Artykuł metodologiczny

Produkcja ludzkich neuronów indukowanych neurogeniną 2 w trójwymiarowym bioreaktorze zawiesinowym

3.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65085

⸱

17 marca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Fraunhofer Project Center for Stem Cell Process Engineering, Fraunhofer Institute for Biomedical Engineering IBMT, 2Bioneer A/S, 3Fraunhofer UK Research Ltd, Technology and Innovation Centre, 4Fraunhofer Institute for Biomedical Engineering IBMT, 5Department of Molecular and Cellular Biotechnology, Saarland University, 6Facultad de Ciencias del Mar, Universidad Católica del Norte

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych w laboratoryjnym bioreaktorze zawiesinowym 3D.

Streszczenie

Pochodzenie komórek linii neuronalnej z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) było kamieniem milowym w badaniach nad mózgiem. Od czasu ich pierwszego pojawienia się, protokoły są stale optymalizowane i są obecnie szeroko stosowane w badaniach i opracowywaniu leków. Jednak bardzo długi czas trwania tych konwencjonalnych protokołów różnicowania i dojrzewania oraz rosnące zapotrzebowanie na wysokiej jakości hiPSC i ich neuronowe pochodne zwiększają potrzebę przyjęcia, optymalizacji i standaryzacji tych protokołów do produkcji na dużą skalę. W niniejszej pracy przedstawiono szybki i skuteczny protokół różnicowania genetycznie zmodyfikowanych, indukowanych doksycykliną neurogeniny 2 (iNGN2) hiPSC do neuronów przy użyciu laboratoryjnego trójwymiarowego (3D) bioreaktora zawiesinowego.

Krótko mówiąc, jednokomórkowe zawiesiny iNGN2-hiPSC mogły tworzyć agregaty w ciągu 24 godzin, a zaangażowanie linii neuronalnej zostało wywołane przez dodanie doksycykliny. Agregaty zostały zdysocjowane po 2 dniach indukcji, a komórki zostały albo kriokonserwowane, albo ponownie posiane w celu końcowego dojrzewania. Wygenerowane neurony iNGN2 wcześnie wykazywały ekspresję klasycznych markerów neuronalnych i tworzyły złożone sieci neurytyczne w ciągu 1 tygodnia po ponownym posiewie, co wskazuje na rosnącą dojrzałość kultur neuronalnych. Podsumowując, przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku do szybkiego generowania neuronów pochodzących z hiPSC w środowisku 3D, który ma ogromny potencjał jako punkt wyjścia do modelowania chorób, fenotypowych wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków i testów toksyczności na dużą skalę.

Wprowadzenie

Zaburzenia neurologiczne są główną przyczyną niepełnosprawności na całym świecie1. Dotyczy to jednej na sześć osób, a liczba zachorowań stale rośnie. Związane z tym obciążenie finansowe dla społeczeństw i ich systemów opieki zdrowotnej jest ogromne. Ocena 30 krajów europejskich w 2010 r. oszacowała roczne koszty związane z zaburzeniami psychicznymi i neurologicznymi na 800 mld euro2. Rosnące obciążenie społeczno-ekonomiczne wymaga skutecznych strategii leczenia i chociaż nasza wiedza na temat patofizjologii chorób znacznie wzrosła, przełożenie na kliniki jest często niewystarczające. Ogólnie rzecz biorąc, tylko 12% farmaceutyków wchodzi do badań klinicznych, z czego ponad 80% kończy się niepowodzeniem na późniejszych etapach, głównie z powodu nieskuteczności lub nieprzewidzianej toksyczności3,4. Powody są różne, ale ograniczona możliwość przejścia z testów na zwierzętach w fazach przedklinicznych do badań na ludziach coraz częściej wysuwa się na pierwszy plan5. Ludzkie modele komórkowe i tkankowe in vitro mogą wypełnić lukę w translacji międzygatunkowej, a postępy w technologii pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka (hiPSC) mają ogromny potencjał w tym zakresie. hiPSC są szeroko stosowane w badaniach podstawowych i mają wspólne zasadnicze cechy z embrionalnymi komórkami macierzystymi (hESC), takie jak prawie nieograniczona zdolność do samoodnawiania się i zdolność do różnicowania się we wszystkie trzy listki zarodkowe 6, przy jednoczesnym obejściu problemów etycznych związanych z niszczeniem zarodków.

Uzyskanie komórek nerwowych z hESC, a później hiPSC, było kamieniem milowym w badaniach nad mózgiem. Początkowe protokoły różnicowania opierały się na zastosowaniu czynników wzrostu naśladujących krytyczne etapy podczas embriogenezy, z których większość obejmowała podwójne hamowanie SMAD w zawiesinie lub hodowlach przylegających7,8,9. Dojrzałe neurony zostały z powodzeniem wygenerowane, ale kilka wad tych protokołów nadal utrudnia ich szerokie zastosowanie w opracowywaniu leków, takich jak niska wydajność i duża zmienność generowanych neuronów między partiami, a także duże obciążenie pracą związane z długim czasem hodowli. Poprawę osiągnięto dzięki wymuszonej ekspresji czynników transkrypcyjnych krytycznie zaangażowanych w neurogenezę, a członkowie rodziny neurogenin (NGN), w szczególności NGN2, zostali zidentyfikowani jako skuteczne sterowniki10. Ektopowa ekspresja NGN2 w hiPSC za pośrednictwem lentiwirusa znacznie przyspieszyła wczesne etapy różnicowania neuronów i indukowała los komórek neuronalnych w ciągu zaledwie 1 tygodnia11. Późniejsze końcowe dojrzewanie w kokulturach z astrocytami dało funkcjonalne neurony o wysokiej czystości i ilości o powtarzalnych właściwościach. Następnie zastosowano ukierunkowaną na miejsce edycję genów locus bezpiecznej przystani miejsca integracji wirusa związanego z adenowirusem 1 (AAVS1) w celu utworzenia linii hiPSC ze stabilną i indukowaną doksycykliną kasetą ekspresyjną dla NGN212,13, minimalizując w ten sposób niepożądane skutki uboczne dostarczania lentiwirusa.

Solidne i efektywne różnicowanie neuronów neurogeniny 2 (iNGN2) indukowanych doksycykliną ma ogromny potencjał dla wysokoprzepustowych fenotypowych badań przesiewowych leków i testów toksyczności10,14,15; a w ciągu ostatniej dekady poczyniono znaczne postępy w bioprzetwarzaniu, wdrażając bioreaktory do skalowalnej ekspansji i różnicowania komórek16,17,18,19. Jednak większość protokołów różnicowania jest zoptymalizowana pod kątem kultur przylegających, a translacja na środowisko trójwymiarowe (3D) często wymaga niezbędnych modyfikacji. Ostatnio doniesiono o udanym zastosowaniu laboratoryjnego bioreaktora 3D o zredukowanych cechach naprężeń ścinających do ekspansji hiPSC i powtarzalnego różnicowania na hepatocyty, kardiomiocyty i neurony20. W tym przypadku przedstawiono szczegółowy protokół generowania i charakterystyki neuronów iNGN2 przy użyciu identycznego laboratoryjnego bioreaktora 3D.

