Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowe pomiary kurczliwości nienaruszonych włókien mięśniowych myszy zanurzonych w hydrożelu przy użyciu systemu opartego na optyce

DOI:

10.3791/65103

⸱

5 maja 2023

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Amsterdam UMC, 2Amsterdam Cardiovascular Sciences, Heart Failures and Arrhythmias, Amsterdam UMC, 3Amsterdam Movement Sciences, Tissue Function and Regeneration, Amsterdam UMC, 4Discipline of Child and Adolescent Health, Faculty of Health and Medicine, University of Sydney

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funkcja mięśni szkieletowych może być oceniana poprzez ilościowe określenie kurczliwości izolowanych włókien mięśniowych, tradycyjnie przy użyciu pracochłonnych, niskoprzepustowych metod. W tym miejscu opisujemy opartą na optyce, wysokoprzepustową metodę ilościowego określania kurczliwości włókien mięśniowych osadzonych w hydrożelu. Podejście to ma zastosowanie w badaniach przesiewowych leków i opracowywaniu terapii.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowla komórkowa in vitro to potężne narzędzie do oceny procesów komórkowych i testowania strategii terapeutycznych. W przypadku mięśni szkieletowych najczęstsze podejścia obejmują albo różnicowanie miogennych komórek progenitorowych w niedojrzałe miotuby, albo krótkoterminową hodowlę ex vivo izolowanych pojedynczych włókien mięśniowych. Kluczową zaletą hodowli ex vivo w porównaniu z in vitro jest zachowanie złożonej architektury komórkowej i cech kurczliwości. W tym miejscu szczegółowo opisujemy eksperymentalny protokół izolacji nienaruszonych włókien mięśniowych zginacza palca brevis od myszy i ich późniejszej hodowli ex vivo. W tym protokole włókna mięśniowe są osadzone w hydrożelu macierzy macierzy na bazie fibryny i błony podstawnej, aby unieruchomić włókna i utrzymać ich funkcję skurczową. Następnie opisujemy metody oceny funkcji kurczliwości włókien mięśniowych za pomocą opartego na optyce, wysokoprzepustowego systemu kurczliwości. Osadzone włókna mięśniowe są stymulowane elektrycznie w celu wywołania skurczów, po czym ich właściwości funkcjonalne, takie jak skrócenie sarkomeru i prędkość skurczu, są oceniane za pomocą kwantyfikacji opartej na optyce. Sprzężenie hodowli włókien mięśniowych z tym systemem pozwala na wysokoprzepustowe badania wpływu środków farmakologicznych na funkcję skurczową oraz badania ex vivo genetycznych zaburzeń mięśni. Wreszcie, protokół ten można również dostosować do badania dynamicznych procesów komórkowych we włóknach mięśniowych za pomocą mikroskopii żywych komórek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postępy w technikach hodowli komórkowych in vitro otworzyły nowe możliwości badania zdolności regeneracyjnych tkanek, patofizjologicznych mechanizmów komórkowych i późniejszych strategii terapeutycznych, a wszystko to przy użyciu tkanek ssaków w dobrze kontrolowanych warunkach1,2,3. Stosowanie systemów hodowli in vitro jest dobrze ugruntowane w dziedzinie badań nad mięśniami4,5. Ogólnie rzecz biorąc, stosuje się niedojrzałe miorurki z miogennych komórek progenitorowych różnicowane in vitro2,6,7,8. Chociaż poczyniono postępy w protokole różnicowania w celu wygenerowania bardziej dojrzałych włókien mięśniowych9, ich niedojrzałość nadal ogranicza translację wyników na ustawienie in vivo1,10. Jednym z głównych problemów w dziedzinie biologii mięśni jest niezdolność zróżnicowanych in vitro miotub do pełnego uosobienia złożonych struktur wewnątrzkomórkowych, procesów sygnalizacji komórkowej i interakcji zewnątrzkomórkowych obserwowanych w natywnej tkance mięśniowej i, co ważne, rekapitulacji sił skurczowych wytwarzanych przez włókna mięśniowe1,2,10,11,12. Ponadto, nieskoordynowane kurczenie się miotub podczas procesu różnicowania często powoduje spontaniczne oderwanie się od szalek hodowlanych, co sprawia, że ocena kurczliwości miotub zróżnicowanych in vitro jest trudna i ograniczona do oceny jakościowej lub półilościowej8,11,12,13. Ograniczenia te często wymagają regularnych eksperymentów in vivo na zwierzętach, szczególnie jeśli głównym wynikiem eksperymentu jest kurczliwość mięśni1.

Alternatywą dla hodowli in vitro zróżnicowanych miotub jest hodowla ex vivo izolowanych dojrzałych włókien mięśniowych1,14. Podczas hodowli ex vivo dojrzała rozwojowo tkanka mięśniowa jest wycinana z organizmu, a następnie izolowana jednokomórkowa do hodowli w warunkach laboratoryjnych1,14. Izolowane dojrzałe włókna mięśniowe zachowują swoje złożone struktury komórkowe obserwowane w natywnej 14,15, a ta metoda otwiera możliwość bezpośrednich interwencji, takich jak manipulacja genetyczna i badania przesiewowe leków, w dobrze zdefiniowanym i kontrolowanym środowisku hodowli. Jedno z pierwszych doniesień dotyczących izolacji włókien mięśni szkieletowych i hodowli ex vivo pochodzi z lat 30. XX wieku; Jednak wydajność żywotnych włókien z tego protokołu była niska16. Dzięki ciągłej optymalizacji procedury izolacji i warunków hodowli, możliwa jest teraz znaczna poprawa ilości żywotnych i funkcjonalnych włókien mięśniowych14,15,17,18,19. Jednym z takich ulepszeń warunków hodowli jest powlekanie szalek hodowlanych białkami macierzy zewnątrzkomórkowej w celu promowania przylegania izolowanych włókien mięśniowych do szalki hodowlanej15,18,20. Zwykle stosuje się powłokę lamininy, ponieważ laminina jest jednym z najobficiej występujących pierwiastków w macierzy zewnątrzkomórkowej mięśni20,21. Optymalizacja procedury izolacji w połączeniu z powlekaniem szalek hodowlanych umożliwiła badaczom mięśni utrzymanie izolowanych żywotnych włókien mięśniowych z nienaruszoną architekturą komórkową i funkcjonalnością kurczliwości w hodowli przez krótki okres czasu1,15,18,22.

