Artykuł metodologiczny

Generowanie myszy z nokautem specyficznych dla brązowego tłuszczu przy użyciu połączonego systemu Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 i jednoprzewodnikowego systemu RNA wirusa związanego z adenowirusem

DOI:

10.3791/65083

⸱

24 marca 2023

 ,  , 
1Section on Integrative Physiology and Metabolism, Research Division, Joslin Diabetes Center, Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole opisujemy procedury techniczne do generowania myszy z nokautem specyficznym dla brązowej tkanki tłuszczowej (BAT), wykorzystując połączony system Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 i systemu jednoprowadnicowego RNA (sgRNA) związanego z adenowirusem (AAV). Opisane etapy obejmują projektowanie sgRNA, przygotowanie cząstek AAV-sgRNA oraz mikroiniekcję AAV do płatów BAT.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Brązowa tkanka tłuszczowa (BAT) to magazyn tłuszczu wyspecjalizowany w rozpraszaniu energii, który może również służyć jako narząd endokrynny poprzez wydzielanie bioaktywnych cząsteczek. Stworzenie myszy z nokautem specyficznych dla BAT jest jednym z najpopularniejszych podejść do zrozumienia wkładu genu będącego przedmiotem zainteresowania w regulację energii za pośrednictwem BAT. Konwencjonalna strategia celowania w geny z wykorzystaniem systemu Cre-LoxP była głównym podejściem do generowania myszy z nokautem specyficznym tkankowo. Takie podejście jest jednak czasochłonne i żmudne. W tym miejscu opisujemy protokół szybkiego i skutecznego nokautu genu będącego przedmiotem zainteresowania w BAT przy użyciu połączonego systemu Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 i systemu jednoprzewodnikowego RNA (sgRNA) wirusa związanego z adenowirusem (AAV). BAT międzyłopatkowy znajduje się w głębokiej warstwie między mięśniami. W związku z tym BAT musi być narażony, aby można było precyzyjnie i bezpośrednio wstrzyknąć AAV do BAT w polu widzenia. Odpowiednie postępowanie chirurgiczne ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania uszkodzeniom nerwów współczulnych i naczyń, takich jak żyła Sultzera, która łączy się z BAT. Aby zminimalizować uszkodzenia tkanek, istnieje krytyczna potrzeba zrozumienia trójwymiarowego położenia anatomicznego BAT oraz umiejętności chirurgicznych wymaganych na etapach technicznych. Protokół ten podkreśla kluczowe procedury techniczne, w tym projektowanie sgRNA ukierunkowanych na gen będący przedmiotem zainteresowania, przygotowanie cząstek AAV-sgRNA oraz operację bezpośredniego mikrowstrzykiwania AAV do obu płatów BAT w celu wygenerowania myszy z nokautem specyficznych dla BAT, które można szeroko zastosować do badania biologicznych funkcji genów w BAT.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otyłość rośnie w znacznym tempie na całym świecie, prowadząc do szerokiego spektrum chorób metabolicznych1,2,3. Tkanka tłuszczowa jest kluczem do tych patologii. Dwa funkcjonalnie odrębne typy tkanki tłuszczowej, które istnieją, to biała tkanka tłuszczowa (WAT), która magazynuje nadmiar kalorii, oraz brązowa tkanka tłuszczowa (BAT) i związany z nią tłuszcz beżowo-brite, które rozpraszają energię do termogenezy. Chociaż BAT został uznany za funkcję rozpraszania energii, pełni również funkcje endokrynologiczne poprzez produkcję bioaktywnych cząsteczek, które regulują metabolizm w dystalnych narządach4,5. Liczne badania na gryzoniach wykazały, że zwiększenie ilości lub aktywności brązowego lub beżowego tłuszczu prowadzi do zwiększonego wydatku energetycznego i poprawy wrażliwości na insulinę. U ludzi osoby z wykrywalnym BAT mają znacznie mniejszą częstość występowania chorób kardiometabolicznych6. W związku z tym BAT ma doskonały potencjał terapeutyczny w zakresie następstw metabolicznych związanych z otyłością7,8,9.