Protokół

UWAGA: Wszystkie manipulacje komórkowe, a także przygotowywanie naczyń hodowlanych i pożywek, powinny być przeprowadzane w warunkach sterylnych. Dygestorium z laminarnym przepływem powietrza należy dokładnie wyczyścić przed użyciem oraz po zakończeniu pracy, przecierając wszystkie powierzchnie 70% etanolem. Opisany protokół został zoptymalizowany pod kątem różnicowania neuronów w inkubatorze i bioreaktorze 3D CERO (w dalszej części tekstu określanym jako bioreaktor laboratoryjny). Ten bioreaktor laboratoryjny posiada cztery gniazda na specjalistyczne probówki bioreaktora, z których każda ma maksymalną pojemność 50 mL. Poziom temperatury i CO2 są stale kontrolowane, a parametry hodowli (np. prędkość obrotowa i czas) są regulowane niezależnie dla każdej probówki. Wszystkie etapy aspiracji, o ile nie wskazano inaczej, zostały wykonane przy użyciu pipety aspiracyjnej i pompy próżniowej.

1. Hodowla i ekspansja hiPSC

UWAGA: W niniejszym protokole zastosowano zmodyfikowaną linię hiPSC BIONi010-C-13 z indukowalną doksycykliną ekspresją NGN2. Przedstawiony tutaj protokół namnażania jest zoptymalizowany dla szalek Petriego o średnicy 6 cm, jednak w razie potrzeby można zastosować alternatywne formaty hodowli.

  1. Płytki Petri o średnicy 6 cm pokryć macierzą błony podstawnej rozcieńczonej w zimnej pożywce Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)/F12 (-/-) do końcowego stężenia 0,083 mg/mL/10 cm2. Inkubować pokryte płytki w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 min.
    UWAGA: Szczegółowy protokół przygotowania roztworu macierzy błony podstawnej znajduje się w instrukcjach producenta. hiPSC można hodować na alternatywnych macierzach zewnątrzkomórkowych w celu ich ekspansji.
  2. Wymrożone hiPSC rozmrozić zgodnie z Protokołem Użytkownika Linii Komórkowych EBiSC21 w bezkarmiącej pożywce do utrzymania iPSC + 10 µM inhibitora ROCK (Y-27632). Zaleca się gęstość wysiewu 1 × 106 żywych komórek na płytkę 60 mm.
  3. Następnego dnia wymienić pożywkę na bezkarmiącą pożywkę do utrzymania iPSC bez inhibitora ROCK i dokonywać codziennych wymian pożywki.
  4. Rozpocząć pasażowanie, gdy kultury hiPSC osiągną konfluencję 60%-80%. Sprawdzać obecność obszarów zróżnicowanych i ręcznie usuwać kolonie, jeśli obszary te przekraczają 5%.
    UWAGA: Niezróżnicowane hiPSC wyglądają jak okrągłe komórki z wyraźnym jąderkiem i mniejszą ilością cytoplazmy. Płaskie i ciasno upakowane kolonie tworzą się wkrótce po rozmrożeniu lub pasażowaniu. Przykładowe obrazy kultur hiPSC w świetle przechodzącym przedstawiono na Rysunku 1. Dalsze informacje znajdują się w Protokole Użytkownika Linii Komórkowych EBiSC21. Do pasażowania przygotować płytki pokryte macierzą błony podstawnej oraz bezkarmiącą pożywkę do utrzymania iPSC.
  5. Odssać pożywkę z kultur hiPSC i wypłukać komórki 2x 0,5 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) w 1x soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS) bez Ca2+ i Mg2+ (DPS [-/-], patrz Tabela Materiałów).
  6. Usunąć nadsącz i dodać 2 mL 0,5 mM EDTA w 1x DPBS (-/-) do płytek Petri 6 cm. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 3 min w inkubatorze.
  7. Odssać 1,5 mL roztworu EDTA i kontynuować inkubację przez 3-5 min.
  8. Delikatnie postukać w płytki, aby ułatwić odrywanie się komórek.
    UWAGA: Odrywanie się komórek oceniać wizualnie. Kolonie hiPSC powinny zacząć odrywać się po 5 min, jednak w przypadku kultur hiPSC o wyższej konfluencji może być wymagany dłuższy czas inkubacji. Jeśli kolonie nie odrywają się, wydłużyć czas inkubacji do 10 min, ale nie przekraczać tego czasu.
  9. Dodać 5 mL bezkarmiącej pożywki do utrzymania iPSC do płytek Petri 6 cm i delikatnie resuspendować kolonie 2x za pomocą pipety serologicznej 10 mL lub końcówek do pipet o szerokim otworze. Przenieść komórki do probówki 15 mL.
    UWAGA: hiPSC są bardzo wrażliwe na stres mechaniczny, dlatego należy unikać wielokrotnej resuspensji. Końcowa zawiesina komórkowa powinna składać się z małych fragmentów kolonii (50-200 µm).
  10. Odssać nadsącz z pokrytych płytek hodowlanych i przygotować 4 mL bezkarmiącej pożywki do utrzymania iPSC na płytkę 6 cm.
  11. Przenieść małe fragmenty kolonii na świeżo przygotowane płytki hodowlane w stosunkach rozcieńczenia od 1:10 do 1:40 i hodować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 z codzienną wymianą pożywki.
    UWAGA: Małe kolonie powinny przytwierdzić się w ciągu 1 lub 2 h po pasażowaniu.

Wzrost hodowli komórek macierzystych; obraz mikroskopowy; morfologia kolonii komórkowych; badania biomedyczne.
Rysunek 1: Morfologia hodowli ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. (A,B) Wysokiej jakości hodowle hiPSC o różnym stopniu konfluencji, wykazujące zwarte kolonie hiPSC o homogenicznej morfologii i wyraźnych krawędziach. (C) Hodowla hiPSC z pojawiającymi się skupiskami zróżnicowanych komórek wokół krawędzi kolonii (biała przerywana linia). Pasek skali = 200 µm. Skrót: hiPSC = ludzka indukowana pluripotencjalna komórka macierzysta. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Prekultywacja hiPSC w systemie bioreaktora laboratoryjnego (dzień -2)

UWAGA: Rozpocznij precultywację, gdy kultury hiPSC osiągną stopień konfluencji między 60% a 80%. Sprawdź kolonie hiPSC pod kątem obszarów zróżnicowanych. Podczas tej fazy precultywacji hiPSC są utrzymywane w bezkarmiącej pożywce do utrzymania iPSC przez 2 dni.

  1. Przygotować pożywki hodowlane, składające się z pożywki do utrzymania iPSC bez komórek karmicielskich oraz 10 µM inhibitor ROCK (Y-27632).
  2. Całkowicie odessać pożywkę z hiPSC i delikatnie przepłukać komórki dwukrotnie 1x DPBS (-/-).
  3. Do szalek Petriego o średnicy 6 cm należy dodać 2,0 ml uprzednio ogrzanego roztworu trypsyny-EDTA i inkubować komórki przez 3 min w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
  4. Delikatnie opukaj płytki, aby ułatwić odklejenie komórek, lub inkubuj przez dodatkowe 1-2 min.
  5. Resuspender komórki w 5 ml pożywki do utrzymania iPSC bez komórek karmicielskich z dodatkiem inhibitora ROCK na każdą szalkę. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 ml lub 50 ml i delikatnie wymieszać poprzez pipetowanie, aby zapewnić rozdzielenie komórek.
  6. Oznaczenie liczby komórek w 100 µL zawiesiny komórkowej przy użyciu automatycznego licznika komórek, zgodnie z wcześniejszym opisem20Przenieś odpowiednią objętość dla 15 × 106 komórek z probówki bioreaktora do probówki o pojemności 50 ml.
  7. Odwiruj komórki z prędkością 300 × g przez 3 min.
  8. Odssać nadsącz i resuspendować komórki w 2 ml pożywki do utrzymania iPSC bez komórek karmiących (feeder-free) z dodatkiem inhibitora ROCK.
  9. Napełnić każdą probówkę o pojemności 50 ml 18 ml pożywki (gęstość wysiewu komórek 0,75 × 106 komórek/ml). Rozdzielić zawiesinę komórkową do probówek bioreaktora (po 20 ml na probówkę).
  10. Umieść probówki w systemie bioreaktora. Ustaw następujące parametry hodowli: okres rotacji 2 s, prędkość rotacji 60 obr./min, brak przerwy w mieszaniu. 37 °Coraz 5% CO22 przez nieokreślony czas20.
  11. Rozpocznij program hodowli poprzez wyświetlacz bioreaktora.
  12. Następnego dnia należy wymienić medium. Pozostawić agregaty do osadzenia w probówkach bioreaktora przez ok. 5 min. Ostrożnie odessać nadsącz.
    UWAGA: Nie należy dopuszczać do sedymentacji agregatów przez więcej niż 10 min, ponieważ mogą one zlepić się ze sobą, tworząc heterogenną zawiesinę agregatów. Zaleca się pozostawienie ok. 5 mL pożywki hodowlanej w probówce bioreaktora.
  13. Do każdej probówki należy dodać 15 ml świeżego pożywki do utrzymania iPSC bez komórek karmicielskich i bez inhibitora ROCK, a następnie kontynuować hodowlę w bioreaktorze laboratoryjnym przez 24 h.