Najbardziej konwencjonalnym podejściem stosowanym w polu mięśniowym do pomiaru siły i zdolności skurczowych jest zamontowanie pojedynczych włókien mięśniowych pomiędzy długotrwałym silnikiem sterującym a przetwornikiem siły23,24. Ogólnie rzecz biorąc, włókna mięśniowe używane w tych konfiguracjach napędzanych silnikiem są wycinane z zamrożonej lub świeżej tkanki, a następnie następuje przepuszczalność lub "skórowanie", co pozwala na zewnętrzną aktywację wapnia, gdzie różne stężenia wapnia są używane do wywołania skurczu włókien mięśniowych24. Chociaż ta metoda jest złotym standardem w pomiarach kurczliwości włókien mięśniowych, tylko jedno włókno mięśniowe może być mierzone na raz, co sprawia, że technika ta jest pracochłonną i czasochłonną procedurą25. Co więcej, procedura izolacji i skórowania włókien mięśniowych zaburza różne struktury zaangażowane w sprzężenie wzbudzenie-skurcz (tj. uwalnianie wapnia i późniejszy wychwyt zwrotny do retikulum sarkoplazmatycznego), uniemożliwiając w ten sposób badanie kinetyki relaksacji i wszelkich chorób, które mogą wpływać na ten proces26,27. Alternatywą dla preparatu włókien ze skórą jest zastosowanie mechanicznej preparacji w celu wyizolowania nienaruszonych włókien mięśniowych, gdzie siły skurczu mogą być mierzone w odpowiedzi na aktywację elektryczną28; Jednak takie podejście jest technicznie trudne i bardzo czasochłonne, co skutkuje pomiarami o niskiej przepustowości. Wreszcie, zarówno w preparatach bez skóry, jak i nienaruszonych, komórki mięśniowe są całkowicie usuwane ze środowiska zewnątrzkomórkowego podczas pomiarów kurczliwości24, co uniemożliwia badanie wpływu składu/sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na skurcz włókien mięśniowych24. W związku z tym konieczne jest opracowanie alternatywnych metod, aby umożliwić pomiary kurczliwości włókien mięśniowych izolowanych nienaruszonych włókien mięśniowych w sposób wysokoprzepustowy, przy jednoczesnym odtworzeniu połączenia między włóknami mięśniowymi a macierzą zewnątrzkomórkową.

Niedawno opracowano nowe podejście oparte na optyce do wysokoprzepustowych pomiarów kurczliwości włókien mięśniowych29. Ten oparty na optyce system mierzy okresowość sarkomerów w celu oceny długości sarkomeru podczas skurczu za pomocą szybkiego obrazowania. W tym systemie komórki pozostają na miejscu w naczyniu hodowlanym, podczas gdy optyka jest poruszana, minimalizując w ten sposób czas potrzebny między pomiarami wielu komórek29. Główną zaletą stosowania tego wysokoprzepustowego podejścia opartego na optyce jest to, że pozwala ono na opracowanie warunków hodowli podobnych do tych panujących w tkance natywnej. Podejściem stosowanym do naśladowania natywnych warunków in vivo jest osadzanie komórek w hydrożelach30. Zazwyczaj hydrożel jest materiałem lepkosprężystym, który jest w stanie zachować swoją objętość i kształt, a hydrożele mają właściwości zarówno materiałów stałych, jak i ciekłych31. Część stała składa się z połączonych ze sobą łańcuchów polimerowych, tworząc strukturę, która wygląda podobnie do net30,31. Właściwości materiałowe hydrożeli można dostroić tak, aby naśladowały osadzanie się matrycy mięśni30,31. W ten sposób połączenie wysokowydajnego systemu opartego na optyce z komórkami osadzonymi w hydrożelach otwiera nowe możliwości oceny wpływu składu macierzy zewnątrzkomórkowej i właściwości mechanicznych na funkcjonalność włókien mięśniowych.

Ogólnym celem tego artykułu jest: 1) opisanie metodologii enzymatycznej izolacji i hodowli ex vivo włókien mięśniowych w warunkach naśladujących środowisko tkanek natywnych oraz 2) ocena kurczliwości włókien mięśniowych przy użyciu podejścia wysokoprzepustowego. Opisujemy szczegółową metodologię łatwego izolowania dużej liczby pojedynczych włókien mięśniowych od mięśnia zginacza palca brevis (FDB) za pomocą trawienia enzymatycznego. Ponadto opisujemy technikę osadzania izolowanych włókien mięśniowych w hydrożelu na bazie fibryny w celu naśladowania natywnego środowiska mięśni i poprawy żywotności i kurczliwości włókien mięśniowych. Następnie przedstawiamy wysokoprzepustową metodę pomiaru żywych skurczów włókien mięśniowych in vitro przy użyciu tego niedawno opracowanego systemu. Dodatkową zaletą tej procedury osadzania jest unieruchomienie włókien podczas skurczu, co może poprawić stosunek sygnału do szumu w tych pomiarach. Ta metoda zatapiania żelu ma zastosowanie zarówno do procedur enkapsulacji pojedynczym polimerem, jak i kompozytowym żelem, ułatwiając ocenę wpływu składu macierzy zewnątrzkomórkowej na kurczliwość włókien mięśniowych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla badań ex vivo, pośmiertne tkanki zostały pobrane od zwierząt uśmierconych do innych zatwierdzonych projektów badawczych i/lub nadwyżki hodowlanej Uniwersytetu VU zgodnie z Dyrektywą Rady Europejskiej (2010/63/UE) za zgodą holenderskiej ustawy o badaniach na zwierzętach.

1. Przygotowanie materiału

  1. Przygotuj pipety do rozcierania (przechowywać w 70% etanolu w komorze przepływowej do czasu użycia). Odetnij końce dwóch końcówek P1,000, aby utworzyć różne rozmiary otworów; Upewnij się, że otwór jest wystarczająco duży, aby mięsień mógł przez niego przejść bez blokowania pipety. Przepuść odcięte końce przez płomień, aby stały się gładkie.
  2. Przygotuj potrawy Sylgard zgodnie z opisem w innym miejscu32, a następnie wysterylizuj 70% etanolem do użycia w celu zabezpieczenia łapy i mięśni podczas izolacji.
    UWAGA: Naczynia Sylgard mogą być ponownie użyte po dokładnym oczyszczeniu wodą dejonizowaną i 70% etanolem.
  3. Przed procedurą izolacji należy przygotować następujące roztwory: pożywkę preparacyjną, pożywkę do hodowli fibryny i pożywkę do trawienia mięśni (patrz Tabela 1).
    UWAGA: Pożywka do trawienia mięśni powinna być sterylizowana filtrem przy użyciu filtra 0,22 μm. Wszystkie przygotowane roztwory należy przed użyciem zrównoważyć w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 30 minut.
  4. Po wytrawieniu mięśniowym należy przygotować następujące roztwory do odlewania hydrożelu: mieszaninę komórek i mieszaninę matrycową (patrz Tabela 2). Połącz mieszankę komórkową i mieszankę matrycową w stosunku 1:1, aby uzyskać końcowe stężenie fibryny 2,5 mg/mL.
    UWAGA: Przygotuj matrycę na lodzie i użyj wstępnie schłodzonych końcówek pipet, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji matrycy błony podstawnej. Zastosowany tutaj stosunek trombiny do fibrynogenu wynoszący 1:10 (jednostek na mg fibrynogenu) został zoptymalizowany pod kątem czasu polimeryzacji wynoszącego 30 minut. Jeśli żel polimeryzuje w ciągu 30 minut, należy zastosować niższe stężenie trombiny. Zobacz dyskusję, aby uzyskać więcej informacji.

