnie, umieszczenie szkiełka nakrywkowego jest czasami wystarczające, aby utworzyć małe rany nabłonkowe nawet bez zadrapań (Rysunek 1C,C', Rysunek 2, oraz Rysunek 3A-C).
      UWAGA: Nie naciskaj podczas drapania powierzchni meduzy, ponieważ uszkadza to ECM i tworzy nieregularną powierzchnię - komórki nabłonkowe migrujące na nieregularnej powierzchni są trudniejsze do utrzymania ostrości.
  3. Tworzenie dużych ran nabłonkowych (0,5-0,9 mm2)
    1. Wykonać igłę do mikroiniekcji za pomocą ściągacza do mikropipet i szklanej rurki kapilarnej (krok 5.2). Umieścić pustą igłę do mikroiniekcji w uchwycie mikroiniektora przymocowanym do mikromanipulatora. Odetnij końcówkę igły tak, aby otwór wynosił około 20-40 μm.
      UWAGA: Nacięte igły do dużych ran nabłonkowych mogą być przechowywane i ponownie używane w celu zwiększenia spójności między eksperymentami.
    2. Ustaw ciśnienie trzymania na mikrowtryskiwaczu na zero i ustaw ciśnienie wyrzutu na około 20 PSI. Ustaw mikrowtryskiwacz tak, aby dostarczał impuls powietrza przez 2 s.
      UWAGA: Może być konieczne dostosowanie ciśnienia wyrzutu w zależności od średnicy otworu igły (tj. mniejsze końcówki będą używać wyższego ciśnienia, podczas gdy większe końcówki będą używać niższego ciśnienia).
    3. Umieść meduzę z parasolem skierowanym do góry na zjeżdżalni depresyjnej na stoliku lunety sekcyjnej, z wystarczającą ilością ASW, aby pokryć zwierzę. Za pomocą mikromanipulatora wyreguluj końcówkę igły do mikroiniekcji tak, aby znajdowała się tuż nad wodą. Aby to zrobić, ostrożnie zanurz końcówkę w wodzie (woda może dostać się do końcówki pipety), a następnie schuj ją tak, aby znalazła się blisko powierzchni nabłonka meduzy.
      UWAGA: Końcówka powinna być umieszczona nad jedną ćwiartką meduzy. Kanały promieniste meduzy dzielą dzwon meduzy na cztery wyraźne ćwiartki. Celowanie w kwadrant spowoduje czystsze obrazowanie, ponieważ gonady i kanały promieniowe są wyłączone z obszaru rany.
    4. Pulsuj powietrzem, naciskając start na wtryskiwaczu. Powtórz impuls w tym samym miejscu dwa do czterech razy, w zależności od szerokości końcówki. Większe końcówki wymagają mniejszej liczby impulsów.
      UWAGA: Wgłębienie w wodzie/meduzie spowodowane pulsem powietrza powinno być widoczne.
    5. Przykryj ranne zwierzę szkiełkiem nakrywkowym do obrazowania dużych ran (Rysunek 1D,D').
    6. Postępuj zgodnie z poniższymi krokami (sekcja 3), aby zobrazować gojenie się ran nabłonkowych.

Diagram anatomii meduzy i analiza struktury komórkowej z mikroskopowymi obrazami zmian komórkowych.
Rysunek 1: Nienaruszona i uszkodzona warstwa nabłonka exumbrella u Clytia medusa. (A) Rysunek przedstawiający ciało Clytia medusa. (A') Nienaruszony nabłonek wyszypułkowy meduzy widziany z góry. (B) Karykatura jednokomórkowych mikroran (czerwone postrzępione kształty) z komórkami nabłonkowymi w kolorze niebieskim. (B') Mikrorany jednokomórkowe. (C) Karykatura małej rany nabłonkowej (czerwono postrzępiony kształt). (C') Mała rana nabłonkowa. (D) Karykatura dużej rany nabłonkowej (czerwono postrzępiony kształt). (D') Duża rana nabłonkowa. Wszystkie obrazy uzyskano za pomocą mikroskopii DIC. Podziałka w (A'-C'): 50 μm. Podziałka w (D'): 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Gojenie się ran nabłonka zewnętrznego, obraz SEM, obecność ECM, aktywność lamellipodiów, naprawa komórkowa.
Rysunek 2: Rany o różnych rozmiarach i uszkodzona błona podstawna. Pokazana jest typowa mała rana nabłonkowa wytrzeszcza, z etykietami wskazującymi na blaszki, które tworzą się z komórek brzeżnych. Ponadto widoczne są mikrorany w obrębie i między komórkami nabłonka. Zwróć uwagę na małe pęknięcie błony podstawnej w górnej części rany. Film 4 pokazuje gojenie się tej rany. Podziałka skali: 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Obrazowanie gojenia się ran nabłonkowych