3. Różnicowanie hiPSC w wczesne neurony (dzień 0)

  1. Przygotować pożywkę neurobazalną (NBM): 50% DMEM/F-12 ze stabilizowanym dipeptydem L-alanylo-L-glutaminy, 50% pożywki neurobazalnej, 0,5x suplementu bezsurowiczego (50x), 0,5x suplementu bezsurowiczego opartego na formulacji N-1 Bottensteina (100x), 0,5x stabilizowanego dipeptydu L-alanylo-L-glutaminy, 0,5x roztworu nieessentialnych aminokwasów MEM (100x), 500 nM pirogronianu sodu (100 mM), 50 nM 2-merkaptoetanolu (50 mM), 0,025% roztworu insuliny ludzkiej oraz 5 U/mL penicyliny-streptomycyny.
    UWAGA: NBM należy przechowywać w temperaturze 4 °C; pożywka może być stosowana przez maksymalnie 2 tygodnie.
  2. Rozpocząć różnicowanie neuronalne poprzez dodanie doksycykliny (DOX) do kultur hiPSC. W tym celu należy pozwolić agregatom osiąść w probówkach bioreaktora. Ostrożnie odessać nadsącz z komórek, pozostawiając w probówce ok. 5 mL, a następnie dodać 35 mL pożywki indukującej neurony (NIM), składającej się z NBM oraz 2 µg/mL DOX.
    UWAGA: Ze względu na światłoczułość DOX zaleca się wyłączenie światła podczas pracy.
  3. Umieścić probówki z powrotem w bioreaktorze laboratoryjnym i kontynuować hodowlę.
  4. Dokonywać wymian pożywek codziennie przez 2 dni, zgodnie z opisem w kroku 3.2.
    UWAGA: Po 4 dniach hodowli w zawiesinie agregaty można dysocjować, a wczesne neurony kriokonserwować lub bezpośrednio przesianć w celu końcowego dojrzewania.

4. Kriokonserwacja wczesnych neuronów (dzień 2)

UWAGA: Kriokonserwacja nie jest wymagana ani krytyczna dla procesu różnicowania, lecz jest wysoce zalecana, ponieważ pozwala na wytworzenie i przechowywanie dużych zapasów wczesnych neuronów do późniejszego dojrzewania i analiz.

  1. Pozostaw agregaty do osadzenia się w probówce bioreaktora. Odessaj nadsącz w sposób opisany wcześniej.
  2. Przenieś agregaty do sterylnej probówki 15 mL lub 50 mL i delikatnie wypłucz agregaty 2x za pomocą 1x DPBS (-/-). Ostrożnie odessij nadsącz w możliwie największej ilości, nie naruszając agregatów.
  3. Dodaj 2-5 mL uprzednio podgrzanego enzymu do dysocjacji komórek, w zależności od wielkości osadu, i inkubuj komórki przez około 10 min w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej. Delikatnie resuspenduj osadzone agregaty co 2 min, aż do ich dysocjacji.
    UWAGA: Po 7-10 min inkubacji powinna zostać uzyskana niemal jednorodna zawiesina komórek.
  4. Dodaj trzykrotną objętość uprzednio podgrzanego medium NBM i ostrożnie resuspenduj komórki, aby zapewnić ich singularyzację.
  5. Wyznacz liczbę komórek i przenieś odpowiednią objętość do krio konserwacji do probówki 15 mL lub 50 mL.
    UWAGA: Zaleca się gęstość komórek rzędu 5-10 × 106 komórek/mL medium do mrożenia.
  6. Wirowuj komórki przy 300 × g przez 3 min.
  7. Odessaj nadsącz i delikatnie resuspenduj osad komórkowy w odpowiedniej objętości medium do mrożenia zawierającego 10% dimetylosulfoksydu (DMSO).
  8. Rozdziel zawiesinę komórek do odpowiednich fiolek do kriokonserwacji (1 mL/fiolka).
  9. Przenieś fiolki natychmiast do schłodzonego pojemnika do wolnego mrożenia wypełnionego 2-propanolem i umieść pojemnik w temperaturze -80 °C na noc. Następnego dnia przenieś fiolki do temperatury -150 °C w celu długoterminowego przechowywania.
    ​UWAGA: Ciekły 2-propanol jest wysoce łatwopalny i w przypadku kontaktu może uszkodzić oczy. Przechowywać z dala od źródeł ciepła oraz stosować rękawice ochronne i okulary.

5. Dojrzewanie neuronów pochodzących z hiPSC w hodowlach monowarstwowych

  1. Przygotować naczynia hodowlane powlekane poli-L-ornityną/lamininą do długoterminowej hodowli neuronów pochodzących z hiPSC.
    1. Rozcieńczyć roztwór stokowy poli-L-ornityny do stężenia 0,001% w 1x DPBS (-/-) i powlekać naczynia przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 4 h w 37 °C. Odessać roztwór poli-L-ornityny i raz przemyć płytki 1x DPBS (-/-).
    2. Rozcieńczyć roztwór lamininy w 1x DPBS (-/-) do stężenia końcowego 10 µg/mL i inkubować naczynia przez noc w 4 °C lub przez 4 h w 37 °C.
      UWAGA: Do procedur powlekania zaleca się objętość 0,1-0,15 mL na cm2, a do wszystkich odpowiednich etapów płukania 0,2 mL na cm2. Można stosować alternatywne podłoża do powlekania, jednak należy ocenić ich potencjalny wpływ na przyleganie i dojrzewanie komórek.
  2. Wymrozić kriokonserwowane komórki. W tym celu umieścić krioprobówkę w kąpieli wodnej (ustawionej na 37 °C) i obracać nią przez około 1 min, aż pozostanie niewielka grudka zamrożonej zawiesiny komórkowej.
  3. Ostrożnie przenieść zawiesinę komórkową kroplami do probówki 15 mL zawierającej 10 mL uprzednio ogrzanego NBM. Przepłukać krioprobówkę 1 mL NBM i przenieść zawiesinę komórkową do tej samej probówki 15 mL.
  4. Wirować komórki przy 300 × g przez 3 min.
  5. Odessać nadsącz i dodać 1-2 mL NIM uzupełnionego o 10 µM inhibitora ROCK.
  6. Ostrożnie resuspender osad komórkowy i określić liczbę komórek.
  7. Odessać pozostały roztwór lamininy z powlekanych naczyń hodowlanych i zasiać komórki z gęstością 1 × 105 komórek/cm2  w NIM uzupełnionym o 10 µM inhibitora ROCK.
  8. Po 24 h zmienić pożywkę na NIM bez inhibitora ROCK.
  9. Dokonywać codziennych zmian pożywki przez 4 dni.
  10. Po tej początkowej fazie indukcji NGN2, pominąć DOX i hodować komórki w NBM, wymieniając połowę pożywki 2x w tygodniu aż do osiągnięcia pożądanego stopnia dojrzewania.
    UWAGA: Zaleca się kokulturę neuronów iNGN2 z astrocytami w celu zwiększenia przeżywalności, przylegania, dojrzałości i aktywności elektrycznej komórek13,22.

