Artykuł metodologiczny

Skuteczne unaczynienie organoidów nerkowych poprzez docelomiczne przeszczepienie zarodków kurczaków

DOI:

10.3791/65090

⸱

17 lutego 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine - Nephrology, Leiden University Medical Center, 2Einthoven Laboratory of Vascular and Regenerative Medicine, Leiden University Medical Center, 3IBPS, CNRS UMR7622, Developmental Biology Laboratory, Sorbonne Université, 4The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Leiden University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół przeszczepu organoidów nerkowych w jamie celomicznej zarodków kurczaków. Metoda ta indukuje unaczynienie i przyspieszone dojrzewanie organoidów w ciągu 8 dni i może być wykorzystana do skutecznego badania tych procesów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoidy nerkowe pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych zawierają struktury podobne do nefronów, które do pewnego stopnia przypominają te w dorosłej nerce. Niestety, ich zastosowanie kliniczne jest utrudnione ze względu na brak funkcjonalnego unaczynienia, a co za tym idzie ograniczone dojrzewanie in vitro. Przeszczepienie organoidów nerkowych w jamie celomicznej zarodków kurczaków indukuje unaczynienie przez perfundowane naczynia krwionośne, w tym tworzenie naczyń włosowatych kłębuszków nerkowych i przyspiesza ich dojrzewanie. Technika ta jest bardzo wydajna, pozwalająca na przeszczepianie i analizę dużej liczby organoidów. W artykule opisano szczegółowy protokół intracelomicznego przeszczepiania organoidów nerkowych w zarodkach kurczaków, a następnie wstrzyknięcia znakowanej fluorescencyjnie lektyny w celu zabarwienia perfundowanego naczynia krwionośnego oraz pobrania przeszczepionych organoidów do analizy obrazowej. Metoda ta może być wykorzystana do indukowania i badania unaczynienia i dojrzewania organoidów w celu znalezienia wskazówek dotyczących wzmocnienia tych procesów in vitro i poprawy modelowania chorób.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykazano, że organoidy nerkowe pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) mają potencjał do badań rozwojowych1,2,3,4, badanie toksyczności5,6, oraz modelowanie chorób5,7,8,9,10,11,12,13. Jednak ich zastosowanie do tych i ewentualnych celów klinicznych transplantacji jest ograniczone przez brak sieci naczyniowej. Podczas rozwoju nerek embrionalnych podocyty, komórki mezangialne i komórki śródbłonka naczyniowego (EC) oddziałują na siebie, tworząc skomplikowaną strukturę kłębuszka nerkowego. Bez tej interakcji bariera filtracji kłębuszkowej, składająca się z podocytów, błony podstawnej kłębuszków nerkowych (GBM) i EC, nie może rozwijać się prawidłowo14,15,16. Chociaż organoidy nerkowe in vitro zawierają pewne EC, nie tworzą one prawidłowej sieci naczyniowej i z czasem zanikają17. Nic więc dziwnego, że organoidy pozostają niedojrzałe. Przeszczep u myszy indukuje unaczynienie i dojrzewanie organoidów nerkowych18,19,20,21. Niestety jest to pracochłonny proces, który nie nadaje się do analizy dużej liczby organoidów.

Kurze embriony są wykorzystywane do badania unaczynienia i rozwoju od ponad wieku22. Są łatwo dostępne, wymagają niewielkiej konserwacji, nie mają w pełni funkcjonalnego układu odpornościowego i mogą rozwijać się normalnie po otwarciu skorupki jajka23,24,25,26. Wykazano, że przeszczepianie organoidów na błonę kosmówkowo-omoczniową (CAM) prowadzi do unaczynienia27. Jednak czas trwania przeszczepu na CAM, jak również poziom dojrzałości przeszczepu, są ograniczone przez tworzenie CAM, które trwa do 7 dnia embrionalnego. W związku z tym niedawno opracowano metodę skutecznego unaczyniania i dojrzewania organoidów nerkowych poprzez docelomiczny przeszczep w zarodkach kurczaków28. Od lat 30. XX wieku wiadomo, że celomiczna jama zarodków kurczaków jest środowiskiem sprzyjającym różnicowaniu tkanek embrionalnych29,30. Dostęp do niego można uzyskać na wczesnym etapie rozwoju embrionalnego i pozwala na stosunkowo nieograniczoną ekspansję przeszczepu we wszystkich kierunkach.