Aby zbadać fizjologię i patofizjologię rozwoju i funkcji BAT oraz wyjaśnić mechanizmy molekularne związane z tymi procesami, metodą wyboru jest model myszy transgenicznej specyficzny dla BAT10. System rekombinacji Cre-LoxP jest najczęściej stosowanym sposobem produkcji myszy z warunkowym nokautem poprzez edycję genomu myszy. System ten umożliwił modyfikację (nadekspresję lub nokaut) genów będących przedmiotem zainteresowania w sposób specyficzny dla tkanki/komórki11. Może być również wykorzystany do znakowania określonego typu komórki poprzez ekspresję selektywnego fluorescencyjnego genu reporterowego.

Ostatnio, podejście systemowe Cre-LoxP zostało jeszcze bardziej rozwinięte poprzez połączenie technologii CRISPR-Cas9 i systemu jednoprzewodnikowego RNA (sgRNA) wirusa związanego z adenowirusem (AAV)12. System CRISPR-Cas9 jest specyficznym i wydajnym narzędziem do edycji genów do modyfikowania, regulowania lub celowania w precyzyjne regiony genomu13. Edycja genomu oparta na CRISPR-Cas9 pozwala na szybką manipulację genetyczną loci genomu, ponieważ nie wymaga rekombinacji homologicznej z wektorem ukierunkowanym na gen. Połączone techniki Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 i AAV-sgRNA umożliwiają naukowcom dokładniejsze zrozumienie funkcji genów, umożliwiając badanie roli genów będących przedmiotem zainteresowania w pożądanych momentach w tkankach/komórkach. Ponadto te połączone techniki skracają czas i wysiłek wymagany do wygenerowania myszy transgenicznych i umożliwiają czasową kontrolę aktywności CRISPR-Cas9 w celu indukowalnej edycji genomu u myszy, jeśli używana jest indukowalna linia Cre14.

Wektory AAV są bezpiecznymi i skutecznymi systemami dostarczania genów in vivo. Jednak AAV ukierunkowane na tkankę tłuszczową pozostają w tyle za aplikacjami w innych tkankach, takich jak mózg, serce, wątroba i mięśnie15. Ze względu na stosunkowo niską wydajność transdukcji i tropizm z naturalnie występującymi wektorami serotypów, dostarczanie genów do tkanki tłuszczowej pod kontrolą AAV jest nadal wyzwaniem15. W ciągu ostatnich 5 lat wraz z innymi z powodzeniem opracowaliśmy skuteczne i minimalnie inwazyjne sposoby dostarczania genów kierowanych przez AAV do tkanki tłuszczowej i stworzyliśmy modele mysie, które pozwalają nam zrozumieć geny zaangażowane w regulację funkcji BAT16,17,18,19. Na przykład, używając AAV8 do dostarczania sgRNA ukierunkowanego na Alox12, który koduje 12-lipooksygenazę (12-LOX), do BAT myszy Ucp1-Cre / Cas9, odkryliśmy, że aktywowany BAT wytwarza metabolity 12-LOX, a mianowicie kwas 12-hydroksy-eikozapentaenowy (12-HEPE) i 13R, 14S-dihydroksy-dokozaheksaenowy kwas (maresin 2), odpowiednio w celu regulacji metabolizmu glukozy i rozwiązania stanu zapalnego związanego z otyłością16, 17. W tym miejscu przedstawiamy protokół krok po kroku dotyczący procedur technicznych, w szczególności operacji bezpośredniego mikrowstrzykiwania AAV-sgRNA do płatów BAT, w celu wygenerowania myszy z nokautem specyficznych dla BAT przy użyciu połączonego systemu Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 i AAV-sgRNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach i procedury opieki zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Joslin Diabetes Center.

1. Badania przesiewowe skutecznych sgRNA w hodowanych komórkach

UWAGA: Aby test był opłacalny, przed zapakowaniem sgRNA w cząsteczki AAV, zalecamy przetestowanie różnych sgRNA w hodowanych komórkach za pomocą systemu opartego na lentiwirusie pod kątem ekspresji Cas9/sgRNA (Rysunek 1) i wybranie sgRNA, które dają najwyższą skuteczność knockdown dla eksperymentów in vivo.