6. Charakterystyka neuronów pochodzących z hiPSC

UWAGA: Różnicowanie w kierunku pochodnych neuronalnych można ocenić za pomocą następujących technik.

  1. Immunocytochemia i obrazowanie
    1. Odssać pożywkę z neuronów pochodzących z hiPSC i wypłukać komórki raz roztworem 1x DPBS z Ca2+ i Mg2+ (+/+).
      UWAGA: Pipetować ostrożnie, najlepiej przy krawędziach dołka, ponieważ komórki mogą bardzo łatwo odkleić się od powierzchni. Dla wszystkich etapów płukania zaleca się objętość 0,2 mL na cm2, aby zapewnić całkowite pokrycie komórek roztworem 1x DPBS (+/+).
    2. Utrwalić komórki neuronalne, stosując roztwór do utrwalania zawierający 4% paraformaldehydu w DPBS (+/+) przez 15 min w temperaturze pokojowej (RT). Zalecana objętość to 0,1 mL na cm2.
      UWAGA: Paraformaldehyd (4%) w DPBS jest roztworem niebezpiecznym i drażniącym skórę, ostrej toksyczności i potencjalnej rakotwórczości. Przechowywać z dala od źródeł ciepła, stosować rękawice ochronne i okulary, unikać wdychania i używać roztworu wyłącznie w wentylowanym pomieszczeniu.
    3. Delikatnie wypłukać komórki 2x w 1x DPBS (+/+) i przystąpić do barwienia.
      UWAGA: Utrwalone komórki można przechowywać w DPBS (+/+) w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca do czasu dalszego przetwarzania.
    4. Odssać DPBS (+/+) z próbek. Przeprowadzić permeabilizację komórek i zablokować nieswoiste miejsca wiązania za pomocą 1x DPBS (+/+) zawierającego 1% BSA i 0,2% Triton-X-100 przez 60 min w RT.
      UWAGA: Zalecana objętość to 0,2 mL na cm2.
    5. Usunąć nadsącz i inkubować komórki przez noc w 4 °C z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w buforze do barwienia (1x DPBS [+/+] zawierający 1% BSA) (patrz Tabela materiałów). Upewnić się, że komórki są całkowicie pokryte roztworem.
      UWAGA: Zalecana objętość to 0,1-0,15 mL na cm2.
    6. Odssać bufor do barwienia i wypłukać komórki 3x w 1x DPBS (+/+).
    7. Rozcieńczyć odpowiednie przeciwciała wtórne (patrz Tabela materiałów) w buforze do barwienia do końcowego stężenia 1:1 000.
    8. Inkubować komórki w roztworze rozcieńczonych przeciwciał przez 1 h w RT w ciemności. Upewnić się, że komórki są całkowicie pokryte roztworem.
      UWAGA: Zalecana objętość to 0,1-0,15 mL na cm2.
    9. Odssać roztwór przeciwciał wtórnych i wypłukać komórki 2x w 1x DPBS (+/+).
    10. Przeprowadzić kontrastowe barwienie jąder za pomocą 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) rozcieńczonego w DPBS (+/+) przez 5 min w RT.
      UWAGA: Zalecana objętość robocza to 0,1-0,15 mL na cm2.
    11. Wypłukać komórki 2x w 1x DPBS (+/+).
    12. Przechowywać komórki w DPBS (+/+) w 4 °C do czasu obrazowania.
      UWAGA: Obrazowanie w świetle przechodzącym jest odpowiednie do śledzenia zmian morfologicznych i wzrostu neurytów. Dodatkowo, ekspresję stereotypowych markerów można ocenić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Podczas gdy niezróżnicowane hiPSC wykazują ekspresję OCT 3/4 i NANOG, beta-III-tubulina (TUBB3) i białko MAP2 (microtubule associated protein 2) mogą służyć jako markery neuronalne do wizualizacji neurytów i aksonów. Sieć neurytową można dalej ocenić, wyznaczając długość neurytów na obrazach w świetle przechodzącym lub fluorescencyjnych.
  2. Analizy ekspresji genów metodą ilościowej polimerazy łańcuchowej w czasie rzeczywistym (qPCR)
    1. Odssać pożywkę i wypłukać komórki raz w 1x DPBS (-/-).
      UWAGA: Zalecana objętość to 0,2 mL na cm2.
    2. Dodać zimny bufor do lizy RNA i zebrać komórki poprzez zeskrobanie.
    3. Wyizolować RNA za pomocą odpowiedniego zestawu kolumnowego i oznaczyć stężenie RNA za pomocą fotospektrometrii UV.
    4. Przygotować cDNA, wykorzystując 250 ng całkowitego RNA i odpowiedni zestaw do odwrotnej transkrypcji.
    5. Przygotować reakcje qPCR z użyciem sond molekularnych (molecular beacons) zawierające 2,5 ng cDNA w dwóch powtórzeniach. Użyć odpowiedniego master mixu i odpowiadających mu zestawów starterów20 (patrz Tabela materiałów).
    6. Przeprowadzić qPCR, stosując 45 cykli z przyłączaniem starterów w 60 °C przez 20 s.
    7. Znormalizować względne poziomy ekspresji genów do średniej z genów referencyjnych GAPDH, HPRT1 i GUSB. Zastosować metodę ΔΔCt23, używając niezróżnicowanych hiPSC jako kalibratora.

Wyniki

W etapach początkowych adherentne hodowle hiPSC są odrywane, dysocjowane do pojedynczych komórek i przenoszone do zawiesiny (Rysunek 2). Agregaty formują się w ciągu 24 h i stale zwiększają swoją wielkość. Po 2 dniach indukcji transgenu wczesne neurony mogą zostać kriokonserwowane do późniejszych eksperymentów.

Utrzymująca się proliferacja podczas pierwszych dni w zawiesinie prowadzi do wzrostu liczby komórek, która osiąga szczyt po 2 dniach indukcji (Rycina 3A,B). Równolegle z proliferacją zaczynają rosnąć agregaty. W porównaniu z dniem 0, średnica wykazuje wzrost o 50% w dniu 2 i prawie podwaja się w dniu 5 (Rycina 3D). Chociaż zwiększająca się średnica ogranicza dostawy składników odżywczych do wnętrza agregatów, żywotność komórek nie ulega pogorszeniu w dniu 2 ani w dniu 5 różnicowania (Rycina 3C). Jednak przedłużona hodowla w zawiesinie trwająca ponad 4 dni nie zwiększa dalszej wydajności komórek, ponieważ agregaty stają się coraz bardziej odporne na singularizację enzymatyczną (Rycina 3B).