  1. Upewnij się, że mikroskop został ustawiony pod kątem oświetlenia Köhlera 53 i że został prawidłowo skonfigurowany do mikroskopii z kontrastem różnicowym zakłócającym (DIC)54. Komórki nabłonkowe są prawie niewidoczne przy użyciu standardowej optyki (Rysunek 3D, E).
  2. Dostosuj ostrość do parasola. Chociaż jest to cienka warstwa, sześciokątne komórki powinny być przezroczyste.
    UWAGA: Parasol i subparasol są oddzielone grubą mezogleą, która jest wsparta na pionowych włóknach. Komórki subparasolowe znajdują się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej co kanały promieniowe. Jeśli początkowo skupisz się na warstwie subparasolowej, powoli dostosuj ostrość przez mezogleę i włókna pionowe, aż znajdziesz wyjęty parasol.
  3. Ręcznie zidentyfikuj ranę do obrazu. W przypadku dużych ran użyj obiektywu 10x. W przypadku mniejszych ran i ran jednokomórkowych użyj obiektywu 20x.
  4. Uruchom program, który zbiera obrazy w postaci filmu w czasie rzeczywistym lub zbiera serię obrazów w regularnych odstępach czasu. Monitoruj postępy, aby upewnić się, że obszar rany nie znika z pola widzenia i że komórki zainteresowania pozostają ostre.
    1. Rany jednokomórkowe zamykają się w ciągu minuty, dlatego wyobraź sobie ich zamknięcie za pomocą filmu.
    2. Aby uchwycić szczegóły dynamiki komórek w przypadku małych ran, zbieraj obrazy mniej więcej co 10 s. Zamykanie małych ran trwa 20-50 minut, w zależności od wielkości.
    3. Nie należy obrazować nieuszczelnionych szkiełek przez okres dłuższy niż 45 minut, ponieważ parowanie wody ze szkiełka z czasem prowadzi do śmierci zwierzęcia i pęknięcia komórek.
    4. W celu dłuższej obserwacji uszczelnij szkiełko nakrywkowe wazeliną, aby zmniejszyć parowanie.
      UWAGA: Niektóre meduzy mogą pulsować na szkiełku, co zakłóca obrazowanie. W tym przypadku umieszczanie zwierząt w rozcieńczeniu 1:10 1% metanosulfonianu etylu 3-aminobenzoesanu (Trikainy), dostosowanego do pH 7,5, w ASW służy jako skuteczny środek znieczulający i nie ma widocznego wpływu na gojenie w ciągu 1 godziny. Jednak zwierzęta umrą, jeśli zostaną pozostawione na kilka godzin w Tricaine.

Przygotowanie i obserwacja preparatów mikroskopowych; Obejmuje obrazy mikroskopowe i techniki obsługi szkiełek.
Rysunek 3: Tworzenie małej rany w nabłonku zewnętrznym. (A) Delikatne drapanie parasola za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl w celu utworzenia małej rany nabłonkowej. (B) Umieszczenie szkiełka nakrywkowego jest czasami wystarczające do powstania małych ran nabłonkowych. (C) Meduza zamontowana na zasuwni depresyjnej. (D) Obraz małej rany nabłonkowej bez optyki DIC i (E) z optyką DIC. Podziałka skali: 50 μm Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Analiza

  1. Przygotowanie plików graficznych
    UWAGA: Aby przetworzyć pliki obrazów, użyj FIJI/ImageJ ze zaktualizowanymi wtyczkami BioFormat.
    1. Ustaw skalę na prawidłowy stosunek pikseli na mikron przed zarejestrowaniem stosu obrazów; Analizuj > ustaw skalę. Jest to niezbędne do wyodrębnienia rzeczywistych pomiarów wielkości w dalszych analizach.
    2. Często zwierzę lekko dryfuje na szkiełku mikroskopowym, dlatego, aby wyeliminować dryf w filmach, zarejestruj obrazy za pomocą wtyczki FIJI liniowego wyrównania stosu z SIFT. Wtyczki > rejestracji > liniowego wyrównywania stosu za pomocą SIFT.
    3. Zapisz zarejestrowany stos jako plik .avi. Plik > Zapisz jako > AVI... W wyskakującym okienku ustaw liczbę klatek na sekundę (animowane postacie są tutaj ustawione na 10 kl./s) i kliknij OK. Użyj tych danych wyjściowych, aby przeprowadzić analizę gojenia się ran.
  2. Analiza obszaru rany
    1. Używając narzędzia lasso w FIJI/ImageJ, obrysuj ranę, śledząc krawędzie komórek. Zmierz obszar rany, który został właśnie obrysowany, za pomocą Command+M lub CTRL+M.
    2. Powtarzaj pomiar obszaru rany co 10 klatek. Pomiary z FIJI/ImageJ można następnie wykreślić za pomocą Prism 9 (Rysunek 4).