2. Rozwarstwienie mięśni FDB

  1. Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy. Zdezynfekuj tylną kończynę 70% alkoholem.
  2. Odetnij dolną tylną nogę powyżej kostki. Rozetnij skórę po grzbietowej stronie stopy w kierunku palców.
    UWAGA: Odetnij dolną tylną nogę w stawie skokowym, aby zapobiec uszkodzeniu mięśni kończyn dolnych i kości piszczelowej, jeśli będą potrzebne później.
  3. Ostrożnie obierz skórę w kierunku palców stóp. Uważaj, aby nie uszkodzić mięśnia. FDB jest najbardziej powierzchownym mięśniem po brzusznej stronie stopy.
  4. Umieścić wypreparowaną stopę w naczyniu Sylgarda z 10 ml podgrzanego podłoża preparacyjnego w temperaturze 37 °C. Przygwoździć stopę przez skórę, która jest nadal przyczepiona do palców, i przygwoździć dolną część nogi poza kostkę.
  5. Ostrożnie usuń tkankę łączną na górze mięśnia. Przetnij ścięgno na pięcie i unieś mięsień do góry za ścięgno.
  6. Przeciąć wzdłuż i pod mięśniem przez tkankę łączną. Kontynuuj cięcie, aż ścięgna palców zostaną odsłonięte.
  7. Kiedy połowa długości trzech ścięgien jest odsłonięta, przetnij ścięgna i uwolnij mięsień ze stopy. OPCJONALNIE: Odetnij czwarte ścięgno boczne i jego włókna mięśniowe.
  8. Oczyść tkankę łączną z mięśnia i przenieś do rurki zawierającej podgrzane podłoże preparacyjne.

3. Trawienie mięśni FDB

  1. Przygotować pożywkę do trawienia mięśniowego zgodnie z tabelą 1.
  2. Przenieść mięśnie FDB do pożywki do trawienia mięśni za pomocą pipety serologicznej. Inkubować w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 80 min.
    UWAGA: Ten czas powinien być zoptymalizowany dla każdej partii kolagenazy. Trawienie jest zakończone, gdy mięsień zaczyna się strzępić i wygląda na powiększony. Zapoznaj się z dyskusją, aby zapoznać się z optymalizacją czasu trawienia.
  3. Po roztrawieniu przenieść mięsień do 15 ml probówki zawierającej 3 ml pożywki preparacyjnej i inkubować przez 30 minut przed rozcieraniem.

4. Tarcie mięśni FDB i sedymentacja grawitacyjna

  1. Rozetrzeć mięsień za pomocą wcześniej przygotowanych końcówek do rozcierania (krok 1.1), pipetując mięsień, przechodząc od największego do najmniejszego rozmiaru. Jeśli ten krok trwa dłużej niż 5 minut, umieść mięsień w inkubatorze na 5 minut, aby mógł odpocząć.
  2. Cierć, aż włókna mięśniowe w większości odpadną od ścięgna, a ścięgno może przejść przez końcówkę P200. Usuń ścięgna.
  3. Dodaj zdysocjowane włókna FDB do 15 ml probówki zawierającej 10 ml pożywki preparacyjnej i pozwól włóknom osiąść w inkubatorze przez 20 minut. Obserwuj uformowane osady.
  4. Opcjonalnie: Usuń 10 ml pożywki z góry i powtórz krok 4.3. Ten krok ułatwia usunięcie nadmiaru zanieczyszczeń i związanych z nimi komórek jednojądrowych.

5. Osadzanie światłowodów FDB

  1. Ostrożnie usuń całe podłoże z wierzchu granulki włókna. Ponownie zawiesić komórki w 875 μl mieszanki komórkowej na mięsień FDB (na lodzie).
    UWAGA: Jeden mięsień FDB daje wystarczającą ilość włókien dla siedmiu dołków 24-dołkowej płytki. Gęstość tę można dostosować do potrzeb eksperymentu. Poniższa objętość żelu (250 μl) jest zoptymalizowana dla formatu 24-dołkowego, ale może być odpowiednio skalowana dla innych formatów.
  2. Podwielokrotność 125 μl komórek wymieszać w pojedynczych probówkach do mikrowirówek.
  3. Raz po drugim dodawać 125 μl mieszaniny matrycowej do podwielokrotności zawiesiny komórek i mieszać, ostrożnie pipetując w górę i w dół, unikając tworzenia się pęcherzyków.
  4. Natychmiast przenieś końcową mieszankę do studzienki.
    UWAGA: Pamiętaj, aby odpipetować mieszaninę do środka studzienki. Powtórz krok 5.3 i krok 5.4 dla każdej studzienki.
  5. Zestal żele w inkubatorze przez 30-45 minut. Po zestaleniu ostrożnie dodaj pożywkę hodowlaną do studzienek.
    UWAGA: Szybkie pipetowanie może odłączyć hydrożel od studzienki. Od tego momentu włókna mogą być stymulowane i mierzone. Jednak z naszego doświadczenia wynika, że pozostawienie włókien do dostosowania się do warunków hodowli przez 24 godziny może poprawić kurczliwość włókien.
  6. W przypadku dłuższej hodowli należy uzupełniać pożywkę o pół zmiany co 2 dni. Aby to zrobić, usuń połowę pożywki hodowlanej i zastąp ją równą ilością świeżej pożywki.