Po kriokonserwacji komórki z drugiego dnia są rozmrażane i wysiewane na szalki pokryte poli-L-ornityną (PLO)-lamininą w celu końcowej maturacji. Co do zasady komórki bardzo dobrze przywierają po rozmrożeniu i wczesnym etapie zaczynają wydłużać neuryty. Temporalny profil ekspresji genów, a także barwienie immunocytochemiczne na markery neuronalne TUBB3 i MAP2, potwierdzają tożsamość komórek neuronalnych (Rycina 4A,B). Oprócz rosnącego poziomu TUBB3 i MAP2, kultury neuronalne są wzbogacone w transkrypty białka tau związanego z mikrotubulami (MAPT), kodującego białko neuronalne zaangażowane w stabilizację aksonów, i wykazują jednoczesny spadek ekspresji regulującego pluripotencję czynnika transkrypcyjnego POU5F1. Co więcej, w ciągu pierwszego tygodnia po rozmrożeniu tworzy się gęsta sieć neurytów (Rycina 4C). Te zmiany morfologiczne, w połączeniu z profilem transkrypcyjnym, sugerują postępującą maturację kultur neuronalnych.

Schemat indukcji neuronalnej z osią czasu; przedstawiono etapy bioreaktora, hodowli i dojrzewania.
Rysunek 2: Generowanie neuronów iNGN2 pochodzących z hiPSC przy użyciu bioreaktora laboratoryjnego. (A) Schematyczny przegląd paradygmatu różnicowania, wyróżniający kluczowe etapy hodowli komórkowej. (B-F) Obrazy w polu jasnym wizualizują (B) hiPSC oraz (C,D) tworzenie się agregatów w bioreaktorze laboratoryjnym. (E,F) Neurony iNGN2 wydłużają neuryty i przechodzą zmiany morfologiczne podczas różnicowania. Pasek skali = 100 µm. Skróty: BMM = macierz błony podstawnej; iPSC-MM = pożywka do utrzymania hiPSC; PLO = poli-L-ornityna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Proces agregacji komórek w ciągu 5 dni; obrazy mikroskopowe, wykresy wydajności, żywotności i wielkości agregatów.
Rycina 3: Wydajność i żywotność komórek podczas formowania i wzrostu agregatów. (A) Obrazy w polu jasnym przedstawiają formowanie się agregatów w ciągu 2 dni hodowli w bioreaktorze laboratoryjnym, a także wzrost wielkości agregatów w czasie. Pasek skali = 500 µm. (B) Ilościowe oznaczenie wydajności komórek i (C) ich żywotności w trakcie przebiegu różnicowania. Wykresy słupkowe przedstawiają średnią + SD z czterech niezależnych eksperymentów. (D) Średnicę, będącą wskaźnikiem wielkości agregatów, wyznaczono półautomatycznie przy użyciu oprogramowania open-source ImageJ (wersja 1.53). Najpierw obrazy w polu jasnym przekształcono w obrazy binarne, a następnie poddano dalszej ocenie za pomocą narzędzia analyze particles, stosując następujące parametry: size > 2,500 µm2, circularity 0.45-1, exclude edges oraz include holes. Linie poziome wskazują średnią ± SD z pięciu niezależnych procesów różnicowania. Pojedyncze kropki reprezentują średnią z poszczególnych eksperymentów różnicowania z co najmniej 20 agregatami w każdym punkcie czasowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres ekspresji genów, mikroskopia fluorescencyjna, wykres słupkowy sieci neurytów, różnicowanie komórek.
Rycina 4: Charakterystyka neuronów iNGN2 pochodzących z hiPSC. Czasowy profil ekspresji genów dla genów neuronalnych TUBB3, MAP2, oraz MAPT, a także genu związanego z pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi POU5F1. Względne poziomy ekspresji znormalizowano względem genów referencyjnych GAPDH, HPRT1, oraz GUSB. Jako kalibrator wybrano nieróżnicowane hiPSC (dzień -2). Symbole geometryczne oznaczają średnią ± SD z czterech niezależnych różnicowań. (B) Reprezentatywne obrazy neuronów iNGN2 w 7. dniu po rozmrożeniu (dzień -2 + 7), barwione pod kątem beta-III-tubuliny (TUBB3, magenta) i białka MAP2 (MAP2, cyjan). Jądra komórkowe skontrastowano barwnikiem DAPI. Paski skali = 100 µm. (C) Ocena sieci neurytów na obrazach w polu jasnym kultur neuronalnych po rozmrożeniu. Całkowitą długość neurytów określono na obszarze 930,82 × 698,11 µm2 przy użyciu programu ImageJ (wersja 1.53). Po dostosowaniu jasności i kontrastu obrazy przekształcono w obrazy 8-bitowe, a kolory odwrócono. Następnie neuryty poddano szkieletyzacji, a następnie przeanalizowano przy użyciu wtyczek ImageJ „Skeletonize” i „Analyze Skeleton” odpowiednio. Całkowitą długość neurytów podzielono przez liczbę som w badanym obszarze, aby uzyskać średnią długość neurytów na komórkę. Wykresy słupkowe przedstawiają średnią + SD z trzech niezależnych eksperymentów. Skróty: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Wcześniej wykazano, że ektopowa ekspresja neuronalnego czynnika transkrypcyjnego NGN2 przyspiesza wczesne etapy różnicowania neuronów i indukuje zaangażowanie linii neuronalnej w hiPSC w ciągu 1 tygodnia od hodowli 12,13,20. W niniejszej pracy opisano szczegółowy protokół różnicowania hiPSC BIONi010-C-13 z edytowanymi genami w neurony iNGN2 przy użyciu bioreaktora laboratoryjnego.

Bioreaktor CERO 3D to bioreaktor o małej objętości z czterema szczelinami na specjalistyczne rurki, każda o maksymalnej pojemności 50 ml. Temperatura i poziom CO2 są stale kontrolowane, a parametry uprawy (np. prędkość obrotowa i czas) są regulowane dla każdej rury, niezależnie umożliwiając użytkownikom równoległe stosowanie kilku podejść do różnicowania. Zintegrowane łamacze fal na wewnętrznej ściance rury pozwalają na zakłócenia medium przy niskim naprężeniu ścinającym i utrzymują agregaty 3D w zawieszeniu podczas kontrolowanego obrotu. Ograniczony dostęp do składników odżywczych, a także wymuszone interakcje 3D komórka-komórka i komórka-macierz zewnątrzkomórkowa (ECM), mogą znacząco wpływać na różnicowanie i zachowanie komórek 24,25,26,27.

Hodowla komórek jako agregatów 3D w zawiesinie zwiększa te interakcje komórkowe, naśladując w ten sposób bardziej zbliżone środowisko in vivo tkanek lub narządów28. Jednoczesne zaburzenie ośrodka reguluje wielkość agregatu pod wpływem tarcia mechanicznego, poprawia wymianę gazową i zmniejsza gradient składników odżywczych i odpadów w rurze, zachowując jednocześnie fizjologicznie odpowiednie gradienty wewnątrz agregatów 29,30,31,32,33,34. Chociaż zmiany podłoża są wykonywane ręcznie, bioreaktor laboratoryjny zmniejsza koszty pracy i eksploatacji w porównaniu ze statycznymi kolbami hodowlanymi. Bioreaktor ma również kilka zalet w porównaniu z w pełni zautomatyzowanymi bioreaktorami z mieszadłem, ponieważ konstrukcja bez wirnika zmniejsza hydrodynamiczne naprężenia ścinające na powierzchni agregatu, poprawiając w ten sposób nie tylko przeżywalność komórek, ale także ograniczając wpływ naprężeń ścinających na wrażliwe iPSC, różnicowanie komórek i funkcję 35,36,37,38.