Analiza migracji komórek; Obraz testu gojenia się ran, wykresy pokazują obszar rany w funkcji zmniejszenia czasu.
Rysunek 4: Analiza obszaru rany w małych ranach nabłonkowych. (A) Przykład gojenia się małej rany nabłonkowej w ciągu 10 min. (B) Przykład gojenia się innej rany nabłonkowej w ciągu 21 min. Fioletowe kontury w A,B są porównywalne z pomiarami obszarów ran przy użyciu narzędzia lasso w FIJI/ImageJ. (C) Znormalizowane zmniejszenie powierzchni rany w czasie w A. (D) Znormalizowane zmniejszenie powierzchni rany w czasie w B. (E) Średnie zmniejszenie powierzchni rany w czasie dla 14 małych ran. n = 14. Słupki błędów wyśrodkowane wokół średniej ± SEM. Słupki skali: 50 μm Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Zastrzyki Mezogleal

  1. Tworzenie naczynia iniekcyjnego
    1. Przygotować polidimetylosiloksan (PDMS), łącząc bazę PDMS i utwardzacz w proporcji 10 części bazy na 1 część utwardzacza wagowo. Mieszaj energicznie, aby w pełni wymieszać bazę i utwardzacz.
    2. Aby usunąć pęcherzyki, umieść mieszaninę w komorze próżniowej na 15 minut. Wlej mieszaninę do szalki Petriego o średnicy 60 mm z nakrętkami probówek do mikrowirówek, aby utrzymać formę na miejscu. Natychmiast umieść formę na nakrętkach tubek pod kątem 45° i przyklej taśmę. Forma składa się z trzech ułożonych w stos, przesuniętych szkiełek szklanych sklejonych ze sobą, aby utworzyć grzbiety w końcowym naczyniu wtryskowym.
    3. Umieść całe naczynie, formę i mieszaninę w piekarniku w temperaturze 60 °C na 2 godziny, aby utwardzić elastomer. Wyjmij formę, aby uzyskać gotowe naczynie do wstrzykiwania.
  2. Wyciąganie mikropipet
    1. Za pomocą ściągacza do mikroelektrod zaprojektuj program ciągnięcia. Użyj jednoetapowego programu z dużą prędkością. Ciepło jest w przybliżeniu zgodne z wynikiem testu RAMP szkła55,56. Sprawdzić, czy powstałe mikropipety mają długie, stałe stożki.
      UWAGA: Używaj cienkościennych szklanych kapilar borokrzemianowych o średnicy zewnętrznej 1.0 mm, średnicy wewnętrznej 0.75 mm i długości 10 cm.
  3. Wstrzykiwanie barwników i leków
    1. Wykonać igłę do mikroiniekcji (jak wyżej).
    2. Napełnić igłę do mikroiniekcji za pomocą długiej końcówki pipety nadmiarem barwnika lub leku do wstrzykiwań do medusa.
      UWAGA: W przypadku Clytia dimetylosulfotlenek (DMSO) należy przechowywać w rozcieńczeniu <1:100 z ASW, ponieważ wyższe stężenia DMSO utrudniają gojenie się ran. W przypadku wstrzykiwania klarownego roztworu można dodać roztwór Fast Green FCF (rozcieńczenie 1:100 0,1% Fast Green FCF w ASW) w celu wizualizacji wstrzykniętej cieczy.
    3. Używając zmodyfikowanej pipety transferowej, jak powyżej, umieść meduzę z subparasolem skierowanym do góry w naczyniu do wstrzykiwań PDMS z wystarczającą ilością ASW, aby przykryć zwierzę (Rysunek 5C). Umieść naczynie na stoliku z lunetą sekcyjną.
      UWAGA: Ograniczenie nadmiaru ASW zapobiega pływaniu meduzy w naczyniu i pozwala na bardziej udane wstrzyknięcia.
    4. Skoncentruj się na końcówce igły do mikroiniekcji i wsuń ją do wody w pobliżu meduzy. Za pomocą mikromanipulatora wciśnij igłę w naczynie, aż się wygnie i złamie. Ten otwór końcówki wynosi około 10-20 μm.
      UWAGA: Ta igła może być używana wielokrotnie do tych samych zastrzyków z barwnikiem/lekiem tego samego dnia. Zaleca się stosowanie świeżej końcówki każdego dnia i do oddzielnych barwników/leków.
    5. Za pomocą mikromanipulatora włóż końcówkę igły przez subparasol do mezoglei, nie nakłuwając parasola.
      UWAGA: Zauważalne będzie marszczenie/fałdowanie nabłonka. Po wprowadzeniu igły do meduzy, bigowanie/fałdowanie ustaje.
    6. Na mikrowtryskiwaczu ustaw ciśnienie trzymania na zero, a ciśnienie wyrzutu na ≤20 PSI. Wstrzyknąć do jednej lub dwóch ćwiartek, wypełniając każdą plamką barwnika lub leku mniej więcej 1/4 powierzchni tego kwadrantu.
      UWAGA: W zależności od wielkości meduzy, większe lub mniejsze objętości są odpowiednie w pojedynczych miejscach wstrzyknięcia. Przepełnienie meduzy powoduje ekstremalne uszkodzenie nabłonka, a nawet śmierć zwierzęcia.
    7. W zależności od tego, jaki barwnik lub lek jest wstrzykiwany, zwierzęta umieszcza się w zlewce ze świeżym ASW, aby umożliwić dyfuzję i inkubację barwnika lub leku.
    8. W celu obrazowania zamontuj meduzę na szkiełku depresyjnym za pomocą zmodyfikowanej pipety transferowej, ustawiając zwierzę tak, aby parasol był skierowany do góry (Rysunek 5). Na tym etapie zwierzęta mogą zostać zranione, aby przetestować działanie wstrzykniętego odczynnika.