  1. Konstrukcja sgRNA CRISPR-Cas9
    1. Projektuj sgRNA za pomocą narzędzi online, takich jak narzędzie do projektowania Broad sgRNA (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)20,21, narzędzie online CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)22 i inne dostępne narzędzia.
    2. Wprowadź nazwy genów lub docelowe sekwencje DNA w polu nazwy genu i wybierz NGG jako motyw sąsiadujący z protospacerem (PAM) dla SpCas9, aby wygenerować potencjalne sekwencje sgRNA.
    3. Wybierz sgRNA o wysokiej przewidywanej skuteczności w miejscu docelowym i niskiej aktywności poza celem. Na przykład zaleca się stosowanie sgRNA o wyniku swoistości co najmniej 50 na wyjściu CRISPOR. Spośród konkretnych sgRNA, które przechodzą filtr, wybierz te z wysokimi wynikami wydajności23.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, wybiera się trzy lub cztery sgRNA, aby zapewnić identyfikację skutecznych sgRNA.
  2. Budowa plazmidu sgRNA CRISPR-Cas9
    1. Zsyntetyzuj pary oligonów sgRNA kodujące 20 sekwencji docelowych nukleotydów (nt) z nawisami (zarówno 5', jak i 3') z miejsca restrykcji BsmBI (Tabela 1) za pomocą platformy syntezy DNA.
    2. Ligaty wyżarzone pary oligonów za pomocą linearyzowanego wektora BsmBI lentiCRISPR v2.
    3. Przekształć produkt ligacji w szczep Stbl3 E. coli i potwierdź insercję sgRNA przez sekwencjonowanie DNA Sangera przy użyciu startera U6 do przodu.
      UWAGA: Zobacz szczegółową procedurę klonowania w protokole Addgene zatytułowanym LentiCRISPRv2 i lentiGuide-Puro: lentiviral CRISPR/Cas9 and single guide RNA24.
  3. Wytwarzanie cząstek lentiwirusowych
    1. Około 24 godziny przed transfekcją rozmieścić 7 x 105 komórek HEK-293 w 4 ml kompletnej pożywki wzrostowej na 6 cm płytce do hodowli tkankowej.
    2. Dodać 15 μl odczynnika do transfekcji LT1 do 250 μl pożywki bez surowicy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    3. Przygotować koktajl transfekcyjny dla każdego sgRNA zgodnie z tabelą 2 w 250 μl pożywki wolnej od surowicy. Zmieszać odczynnik do transfekcji przygotowany w kroku 1.3.2 z koktajlem plazmidowym i inkubować przez 20-30 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Zastąp całą pożywkę wzrostową 3,5 ml świeżej pożywki wzrostowej dla komórek HEK-293, a następnie dodaj kroplami mieszaninę odczynników do transfekcji DNA do komórek HEK-293 hodowanych w 3,5 ml świeżej pożywki wzrostowej.
    5. Po 12-15 godzinach transfekcji zmień pożywkę, aby usunąć odczynnik do transfekcji i zastąp ją 4 ml świeżej pożywki wzrostowej.
    6. Po 24 godzinach inkubacji zebrać pożywkę do hodowli komórkowej zawierającą cząstki lentiwirusa i przefiltrować pożywkę przez filtr 0,45 μm w celu usunięcia wszelkich komórek HEK-293. Wirusy mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka dni. W przypadku długotrwałego przechowywania wirusy należy zamrozić w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Postępuj zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego podczas przygotowywania cząstek lentiwirusa i pracuj w środowisku (np. BL2+) odpowiednim do obchodzenia się z lentiwirusem. Zobacz szczegółową procedurę przygotowania lentiwirusa w protokole Addgene zatytułowanym pLKO.1 - TRC Cloning Vector (https://www.addgene.org/protocols/plko/#G).
  4. Zakażenie brązowych preadipocytów i oznaczanie knockdownu za pośrednictwem sgRNA
    1. Płytka 1 x 106 unieśmiertelnionych brązowych preadipocytów myszy w 1 ml świeżej pożywki zawierającej 8 μg/ml polibrenu na studzienkę na płytce 6-dołkowej.
      UWAGA: W tym badaniu unieśmiertelnione brązowe preadipocyty zostały wygenerowane przy użyciu antygenu T SV40 25. Brązowe preadipocyty są hodowane w DMEM o wysokiej zawartości glukozy z 10% FBS.
    2. Dodać 1 ml roztworu cząstek lentiwirusa z kroku 1.3, aby zainfekować komórki. Utrzymuj równolegle jedną niezainfekowaną studzienkę komórek, aby służyła jako kontrola selekcji antybiotyków.
    3. Zmienić na świeże podłoże 24 godziny po zakażeniu. Dodać odpowiednie antybiotyki (np. puromycynę o końcowym stężeniu 1 μg/ml) do pożywki, aby zabić niezakażone komórki i wybrać te zakażone. Zmieniaj pożywkę na świeżą zawierającą wybrany antybiotyk co drugi dzień, aż wszystkie niezakażone komórki kontrolne umrą.
    4. Zbierz białko z komórek zakażonych wirusem i określ skuteczność knockdown sgRNA za pomocą analizy western blot. Postępuj zgodnie ze szczegółową procedurą western blotting w Eslami i Lujan26. Ze względu na różną szybkość obrotu między białkami, należy przetestować wiele punktów czasowych (np. od 6 do 12 dnia po zakażeniu wirusem), aby zaobserwować utratę sygnału białkowego.
      UWAGA: Jeśli przeciwciało, które rozpoznaje białko kodowane przez gen będący przedmiotem zainteresowania, nie jest dostępne, sekwencjonowanie Sangera można alternatywnie wykorzystać do określenia wydajności edycji genomu każdego sgRNA. Krótko mówiąc, amplifikuj genomowe DNA za pomocą starterów flankujących region ukierunkowany na sgRNA, aby wygenerować amplikony PCR o długości ~ 700 pz. Prognozowane miejsce przerwy powinno znajdować się ~200 pz poniżej miejsca rozpoczęcia sekwencjonowania. Następnie poddaj produkt PCR sekwencjonowaniu Sangera. Przeanalizuj wyniki sekwencjonowania za pomocą narzędzi online, takich jak Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE), aby określić częstotliwość małych indeli generowanych przez każde sgRNA w puli komórek27.