Bioreaktory z kołem pionowym, w których komórki są mieszane przez duży wirnik pionowy, a także bioreaktory z ruchem kołysanym wykorzystujące napompowane worki hodowlane przymocowane do platformy z napędem silnikowym, stanowią alternatywne platformy zawieszenia 3D. Chociaż nadmiernie przetestowano je pod kątem hodowli hiPSCs 17,18,19,39,40, niewiele wiadomo na temat ich zastosowania w podejściach do różnicowania neuronów, a doniesienia ograniczają się do udanej ekspansji neuronalnych komórek prekursorowych ssaków i ludzi w bioreaktorach z mieszadłem 41,42,43,44 , przy czym nieliczna liczba badań koncentrowała się na dojrzewaniu44,45. Ogólnie rzecz biorąc, zautomatyzowane platformy zawieszenia 3D mają tę zaletę, że są w pełni zautomatyzowane i sterowane komputerowo zmiany medium, zmniejszając w ten sposób różnice w obsłudze i minimalizując ryzyko zanieczyszczenia. Ponadto parametry składników odżywczych, takie jak stężenie mleczanu i glukozy, mogą być stale monitorowane. Jednak stworzenie tych systemów często wymaga znacznych inwestycji początkowych, powierzchni laboratoryjnej i przeszkolenia wykwalifikowanego personelu. Bioreaktor laboratoryjny stanowi kompaktową i łatwą w użyciu alternatywę do hodowli komórek w zawiesinie, ale nie zapewnia jednoczesnego monitorowania składników odżywczych.

Podobnie jak w przypadku większości protokołów stosowanych do hodowli komórek na platformach zawiesinowych 3D, początkowe formowanie agregatów stanowi krytyczny krok. hiPSC są hodowane jako przylegające monowarstwy, a następnie przenoszone jako zawiesiny jednokomórkowe do środowiska 3D. Aby zminimalizować utratę komórek na tym etapie, należy wziąć pod uwagę kilka aspektów. Konstrukcja probówek ze zintegrowanymi łamaczami fal oznacza, że wymagana jest minimalna objętość hodowli wynosząca 10 ml na probówkę, aby zapewnić optymalne zakłócenia medium. W związku z tym w perspektywie długoterminowej nie należy podcinać krytycznego wolumenu. Ponadto wysoce zalecana jest początkowa gęstość wysiewu wynosząca 7,5 miliona komórek na 10 ml objętości kultury i prędkość obrotowa 60 obr./min w celu utworzenia stabilnych agregatów w krótkim okresie, chociaż adaptacje mogą być konieczne w zależności od linii komórkowej.

Po przeniesieniu hiPSC do zawiesiny, w ciągu 24 godzin powinny powstać agregaty. Pierwsza zmiana podłoża jest krytyczna, ponieważ agregaty są małe i mogą nie osiadać prawidłowo. Czas sedymentacji agregatów może być wydłużony, ale nie powinien przekraczać więcej niż 10 minut, ponieważ agregaty mogą zacząć zbijać się w bryły i rosnąć w niejednorodny sposób. Podczas aspiracji w probówce należy pozostawić minimalną objętość kultury wynoszącą 5 ml i unikać wszelkich zakłóceń pożywki. Niemniej jednak w początkowych fazach należy spodziewać się utraty komórek i agregatów. Liczba komórek wskazuje na stałą wydajność komórek w ciągu pierwszych 2 dni w hodowli, co wskazuje, że wysoka zdolność proliferacyjna hiPSC kompensuje początkową utratę komórek. Po zawieszeniu, delikatna uprawa i perturbacja prowadzą do powstania agregatów o jednorodnej wielkości, które z czasem zaczynają rosnąć.

Różnicowanie neuronów przeprowadzono zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem opartym na nadekspresji NGN2 indukowanej doksycykliną13, a poszczególne etapy zoptymalizowano pod kątem hodowli 3D. Neuronalny czynnik transkrypcyjny NGN2 jest dobrze opisanym czynnikiem różnicowania neuronów i znacznie przyspiesza indukcję neuronów 11,13,46. Podczas gdy konwencjonalne wzorce ze zdefiniowanymi czynnikami wzrostu trwają od kilku tygodni do miesięcy 7,8,9, ekspresja NGN2 indukuje los komórek neuronalnych w ciągu kilku dni. Oprócz skróconego czasu uprawy, protokół nie zależy ani od drogich czynników wzrostu, ani od matryc powlekających dla początkowej kultury zawiesinowej, co dodatkowo obniża koszty uprawy.

Co więcej, bezpośrednie porównanie napędzanej przez NGN2 generacji niedojrzałych neuronów w kulturach adherentnych i zawiesinowych wykazało 1,36-krotny wzrost liczby komórek po 4 dniach hodowli przy użyciu bioreaktoralaboratoryjnego 20, podczas gdy oczekuje się, że objętość pożywki potrzebna do wytworzenia 1 miliona komórek zostanie zmniejszona o połowę. Wykorzystanie bioreaktora stacjonarnego do generowania neuronów iNGN2 może być zatem korzystne, ponieważ można wyprodukować większą liczbę komórek przy krótszym czasie i kosztach obsługi. Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, zaangażowanie linii neuronalnej zaobserwowano na wczesnym etapie. Po 2 dniach indukcji NGN2 widoczna była głęboka ekspresja klasycznych markerów neuronalnych, takich jak TUBB3, MAP2 i MAPT, co potwierdza możliwość zastosowania bioreaktora laboratoryjnego do indukcji neuronów. Zgodnie z tym protokołem, około 6,2 miliona niedojrzałych neuronów iNGN2 można uzyskać z 1 miliona hiPSC w ciągu 4 dni od hodowli. Jednak wydajność wyjściowa może się różnić w zależności od partii i zależeć od objętości kultury zawiesinowej podczas siewu.

Aby jeszcze bardziej zwiększyć plon, czas uprawy został wydłużony o dodatkowe 3 dni; Jednakże, chociaż agregaty stały się większe, stały się również bardzo zwarte i nie mogły być prawidłowo oddzielone w celu kriokonserwacji lub ponownego powlekania. Pomimo postępów w podejściu do hodowli 3D, przylegające hodowle neuronów 2D są nadal złotym standardem w analizach funkcjonalnych, takich jak układy mikroelektrod lub obrazowanie wapnia. Singularyzacja komórek jest zatem ważnym warunkiem wstępnym dla jednorodnie rozmieszczonej monowarstwy neuronalnej i sieci neuronalnej. Silniejsze mechaniczne oderwanie komórek lub ostre odczynniki dysocjacyjne mogą być stosowane w celu zapewnienia singularizacji, ale z potencjalnym wpływem na żywotność komórek, fizjologię i zdolność ponownego przyłączenia47,48. Jeśli chodzi o konieczność posiadania pojedynczych komórek do dalszych analiz i dojrzewania, agregaty zostały zdysocjowane po 4 dniach w zawiesinie, a neurony iNGN2 (dzień 2) uległy krioprezerwacji. Różnicowanie i charakterystyka neuronów iNGN2 po rozmrożeniu potwierdziły rosnącą dojrzałość kultur neuronalnych i tworzenie się gęstej sieci neuronowej.

Dostarczony protokół daje dużą liczbę neuronów iNGN2. Należy jednak wziąć pod uwagę kilka ograniczeń. Podobnie jak w przypadku większości platform do hodowli zawiesinowych, przeniesienie hiPSC z hodowli przylegającej 2D do środowiska 3D ma kluczowe znaczenie i często wiąże się z głęboką utratą komórek. Oczekuje się dalszych znacznych strat komórek i agregatów podczas zmian pożywki. W porównaniu z platformami zautomatyzowanymi, czas obsługi i ryzyko zanieczyszczenia przy użyciu bioreaktora stołowego są wydłużone, ponieważ wymiana medium musi być wykonywana ręcznie. Oprócz braku automatyzacji, bioreaktor laboratoryjny nie oferuje możliwości monitorowania składników odżywczych, a maksymalna pojemność 50 ml na probówkę ogranicza potencjał skalowania protokołu. Na koniec ważne jest, aby zauważyć, że chociaż NGN2 przyspiesza zaangażowanie linii neuronalnej, czas dojrzewania końcowego nie ulega skróceniu i nadal wymaga długotrwałej hodowli przez kilka tygodni. Biorąc pod uwagę znaczenie wsparcia astrocytarnego dla funkcji neuronów, przywiązania i przeżycia 49,50,51, należy rozważyć podejścia oparte na kokulturze, które mogą być nawet niezbędne do długoterminowej hodowli.