Konfiguracja mikroskopu preparacyjnego do wstrzyknięcia meduzy i badania; Zawiera mikromanipulator, igły.
Rysunek 5: Konfiguracja iniekcji do wprowadzania barwników lub leków do ECM. (A) Konfiguracja wtrysku. (B) Zbliżenie zestawu do wstrzykiwania pokazujące ułożenie igły do mikroiniekcji (kąt około 45° w stosunku do zwierzęcia w naczyniu). (C) Zbliżenie silikonowego naczynia iniekcyjnego z meduzą w niewielkiej ilości ASW do wstrzykiwań. (D) Igła do mikroiniekcji załadowana Fast Green FCF wchodząca do mezoglei meduzy przez podparasol. (E) Po wstrzyknięciu Fast Green FCF do zamontowanej meduzy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z powyższymi protokołami, mikrorany jednokomórkowe, małe rany i duże rany zostały zobrazowane. Zarejestrowane stosy plików graficznych zostały zapisane jako pliki .avi.

W filmie 1 można zauważyć, że mikrorany zamykają się między komórkami i w ich obrębie (Rysunek 1 i Rysunek 2). Podczas zamykania obserwuje się małe blaszki, po których następuje skurcz i gojenie. Zanieczyszczenia są wykluczane i uwalniane do wody. Gojenie kończy się w ciągu minuty lub krócej.

W filmie 2 i 3, małe rany o różnych kształtach goją się poprzez tworzenie lamellipodiów, rozszerzanie kontaktów lamellipodial i rozprzestrzenianie się komórek na brzegu rany, jak wcześniej opisano40 (Rysunek 1 i Rysunek 2). Komórki znajdujące się na poziomach za komórkami brzeżnymi nie uczestniczą w gojeniu się ran tej wielkości, ani nie ma zbiorowej migracji komórek. Po szybkim i postępującym zamykaniu szczelin nabłonkowych następuje skurcz tkanki wzdłuż nowo utworzonego szwu rany40. Pokazano znormalizowane tempo gojenia się tych dwóch ran, wyrażone jako procent pierwotnego obszaru w czasie (Rysunek 4C,D). Chociaż istnieje pewna zmienność w dynamice zamykania ran, uśrednienie procentowego zamknięcia obszaru w czasie dla 14 ran o różnych kształtach w zakresie od 0,02 do 0,125 mm2 pozwala na ustalenie średniej krzywej gojenia się ran u zwierząt nieleczonych (Rysunek 4E).

Uszkodzenie błony podstawnej jest wyraźnie widoczne, gdy wystąpi (Rysunek 2). W filmie 4 komórki na brzegu małej rany, w której dochodzi do uszkodzenia błony podstawnej, rozprzestrzeniają się wokół uszkodzonego obszaru, a zamknięcie szczeliny kończy się skurczem sznurka torebki.

Jeśli tkanka jest odwodniona lub zbyt uszkodzona, aby ją naprawić, ruchy komórek mogą się zatrzymać, lub cały arkusz komórek może pęknąć (Film 5 i Film 6). Zwykle dzieje się to po długich okresach obrazowania (45 minut lub dłużej). Jeśli pękanie komórek nastąpi na wczesnym etapie obrazowania, próbka jest odrzucana.

Jak pokazano w filmie 7, duże rany goją się w kilku etapach. Po pierwsze, brzeg rany staje się gładki i regularny z powodu skurczów na brzegu, jak wcześniej informowano57. Następnie obserwuje się, jak lamellipodia tworzą się z komórek na brzegu rany, przy czym lamellipodia przesuwają się do przodu, aby zmaksymalizować kontakt z sąsiednimi lamellipodiami. Śledzenie jąder w komórkach na brzegu rany i kilka poziomów za komórkami brzeżnymi pokazuje, że duże luki zamykają się przez zbiorową migrację komórek40. Komórki nigdy się nie odłączają, ale poruszają się razem jako arkusz.

Wprowadzenie barwników i środków farmakologicznych może być potężnym narzędziem do analizowania mechanizmów biologicznych. Wiele substancji jest wykluczonych z Clytia (nie pokazano), prawdopodobnie z powodu warstwy śluzu, która pokrywa powierzchnię zwierzęcia. Jednak mikroiniekcja może być stosowana do bezpośredniego wprowadzania cząsteczek do ECM, zakłócając strukturę ECM lub zakłócając działania regulacyjne w ECM. Ponadto barwniki i inne cząsteczki są w stanie wniknąć do komórek nabłonka od strony podstawnej. Na przykład, Rysunek 6 pokazuje barwienie jądrowe za pomocą Hoechst, barwienie błony za pomocą FM1-43 oraz hamowanie tworzenia lamellipodiów przez cytochalazynę B po mikrowstrzyknięciu tych odczynników do ECM. Wprowadzenie tych cząsteczek do ECM i komórek nabłonka przed zranieniem pozwala na eksperymenty, które testują wpływ narzędzi farmakologicznych na proces gojenia.