2. Budowa plazmidu AAV-sgRNA

UWAGA: W tym kroku skuteczne sgRNA zidentyfikowane na powyższym ekranie są klonowane do wektora pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP vector28 (Rysunek 2). W międzyczasie sgRNA nieukierunkowane (np. TCTGATAGCGTAGGAGTGAT29), które nie rozpoznaje żadnej sekwencji w genomie myszy, jest również klonowane do tego samego wektora, aby służyć jako nieedytowana kontrola.

  1. Linearyzuj szkielet pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP za pomocą BbsI, który generuje identyczne zwisy ze zsyntetyzowanymi oligonukleotydami sgRNA.
  2. Zwiąż wyżarzane pary oligonugoligatów ze zlinearyzowanym wektorem pAAV i potwierdź insercji sgRNA zgodnie z opisem w kroku 1.2.
    UWAGA: Procedura klonowania lentiCRISPRv2-sgRNA jest również stosowana do budowy plazmidu AAV-sgRNA.

3. Opakowanie AAV

  1. Wektory AAV wygenerowane w sekcji 2 należy spakować do serotypu 8 AAV. Przygotuj AAV o wysokim mianie zgodnie z poprzednim protokołem30 lub poproś o usługę pakowania AAV od rdzeni wirusowych lub usług komercyjnych. Rozcieńczyć miano wirusa do 1 x10 13 kopii genomu/ml.
    UWAGA: Zmodyfikowany genom AAV2 wyrażający sgRNA jest upakowany w serotyp 8 AAV. Ten serotyp został wybrany ze względu na jego wysoką skuteczność w tkance tłuszczowej18,31. Aby zapobiec odpowiedzi immunologicznej wywołanej przez zanieczyszczenia, takie jak szczątki komórek i niewielkie ilości składników pożywki, do wstrzykiwań in vivo wymagany jest ultra oczyszczony AAV. Ultra-oczyszczanie można osiągnąć za pomocą gradientów jodixanolu i ultrawirowania30.