6. Pomiary kurczliwości oparte na optyce

  1. Włącz system pomiaru kurczliwości oparty na optyce (patrz tabela materiałów), lampę fluorescencyjną, stymulator ogniw elektrycznych i komputer. Ustaw stymulator elektryczny na 1,0 Hz, 10,0 V i czas trwania impulsu 5,00 ms, aby stymulować izolowane włókna mięśniowe.
  2. Włóż płytkę do układu pomiarowego. Podłącz stymulator do wkładu stymulatora i włóż go do płytki hodowlanej.
  3. Otwórz program IonWizard i otwórz nowy plik, klikając Plik (lewy górny róg ekranu) | Nowy.
  4. Sprawdź, czy program jest w odpowiednim eksperymencie, Szkieletowy Sarkomer, klikając Nowy | Zbierz eksperyment. Aby zmienić eksperyment, kliknij żądany eksperyment i naciśnij dodaj. W eksperymencie z sarkomerem szkieletowym zastosuj następujące ustawienia: Sarc 20x, Linie średnie, pojedynczy FFT, częstotliwość próbkowania 250 Hz i czas akwizycji 10 s.
    UWAGA: Ustawienia eksperymentalne powinny być przygotowane przed eksperymentem. Ustawienia można dostosować do potrzeb eksperymentu.
  5. Ustaw temperaturę układu pomiarowego na 25 °C. Kliknij otwórz wyszukiwarkę komórek pod paskiem narzędzi i poczekaj, aż pojawi się nowy ekran. W prawym górnym rogu tego ekranu wybierz typ płyty i aktywne studnie.
    UWAGA: Pomiary są wykonywane w temperaturze 25 °C w celu zmniejszenia prędkości skurczu szybkokurczliwych włókien mięśniowych FDB, zapobiegając w ten sposób niedostatecznemu próbkowaniu zdarzenia skurczowego.
  6. Ustaw ostrość włókien, regulując suwak ostrości. Alternatywnie użyj W i S dla tej funkcji ustawiania ostrości.
  7. Włącz stymulację, aby rozpocząć stymulację elektryczną. Zauważ, że włókna zaczynają teraz drgać.
    UWAGA: Jeśli żadne włókna nie drgają, upewnij się, że wszystkie przewody są podłączone, a stymulator jest całkowicie zanurzony. Jeśli po tym czasie nadal nie ma ruchu, włókna mogą nie reagować z powodu nadmiernego trawienia lub nadmiernego uszkodzenia podczas tryturacji.
  8. Skoncentruj obszar pomiaru na końcu włókna tak, aby sarkomery biegły pionowo. Upewnij się, że sarkomery są ostre. Jeśli sarkomery są aktywne, na pasku narzędzi widoczny jest pojedynczy pik. Podczas skurczu szczyt ten przesunie się w prawo, gdy sarkomer się skróci.
    UWAGA: Fioletowy obszar pomiaru można dostosować przed rozpoczęciem eksperymentu. Aby zapewnić prawidłowy pomiar, dołącz ~20 sarkomerów. Jeśli ten pik zmieni kształt podczas skurczu, może to oznaczać, że sarkomer jest zasłonięty lub nieostry podczas skurczu, co wprowadza szum.
  9. Rozpocznij eksperyment, klikając przycisk Start na pasku narzędzi. Naciśnij Q, aby rozpocząć pomiar i poczekaj, aż program zmierzy 10 stanów przejściowych skurczu. Jeśli więcej niż cztery stany nieustalone wyglądają na wolne od szumów, zatwierdź pomiar, naciskając Z. Jeśli stany nieustalone mają zbyt duży szum, odrzuć pomiar, naciskając X.
  10. Zmierz od 10 do 20 włókien na warunek. Lokalizacje wcześniej zmierzonych włókien są zachowywane.
  11. Opcjonalnie: Dodaj związki, po czym włókna można w tym momencie ponownie zmierzyć.
  12. Po zakończeniu eksperymentu naciśnij przycisk zatrzymania na dolnym pasku narzędzi, aby zamknąć okno wyszukiwarki komórek. Zapisz plik i rozpocznij nowy plik.
  13. Aby przeanalizować dane, otwórz program "Pulpit Cytosolver". Kliknij import i wybierz pliki, które chcesz przeanalizować.
  14. Po zakończeniu analizy przez program poszukaj niebieskich, czerwonych i szarych szczytów. Niebieskie szczyty są stanami nieustalonymi, które są akceptowane przez program. Czerwone szczyty to stany nieustalone, które są odrzucane przez program, a szare szczyty to stany nieustalone odrzucane przez użytkownika.
    UWAGA: Kryteria odrzucenia można dostosować w oprogramowaniu analitycznym. Ogólnie rzecz biorąc, wartości są odrzucane, jeśli przekraczają maksymalny limit pochodnej, a stany nieustalone są odrzucane na podstawie wartości dopasowania krzywej R2 wynoszących <0,95.
  15. Kliknij eksport. Zaznacz następujące pola: Uśrednione dane przejściowe i eksport do programu Excel.
  16. Po zakończeniu wyłącz wszystkie maszyny. Wyjmij płytkę hodowlaną i wyrzuć ją. Wyczyść elektrody stymulatora wodą dejonizowaną i 70% etanolem.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tego protokołu, pojedyncze włókna mięśniowe FDB zostały wyizolowane i zatopione w hydrożelu. Przegląd procedury rozwarstwiania mięśni jest pokazany w Rysunek 1. Mięsień FDB jest odsłonięty z nienaruszonymi ścięgnami i odcięty od powięzi. Utrzymanie ścięgien mięśni jako punktów mocowania minimalizuje potencjalne uszkodzenia włókien mięśniowych podczas procedury izolacji. Nadmiar tkanki łącznej można odciąć, aby zmniejszyć zanieczyszczenia i wzrost wtórnych typów komórek. Po wystarczającym wycięciu i oczyszczeniu mięśnia, mięsień jest trawiony enzymatycznie za pomocą kolagenazy, a pojedyncze włókna mięśniowe są uwalniane przez rozcieranie przed osadzeniem izolowanych komórek w hydrożelach. Izolacja włókien mięśniowych FDB zapewnia stosunkowo krótkie włókna mięśniowe, które mają tę zaletę, że można nimi łatwo manipulować. Ze względu na swój rozmiar, włókna mięśniowe FDB mogą być bezpiecznie pipetowane bez uszkodzeń spowodowanych splątaniem i są łatwo osadzone w hydrożelu. Ponieważ pojedyncze włókna mięśniowe nie przylegają zbyt dobrze do płytek hodowlanych, zatopienie włókien w hydrożelu zapewnia, że włókna pozostaną na swoim miejscu podczas hodowli komórkowej i pomiarów kurczliwości. Co więcej, dodanie macierzy błony podstawnej do żelu fibrynowego pozwala na interakcje między włóknami mięśniowymi a macierzą, naśladując natywne środowisko in vivo. Wyizolowane pojedyncze włókna mięśniowe mogą być manipulowane i utrzymywane w kulturze przez kilka dni po izolacji. W Rysunek 2 pokazany jest przykład izolowanych włókien FDB osadzonych w matrycy hydrożelowej. Zdrowe włókna mają widoczne sarkomery i są rozciągnięte prosto (niebieska strzałka), podczas gdy zakrzywione włókna są zazwyczaj uszkodzone lub nieżywotne (żółta strzałka) i powinny być wyłączone z pomiarów. Nadmiernie skurczone włókna pojawiają się w matrycy jako ciemne, zwinięte w kłębek obiekty (czerwona strzałka). Jeśli procedura izolacji zakończyła się sukcesem, proporcja zdrowych włókien powinna wynosić ~75%. Większy odsetek włókien hiperskurczowych zwykle wskazuje na uszkodzenie podczas procedury izolacji. Błona włókien mięśniowych może zostać uszkodzona przez nadmierne trawienie mięśnia lub uszkodzenie włókien podczas trituracji. Uszkodzenie trituracyjne występuje głównie wtedy, gdy mięsień jest niedostatecznie trawiony, a zatem nie rozpada się łatwo.