Ten artykuł przedstawia protokół przeszczepu organoidów nerkowych pochodzących z hiPSC w jamie celomicznej zarodków kurcząt dnia 4. Ta metoda indukuje unaczynienie i przyspieszone dojrzewanie organoidów w ciągu 8 dni. Wstrzyknięcie znakowanej fluorescencyjnie soczewki culinaris aglutynininy (LCA) przed złożeniem w ofierze zarodków umożliwia wizualizację perfundowanych naczyń krwionośnych w organoidach za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z holenderskim prawem, zgoda komitetu ds. dobrostanu zwierząt nie była wymagana dla tych badań.

1. Przygotowanie organoidów nerkowych pochodzących z hiPSC do przeszczepu

  1. Różnicowanie hiPSC od organoidów nerkowych za pomocą protokołu opracowanego przez Takasato et al.4,18,31. Hodować organoidy zgodnie z niniejszym protokołem na poliestrowych wkładkach do hodowli komórkowych z porami 0,4 μm (wkładki do hodowli komórkowych) do 7 + 12 dnia różnicowania. Każda wkładka do hodowli komórkowej będzie zawierała trzy organoidy.
  2. Usuń organoidy z wkładki do hodowli komórkowej.
    1. Zrób otwór w środku błony wkładki do hodowli komórkowej za pomocą pary kleszczy preparacyjnych. Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj trzy nacięcia w błonie od otworu pośrodku do krawędzi wkładki do hodowli komórkowej, przecinając między organoidami. Spowoduje to powstanie trzech kawałków błony, z których każdy ma dołączony jeden organoid, które są nadal połączone z wkładką do hodowli komórkowej na ich zewnętrznej krawędzi.
    2. Chwyć jeden z kawałków błony blisko jej zewnętrznej krawędzi za pomocą kleszczy i oderwij go od wkładki do hodowli komórkowej. Umieść kawałek membrany z dołączonym organoidem na szalce Petriego. Dodaj kilka kropli soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) bez wapnia i magnezu (DPBS-/-) firmy Dulbecco do organoidu, aby uniknąć odwodnienia. Powtórz tę czynność dla pozostałych dwóch organoidów.
  3. Przetnij organoidy na pół, przytrzymując ich błonę na miejscu kleszczami i przecinając je na pół obosieczną żyletką ze stali nierdzewnej (cały organoid jest zbyt duży, aby celom mógł się pomieścić na tym etapie rozwoju). Delikatnie zepchnij dwie połówki organoidu z membrany za pomocą dysektora opony twardej. Wyrzuć błonę i pozostaw organoidy w DPBS-/- do czasu przeszczepu.
    UWAGA: Do przeszczepu należy przygotować maksymalnie trzy organoidy na raz, aby uniknąć stresu dla organoidów przed przeszczepem. Idealnie byłoby, gdyby jedna osoba przygotowywała organoidy, podczas gdy inna wykonywała przeszczep.