Dynamika błony komórkowej; kontrast interferencyjny różnicowy, mikroskopia fluorescencyjna; Porównanie eksperymentalne.
Rysunek 6: Komórki nabłonkowe meduzy po mikroiniekcji barwników lub środków farmakologicznych. (A) Komórki nabłonkowe pokazane w górnym panelu 5 minut po wstrzyknięciu 20 μM Hoechst (jądra) i 50 μM FM1-43 (błony). (B,C) Gojenie się ran po wstrzyknięciu kontrolą 1:1,000 DMSO (B) lub 100 μM cytochalazyną B (C). Rany zostały założone 15 minut po wstrzyknięciu. Zdjęcia zostały wykonane 5 minut po zranieniu. Powstawanie lamellipodiów jest hamowane przez cytochalazynę B. Uważa się, że pozorne "włókna" często widoczne między komórkami w obszarze rany są wynikiem napięcia rozciągającego błonę podstawną - nie plamią się falloidyną (nie pokazano). Podziałka skali: 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Film 1: Film poklatkowy przedstawiający gojenie się mikroran jednokomórkowych. Czas, który upłynął: 20 s. Liczba klatek na sekundę: 10 kl./s. Podziałka skali: 50 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 2: Film poklatkowy przedstawiający gojenie się małej rany nabłonkowej. Czas, który upłynął: 9 min 54 s. Liczba klatek na sekundę: 10 kl./s. Podziałka skali: 50 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 3: Film poklatkowy przedstawiający gojenie się małej rany nabłonkowej. Ta rana jest większa i ma bardziej nieregularny kształt niż rana z filmu 2. Czas, który upłynął: 20 min 54 s. Liczba klatek na sekundę: 10 kl./s. Podziałka skali: 50 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 4: Film poklatkowy przedstawiający małą ranę i mikroranę gojącą się z pęknięciem błony podstawnej. Blaszki rozprzestrzeniają się wokół rozdarcia błony podstawnej, chociaż mogą przesuwać się nad resztą ECM. Gdy obszar rany z uszkodzeniem błony podstawnej zostanie otoczony, skurcz sznurka torebki ciągnie komórki nad tym obszarem. Czas, który upłynął: 19 min 4 s. Liczba klatek na sekundę: 10 kl./s. Podziałka skali: 50 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 5: Komórki umierające w małej ranie nabłonkowej. Śmierć komórki jest prawdopodobnie spowodowana odwodnieniem zwierzęcia. Czas, który upłynął: 4 min 24 s. Liczba klatek na sekundę: 10 kl./s. Podziałka skali: 100 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 6: Mała rana nabłonkowa nie może się całkowicie zagoić. Czas, który upłynął: 42 min 32 s. Liczba klatek na sekundę: 10 kl./s. Podziałka skali: 50 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 7: Gojenie się dużych ran nabłonkowych. Czas, który upłynął: 25 min 29 s. Liczba klatek na sekundę: 10 kl./s. Podziałka skali: 100 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Rysunek uzupełniający 1: Schematy wymiarów zbiorników Clytia. Wizualizacja 3D zbiorników Clytia wykonanych na zamówienie. (A) Widok z przodu i z tyłu. (B) Widok z boku. Wycięcie w elemencie pokazanym na zielono jest pokryte nylonową siatką. Woda dostaje się do zbiornika bezpośrednio nad siatką, omiata siatkę i tworzy prąd kołowy. Woda wydostaje się z systemu przez otwór w końcówce pokazany na niebiesko. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Film uzupełniający 1: Bezkomórkowa macierz zewnątrzkomórkowa w Clytia. Stos Z Clytia wykonany za pomocą mikroskopii konfokalnej. Stos początkowo skupia się na wydechu, a następnie skanuje co 10 μm przez ECM do płytki, endodermy i podparasola. Obrazy wykorzystujące DIC (po lewej) i barwienie jądrowe Hoechsta (po prawej) pokazują brak komórek w ECM. Podziałka skali: 100 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule przedstawiono metodologię obrazowania ran in vivo w Clytia, stosunkowo nowym modelowym organizmie bezkręgowców 40,43,58. Istnieje kilka czynników, które sprawiają, że system ten jest unikalnym i potężnym narzędziem badawczym, różniącym się od innych modeli używanych do badania gojenia się ran i ponownego nabłonkowania. Po pierwsze, nabłonek jednowarstwowy jest przymocowany do przezroczystego ECM, co przypomina testy hodowli tkankowej in vitro (ryc. 1, ryc. 2, ryc. 3, ryc. 4). Podobnie jak w testach in vitro, komórki można obrazować w wysokiej rozdzielczości. Jednak w przeciwieństwie do hodowli tkankowej, istnieje autentyczne środowisko komórkowe i ECM, dzięki czemu gojenie się ran można postrzegać w kontekście złożonych zdarzeń sygnalizacyjnych, które występują u żywego rannego zwierzęcia. Po drugie, Clytia nie ma reakcji zapalnych, migrujących fibroblastów, naczyń krwionośnych i krwi. Pozwala to na badanie procesu reepitelializacji in vivo przy braku nakładających się zdarzeń, które występują u bardziej złożonych dorosłych zwierząt podczas gojenia się ran59. Po trzecie, ECM jest bezkomórkowy (film uzupełniający 1) i duży, co umożliwia łatwy dostęp za pomocą igły do mikroiniekcji (Rysunek 5 i Rysunek 6). Korzystając z tego podejścia, naukowcy mogą przetestować wpływ odczynników farmakologicznych, które zaburzają strukturę ECM lub sygnalizację, na gojenie się ran in vivo. Odczynniki mogą być również wprowadzane do komórek nabłonkowych i można ocenić ich wpływ na gojenie się ran in vivo. Po czwarte, istnieją protokoły tworzenia mutantów i zwierząt transgenicznych w systemie Clytia 42,43,44,45. Gojenie się ran in vivo można zatem zaobserwować u zwierząt ze zwiększoną/zmniejszoną ekspresją genów będących przedmiotem zainteresowania.