Funkcjonalność i żywotność światłowodu zostały ocenione poprzez pomiary kurczliwości włókien mięśniowych za pomocą opartego na optyce, wysokoprzepustowego systemu pomiaru kurczliwości. System generuje kilka parametrów, takich jak długość sarkomeru, procent skrócenia sarkomeru, prędkość skurczu i prędkość relaksacji. Korzystając z systemu pomiaru kurczliwości, skurcz sarkomeru można zmierzyć na włókno mięśniowe. Rysunek 3 pokazuje przykłady skurczów włókien mięśniowych mierzonych za pomocą systemu pomiarowego. Z pojedynczego stanu przejściowego skurczu uzyskuje się następujące parametry: długość sarkomeru na linii bazowej, czas trwania skurczu, długość sarkomeru przy maksymalnym skurczu i czas trwania relaksacji (Rysunek 3A). Parametry te są używane do obliczania procentu prędkości skracania, kurczenia się i relaksacji sarkomeru. W razie potrzeby można również obliczyć średnie wartości prędkości na podstawie czasu trwania i bezwzględnego skrócenia. Prawidłowy pomiar skurczu obejmuje prostą linię bazową, po której następuje spadek do wartości szczytowej i powrót do linii bazowej (Rysunek 3A). Szum, nieostre sarkomery lub nieprawidłowy ruch światłowodu mogą wpływać na stan nieustalony pomiaru (Rysunek 3B,C), a pomiary te mogą zostać odrzucone ręcznie lub zostaną odrzucone przez program do analizy. W tym podejściu wyraźna wizualizacja sarkomerów jest ważna dla pomiaru skurczów; Tak więc wszystko, co zmniejsza widoczność sarkomerów, może wprowadzać hałas. Może się to zdarzyć, jeśli podczas skurczu występuje ruch sarkomeru poza płaszczyzną ogniskową. Pomiary, w których seria skurczów różni się prędkością lub głębokością, również powinny być wyłączone ze zbioru danych.

Dane dotyczące kurczliwości pojedynczych włókien mięśniowych uzyskane za pomocą tego systemu mogą być wykorzystane do porównania różnych warunków hodowli. Skuteczność systemu zilustrowano na rysunku Rysunek 4. Tutaj zmierzyliśmy skurcze włókien mięśniowych FDB zarówno w formatach hodowli 2D (płytki hodowlane pokryte lamininą), jak i 3D (hydrożel fibrynowy). Wyższy odsetek użytecznych pomiarów osiągnięto w 3D, ponieważ osadzenie włókien w żelu zapobiegło wpływowi ruchu bocznego i innych artefaktów ruchu na pomiar (Rysunek 4A). Osadzenie włókien nie miało znaczącego wpływu ani na wartości skracania sarkomeru, ani na maksymalne wartości prędkości kurczenia się w porównaniu z włóknami hodowanymi w 2D (Rysunek 4B). Aby zilustrować, w jaki sposób różne matryce wpływają na skurcz włókien mięśniowych FDB, porównaliśmy również ten hydrożel fibrynowy z czystą macierzą błony podstawnej (4 mg / ml) (Rysunek 4C). Zmniejszona kurczliwość obserwowana w czystej macierzy błony podstawnej była prawdopodobnie spowodowana sztywnością żelu lub zwiększonymi interakcjami komórka-macierz. Badano również stężenia fibryny do 7 mg/ml, które nie miały znaczącego wpływu na szybkość kurczenia się i skracanie (dane niepublikowane). Zastosowanie tego hydrożelu na bazie fibryny zapewnia minimalną ingerencję w parametry skurczowe.

figure-results-1
Rysunek 1: Przegląd procedury rozwarstwiania mięśni FDB. (A) Tylna kończyna jest przecięta powyżej kostki (czerwona przerywana linia), oraz (B) skóra jest usuwana przez cięcie wzdłuż górnej części stopy wzdłuż niebieskiej przerywanej linii. (C) Stopa jest przygwożdżona przez kostkę, a skóra u stóp. (D) Mikroskopowy widok odsłoniętego mięśnia i otaczającej go tkanki łącznej. Powięź jest widoczna jako biała, nieprzezroczysta warstwa, przez którą przebiega układ krwionośny. (E) Powięź jest usuwana z mięśnia, a ścięgno jest przecinane wzdłuż czerwonej przerywanej linii. (F) Mięsień FDB jest oddzielany od leżącej pod nim tkanki poprzez podnoszenie i cięcie pod mięśniem i wzdłuż niego. (G) Gdy ścięgna palców u nóg są wyraźnie widoczne, FDB jest odcinany wzdłuż czerwonej przerywanej linii. (H) FDB jest zabezpieczony przez ścięgna, a czwarte ścięgno boczne i jego włókna można usunąć, przecinając wzdłuż czerwonej przerywanej linii. Nadmiar powięzi można teraz odciąć. (I) Po oczyszczeniu mięsień FDB jest przenoszony do roztworu kolagenazy. Podziałka = (D-I) 2 mm. Skrót: FDB = flexor digitorum brevis. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Mikroskopijny obraz włókien mięśniowych FDB zanurzonych w hydrożelu po 24 godzinach hodowli. Niebieska strzałka: Przykład żywotnego włókna mięśniowego FDB. Żółta strzałka: Przykład skręconego włókna mięśniowego FDB. Skręcone włókna mięśniowe mogą mieć zmniejszoną żywotność i upośledzone skurcze, a zatem powinny być wyłączone z pomiarów. Czerwona strzałka: Przykład nadmiernie skurczonego włókna mięśniowego FDB. Nadmierny hiperskurcz występuje, gdy trituracja jest wykonywana zbyt energicznie lub może być spowodowana nadmiernym trawieniem kolagenazy lub użyciem niezrównoważonej pożywki hodowlanej. Podziałka = 100 μm. Skrót: FDB = flexor digitorum brevis. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Przykład stanów przejściowych skurczu światłowodu mierzonych za pomocą opartego na optyce, wysokoprzepustowego systemu skurczowego. (A) Przykład normalnego stanu przejściowego skurczu. Ten stan przejściowy jest uzyskiwany z sarkomerów otoczonych fioletowym kwadratem pokazanym na dolnym pasku narzędzi. Stan przejściowy składa się z następujących składników: długości sarkomeru na linii podstawowej (zielony), czasu trwania skurczu (niebieski), długości sarkomeru przy maksymalnym skurczu (fioletowy) i czasu trwania relaksacji (czerwony). Na podstawie tych wartości obliczane są takie parametry, jak prędkość i procent skurczu. (B) Przykład nieodpowiedniego stanu przejściowego skurczu. Pomiary te mają miejsce, gdy sygnał sarkomeru nie jest odbierany z powodu szumu (patrz czerwone strzałki). (C) Przykład stanu przejściowego skurczu, który ma artefakt ruchu (patrz zielone strzałki). Artefakty ruchowe występują, gdy włókno mięśniowe porusza się poza ogniskiem podczas skurczu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Reprezentatywne dane uzyskane przy użyciu wysokoprzepustowego systemu skurczowego opartego na optyce podczas porównywania warunków 2D i 3D oraz różnych hydrożeli. (A) Procent zaakceptowanych i odrzuconych pomiarów skurczu znalezionych przez program do analizy danych w kulturze 2D i w kulturze 3D na podstawie 30 pomiarów. (B) Porównanie maksymalnej prędkości skurczu we włóknach mięśniowych hodowanych w 2D i 3D wyizolowanych od trzech myszy po 24 godzinach hodowli. (C) Porównanie skrócenia sarkomeru we włóknach mięśniowych hodowanych w 2D i 3D wyizolowanych od trzech myszy po 24 godzinach hodowli. (D) Porównanie maksymalnej prędkości skurczu włókien mięśniowych zanurzonych w czystej macierzy błony podstawnej (Matrigel) i hydrożelu fibryny wyizolowanych od trzech myszy po 24 godzinach hodowli. (E) Porównanie skrócenia sarkomeru czystych włókien mięśniowych osadzonych w macierzy błony podstawnej (Matrigel) i hydrożelu fibrynowego wyizolowanych od trzech myszy po 24 godzinach hodowli. Dane zostały przeanalizowane za pomocą testu t-Studenta i są wyświetlane jako średnia ± SD. Każdy punkt danych to jedno włókno mięśniowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Skład pożywki do preparacji używanej do preparowania mięśni, pożywki do hodowli fibryny używanej do hodowli izolowanych włókien mięśniowych oraz pożywki do trawienia mięśni używanej do enzymatycznego trawienia izolowanych mięśni. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Skład mieszanki komórek użytej do odlewania hydrożeli oraz mieszanki matrycowej użytej do odlewania hydrożeli. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół przeprowadzania enzymatycznej izolacji i hodowli włókien mięśniowych FDB w formacie hodowli 3D, a następnie pomiarów kurczliwości przy użyciu systemu pomiaru kurczliwości opartego na optyce. Protokół ten ma wiele zalet, w tym: 1) prostą i terminową izolację wielu nienaruszonych włókien mięśniowych z jednego mięśnia; 2) osadzenie włókien mięśniowych w przestrajalnej matrycy hydrożelowej; 3) wykonywanie wysokoprzepustowych pomiarów kurczliwości z wykorzystaniem układu optycznego; oraz 4) zdolność do przeprowadzania powtarzających się pomiarów tych samych włókien mięśniowych po interwencji. Izolacja pojedynczych żywych włókien mięśniowych zapewnia dojrzałe komórki mięśniowe, które zachowują swoją funkcję skurczową. Ponieważ włókna mięśniowe uzyskane z mysiego FDB są stosunkowo małe, można nimi łatwo manipulować podczas izolacji i zachowują swój prosty kształt, co pozwala na dalsze pomiary skurczu. Chociaż system został opracowany przede wszystkim do badania skurczu kardiomiocytów, włókna mięśni szkieletowych zawierają tę samą maszynerię kurczliwą z łatwo rozpoznawalnym wzorem sarkomerowym, a zatem mogą być również mierzone za pomocątego systemu. Sprzężenie pomiarów kurczliwości pojedynczych komórek z żywymi hodowlami włókien mięśniowych ex vivo jest potężnym narzędziem do oceny zdrowia i funkcji dojrzałych włókien mięśniowych w odpowiedzi na aktywację elektryczną.