2. Przygotowanie zarodków kurcząt do przeszczepu

  1. Wysiaduj zapłodnione białe jaja leghorn. Rozpocznij inkubację jaj w różnicowaniu organoidów nerkowych w 7 + 8 dniu, aby zapewnić prawidłowy czas przeszczepu.
    1. Umieść zapłodnione jaja białego leghorna (Gallus domesticus) poziomo na uchwycie (Rysunek 1A; dzień 0), zaznaczając ołówkiem środek strony skierowanej do góry.
      UWAGA: Jako uchwyty do inkubacji jaj można użyć wykonanych na zamówienie plastikowych uchwytów lub kartonów na jajka.
    2. Umieść uchwyt z jajami w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 38 ± 1 ºC (Rysunek 1A; dzień 0).
    3. Wysiaduj jaja przez 3 dni, utrzymując napełniony zbiornik na wodę w inkubatorze.
  2. Utwórz okno w skorupce jajka w 3 dniu inkubacji.
    1. W 3 dniu inkubacji umieść mały kawałek (~1 cm x 0,5 cm) przezroczystej taśmy na spiczastej końcówce jaja (mały koniec). Zrób mały otwór w skorupce jajka na środku przezroczystej taśmy, stukając w nią ostrym końcem nożyczek do preparowania.
    2. Wprowadzić igłę 19 G na strzykawce o pojemności 5 ml do otworu pod kątem 45°, unikając uszkodzenia woreczka żółtkowego, i odessać 2-3 ml białka z jaja, aby obniżyć zarodek do wnętrza jaja. Uszczelnij otwór drugim kawałkiem (~1 cm x 0,5 cm) przezroczystej taśmy.
    3. Umieść duży kawałek (~5 cm x 5 cm) przezroczystej taśmy na zaznaczonej ołówkiem, skierowanej do góry stronie jajka. Zrób otwór w skorupce jajka w środku przezroczystej taśmy, stukając w nią ostrym końcem nożyczek do preparowania (Rysunek 1A; Dzień 3).
    4. Zaczynając od tego otworu, wytnij małe okrągłe okienko w skorupce jajka za pomocą zakrzywionych nożyczek preparacyjnych. Spójrz przez to okno, aby zlokalizować zarodek, a następnie powiększ okno, aby zoptymalizować dostęp do zarodka (Rysunek 1A; Dzień 3).
    5. Usuń wszelkie duże kawałki skorupki jaja, które mogły spaść na zarodek za pomocą kleszczy. Usuń mniejsze kawałki, umieszczając kilka kropli DPBS z wapniem i magnezem (DPBS+/+) na zarodku za pomocą plastikowej pipety transferowej, a następnie zasysając DPBS+/+ ze skorupką jajka do pipety.
    6. Dodaj trzy krople DPBS+/+ uzupełnione 0,5% penicyliny/streptomycyny do jaja za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia.
    7. Ostrożnie uszczelnij okno dużym kawałkiem (~5 cm x 5 cm) przezroczystej taśmy przed umieszczeniem jaja z powrotem w inkubatorze do 4 dnia inkubacji, kiedy zarodek jest w stadium Hamburger-Hamilton 23-24 (HH 23-24)32.
      UWAGA: Uszczelnienie okienka jest bardzo ważne, aby uniknąć odwodnienia i śmierci zarodka.
    8. Codziennie sprawdzaj zarodki pod kątem żywotności, patrząc na nie przez taśmę (nie usuwaj taśmy, aby uniknąć odwodnienia). W pierwszych dniach inkubacji kolor żółtka jaja zmienia się z jasnego na matowożółty po śmierci zarodka. Wyrzuć martwe zarodki.
    9. Utrzymuj miskę na wodę w inkubatorze napełnioną.