W tej technice składa się kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, jak pokazano na rysunku 3, konieczne jest użycie mikroskopu, który jest prawidłowo skonfigurowany do mikroskopii DIC, ponieważ płaskie, przezroczyste komórki nabłonka są prawie niewidoczne przy użyciu standardowej mikroskopii świetlnej. Ważne jest również, aby rozwinąć umiejętność delikatnego ranienia zwierząt, tak aby nabłonek został uszkodzony bez żłobienia ECM. Podobnie delikatny dotyk jest konieczny w przypadku mikroiniekcji materiałów do ECM, ponieważ rozległe uszkodzenia zwierzęcia podczas wstrzykiwania mogą zagrozić późniejszej analizie gojenia się ran. Chociaż techniki te wymagają nauki, nawet początkujący studenci szybko opanowali je w laboratorium Malamy. Rzeczywiście, protokoły te zostały wykorzystane do zademonstrowania migracji komórek na studiach licencjackich na Uniwersytecie w Chicago.

Dla optymalnego obrazowania ważne jest, aby zwierzę się nie poruszało, a wybrany obszar rany nie wychodził poza pole widzenia. Jeśli zwierzęta pulsują, leczenie trikainą zgodnie z opisem jest bardzo skuteczne. W przypadku dryfowania często konieczna jest ręczna zmiana położenia próbki. Ruchy te można wyeliminować z końcowego filmu za pomocą funkcji rejestracji w FIJI/ImageJ.

Ograniczeniem tego systemu jest to, że nie jest możliwe stworzenie identycznych ran, ponieważ rany różnią się zarówno kształtem, jak i rozmiarem przy użyciu opisanych tutaj metod. W związku z tym określenie ilościowe dokładnego tempa zamykania się ran lub migracji komórek może być trudne. Markery pozycyjne, takie jak ziarna węgla, przyklejają się do odsłoniętego ECM u rannego zwierzęcia i mogą być używane do pomiaru szybkości zbiorowej migracji komórek w dużych ranach (nie pokazano). W przypadku analizy małych zamknięć ran, nawet przy zmiennym rozmiarze i kształcie rany, istnieje ograniczony zakres szybkości zamykania ran tej wielkości (ryc. 4). Możliwe jest zatem ilościowe wykrycie działania promotorycznych lub represyjnych odczynników farmakologicznych.

Chociaż praca ta opisuje charakterystykę gojenia się ran przy użyciu tylko mikroskopii DIC, te same podejścia można zastosować do obrazowania gojenia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej. Aby w tym pomóc, istnieją protokoły generowania transgenicznych zwierząt, w których różne białka komórkowe i zewnątrzkomórkowe są znakowane fluorescencyjnie. Równoczesne obrazowanie za pomocą DIC i fluorescencji, w połączeniu z zaburzeniami gojenia się ran za pomocą środków farmakologicznych lub zmutowanych linii, będzie skutecznym podejściem do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw procesu gojenia się ran w nabłonku.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

