Izolacja i hodowla ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej za pomocą innowacyjnej metody wolnej od ksenogenu w terapii u ludzi

Podsumowanie

Produkty ksenogeniczne (chemiczne lub pochodzenia zwierzęcego) wprowadzone do etapów przygotowania/manipulacji terapii komórkowej są związane ze zwiększonym ryzykiem reaktywności immunologicznej i transmisji patogennej u pacjentów gospodarza. W tym artykule opisano całkowicie wolną od ksenogenów metodę izolacji i ekspansji in vitro ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej.

Streszczenie

Biorąc pod uwagę rosnący wpływ terapii komórkami macierzystymi, pojawiły się obawy dotyczące bezpieczeństwa biologicznego w związku z potencjalnym skażeniem lub przenoszeniem infekcji w związku z wprowadzeniem produktów pochodzenia zwierzęcego podczas manipulacji in vitro. Składniki ksenogenne, takie jak kolagenaza lub płodowa surowica bydlęca, powszechnie stosowane na etapach izolacji i ekspansji komórek, mogą być związane z potencjalnym ryzykiem reaktywności immunologicznej lub infekcji wirusowej, bakteryjnej i prionowej u pacjentów otrzymujących. Zgodnie z wytycznymi dobrej praktyki wytwarzania należy unikać chemicznej dysocjacji tkanek, a płodową surowicę bydlęcą (FBS) można zastąpić suplementami niezawierającymi ksenogenów. Ponadto, aby zapewnić bezpieczeństwo produktów komórkowych, ważne jest określenie bardziej wiarygodnych i odtwarzalnych metod. Opracowaliśmy innowacyjną, całkowicie wolną od ksenogenu metodę izolacji i ekspansji in vitro ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej bez zmiany ich właściwości w porównaniu ze standardowymi protokołami hodowli kolagenazy FBS. W tym przypadku wyizolowano ludzkie komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (hASC) z tkanki tłuszczowej jamy brzusznej. Próbkę mechanicznie rozdrobniono nożyczkami/skalpelem, podano mikropreparowaniu i mechanicznie zdyspergowano na 10-centymetrowej szalce Petriego, a następnie przygotowano z nacięciami skalpela w celu ułatwienia przyczepiania się fragmentów tkanek i migracji hASC. Po przeprowadzeniu etapów mycia wybrano hASC ze względu na ich przyleganie do tworzywa sztucznego bez trawienia enzymatycznego. Wyizolowane hASC hodowano z pożywką uzupełnioną 5% ludzkim lizatem płytkowym wolnym od heparyny i odłączono od substytutu trypsyny niepochodzącego od zwierząt. Zgodnie ze wskazówkami Dobrej Praktyki Wytwarzania (GMP) dotyczącymi wytwarzania produktów komórkowych przeznaczonych do terapii u ludzi, w żadnych pożywkach hodowlanych nie stosowano antybiotyków.

Wprowadzenie

W ostatnich dziesięcioleciach, rosnące zapotrzebowanie na innowacyjne terapie terapeutyczne spowodowało znaczne wysiłki i inwestycje w dziedzinie medycyny translacyjnej¹. Produkty komórkowe wiążą się z ryzykiem określonym przez źródło komórki, proces produkcyjny (izolacja, ekspansja lub modyfikacja genetyczna) oraz suplementy niekomórkowe (enzymy, czynniki wzrostu, suplementy hodowlane i antybiotyki), a te czynniki ryzyka zależą od konkretnego wskazania terapeutycznego. Na jakość, bezpieczeństwo i skuteczność produktu końcowego mogą mieć duży wpływ wyżej wskazane elementy². Terapia komórkami macierzystymi wymaga przestrzegania zasad bezpieczeństwa biologicznego; Potencjalne ryzyko przenoszenia patogenów z produktami pochodzenia zwierzęcego w hodowli komórkowej może być problematyczne, dlatego niezbędne jest dokładne przetestowanie każdego produktu wprowadzanego do produkcji³.