3. Przeszczep wewnątrzcelomiczny w 4 dniu inkubacji

  1. Uzyskanie dostępu do jamy celomicznej
    1. Odetnij taśmę od okna zakrzywionymi nożyczkami preparacyjnymi.
    2. Umieść jajko pod mikroskopem preparacyjnym na gumowym uchwycie lub kartonie na jajka.
    3. Zarodek kurczaka znajduje się teraz w HH 23-24 i leży na lewym boku, prawą stroną skierowaną w stronę widza (Rysunek 1A; Dzień 4). Zlokalizuj prawe skrzydło i zawiązek nogi zarodka, ponieważ celom będzie dostępny między tymi dwoma pąkami kończyn. W obszarze między prawym skrzydłem a zawiązkiem nogi utwórz kolejno otwór w błonie witeliny, kosmówce i owodni, przytrzymując je dwiema parami kleszczy preparacyjnych i delikatnie ciągnąc je w przeciwnych kierunkach.
      UWAGA: Błona witelinowa jest pierwszą błoną, która pojawia się po otwarciu jaja, a w niektórych przypadkach jest już uszkodzona po wykonaniu okna w 3 dniu. Jeśli zarodek jest obrócony, leżąc na prawym boku z lewym bokiem skierowanym w stronę widza (Ryc. 1A; dzień 4), konieczne jest odwrócenie go, aby umożliwić przeszczep. Aby to zrobić, wykonaj duży otwór w błonie błony witelinowej i kosmówkowej, a następnie ostrożnie obróć zarodek za pomocą kleszczy.
    4. Sprawdź, czy dostęp do jamy celomicznej jest niezakłócony: delikatnie chwyć krawędź ściany ciała między skrzydłem a pąkiem kończyny za pomocą kleszczy preparacyjnych i lekko pociągnij w kierunku widza. Jama celomiczna musi być wyraźnie widoczna. Ostrożnie włóż, ale cienkie narzędzie (np. drut wolframowy w uchwycie na mikroskalpel) do jamy celomicznej.
      UWAGA: Jeśli włożenie narzędzia do jamy celomicznej nie jest możliwe, oznacza to, że jedna lub więcej błon nie została prawidłowo otwarta.
  2. transplantacja
    1. Umieść pół organoidu w jaju na wierzchu allantois za pomocą dysektora opony twardej.
    2. Za pomocą kleszczy preparacyjnych ostrożnie chwyć krawędź ściany ciała i pociągnij ją lekko w kierunku widza, aby widoczny był otwór do celomu.
      UWAGA: Unikaj uszkadzania naczyń krwionośnych w ścianie ciała.
    3. Delikatnie przesuń organoid w kierunku i przez otwór w ścianie ciała do celonu za pomocą drutu wolframowego w uchwycie na mikroskalpel. Popchnij organoid lekko czaszką, aby umieścić go w celomie. Jest teraz widoczny tuż za pąkiem skrzydła (Rysunek 1A; Dzień 4).
    4. Dodaj trzy krople DPBS+/+ do jajka za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia.
    5. Ostrożnie uszczelnij okno dużym kawałkiem (~5 cm x 5 cm) przezroczystej taśmy przed umieszczeniem jaja z powrotem w inkubatorze do 12 dnia inkubacji (8 dni po przeszczepie).
    6. Codziennie sprawdzaj zarodki pod kątem żywotności, patrząc na nie przez taśmę (nie usuwaj taśmy, aby uniknąć odwodnienia). Wyrzuć martwe zarodki.
      UWAGA: W miarę wzrostu zarodków i ich błon kosmówkowo-omoczniowych stają się one wyraźniej widoczne przez taśmę. Brak ruchu przez zarodek oraz zapadnięte lub rzadkie naczynia krwionośne są oznaką śmierci zarodka.
    7. Codziennie sprawdzaj zbiornik na wodę w inkubatorze i utrzymuj go napełnionym.

4. Wstrzyknięcie fluorescencyjnie znakowanej lektyny

  1. Przygotowanie do wstrzyknięcia
    1. Szklane igły do mikroiniekcji należy wykonać, wciągając szklane mikrokapilary do ściągacza do mikropipet z następującymi ustawieniami: Ciepło 533, Ciągnięcie 60, Prędkość 150, Czas 200. Patrząc przez mikroskop preparacyjny, ostrożnie odłamać końcówki igieł do mikroiniekcji za pomocą kleszczy preparacyjnych, aby utworzyć otwór.
      UWAGA: Wymagane ustawienia ściągacza do mikropipet mogą się różnić w zależności od urządzenia.
    2. Zmontuj układ wtryskowy. Weź dwa kawałki silikonowej rurki o długości 38 cm i połącz je ze sobą, umieszczając między nimi filtr 0,2 μm. Włóż ustnik do końca rurki, która jest połączona z wylotem filtra (rurka silikonowa 1), a łącznik do końca rurki, który jest połączony z wlotem filtra (rurka silikonowa 2). Na koniec włóż igłę do mikroiniekcji do łącznika (Rysunek 1B).
    3. Rozcieńczyć znakowaną fluorescencyjnie soczewkę aglutyninę kulinarynową (LCA) za pomocą DPBS-/- do stężenia 2,5 mg mL-1 w probówce 0,5 ml i wirować przez ~30 s w mikrowirówce, aby przesunąć agregaty na dno probówki.
    4. Odpipetować pipetą 20 μl LCA na kawałek parafilmu.
    5. Odessać 20 μl LCA z parafilmu do igły mikrokapilarnej zmontowanego systemu iniekcyjnego.
  2. zastrzyk
    1. Odetnij taśmę od okna zakrzywionymi nożyczkami preparacyjnymi. Umieść jajko pod mikroskopem preparacyjnym w gumowym uchwycie.
    2. Oceń unaczynienie i zlokalizuj żyły, które można odróżnić od tętnic po ich nieco jaśniejszym czerwonym kolorze (Rysunek 1A; dzień 12). Aby poprawić dostęp do układu krwionośnego, ostrożnie powiększ okno, tnąc zakrzywionymi nożyczkami preparacyjnymi. Wybierz żyłę do wstrzyknięcia na podstawie dostępności i rozmiaru.
    3. Wprowadzić końcówkę igły mikrokapilarnej do wybranej żyły pod kątem 0°-20º. Upewnij się, że igła znajduje się w żyle, delikatnie przesuwając końcówkę z boku na bok. Delikatnie i równomiernie wdmuchnąć w układ wtryskowy, aby wstrzyknąć LCA (Rysunek 1A; dzień 12).
      UWAGA: Jeśli igła w żyle znajduje się we właściwej pozycji, powinna pozostać w granicach żyły.
    4. Umieść jajo z powrotem w inkubatorze na 10 minut, aby LCA mógł krążyć.
      UWAGA: W tym czasie nie ma potrzeby zamykania jajka taśmą.