E.E.L.L. jest wspierany przez grant z National Science Foundation PRFB 2011010. Chcielibyśmy podziękować Tsuyoshi Momose i Evelyn Houliston za pomoc w założeniu naszych kolonii Clytia, Jean-Baptiste Reynier za zebranie obrazów gojenia się mikroran, Harry'emu Kyriazesowi za budowę pseudo-kreisel tanks oraz Elizabeth Baldo za utrzymanie siedliska Clytia. Rysunek 1B został utworzony za pomocą BioRender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
20500 Mikroskop ACE EKE Światłowodowe źródło światłaKramer Scientific Corporation
AxioCam 506 monoZEISS426557-0000-000-MA285
Rurki kapilarneWorld Precision InstrumentsTW1004
Cytochalazyna BAbcamab143482
Prowadnice depresyjneAmscopeBS-C12
DMR z opcjami DIC i fluorescencyjną lampą halogenowąLeica
3-aminobenzoesan etylu metanosulfonianSigmaAldrich E10521-10G
Fast Green FCFThermo ScientificA16520-06
FM1-43Biotium70022Wzbudzenie/emisja: 480/598 nm 
Hoechst 33342Thermo Scientific62249Wzbudzenie/emisja: 361/497 nm 
imageJKońcówki do
(0,5-10 μ L /2-20 μ L)Eppendorf930001007
MicromanipulatorWorld Precision Instruments3301R / M3301L
Szklana osłona mikroskopu (22X40-1,5)Fisherbrand12-544-BP
Szalka Petriego (60 mm x 15 mm)FisherbrandFB085713A
PicoNozzle v2World Precision Instruments5430-ALL
Ściągacz do pipetSutter Instrument CoP-97
Pneumatyczna pompa PicoPumpWorld Precision InstrumentsPV820
Odkurzacz z poliwęglanu, eksykatorBel-artF42025-0000
Prism 9GraphPad
STEMI Sv11 Luneta preparcyjnaZEISSSTEMI SV11
SYLGARD 184Dow Silicones1024001
Pipety transferoweFisherbrand13-711-7M
Z-Hab mini systemPentair
ZEN Oprogramowanie mikroskopoweZeiss
mikroładowarek NIH