Tradycyjna metoda izolowania ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (hASC) obejmuje trawienie enzymatyczne przeprowadzane za pomocą kolagenazy, a następnie etapy płukania przez wirowanie⁴. Podczas gdy izolacja enzymatyczna jest ogólnie uważana za bardziej wydajną niż inne techniki mechaniczne pod względem wydajności i żywotności komórek, stosowane składniki pochodzenia zwierzęcego, takie jak kolagenaza, są uważane za więcej niż minimalnie manipulowane przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków. Oznacza to, że istnieje znacznie zwiększone ryzyko wystąpienia reakcji immunologicznych lub przeniesienia choroby, co ogranicza translację terapii hASC do warunków klinicznych^5,6.

Trawienie oparte na trypsynach to kolejny enzymatyczny protokół izolowania ASC. Opisano różne techniki z niewielkimi modyfikacjami pod względem stężenia trypsyny, szybkości wirowania i czasu inkubacji. Niestety, metoda ta nie jest dobrze opisana, a w literaturze brakuje porównań, szczególnie z protokołami izolacji mechanicznej⁷. Jednak pod względem przekładalności podejścia trypsyna ma te same wady co kolagenaza.

Alternatywne metody izolacji w celu uzyskania ASC, oparte na siłach mechanicznych i bez dodatku enzymów, polegają na szybkim wirowaniu (800 x g lub 1,280 x g, 15 min) fragmentów tkanki tłuszczowej. Następnie osad inkubuje się z buforem do lizy czerwonych krwinek (5 min), po czym następuje kolejny etap wirowania przy 600 x g przed ponownym zawieszeniem w pożywce hodowlanej. Pomimo większej liczby komórek wyizolowanych w pierwszych dniach w porównaniu z metodami eksplantacji, poprzednie badanie wykazało niższą proliferację lub jej brak po drugim tygodniu hodowli⁸.

Poza tym, dalsze manipulacje z dodanymi pożywkami ksenogenicznymi, takimi jak płodowa surowica bydlęca (FBS), która jest używana jako dodatek czynnika wzrostu do hodowli komórkowej, wiąże się ze zwiększonym ryzykiem reaktywności immunologicznej i narażeniem na infekcje wirusowe, bakteryjne lub prionowe pacjenta gospodarza9^,10. Reakcje immunologiczne i rozwój wysypki pokrzywkowej zostały już opisane u osób otrzymujących kilka dawek mezenchymalnych komórek macierzystych wytwarzanych za pomocą FBS¹¹. Ponadto FBS jest poddawany zmienności między partiami, co może mieć wpływ na jakość produktu końcowego¹².

Zgodnie z wytycznymi dobrej praktyki produkcyjnej (GMP), należy unikać dysocjacji tkanek enzymatycznych, a FBS należy zastąpić suplementami wolnymi od ksenogenów. Te kroki, wraz z bardziej wiarygodnymi i powtarzalnymi protokołami, są niezbędne do wsparcia stosowania terapii komórkowej^3,13.

W tym kontekście, ludzki lizat płytkowy (hPL) został zasugerowany jako substytut FBS, ponieważ jest to suplement bezkomórkowy, zawierający białko, wzbogacony w czynnik wzrostu, i został wcześniej wprowadzony wśród produktów komórkowych klasy klinicznej jako dodatek pożywki do hodowli i ekspansji komórek in vitro^14,15. Ponieważ hPL jest produktem pochodzenia ludzkiego, jest często stosowany jako substytut FBS podczas hodowli in vitro hASC przeznaczonych do zastosowań klinicznych, zmniejszając w ten sposób problemy dotyczące reakcji immunologicznych i infekcji związanych z translatowalnością FBS^15,16.

Pomimo wyższych kosztów produkcji, już wykazano, że w porównaniu do FBS, hPL wspiera żywotność komórek dla wielu typów komórek, zwiększa proliferację, opóźnia starzenie, zapewnia stabilność genomu i zachowuje immunofenotyp komórkowy nawet w późnych przejściach komórkowych; wszystkie te elementy wspierają przejście na ten suplement do hodowli11.