5. Zbieranie przeszczepionych organoidów w 12 dniu inkubacji

  1. Poświęcenie zarodka kurczaka
    1. Umieść jajko w gumowym uchwycie na ławce. Odetnij taśmę od okna zakrzywionymi nożyczkami preparacyjnymi. Następnie przeciąć błony otaczające zarodek zakrzywionymi nożyczkami preparacyjnymi.
      UWAGA: Do tego kroku nie jest wymagany mikroskop preparacyjny.
    2. Wyjmij zarodek z jaja za pomocą perforowanej łyżki i natychmiast odetnij zarodek za pomocą nożyczek. Umieścić ciało zarodka na szalce Petriego pod mikroskopem preparacyjnym.
  2. Lokalizowanie i zbieranie organoidów
    1. Umieść zarodek na plecach na szalce Petriego i rozłóż jego kończyny.
    2. Ostrożnie otwórz ścianę brzuszną zarodka wzdłuż osi podłużnej za pomocą kleszczy.
    3. Zlokalizuj organoid wewnątrz zarodka. Organoid najczęściej przyczepia się do prawego płata wątroby, albo na końcu ogona, albo czaszkowo tuż pod klatką piersiową (Ryc. 1A; dzień 12). Dlatego zaleca się rozpoczęcie od przyjrzenia się tym lokalizacjom.
    4. Po zlokalizowaniu organoidu usuń go z zarodka, przecinając go mikronożyczkami. Umieść organoid i tkankę kurczaka, która jest z nim nieuchronnie przyczepiona, na szalce Petriego pod mikroskopem preparacyjnym. Usuń jak najwięcej tkanki kurczaka za pomocą obosiecznej żyletki ze stali nierdzewnej.
    5. Przetwarzaj organoid w zależności od pożądanej analizy.