Podsumowując, protokół różnicowania 2D został z powodzeniem przeniesiony do środowiska 3D w celu szybkiego i powtarzalnego generowania neuronów iNGN2 poprzez wdrożenie bioreaktora stacjonarnego. Opisany protokół pozwala na uzyskanie dużej ilości dobrej jakości neuronów pochodzących z iPSC, które mogą służyć jako punkt wyjścia do złożonych testów modelowych, wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków i testów toksyczności na dużą skalę.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Projekt EBiSC2 otrzymał dofinansowanie od Wspólnego Przedsięwzięcia (JU) Inicjatywy Leków Innowacyjnych (JU) na podstawie umowy o grant nr 821362. Wspólne Przedsięwzięcie otrzymuje wsparcie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji "Horyzont 2020" oraz EFPIA. Dziękujemy Nadine J. Smandzich, Helene D. M. Hemmer, Johnn-Majd Balsters i Vanessie M. Nalewaja za pomoc w analizach immunocytochemicznych i ekspresji genów, a także Heike Arthen za doskonałe wsparcie techniczne. Ponadto dziękujemy Stephanie Bur za stworzenie programu bioreaktorów. Rysunek 2A został utworzony za pomocą BioRender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanol 50 mMGibco 
60 mm Nunclon Delta SurfaceNunc734-2040
Przeciwciało tubulinowe anty-beta III [TU-20] (rozcieńczenie 1:1,000)Abcam   AB7751 
Biosystemy stosowane  Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemnościThermo Fisher Scientific   
Suplement B-27 (50x) Gibco11530536suplement bez surowicy (50x)
BIONi010-C-13 linia hiPSCEuropejski Bank dla indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (EBiSC), BIONEER jako deponentSAMEA103988285Bioneer jest deponentem w EBiSC i właścicielem linii hiPSC.
Biorender 
Klasa hodowli komórkowej BSAThermo Fisher Scientific   
Inkubator CERO 3D & BioreaktorOLS OMNI Life Science2800000
CEROtubes Probówki do hodowli komórkowych 50 mLOLS OMNI Life Science2800005
Citavi 6Swiss Academic Software
CryoStor CS10Stemcell7930pożywka zamrażająca zawierająca 10% DMSO
Cytofix Fixation SolutionBD Biosciences 554655roztwór utrwalający zawierający 4% paraformaldehydu 
DAPI (BARWIENIE UTRWALONYCH KOMÓREK NUCBLUE) Thermo Fisher Naukowy   
Chlorowodorek doksycykliny (DOX)Sigma-AldrichD3447
DPBS bez wapnia i magnezu (DPBS -/-) Gibco14190250
DPBS z Wapniem i Magnezem (DPBS +/+) Gibco11580456
DMEM/F12 (-/-)Gibco21331-020
DMEM/F-12, suplement GlutaMAXGibco31331-028
EVOS XL System obrazowania komórek rdzeniowychThermo Fisher Scientific
Goat anty-mysie IgG (H+L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific   A21424
Suplement GlutaMAX Gibco 35050-038stabilizowany dipeptyd L-alanylo-L-glutaminy
ImageJ 1.51v National Institute of Health
Roztwór insuliny ludzkiSigma-AldrichI9278l
LamininMerckL2020
MACSQuant AnalyzerMiltenyi
MAP2 Przeciwciało monoklonalne (rozcieńczenie 1: 300)Thermo Fisher Scientific   13-1500 
Matrigel Zredukowany czynnik wzrostu, bez czerwieni fenolowej Nauki przyrodnicze Corning 356231matryca błony podstawnej
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)Gibco 
11140035 Zestaw optycznych folii samoprzylepnych MicroAmp Thermo Fisher Naukowy   
mTeSR1Stemcell85850bezfeederowe podłoże do konserwacji iPSC 
Suplement N-2 (100x)Gibco17502-048bez serum Suplement na bazie Bottensteina s Preparat N-1
Neurobasal MediumGibco11570556
Nikon Eclipse TS2Nikon Instruments Europe B.V.
NucleoCounter-NC200ChemoMetec A/S
Pochodzenie 2021OriginLab
Penicylina-StreptomycynaGibco11548876
Bufor do trwałej ondulacji/płukania BD Nauki Biologiczne 
Test podkładowy TUBB3(Hs00801390_s1)Test podstawowy Thermo Fisher Scientific11620099
Test podkładowy GAPDH (Hs99999905_m1)Thermo Fisher Scientific11620099
GUSB (Hs99999908_m1)Thermo Fisher Scientific11620099
Test gruntowy HPRT1 (Hs99999909_m1)Thermo Fisher Scientific11620099
podkładowy MAP2 (Hs00258900_m1)Thermo Fisher Scientific11620099
Test podkładowy MAPT (Hs00902194_m1)Thermo Fisher Scientific11620099
Test wstępny POU5F1 (Hs04260367_gH)Thermo Fisher Scientific11620099
Poli-L-ornityna 0,01%MerckP4957
RNeasy Plus Micro Kit (50)-ZestawQiagen74034Zestaw do izolacji RNA oparty na kolumnie
Bufor RLTQiagen79216Bufor do lizy komórek
Pirogronian sodu (100 mM)Gibco12539059
StemPro AccutaseGibco11599686enzym dysocjacji komórek
TAQMAN FAST ADVANCED MASTER MIXThermo Fisher Scientific   11380912qPCR master mix
Triton-X-100Sigma-AldrichT8787
TrypLE Select EnzymGibco12563-011Roztwór trypsyny-EDTA
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher ScientificAM9260G
KasetaVia1 ChemoMetec A/S941-0012
Filtrowane końcówki do pipet o szerokim otworzeThermo Fisher Naukowe10088880
X20 OPTYCZNE 96-DOŁKOWE SZYBKIE PRZEZROCZYSTE PŁYTKI REAKCYJNE Thermo Fisher Scientific15206343
dichlorowodorek Y-27632, inhibitor kinazy Rho (inhibitor ROCK)Abcamab120129
1152892610400745Biorender.com123300231233355310095714554723Test gruntowy Test gruntowy Test Test podkładowy