Ograniczeniem stosowania zdysocjowanych włókien mięśniowych jest brak sił zewnętrznych (tj. biernego rozciągania) przyłożonych do włókien, co skutkuje mniejszymi długościami spoczynkowych sarkomerów w porównaniu do tych występujących in vivo. Chociaż długość sarkomeru wynosząca 2,4-2,5 μm zapewnia optymalne wytwarzanie siły, długość spoczynkowego sarkomeru może się znacznie różnić33. Chociaż spoczynkowa długość sarkomeru in vivo FDB nie została jeszcze opisana, nasze własne niepublikowane dane sugerują średnią długość 2,2 μm. Obecne wyniki pokazują średnią długość spoczynkowego sarkomeru wynoszącą ~1,95 μm w nieobciążonych włóknach FDB po 24 godzinach w hodowli (ryc. 3). Chociaż ta mniejsza długość spoczynkowego sarkomeru skutkowałaby mniejszą produkcją siły, długość ~1,95 μm powinna nadal wytwarzać >90% maksymalnej siły34. W związku z tym te długości sarkomerów powinny być wystarczające do określenia różnic w funkcji włókien między różnymi modelami genetycznymi lub po leczeniu farmakologicznym. Dodatkowo zatopienie włókien w hydrożelu zapewnia wiele dodatkowych punktów przyczepności w porównaniu ze swobodnie pływającymi włóknami hodowlanymi 2D, co ograniczyłoby dalsze skracanie sarkomeru w czasie.

Jedną z zalet tego protokołu izolacji włókien mięśniowych jest wykorzystanie łatwego do wypreparowania mięśnia szybkokurczliwego składającego się ze stosunkowo małych włókien mięśniowych w porównaniu z innymi mięśniami, takimi jak prostownik długi palca (EDL). Ich mniejszy rozmiar sprawia, że izolacja mięśni jest bardziej odpowiednia do separacji opartej na trituracji, zmniejszając w ten sposób ryzyko uszkodzenia włókien mięśniowych wywołanego pipetowaniem lub splątaniem. Macierz zewnątrzkomórkowa mięśni FDB może być łatwo trawiona enzymatycznie za pomocą kolagenazy, co pozwala na izolację setek włókien mięśniowych w krótkim czasie. Jednak nadmierne trawienie może prowadzić do uszkodzenia włókien mięśniowych. Nadmierne trawienie włókien mięśniowych można rozpoznać, gdy mięsień rozpada się niemal natychmiast podczas rozcierania mięśnia lub gdy duża część objętości komórki jest nadmiernie skurczona podczas procedury wysiewu komórek. Aby zapobiec nadmiernemu trawieniu mięśni, czas trawienia musi być zoptymalizowany dla każdej partii kolagenazy. Aby to sprawdzić, dwa mięśnie FDB powinny być trawione równolegle, z rozłożonym czasem trawienia wynoszącym 5 minut między nimi. Należy wybrać czas trawienia z najwyższym plonem żywotnych włókien mięśniowych. Tę optymalizację należy następnie przeprowadzić po raz drugi, ponownie z 5-minutową separacją w czasie trawienia. Czas trawienia, w którym powstają najbardziej żywotne włókna mięśniowe, powinien być stosowany jako optymalny czas trawienia dla obecnej partii kolagenazy. Innym sposobem ograniczenia zmienności kolagenazy między partiami byłoby bezpośrednie obliczenie jednostek aktywności na mililitr roztworu podstawowego, a następnie odtworzenie kolejnych partii kolagenazy do tej samej ilości. Wreszcie, może być konieczne zoptymalizowanie czasu trawienia u różnych szczepów myszy, na przykład w przypadku badania starych lub chorych zwierząt, które wykazują zwiększone odkładanie się macierzy zewnątrzkomórkowej35,36.