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tyler, S. Epithelium-the primary building block for metazoan complexity. Integrative and Comparative Biology. 43 (1), 55-63 (2003).
  2. Kurn, H., Daly, D. T. Histology, Epithelial Cell. StatPearls. , (2022).
  3. Schempp, C., Emde, M., Wölfle, U. Dermatology in the Darwin anniversary. Part 1: Evolution of the integument. Journal of the German Society of Dermatology. 7 (9), 750-757 (2009).
  4. Lopez-Ojeda, W., Pandey, A., Alhajj, M., Oakley, A. M. Anatomy, Skin (Integument). StatPearls. , (2022).
  5. Bukowiecki, A., Hos, D., Cursiefen, C., Eming, S. A. Wound-healing studies in cornea and skin: parallels, differences and opportunities. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1257(2017).
  6. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  7. Hynes, R. O. The evolution of metazoan extracellular matrix. The Journal of Cell Biology. 196 (6), 671-679 (2012).
  8. Fidler, A. L., et al. Collagen IV and basement membrane at the evolutionary dawn of metazoan tissues. eLife. 6, 24176(2017).
  9. Bullen, T. F., et al. Characterization of epithelial cell shedding from human small intestine. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 86 (10), 1052-1063 (2006).
  10. Watson, A. J. M., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
  11. Sonnemann, K. J., Bement, W. M. Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 237-263 (2011).
  12. Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. Single cell wound repair. BioArchitecture. 1 (3), 114-121 (2011).
  13. Fenteany, G., Janmey, P. A., Stossel, T. P. Signaling pathways and cell mechanics involved in wound closure by epithelial cell sheets. Current Biology. 10 (14), 831-838 (2000).
  14. Pastar, I., et al. Epithelialization in wound healing: a comprehensive review. Advances in Wound Care. 3 (7), 445-464 (2014).
  15. Rousselle, P., Braye, F., Dayan, G. Re-epithelialization of adult skin wounds: Cellular mechanisms and therapeutic strategies. Advanced Drug Delivery Reviews. 146, 344-365 (2019).
  16. Bement, W. M., Forscher, P., Mooseker, M. S. A novel cytoskeletal structure involved in purse string wound closure and cell polarity maintenance. The Journal of Cell Biology. 121 (3), 565-578 (1993).
  17. Vedula, S. R. K., Ravasio, A., Lim, C. T., Ladoux, B. Collective Cell migration: a mechanistic perspective. Physiology. 28 (6), 370-379 (2013).
  18. Li, L., He, Y., Zhao, M., Jiang, J. Collective cell migration: Implications for wound healing and cancer invasion. Burns & Trauma. 1 (1), 21-26 (2015).
  19. Bornes, L., Windoffer, R., Leube, R. E., Morgner, J., van Rheenen, J. Scratch-induced partial skin wounds re-epithelialize by sheets of independently migrating keratinocytes. Life Science Alliance. 4 (1), 202000765(2021).
  20. Theveneau, E., Mayor, R. Collective cell migration of epithelial and mesenchymal cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (19), 3481-3492 (2013).
  21. Haensel, D., Dai, X. Epithelial-to-mesenchymal transition in cutaneous wound healing: where we are and where we are heading. Developmental Dynamics. 247 (3), 473-480 (2018).
  22. Cordeiro, J. V., Jacinto, A. The role of transcription-independent damage signals in the initiation of epithelial wound healing. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (4), 249-262 (2013).
  23. Abreu-Blanco, M. T., Watts, J. J., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. Cytoskeleton responses in wound repair. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (15), 2469-2483 (2012).
  24. Klarlund, J. K., Block, E. R. Free edges in epithelia as cues for motility. Cell Adhesion & Migration. 5 (2), 106-110 (2011).
  25. Enyedi, B., Niethammer, P. Mechanisms of epithelial wound detection. Trends in Cell Biology. 25 (7), 398-407 (2015).
  26. Niethammer, P. The early wound signals. Current Opinion in Genetics & Development. 40, 17-22 (2016).
  27. Jacinto, A., Martinez-Arias, A., Martin, P. Mechanisms of epithelial fusion and repair. Nature Cell Biology. 3 (5), 117-123 (2001).
  28. Mayor, R., Etienne-Manneville, S. The front and rear of collective cell migration. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 17 (2), 97-109 (2016).
  29. Gupta, S., Yap, A. S. How adherens junctions move cells during collective migration. Faculty Reviews. 10, 56(2021).
  30. Blair, M. J., Jones, J. D., Woessner, A. E., Quinn, K. P. Skin structure-function relationships and the wound healing response to intrinsic aging. Advances in Wound Care. 9 (3), 127-143 (2020).
  31. Falanga, V., et al. Chronic wounds. Nature Reviews. Disease Primers. 8 (1), 50(2022).
  32. Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  33. Jonkman, J. E. N., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
  34. Poujade, M., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (41), 15988-15993 (2007).
  35. Masson-Meyers, D. S., et al. Experimental models and methods for cutaneous wound healing assessment. International Journal of Experimental Pathology. 101 (1-2), 21-37 (2020).
  36. Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
  37. Tsai, C. -R., Wang, Y., Galko, M. J. Crawling wounded: molecular genetic insights into wound healing from Drosophila larvae. The International Journal of Developmental Biology. 62 (6-7-8), 479-489 (2018).
  38. Richardson, R., et al. Adult zebrafish as a model system for cutaneous wound-healing research. The Journal of Investigative Dermatology. 133 (6), 1655-1665 (2013).
  39. Erickson, J. R., Echeverri, K. Learning from regeneration research organisms: The circuitous road to scar free wound healing. Developmental Biology. 433 (2), 144-154 (2018).
  40. Kamran, Z., et al. In vivo imaging of epithelial wound healing in the cnidarian Clytia hemisphaerica demonstrates early evolution of purse string and cell crawling closure mechanisms. BMC Developmental Biology. 17 (1), 17(2017).
  41. Home. MARIMBA. , Available from: http://marimba.obs-vlfr.fr/home (2023).
  42. Chari, T., et al. Whole-animal multiplexed single-cell RNA-seq reveals transcriptional shifts across Clytia medusa cell types. Science Advances. 7 (48), (2021).
  43. Weissbourd, B., et al. A genetically tractable jellyfish model for systems and evolutionary neuroscience. Cell. 184 (24), 5854-5868 (2021).
  44. Momose, T., et al. High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion. Scientific Reports. 8 (1), 11734(2018).
  45. Houliston, E., Leclère, L., Munro, C., Copley, R. R., Momose, T. Past, present and future of Clytia hemisphaerica as a laboratory jellyfish. Current Topics in Developmental Biology. 147, 121-151 (2022).
  46. Schmid, V., et al. The extracellular matrix (mesoglea) of hydrozoan jellyfish and its ability to support cell adhesion and spreading. Hydrobiologia. 216 (1), 3-10 (1991).
  47. Day, R. M., Lenhoff, H. M. Hydra mesoglea: a model for investigating epithelial cell-basement membrane interactions. Science. 211 (4479), 291-294 (1981).
  48. Zhang, X., et al. The collagens of hydra provide insight into the evolution of metazoan extracellular matrices. The Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6792-6802 (2007).
  49. Danjo, Y., Gipson, I. K. Actin 'purse string' filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement. Journal of Cell Science. 111 (22), 3323-3332 (1998).
  50. Arenas Gómez, C. M., Sabin, K. Z., Echeverri, K. Wound healing across the animal kingdom: Crosstalk between the immune system and the extracellular matrix. Developmental Dynamics. 249 (7), 834-846 (2020).
  51. Lechable, M., et al. An improved whole life cycle culture protocol for the hydrozoan genetic model Clytia hemisphaerica. Biology Open. 9 (11), (2020).
  52. Casares, L., et al. Hydraulic fracture during epithelial stretching. Nature Materials. 14 (3), 343-351 (2015).
  53. Wayne, R. Chapter 4 - Bright-Field Microscopy. Light and Video Microscopy (Third Edition). , 95-116 (2019).
  54. Murphy, D. B., Davidson, M. W. Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging: Second Edition. , John Wiley and Sons. (2012).
  55. Micropipette Techniques for Electrophysiology. , Available from: https://www.sutter.com/micropipette/cookbook.html (2022).
  56. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller). Journal of Visualized Experiments. (20), e939(2008).
  57. Klarlund, J. K. Dual modes of motility at the leading edge of migrating epithelial cell sheets. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (39), 15799-15804 (2012).
  58. Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. Clytia hemisphaerica: a jellyfish cousin joins the laboratory. Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).
  59. Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: a cellular perspective. Physiological Reviews. 99 (1), 665-706 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

obrazowanie in vivotworzenie lamelipodi wskurcz typu sznurkakolektywna migracja kom rektechnika mikroiniekcjiuszkodzenie b ony podstawnejmikroskopia interferencyjna r nicowamacierz zewn trzkom rkowa

Powiązane artykuły