4. Przygotowanie myszy Ucp1 Cre/Cas9

  1. Kup szczep myszy Ucp1-Cre (patrz Tabela materiałów), który wykazuje ekspresję rekombinazy Cre pod kontrolą promotora Ucp1. Kup homozygotyczne myszy knock-in STOP-Cas9 z floxingiem Rosa2632 (patrz Tabela materiałów), w których ekspresja Cas9 jest regulowana w sposób zależny od rekombinazy Cre.
  2. Skrzyżowanie tych szczepów w celu wygenerowania myszy Ucp1-Cre/Cas9, zgodnie z wcześniejszym opisem16,17. Trzymaj wszystkie myszy w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i wilgotności (23 °C, 30% wilgotności) w 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym (światła włączają się o 6:30; wyłączają się o 18:30) z bezpłatnym dostępem do diety i wody.
  3. Potraktuj powstałe myszy Ucp1-Cre / Cas9 AAV przenoszącymi kontrolne sgRNA lub sgRNA ukierunkowane na gen zainteresowania za pomocą metody opisanej poniżej. W tym badaniu wykorzystano 12-15 tygodniowe samce myszy Ucp1-Cre / Cas9 o wadze około 30 g.

5. Operacja wstrzyknięcia AAV do BAT u myszy

  1. Znieczulenie myszy poprzez ciągłe wdychanie 2,5% izofluranu w celu indukcji i podtrzymania.
  2. Nasmaruj oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Następnie podaj myszom leki przeciwbólowe (banamina, 2,5 mg/kg masy ciała [m.c.), wstrzyknięcie podskórne, patrz tabela materiałów) myszom, aby zminimalizować i zapobiec pooperacyjnemu bólowi i stresowi.
  3. Ogol futro myszy w obszarze międzyłopatkowym za pomocą golarki i wysterylizuj obszar chirurgiczny za pomocą co najmniej trzech naprzemiennych rund peelingu na bazie jodu lub chlorheksydyny, a następnie 70% etanolu. Następnie nałóż sterylne obłożenia chirurgiczne wokół miejsca nacięcia.
  4. Naciąć skórę między łopatkami za pomocą skalpela (Ryc. 3A-B), a następnie oderwać ogoloną skórę, aby odsłonić tkankę tłuszczową na szyi za pomocą nożyczek chirurgicznych (Rysunek 3C-D). Wielkość nacięcia zależy od wielkości ciała, ale generalnie nacięcie powinno wynosić około 2 cm, aby odsłonić tkankę tłuszczową w okolicy międzyłopatkowej.
  5. Przetnij tkankę tłuszczową na granicy między dystalnym obszarem tkanki tłuszczowej a mięśniami, wykonując pojedyncze nacięcie (Rysunek 3E-F). Wielkość nacięcia powinna wynosić około 1 cm, aby po prostu otworzyć wejście do włożenia nożyczek chirurgicznych do złuszczania tkanek tłuszczowych.
  6. Używając ręki dominującej, oderwij tkankę tłuszczową tępo i pionowo nożyczkami chirurgicznymi, aby odsłonić BAT, jednocześnie ściskając tkanki tłuszczowe, w tym BAT, ręką niedominującą (Rysunek 3G). Użyj żyły Sultzera jako punktu orientacyjnego, aby wskazać dokładną lokalizację BAT.
    UWAGA: BAT w klasie Rysunek 3H został całkowicie naświetlony w celu demonstracji obrazu. Nadmierna preparacja może spowodować uszkodzenie nerwów otaczającego BAT. Nieprawidłowy kierunek nożyczek może uszkodzić otaczające mięśnie i żyłę Sultzera, odprowadzając BAT i może prowadzić do nadmiernego krwawienia.
  7. Dla każdej myszy wstrzyknąć powoli 40 μl AAV do obu płatów BAT (20 μl na jeden płat BAT) za pomocą ostrej igły (32 G, zob. tabela materiałów) połączonej ze strzykawką Hamiltona (100 μl, zob. tabela materiałów; Rysunek 3I). Sprawdzić, czy wstrzyknięcie zostało wykonane, ponieważ podczas podawania AAV nie ma wycieków z miejsca wstrzyknięcia.
    UWAGA: BAT w Rysunek 3I został całkowicie naświetlony w celu demonstracji obrazu. Objętość roztworu AAV, który ma być podany do płata BAT, zależy od wielkości BAT myszy biorcy. Ustaliliśmy, że 20 μl roztworu AAV jest odpowiednie dla jednego płata BAT o wadze około 0,05 g w zwykłej myszy C57BL6/J o wadze 30 g. W razie potrzeby może być konieczne stężenie roztworu wirusowego, aby osiągnąć pożądaną objętość.