Możliwość pipetowania żywotnych izolowanych włókien mięśniowych otwiera możliwości hodowli włókien mięśniowych FDB w różnych warunkach hodowli. Jedną z takich opcji jest hodowla tych włókien w hydrożelach w celu naśladowania natywnego środowiska hodowli tkankowej. Ten protokół zatapiania zapewnia, że włókna pozostają na miejscu podczas pomiarów skurczu i został zoptymalizowany, aby umożliwić włóknom osadzenie się na dnie płytki przed związaniem żelu. Jednak protokół ten może wymagać dostosowania w celu uwzględnienia różnic w zapasach trombiny i fibrynogenu. Jeśli aktywność trombiny jest zbyt wysoka, żel przedwcześnie stwardnieje, a włókna mogą pozostać zawieszone w wyższych miejscach poza płaszczyzną ogniskowej mikroskopu. Jeśli tak się stanie, należy dostosować stosunek trombiny do fibrynogenu. Można to sprawdzić, platerując włókna w coraz niższych stężeniach trombiny i zwracając uwagę na to, jak długo trwa polimeryzacja. Zazwyczaj nie powinno to nastąpić szybciej niż 30 minut. Jednak zbyt niskie stężenie trombiny może również upośledzać proces polimeryzacji. Inną metodą upewnienia się, że włókna znajdują się we właściwej płaszczyźnie ogniskowej, jest najpierw wysiew ich za pomocą protokołu 2D, a następnie dodanie warstwy hydrożelu na włókna po ich przyklejeniu do płytki hodowlanej. Należy jednak mieć świadomość, że usunięcie podłoża z włókien może wywołać hiperskurcz, ponieważ są one wrażliwe na wysychanie. Nie jest również jasne, czy hydrożel w pełni przyczepi się do płytki hodowlanej i może łatwiej się poluzować. Dlatego ta procedura osadzania jest preferowana do utrzymania żywotności włókien i na miejscu do pomiarów skurczu.

Zastosowanie tego protokołu umożliwia badanie dynamiki kurczliwości dojrzałych włókien mięśniowych ex vivo i może być stosowane zarówno u zdrowych myszy, jak i tych będących nosicielami mutacji genetycznych w chorobach mięśni. Umożliwia również testowanie, w jaki sposób warunki hodowli lub dodawanie związków wpływa na funkcję włókien mięśniowych. Dane dotyczące kurczliwości uzyskane za pomocą systemu opartego na optyce wskazują na zdolność skurczową żywych pojedynczych włókien mięśniowych, a zmiany tej zdolności mogą być skorelowane ze zdrowiem włókien. Same te dane nie są jednak wystarczające do określenia, czy zmiany te zachodzą na etapach mostkowania krzyżowego aktyna-miozyna lub uwalniania wapnia podczas skurczu mięśni. Chociaż w tym protokole nie opisujemy metod pomiaru sygnalizacji wapniowej, ta konfiguracja jest również w stanie mierzyć stany przejściowe wapnia na bazie Fura w kurczących się komórkach mięśniowych29. Wadą tego systemu jest to, że mięsień FDB zawiera tylko szybkokurczliwe włókna mięśniowe typu IIa/IIx, a mięśnie zawierające wolnokurczliwe włókna typu I tej wielkości nie zostały jeszcze opisane37. Eliminuje to możliwość badania funkcjonowania specyficznego dla danego rodzaju włókien za pomocą tej metody. Protokół, który tutaj proponujemy, może potencjalnie zostać zaadaptowany do innych mięśni, takich jak EDL lub płaszczkowaty, w celu zbadania różnic między rodzajami włókien. Ze względu na ich większy rozmiar, protokół ten musiałby zostać jeszcze bardziej zoptymalizowany dla tych mięśni. Dłuższe włókna mają tendencję do plątania się na etapie sedymentacji grawitacyjnej i pękają, jeśli są manipulowane przez pipetowanie, co doprowadziłoby do niższej wydajności. Ze względu na ich niekompatybilność z pipetowaniem, dłuższe włókna są również mniej kompatybilne z techniką zatapiania żelu. Pomiary tych włókien można nadal wykonywać w formacie hodowli 2D, ale włókna mogą się bardziej poruszać podczas skurczu ze względu na swój rozmiar, wpływając w ten sposób na stosunek sygnału do szumu. Innym ograniczeniem tego systemu jest brak możliwości wykonywania pomiarów siły równolegle z pomiarami skurczu, takich jak pomiary siły, które można uzyskać przy użyciu innych nienaruszonych preparatów włókien mięśniowych28. Ograniczenie to można jednak obejść, szacując siłę generowaną przez włókno mięśniowe. Siłę generowaną przez włókna mięśniowe można oszacować, jeśli znany jest kształt włókien mięśniowych w stanach skurczu i rozluźnienia, a także moduł Younga macierzy25. Niemniej jednak ten system optyczny zapewnia łatwe w użyciu, wysokowydajne podejście do badania funkcji skurczu mięśni i otwiera szereg nowych możliwości badania genetycznych chorób mięśni i interwencji terapeutycznych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Sylvii Bogaards, Sannie Luijcx, Valentijnowi Jansenowi, Michielowi Helmesowi i Emmy Manders za ich techniczną wiedzę w pomocy w rozwoju tego protokołu. Praca ta została wsparta nagrodami Stowarzyszenia Dystrofii Mięśniowej (Nagroda za rozwój MDA603238 dla T.J.K.), Holenderskiego Sojuszu Sercowo-Naczyniowego (Grant dla T.J.K) oraz Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych (NHMRC, Australia; Stypendium APP1121651 do M.Y.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Aprotynina firmy Bovine LungThermo ScientificAAJ63039MC100 mM roztwór podstawowy w PBS może być przechowywana w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Wysterylizuj roztwór podstawowy za pomocą 0,22 &mikro; m filtr.
Kolagenaza typu 2Worthington7733610% (w/v) roztwór podstawowy może być przechowywana w temperaturze -20 °C. Ważenie kolagenazy powinno odbywać się w komorze bezpieczeństwa, ponieważ wdychanie jest niebezpieczne.
Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher10500064
Fibrinogen z osocza bydlęcegoSigma Aldrich50-176-505420 mg/ml roztwór podstawowy w PBS można przechowywać w temperaturze -80 °C. Sterylizować roztwór podstawowy za pomocą 0,22 &mikro; m filtr.
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixThermo FisherA1413201mg/ml roztwór podstawowy przygotowuje się w MEM i przechowuje w temperaturze -20 °C.
Gibco MEM Wysoka glukoza + pirogronianThermo Fisher11095080
Surowica dla koniThermo FisherH1270
Matrigel GFR Membrane MatrixCorningCB-402304 mg/ml roztwór podstawowy przygotowuje się w MEM i przechowuje w temperaturze -20 °C.
Penicylina/StreptomycynaSigma AldrichP4333
Wymiana surowicy 2 (50x)Sigma AldrichS9388
Trombina, Osocze bydlęceThermo ScientificAAJ63383EXP125 U/ml zapas w PBS można przechowywać w temperaturze -20 °C. Sterylizować roztwór podstawowy za pomocą 0,22 &mikro; m filtr.
Kwas traneksamowyThermo Scientific AC22804250080 mM roztwór podstawowy w PBS może być przechowywany w temperaturze -20 °C. Wysterylizuj roztwór podstawowy za pomocą 0,22 &mikro; m filtr.
Sprzęt
24-dołkowy stymulator elektrycznyIonOptixN/A
Dumont #55 KleszczeFine Science Tools11295-51
Ekstra cienkie nożyczki BonnFine Science Tools14084-08
MultiCell CytocypherIonOptixN/A
MyoCam-S3IonOptixNie dotyczy
MyoPacerIonOptixN/A
SYLGARD 184 elastomer silikonowy, baza i Utwardzacz Dow corning Nie dotyczy
Vannas Spring Scissor - 25 mm Cutting EdgeFine Science Tools15002-08
Software
CytoSolverIonOptixN/a
IonWizard IonOptixN/a
4