Celem tej pracy było opracowanie ustandaryzowanego protokołu do izolacji i hodowli hASC metodą całkowicie bezzwierzęcą, bez modyfikacji fizjologii komórki i właściwości macierzystych w porównaniu do klasycznych hASC hodowanych przez FBS (Rysunek 1).

Protokół

hASC zostały wyizolowane z tkanki tłuszczowej brzucha zdrowej kobiety, która przeszła rekonstrukcję piersi za pomocą autologicznych płatów brzusznych (głębokie dolne płaty perforacyjne nadbrzusza, [DIEP]) w Szpitalu Uniwersyteckim w Lozannie, CHUV, Lozanna, Szwajcaria. Odrzucona część płata oraz tkanka tłuszczowa została pozyskana po podpisaniu przez pacjenta świadomej zgody. Wszystkie protokoły zostały sprawdzone i zatwierdzone przez szpitalny Dział Biobanku DAL (numer 314 GGC) oraz komisje bioetyczne zgodnie z Deklaracją Helsińską.

UWAGA: Wszystkie kroki muszą być wykonywane pod okapem z przepływem laminarnym i w warunkach aseptycznych. Należy zawsze nosić rękawice i fartuchy laboratoryjne do ochrony osobistej, a wszystkie powierzchnie należy myć odpowiednimi środkami biobójczymi. Nadmiar tkanek należy odpowiednio zutylizować jako odpady biomedyczne.

1. Potrzebne materiały i przygotowanie roztworów hodowlanych

1. Do izolacji, ekspansji i krioprezerwacji komórek zaopatrz się w następujące instrumenty: sterylne nożyczki; sterylne skalpele; sterylna pęseta; 10-centymetrowa szalka Petriego; probówki 15 ml; kolby T25; komora Burkera; kriowialisty; pojemnik do zamrażania komórek; mikroskop optyczny z obiektywami o powiększeniu 4x i 10x; i wahadłowa wirówka kubełkowa.
2. Do immunofenotypowania należy zaopatrzyć się w następujące przyrządy i odczynniki: probówki FACS, sterylny roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS); Minimalna pożywka egzogenna (DMEM) firmy Dulbecco; hPL; siarczek dimetylu; i trypsyna wolna od zwierząt.
3. Przygotuj kompletną pożywkę hodowlaną, uzupełniając DMEM 5% hPL bez heparyny. Przechowuj podłoże w temperaturze 4 °C przez okres do 3 tygodni i zawsze używaj go w ciepłym (od temperatury pokojowej do 37 °C). Postępując zgodnie z wytycznymi GMP dotyczącymi produkcji leków komórkowych przeznaczonych do terapii u ludzi, nie należy dodawać żadnych antybiotyków do pożywki hodowlanej.
4. Przygotować pożywkę zamrażającą zawierającą 20% hPL i 10% siarczku dimetylu w DMEM.