6. Barwienie immunofluorescencyjne w całości

  1. Umieścić przeszczepiony organoid na płytce 24-dołkowej i umieścić w 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA) w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. Przemyć 3x DPBS-/-.
  2. Przepuszczalność i zablokowanie organoidu w 300 μl roztworu blokującego (0,3% Triton-X w DPBS-/- zawierającym 10% surowicy osła) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotuj mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych: dla jednego organoidu rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe NPHS1 (owca-α-człowiek, rozcieńczenie 1:100), CD31 (mysz-α-człowiek, rozcieńczenie 1:100) i LTL (biotyna sprzężona, rozcieńczenie 1:300) w 300 μl roztworu blokującego. Dodać mieszaninę przeciwciał do organoidu i inkubować przez 72 godziny w temperaturze 4 °C.
  4. Umyć 3x z 0,3% TritonX w DPBS-/-.
  5. Przygotować mieszankę przeciwciał drugorzędowych: dla jednego organoidu rozcieńczyć przeciwciał α a drugorzędowe Alexa Fluor 647 (rozcieńczenie 1:500), α osła Alexa Fluor 488 (rozcieńczenie 1:500) i streptawidynę Alexa Fluor 405 (rozcieńczenie 1:200) w 300 μl roztworu blokującego. Dodaj mieszaninę przeciwciał drugorzędowych do organoidu i inkubuj przez 2-4 godziny w temperaturze pokojowej. Przykryj folią aluminiową, aby uniknąć wystawienia przeciwciał drugorzędowych na działanie światła.
  6. Umyć 3x za pomocą DPBS-/-.
  7. Osadź organoid w ~30 μl podłoża montażowego w naczyniu ze szklanym dnem o średnicy 35 mm i pozostaw do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej, przykryty folią aluminiową. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  8. Obraz za pomocą mikroskopu konfokalnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda i harmonogram różnicowania hiPSC do organoidów nerkowych, inkubacja zapłodnionych jaj kurzych, przeszczepianie organoidów nerkowych, wstrzykiwanie LCA i zbieranie organoidów są podsumowane w Rysunek 1A. Ważne jest, aby skoordynować czas różnicowania organoidów i inkubacji jaj kurzych, rozpoczynając różnicowanie 15 dni przed inkubacją. Działania w dniu 0, 3, 4 i 12 inkubacji są zilustrowane zdjęciami poniżej osi czasu. Organoidy przesadza się w 7 + 12 dniu różnicowania się w zarodki kurcząt w dn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule przedstawiono protokół docelomicznego przeszczepiania organoidów nerkowych pochodzących z hiPSC w zarodkach kurcząt. Po przeszczepie organoidy są unaczyniane przez perfundowane naczynia krwionośne, które składają się z kombinacji EC pochodzących z ludzkich organoidów i kurczaków. Są one rozprowadzane po całym organoidzie i atakują struktury kłębuszków nerkowych, umożliwiając interakcję między EC a podocytami. Wcześniej wykazano, że prowadzi to do zwiększonego dojrzewania organoidowych struktur kłębuszkowych i ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy George'owi Galarisowi (LUMC, Leiden, Holandia) za pomoc w wstrzykiwaniu zarodków kurzych. Dziękujemy za wsparcie ze strony Saskii van der Wal-Maas (Wydział Anatomii i Embriologii, LUMC, Lejda, Holandia), Conny van Munsteren (Wydział Anatomii i Embriologii, LUMC, Lejda, Holandia), Manon Zuurmond (LUMC, Lejda, Holandia) oraz Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, Holandia). M. Koning jest wspierany przez "Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC". Prace te były częściowo wspierane przez Fundusz Uniwersytetu w Lejdzie "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund" GWF2019-02. Prace te są wspierane przez partnerów z Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) oraz Health Holland, Top Sector Life Sciences & Health. C.W. van den Berg i T.J. Rabelink są wspierani przez The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine jest wspierane przez granty Novo Nordisk Foundation (NNF21CC0073729).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 &mikro; Filtr m: Filtr strzykawkowy Whatman Puradisc 30 0,2 i mikro; mNaczynia ze10462200
35 mm MatTek CorporationP35G-1.5-14-C
Zespoły probówek aspiratora do kalibrowanych pipet mikrokapilarnychSigma-AldrichA5177-5EAZawiera silikonowe rurki, ustnik i łącznik
Mikroskop konfokalny: Laserowy mikroskop konfokalny Leica White Light LeicaTCS SP8
Kleszcze preparacyjne, proste. Tytan, zakrzywiony, z drobnymi ostrymi końcówkamiHammacher KarlHAMMHTC091-10
Kleszcze preparacyjne, typ prosty. Tytan, prosty, z drobnymi ostrymi końcówkamiHammacher KarlHAMMHTC090-11
Mikroskop preparacyjny Wild Heerbrugg355110
Nożyczki preparacyjne, zakrzywione, OP-special, bardzo ostre/ostreHammacher KarlHAMMHSB391-10
Serum osłaSigma-AldrichD9663
Osioł-&alfa;-mysz Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-212-02rozcieńczenie 1:500
Osioł-&alfa;-owca Alexa Fluor 647ThermoFisher ScientificA-21448rozcieńczenie 1:500
Dwustronne żyletki ze stali nierdzewnejElectron Microsopy Sciences72000
DPBS, wapń, magnez (DPBS-/-)ThermoFisher Scientific14040133
DPBS, bez wapnia, bez magnezu (DPBS+/+)ThermoFisher Scientific14190094
Kartony na jajka lub uchwyty na jajka na zamówienie NANA Zapłodnione
jaja białych leghornów (Gallus Gallus Domesticus) Drost Loosdrecht B.V.NA
InkubatorElbanton BVET-3 combi
Lotus Tetragonolobus lektyna (LTL) BiotynylowaneVector LaboratoriesB-1325rozcieńczenie 1:300
Mikronożyczki, proste, ostre/ostre, długość cięcia 10 mmHammacher KarlHAMMHSB500-09
Mikrokapilary: Cienkościenne szklane kapilary 1,5 mm, żarnikWorld Precision InstrumentsTW150F-3
Ściągacz do mikropipetSutter Instrument FirmaModel P-97Używamy następujących ustawień: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200
Uchwyt na mikroskalpel: Castroviejo uchwyt na ostrze i szpilki, 12 cm, okrągła rękojeść, stożkowe szczęki 10 mm.EuronexiaL-120
Medium montażowe: Prolong Gold Antifade Mountant ThermoFisher ScientificP36930
Olivecrona opona twarda dissekcja 18 cm Reda41146-18
Parafilm Heathrow ScientificHS234526B
Penicylina-streptomycyna 5 000 U/mlThermoFisher Scientific15070063
Łyżka perforowana EuronexiaS-20-P
szalka Petriego 60 x 15 mm CELLSTAR628160
Plastikowe pipety transferowe ThermoFisher ScientificPP89SB
Oczyszczone mysie przeciwciało anty-ludzkie CD31BD Biosciences555444rozcieńczenie 1:100
Soczewka znakowana rodaminą Lens Culinaris Agglutinin (LCA)Vector LaboratoriesRL-1042Ten produkt został niedawno wycofany z produkcji. Vectorlabs nadal produkuje Dylight 649 znakowane LCA (DL-1048-1) i LCA znakowane fluoresceiną (FL-1041-5)
Owcze przeciwciało anty-ludzkie NPHS1R& Systemy DAF4269rozcieńczenie 1:100
Sterylne igły podskórne, 19 GBD mikrolance301500
Streptawidyna Alexa Fluor 405ThermoFisher ScientificS32351rozcieńczenie 1:200
Strzykawka 5 mlBD Szmaragd307731
Przezroczysta taśma Tesa4124Dostępny w większości sklepów z narzędziami
Triton XSigma-AldrichT9284
Drut wolframowy, średnica 0,25 mmThermoFisher Scientific010404.H2
szklanym dnem Whatman