  8. Upewnij się, że nie ma krwawienia z wstrzykniętego BAT lub otaczających tkanek. Przycisnąć gazę nasączoną roztworem nadtlenku wodoru (patrz Tabela materiałów) na miejsce krwawienia w celu hemostazy.
  9. Umieść odsłonięte tkanki tłuszczowe z powrotem w ich normalnej pozycji. Zszyj krawędź tkanki tłuszczowej i mięśni za pomocą wchłanialnej nici monofilamentowej 5-0 (Rysunek 3J). Zszyj otwartą skórę za pomocą niebarwionych nici plecionych vicryl pokrytych 5-0 (Rysunek 3K-L).
    UWAGA: Rysunek 4 opisuje etapy zszywania obranej tkanki tłuszczowej i mięśni.
  10. Po operacji należy utrzymać zwierzęta na poduszce grzewczej aż do całkowitego wyzdrowienia. Zapewnij zwierzętom dostęp do jedzenia, wody i dużej ilości ściółki do gniazdowania. Monitoruj je regularnie pod kątem jakichkolwiek oznak stresu lub choroby przez 7 dni rekonwalescencji przed rozpoczęciem eksperymentu.
  11. Potwierdź skuteczność docelowej delecji genu za pomocą analizy western blot w BAT wypreparowanym na myszach, jak w Sugimoto et al.16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W trakcie powyższych procedur, precyzyjne dostarczenie AAV-sgRNA do BAT jest kluczowe dla powodzenia protokołu. Aby zmaksymalizować efekt AAV-sgRNA i zminimalizować uszkodzenia tkanek podczas operacji, konieczne jest zrozumienie trójwymiarowej (3D) anatomicznej lokalizacji BAT. Jak pokazano w Rysunek 3E, trudno jest określić dokładną lokalizację BAT bez odsłonięcia tkanki. Nadmierne narażenie na BAT może jednak uszkodzić tkankę (Rysunek 3H, I); w związku ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istniejące opublikowane metody dostarczania genów za pośrednictwem AAV do międzyłopatkowego BAT nie zawierają szczegółowych zdjęć i filmów opisujących techniki chirurgiczne i podejście do bezpośredniego wstrzykiwania AAV do BAT. W większości opublikowanych metod33,34 AAV jest wstrzykiwany do tkanki tłuszczowej otaczającej BAT między łopatkami, a nie do samego BAT. W związku z tym istnieje kilka kluczowych kroków w tym protokole, które decydują o powodzeniu badani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez granty amerykańskich National Institutes of Health (NIH) R01DK122808, R01DK102898 i R01DK132469 (dla Y.-H.T.), a także P30DK036836 (dla Centrum Badań nad Cukrzycą w Joslin Diabetes Center). T. T. był wspierany przez SUNSTAR Research Fellowship (Hiroo Kaneda Scholarship, Sunstar Foundation, Japonia) oraz grant American Heart Association 903968 Y. Z. był wspierany przez Charles A. King Trust Fellowship. Dziękujemy Seanowi D. Kodaniemu za uprzejmą korektę manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemikalia, peptydy i białka
Pożywka bez surowicy OPTI-MEMInvitrogen31985
Odczynnik do infekcji / transfekcji polibrenuSigmaTR-1003-G
Odczynnik do transfekcji TransIT-LT1MirusMIR 2300
Rekombinowane DNA
lentiCRISPR v2 wektor Addgene52961
pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFPAddgene89060
plazmid otoczki pMD2.GAddgene12259
plazmid pakujący psPAX2Addgene12260
Modele eksperymentalne: Linie komórkowe Komórki
HEK-293Komórki ATCCCRL-1573
WT-1Opracowany w laboratorium TsengPMID: 14966273
Modele eksperymentalne: Organizmy/szczepy
Cas9 myszy knockinJackson Laboratories24857
Myszy Ucp1-CREJackson Laboratories24670
Inne
BanaminePatterson07-859-1323
Hamilton strzykawkaHamiltonModel 710 RN Strzykawka
Roztwór nadtlenku wodoruFisher ScientificH325-500
IgłaHamilton32 gauge, mała piasta Igła RN, igła typu 2
Szew 5-0 Unify PCL25 P-3 Niebarwiona 18 cali Monofilament 12/BxHenry Schein1273504
Szew 5-0 Unify Silk P-3 18 cali 12/BxHenry Schein
rekombinowane1294522