2. Izolacja hASC z próbki tkanki tłuszczowej

1. Próbkę tkanki tłuszczowej należy poddać obróbce w ciągu 6 godzin od jej uzyskania. Przed przystąpieniem do ustalonej metody izolacji mechanicznej wolnej od ksenogenów, należy przemyć tkankę 2x PBS przez 10 minut, aż do uwolnienia tkanki łącznej i krwi.
2. Pobraną próbkę tkanki tłuszczowej z operacji abdominoplastycznej należy przechowywać w PBS w temperaturze 4°C do czasu przetworzenia, a w każdym razie nie dłużej niż 24 godziny, aby nie uszkodzić żywotności hASC.
3. Pokrój tkankę tłuszczową na mniejsze kawałki o długości około 1^cm2 za pomocą sterylnych nożyczek.
4. Za pomocą skalpela rozetnij każdy kawałek na małe fragmenty o średnicy <5 mm i rozproszyj pięć z nich na 10 cm szalce Petriego (Ryc. 2A).
5. Aby przymocować każdy fragment, użyj skalpela, aby wykonać nacięcia na plastikowej powierzchni, przeciągając każdy fragment, aż mocno przyklei się do szalki Petriego. Użyj pęsety, aby poradzić sobie z fragmentem (Rysunek 2B).
6. Delikatnie dodaj 10 ml kompletnej pożywki hodowlanej, aby pokryć wszystkie fragmenty bez ich odłączania.
7. Inkubować płytki Petriego w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . hASC będą migrować z tkanki i zostaną wybrane ze względu na ich przyleganie do tworzywa sztucznego bez trawienia enzymatycznego.
8. Do momentu zbiegu komórek monitoruj ekspansję hASC pod mikroskopem optycznym przy 4-krotnym powiększeniu raz dziennie. Gdy hASC zaczynają wychodzić z tkanki, pojawiają się jako małe skupiska wokół fragmentów tkanki o typowej morfologii podobnej do fibroblastów. hASC są wybierane ze względu na ich zdolność do przylegania do powierzchni tworzywa sztucznego. Co 72 godziny usuwaj jak najwięcej pożywki i zastąp ją świeżą, kompletną pożywką w celu usunięcia resztek komórek.
9. Pozostaw fragmenty tkanki na miejscu do pierwszego przejścia komórek, czyli zwykle po 7 dniach.

3. Hodowla hASC po fazie izolacji

1. Gdy kultura hASC osiągnie zbieżność 70%-80%, hASC są gotowe do odłączenia i dalszej rozbudowy, aby można je było wykorzystać do innych eksperymentów lub długoterminowego przechowywania.
2. Za pomocą sterylnej pęsety usuń i wyrzuć wszystkie kawałki tkanki z szalki Petriego. Wyjąć i wyrzucić wyczerpane podłoże, uważając, aby nie dotknąć hASC, aby ich nie odłączyć.
3. Ostrożnie umyj komórki raz 10 ml PBS. Dodać 1 ml 1x trypsyny wolnej od zwierząt i pozostawić szalkę Petriego w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 5 minut.
4. Sprawdź pod mikroskopem optycznym przy 4-krotnym powiększeniu, czy wszystkie komórki się odłączyły; w przeciwnym razie pozostaw szalkę Petriego na dodatkowe 2 minuty w inkubatorze i na koniec delikatnie postukaj w plastikową powierzchnię, aby ułatwić odklejenie komórek.
5. Zatrzymaj działanie trypsyny, dodając 2 ml kompletnej pożywki i zbierz wszystkie komórki w probówce o pojemności 15 ml.
6. W celu usunięcia pozostałej trypsyny należy odwirować probówkę o stężeniu 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant, zawiesić komórki w 5 ml kompletnej pożywki i przenieść zawiesinę komórek do nowej kolby T25. Utrzymuj hASC w kulturze i rozwijaj je, aż będą potrzebne.

4. Badanie immunofenotypu metodą cytometrii przepływowej

1. Gdy posiew hASC osiągnie zbieżność 70%-80%, należy odłączyć hASC, jak opisano wcześniej w sekcji 3.
2. Po zebraniu komórek zawiesić je w 1 ml kompletnej pożywki i policzyć porcję za pomocą licznika komórek pod mikroskopem optycznym przy 10-krotnym powiększeniu.
3. Odwirować hASC przy 300 x g przez 5 minut i zawiesić je na 1 x 10⁶ komórek/ml buforu FACS. Przenieść 100 μl zawiesiny zawierającej 1 x^{10 5} komórek do jednej probówki FACS. Użyj jednej probówki FACS dla każdego badanego antygenu oraz jeszcze jednej dla każdej kontroli izotypowej.
4. Wybarwić komórki 100 μl następujących przeciwciał rozcieńczonych w buforze FACS: anty-CD73 (1:1,000, IgG1, znakowane FITC), anty-CD105 (1:200, IgG1, znakowane PE); anty-CD34 (1:66, IgG1, znakowane FITC); anty-CD45 (1:66, IgG1, znakowane FITC); oraz kontrole izotypowe dla każdego fluoroforu, IgG1 znakowane FITC (1:1,000) i IgG1 PE znakowane (1:50).
5. Inkubować próbki przez 1 godzinę w ciemności z mieszaniem w temperaturze 4 °C. Odwirować probówki o stężeniu 300 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i zawiesić komórki w 500 μl buforu FACS.
6. Oceń immunofenotyp komórki za pomocą przyrządu do cytometrii przepływowej, rejestrując 50 000 zdarzeń dla każdej probówki wewnątrz bramki wybranej w celu wykluczenia resztek komórek. Obliczyć procent komórek wykazujących ekspresję jako różnicę w stosunku do specyficznej kontroli izotypowej.