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
  2. Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
  3. Kim, Y. K., et al. Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development. Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).
  4. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  5. Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communications. 9 (1), 5167(2018).
  6. Vanslambrouck, J. M., et al. Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids. Nature Communications. 13 (1), 5943(2022).
  7. Tanigawa, S., et al. Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes. Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).
  8. Forbes, T. A., et al. Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms. American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).
  9. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715(2015).
  10. Cruz, N. M., et al. Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease. Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).
  11. Gupta, N., et al. Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair. Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772(2022).
  12. Hiratsuka, K., et al. Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery. Scencei Advances. 8 (38), eabq0866(2022).
  13. Dorison, A., et al. Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking. Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).
  14. Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
  15. Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis. The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).
  16. Sison, K., et al. Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).
  17. Ryan, A. R., et al. Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis. Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).
  18. vanden Berg, C. W., et al. Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
  19. Sharmin, S., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).
  20. Bantounas, I., et al. Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors. Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).
  21. vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids. Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).
  22. Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. Avians as a model system of vascular development. Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).
  23. Jankovic, B. D., et al. Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo. Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).
  24. Alkie, T. N., et al. Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective. Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).
  25. Rawles, M. E. Transplantation of normal embryonic tissues. Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).
  26. Rawles, M. E. The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).
  27. Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).
  28. Koning, M., et al. Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40(2022).
  29. Hamburger, V. Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos. Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).
  30. Dossel, W. E. New method of intracelomic grafting. Science. 120 (3111), 262-263 (1954).
  31. Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
  32. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
  33. Aleksandrowicz, E., Herr, I. Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo. ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).
  34. ACUC. Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , Available from: https://www.cpp.edu/research/research-compliance/iacuc/docs/iacuc-guidelines-on-euthanasia-of-chicken-and-embryos.pdf (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Unaczynienie organoid wludzkie indukowane pluripotencjalne kom rki macierzystekapilary k buszkoweperfuzowane naczynia krwiono neobrazowanie immunofluorescencyjnekom rki r db onkamodelowanie chor b

Powiązane artykuły