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, L. R., Meyer, G. A. Skeletal muscle explants: Ex-vivo models to study cellular behavior in a complex tissue environment. Connective Tissue Research. 61 (3-4), 248-261 (2020).
  2. Khodabukus, A., Prabhu, N., Wang, J., Bursac, N. In vitro tissue-engineered skeletal muscle models for studying muscle physiology and disease. Advanced Healthcare Materials. 7 (15), 1701498(2018).
  3. Fernandez-Costa, J. M., Fernandez-Garibay, X., Velasco-Mallorqui, F., Ramon-Azcon, J. Bioengineered in vitro skeletal muscles as new tools for muscular dystrophies preclinical studies. Journal of Tissue Engineering. 12, 2041731420981339(2021).
  4. Romagnoli, C., Iantomasi, T., Brandi, M. L. Available in vitro models for human satellite cells from skeletal muscle. International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13221(2021).
  5. Dessauge, F., Schleder, C., Perruchot, M. -H., Rouger, K. 3D in vitro models of skeletal muscle: Myopshere, myobundle and bioprinted muscle construct. Veterinary Research. 52 (1), 72(2021).
  6. Hosoyama, T., Meyer, M. G., Krakora, D., Suzuki, M. Isolation and in vitro propagation of human skeletal muscle progenitor cells from fetal muscle. Cell Biology International. 37 (2), 191-196 (2013).
  7. Guo, X., et al. In vitro differentiation of functional human skeletal myotubes in a defined system. Biomaterials Science. 2 (1), 131-138 (2014).
  8. Denes, L. T., et al. Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation. Skeletal Muscle. 9 (1), 17(2019).
  9. Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In vitro differentiation of mature myofibers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141(2017).
  10. Khodabukus, A. Tissue-engineered skeletal muscle models to study muscle function, plasticity, and disease. Frontiers in Physiology. 12, 619710(2021).
  11. Engler, A. J., et al. Myotubes differentiate optimally on substrates with tissue-like stiffness: Pathological implications for soft or stiff microenvironments. Journal of Cell Biology. 166 (6), 877-887 (2004).
  12. Huang, N. F., et al. Myotube assembly on nanofibrous and micropatterned polymers. Nano Letters. 6 (3), 537-542 (2006).
  13. Earle, A. J., et al. Mutant lamins cause nuclear envelope rupture and DNA damage in skeletal muscle cells. Nature Materials. 19 (4), 464-473 (2020).
  14. Stange, K., Ahrens, H. E., von Maltzahn, J., Rontgen, M. Isolation and ex vivo cultivation of single myofibers from porcine muscle. In Vitro Cellular and Developmental Biology. Animal. 56 (8), 585-592 (2020).
  15. Ravenscroft, G., et al. Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system--A more mature muscle culture system. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).
  16. Ramsey, R. W., Street, S. F. The isometric length-tension diagram of isolated skeletal muscle fibers of the frog. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 15 (1), 11-34 (1940).
  17. Selvin, D., Hesse, E., Renaud, J. M. Properties of single FDB fibers following a collagenase digestion for studying contractility, fatigue, and pCa-sarcomere shortening relationship. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), R467-R479 (2015).
  18. Renzini, A., et al. Culture conditions influence satellite cell activation and survival of single myofibers. European Journal of Translational Myology. 28 (2), 7567(2018).
  19. Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074(2013).
  20. Holmberg, J., Durbeej, M. Laminin-211 in skeletal muscle function. Cell Adhesion and Migration. 7 (1), 111-121 (2013).
  21. Stuelsatz, P., Keire, P., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation, culture, and immunostaining of skeletal muscle myofibers from wildtype and nestin-GFP mice as a means to analyze satellite cell. Methods in Molecular Biology. 1556, 51-102 (2017).
  22. Alkhateeb, H., Chabowski, A., Bonen, A. Viability of the isolated soleus muscle during long-term incubation. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 31 (4), 467-476 (2006).
  23. Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695(2015).
  24. Ottenheijm, C. A., et al. Altered myofilament function depresses force generation in patients with nebulin-based nemaline myopathy (NEM2). Journal of Structural Biology. 170 (2), 334-343 (2010).
  25. Rausch, M., et al. Measurement of skeletal muscle fiber contractility with high-speed traction microscopy. Biophysical Journal. 118 (3), 657-666 (2020).
  26. de Winter, J. M., et al. KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 754-767 (2020).
  27. Wijnker, P. J. M., vander Velden, J. Mutation-specific pathology and treatment of hypertrophic cardiomyopathy in patients, mouse models and human engineered heart tissue. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1866 (8), 165774(2020).
  28. Cheng, A. J., Westerblad, H. Mechanical isolation, and measurement of force and myoplasmic free [Ca(2+)] in fully intact single skeletal muscle fibers. Nature Protocols. 12 (9), 1763-1776 (2017).
  29. Cao, L., Manders, E., Helmes, M. Automatic detection of adult cardiomyocyte for high throughput measurements of calcium and contractility. PLoS One. 16 (9), e0256713(2021).
  30. Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirci, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2010).
  31. Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical Research. 26 (3), 631-643 (2009).
  32. Cold Spring Harbor Protocols. Sylgard-coated coverslips and petri dishes. Cold Spring Harbor Protocols. 2022 (8), Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2022).
  33. Moo, E. K., Fortuna, R., Sibole, S. C., Abusara, Z., Herzog, W. In vivo sarcomere lengths and sarcomere elongations are not uniform across an intact muscle. Frontiers in Physiology. 7, 187(2016).
  34. Moo, E. K., Leonard, T. R., Herzog, W. The sarcomere force-length relationship in an intact muscle-tendon unit. Journal of Experimental Biology. 223, 215020(2020).
  35. Schuler, S. C., et al. Extensive remodeling of the extracellular matrix during aging contributes to age-dependent impairments of muscle stem cell functionality. Cell Reports. 35 (10), 109223(2021).
  36. Carberry, S., Zweyer, M., Swandulla, D., Ohlendieck, K. Proteomics reveals drastic increase of extracellular matrix proteins collagen and dermatopontin in the aged mdx diaphragm model of Duchenne muscular dystrophy. International Journal of Molecular Medicine. 30 (2), 229-234 (2012).
  37. Tarpey, M. D., et al. Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function. Skeletal Muscle. 8 (1), 14(2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Muscle Fiber ContractilityHydrogel EmbeddingOptics Based MeasurementHigh Throughput ScreeningMuscle Fiber IsolationElectrical StimulationSarcomere ShorteningFibrin HydrogelEx Vivo MuscleContractile Function

Powiązane artykuły