Bibliografia

  1. Feigin, V. L., et al. The global burden of neurological disorders: translating evidence into policy. The Lancet. Neurology. 19 (3), 255-265 (2020).
  2. Olesen, J., Gustavsson, A., Svensson, M., Wittchen, H. -U., Jönsson, B. The economic cost of brain disorders in Europe. European Journal of Neurology. 19 (1), 155-162 (2012).
  3. Preclinical Development: The Safety Hurdle Prior to Human Trials. American Pharmaceutical Review. , Available from: https://www.americanpharmaceuticalreview.com/Featured-Articles/187349-Preclinical-Development-The-Safety-Hurdle-Prior-to-Human-Trials (2016).
  4. van Norman, G. A. Phase II trials in drug development and adaptive trial design. JACC. Basic to Translational Science. 4 (3), 428-437 (2019).
  5. van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: part 2: potential alternatives to the use of animals in preclinical trials. JACC. Basic to Translational Science. 5 (4), 387-397 (2020).
  6. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  7. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  8. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  9. Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PloS One. 8 (3), 59252(2013).
  10. Hulme, A. J., Maksour, S., St-Clair Glover, M., Miellet, S., Dottori, M. Making neurons, made easy: the use of Neurogenin-2 in neuronal differentiation. Stem Cell Reports. 17 (1), 14-34 (2022).
  11. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  12. Schmid, B., et al. Generation of two gene edited iPSC-lines carrying a DOX-inducible NGN2 expression cassette with and without GFP in the AAVS1 locus. Stem Cell Research. 52, 102240(2021).
  13. Shih, P. -Y., et al. Development of a fully human assay combining NGN2-inducible neurons co-cultured with iPSC-derived astrocytes amenable for electrophysiological studies. Stem Cell Research. 54, 102386(2021).
  14. Chang, C. -Y., et al. Induced pluripotent stem cell (iPSC)-based neurodegenerative disease models for phenotype recapitulation and drug screening. Molecules. 25 (8), 2000(2000).
  15. Silva, M. C., Haggarty, S. J. Human pluripotent stem cell-derived models and drug screening in CNS precision medicine. Annals of the New York Academy of Sciences. 1471 (1), 18-56 (2020).
  16. Elanzew, A., Sommer, A., Pusch-Klein, A., Brüstle, O., Haupt, S. A reproducible and versatile system for the dynamic expansion of human pluripotent stem cells in suspension. Biotechnology Journal. 10 (10), 1589-1599 (2015).
  17. Davis, B. M., Loghin, E. R., Conway, K. R., Zhang, X. Automated closed-system expansion of pluripotent stem cell aggregates in a rocking-motion bioreactor. SLAS Technology. 23 (4), 364-373 (2018).
  18. Kropp, C., et al. Impact of feeding strategies on the scalable expansion of human pluripotent stem cells in single-use stirred tank bioreactors. Stem Cells Translational Medicine. 5 (10), 1289-1301 (2016).
  19. Borys, B. S., et al. Overcoming bioprocess bottlenecks in the large-scale expansion of high-quality hiPSC aggregates in vertical-wheel stirred suspension bioreactors. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 55(2021).
  20. Kwok, C. K., et al. Scalable expansion of iPSC and their derivatives across multiple lineages. Reproductive Toxicology. 112, 23-35 (2022).
  21. User Protocol for Human induced Pluripotent Stem Cells. EBiSC. , Available from: https://ebisc.org/docs/ebisc/EBiSC_User_Protocol_for_Human_induced_Pluripotent_Stem_Cells.pdf (2023).
  22. Neyrinck, K., et al. SOX9-induced generation of functional astrocytes supporting neuronal maturation in an all-human system. Stem Cell Reviews and Reports. 17 (5), 1855-1873 (2021).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  24. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
  25. Burdick, J. A., Vunjak-Novakovic, G. Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation. Tissue Engineering. Part A. 15 (2), 205-219 (2009).
  26. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125, 3015-3024 (2012).
  27. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  28. Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).
  29. Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. Effects of hydrodynamics on cultures of mammalian neural stem cell aggregates in suspension bioreactors. Industrial and Engineering Chemical Research. 40 (23), 5350-5357 (2001).
  30. Gerecht-Nir, S., Cohen, S., Itskovitz-Eldor, J. Bioreactor cultivation enhances the efficiency of human embryoid body (hEB) formation and differentiation. Biotechnology and Bioengineering. 86 (5), 493-502 (2004).
  31. Zhao, F., et al. Effects of oxygen transport on 3-d human mesenchymal stem cell metabolic activity in perfusion and static cultures: experiments and mathematical model. Biotechnology Progress. 21 (4), 1269-1280 (2005).
  32. Cimetta, E., Figallo, E., Cannizzaro, C., Elvassore, N., Vunjak-Novakovic, G. Micro-bioreactor arrays for controlling cellular environments: design principles for human embryonic stem cell applications. Methods. 47 (2), 81-89 (2009).
  33. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells. Tissue Engineering. Part A. 16 (2), 405-421 (2010).
  34. Sargent, C. Y., et al. Hydrodynamic modulation of embryonic stem cell differentiation by rotary orbital suspension culture. Biotechnology and Bioengineering. 105 (3), 611-626 (2010).
  35. Liu, N., Zang, R., Yang, S. -T., Li, Y. Stem cell engineering in bioreactors for large-scale bioprocessing. Engineering in Life Sciences. 14 (1), 4-15 (2014).
  36. Wolfe, R. P., Leleux, J., Nerem, R. M., Ahsan, T. Effects of shear stress on germ lineage specification of embryonic stem cells. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (10), 1263-1273 (2012).
  37. Wolfe, R. P., Ahsan, T. Shear stress during early embryonic stem cell differentiation promotes hematopoietic and endothelial phenotypes. Biotechnology and Bioengineering. 110 (4), 1231-1242 (2013).
  38. Shafa, M., et al. Impact of stirred suspension bioreactor culture on the differentiation of murine embryonic stem cells into cardiomyocytes. BMC Cell Biology. 12 (1), 53(2011).
  39. Kwok, C. K., et al. Scalable stirred suspension culture for the generation of billions of human induced pluripotent stem cells using single-use bioreactors. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1076-1087 (2018).
  40. Rodrigues, C. A. V., et al. Scalable culture of human induced pluripotent cells on microcarriers under xeno-free conditions using single-use vertical-wheel™ bioreactors. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 93 (12), 3597-3606 (2018).
  41. Gilbertson, J. A., Sen, A., Behie, L. A., Kallos, M. S. Scaled-up production of mammalian neural precursor cell aggregates in computer-controlled suspension bioreactors. Biotechnology and Bioengineering. 94 (4), 783-792 (2006).
  42. Baghbaderani, B. A., et al. Expansion of human neural precursor cells in large-scale bioreactors for the treatment of neurodegenerative disorders. Biotechnology Progress. 24 (4), 859-870 (2008).
  43. Baghbaderani, B. A., et al. Bioreactor expansion of human neural precursor cells in serum-free media retains neurogenic potential. Biotechnology and Bioengineering. 105 (4), 823-833 (2010).
  44. Serra, M., Brito, C., Costa, E. M., Sousa, M. F. Q., Alves, P. M. Integrating human stem cell expansion and neuronal differentiation in bioreactors. BMC Biotechnology. , 82(2009).
  45. Zhao, S., et al. Generation of cortical neurons through large-scale expanding neuroepithelial stem cell from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 431(2020).
  46. Pawlowski, M., et al. Inducible and deterministic forward programming of human pluripotent stem cells into neurons, skeletal myocytes, and oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
  47. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 818-827 (2008).
  48. Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61 (1), 78-84 (2016).
  49. Allen, N. J. Astrocyte regulation of synaptic behavior. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 439-463 (2014).
  50. Verkhratsky, A., Nedergaard, M., Hertz, L. Why are astrocytes important. Neurochemical Research. 40 (2), 389-401 (2015).
  51. Jäkel, S., Dimou, L. Glial cells and their function in the adult brain: a journey through the history of their ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 24(2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Neurony Neurogeniny 2trójwymiarowy bioreaktorindukowane pluripotencjalne komórki macierzysteróżnicowanie neuronalnehodowla zawiesinowaindukcja doksycyklinąpożywka do indukcji neuronalnejtworzenie agregatów komórkowychprotokół kriozachowaniaekspresja markerów neuronalnych
Produkcja ludzkich neuronów indukowanych neurogeniną 2 w trójwymiarowym bioreaktorze zawiesinowym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.