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kopelman, P. G. Obesity as a medical problem. Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).
  2. Finkelstein, E. A., et al. Obesity and severe obesity forecasts through 2030. American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).
  3. Craft, S. Insulin resistance and Alzheimer's disease pathogenesis: Potential mechanisms and implications for treatment. Current Alzheimer Research. 4 (2), 147-152 (2007).
  4. Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nature Reviews Endocrinology. 13 (1), 26-35 (2017).
  5. Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocrine Reviews. 41 (1), 53-65 (2020).
  6. Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nature Medicine. 27 (1), 58-65 (2021).
  7. Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: Physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
  8. Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).
  9. Darcy, J., Tseng, Y. H. ComBATing aging-does increased brown adipose tissue activity confer longevity. Geroscience. 41 (3), 285-296 (2019).
  10. da Silva Xavier, G., Hodson, D. J. Mouse models of peripheral metabolic disease. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 32 (3), 299-315 (2018).
  11. Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: General principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory Animal Research. 34 (4), 147-159 (2018).
  12. Wang, D., Zhang, F., Gao, G. CRISPR-based therapeutic genome editing: Strategies and in vivo delivery by AAV vectors. Cell. 181 (1), 136-150 (2020).
  13. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  14. Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33 (4), 390-394 (2015).
  15. Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: An emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
  16. Sugimoto, S., et al. Brown adipose tissue-derived MaR2 contributes to cold-induced resolution of inflammation. Nature Metabolism. 4 (6), 775-790 (2022).
  17. Leiria, L. O., et al. 12-lipoxygenase regulates cold adaptation and glucose metabolism by producing the omega-3 lipid 12-HEPE from brown fat. Cell Metabolism. 30 (4), 768-783 (2019).
  18. Shamsi, F., et al. FGF6 and FGF9 regulate UCP1 expression independent of brown adipogenesis. Nature Communications. 11, 1421(2020).
  19. Romanelli, S. M., et al. BAd-CRISPR: Inducible gene knockout in interscapular brown adipose tissue of adult mice. Journal of Biological Chemistry. 297 (6), 101402(2021).
  20. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
  21. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9, 5416(2018).
  22. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  23. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148(2016).
  24. Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
  25. Tseng, Y. H., Kriauciunas, K. M., Kokkotou, E., Kahn, C. R. Differential roles of insulin receptor substrates in brown adipocyte differentiation. Molecular and Cellular Biology. 24 (5), 1918-1929 (2004).
  26. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: Sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359(2010).
  27. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).
  28. Jarrett, K. E., et al. Somatic genome editing with CRISPR/Cas9 generates and corrects a metabolic disease. Scientific Reports. 7, 44624(2017).
  29. Zhang, Y., et al. Optimized RNA-targeting CRISPR/Cas13d technology outperforms shRNA in identifying functional circRNAs. Genome Biology. 22 (1), 41(2021).
  30. Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960(2019).
  31. Jimenez, V., et al. In vivo adeno-associated viral vector-mediated genetic engineering of white and brown adipose tissue in adult mice. Diabetes. 62 (12), 4012-4022 (2013).
  32. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  33. Huang, W., Queen, N. J., Cao, L. rAAV-mediated gene delivery to adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1950, 389-405 (2019).
  34. Xue, K., Wu, D., Qiu, Y. Specific and efficient gene knockout and overexpression in mouse interscapular brown adipocytes in vivo. STAR Protocols. 3 (4), 101895(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Nokaut tkanki t uszczowej brunatnejsystem Cre LoxPedycja CRISPR Cas9brunatna tkanka t uszczowanokaut tkankowo specyficznymikroiniekcja AAVcelowanie genowemetabolizm energetyczny

Powiązane artykuły