5. Test proliferacji hASC

1. Gdy kultura hASC osiągnie zbieżność 70%-80%, odłącz hASC zgodnie z opisem w sekcji 3.
2. Po zebraniu komórek zawiesić je w 1 ml kompletnej pożywki i policzyć porcję za pomocą licznika komórek pod mikroskopem optycznym przy 10-krotnym powiększeniu.
3. Wysiew 5 x 10² hASC w 200 μl kompletnego podłoża w 96-dołkowych przezroczystych płytkach. Zasiej komórki w kontrpróbach technicznych, z jednym dołkiem na każdy punkt czasowy.
4. Po 3 dniach od wysiewu rozpocznij wykrywanie proliferacji komórek za pomocą zestawu do oznaczania proliferacji, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Krótko mówiąc, zastąp pożywkę hodowlaną 100 μl świeżej pożywki dodanej do 20 μl odczynnika do oznaczania na basenik. Inkubować hASC przez 2,5 h w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ w celu wytworzenia odczynnika, a następnie wykryć absorbancję przy 490 nm za pomocą spektrofotometru.
5. Wyraż proliferację hASC jako procentową absorbancję po usunięciu absorbancji ślepej próby.

6. Kriokonserwacja i przechowywanie hASC

1. Odłączyć ogniwa zgodnie z opisem w sekcji 3 i policzyć podwielokrotność za pomocą licznika komórek pod mikroskopem optycznym przy 10-krotnym powiększeniu.
2. Odwirować komórki o masie 300 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Zawiesić komórki za pomocą mieszanki zamrażającej o gęstości 1 x 10⁶ hASCs/ml i przenieść 1 ml roztworu komórkowego do jednego kriowialu.
3. Umieść kriowiale w temperaturze -80 °C w pojemniku do zamrażania, który obniża temperaturę o 1 °C/min, a następnie przenieś kriowiale do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.

Wyniki

Stosując opisaną powyżej metodę izolacji, pomyślnie uzyskano hASC z próbek tkanki tłuszczowej brzucha bez użycia kolagenazy. Ponadto hASC namnożono w całkowicie ksenogennych warunkach w obecności hPL, bez żadnych innych komponentów pochodzenia zwierzęcego. Poniższe wyniki potwierdzają skuteczność protokołu i zostały uzyskane z hASC hodowanych równolegle z hPL oraz z FBS jako warunkiem kontrolnym.

Po początkowym pojawieniu się klastrów, hASCs wykazywały klasyczny wrzecionowaty kształt, były mni...

Dyskusja

Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej przyciągnęły zainteresowanie badań translacyjnych w ciągu ostatniej dekady ze względu na ich obfitość, szybkie i niedrogie metody izolacji, wysoki wskaźnik proliferacji in vitro/in vivo oraz właściwości macierzyste/różnicujące 18,19,20. W rezultacie, hASC są uważane za doskonałego kandydata na strategie komórkowe w medycynie regeneracyjnej^21<...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki 15 ml	euroclone	et5015b
anty-CD105	BD Biosciences	BD560839
anty-CD34	BD Biosciences	BD555821
anty-CD45	BD Biosciences	BD555482
anty-CD73	BD Biosciences	BD561254
autoMACS Roztwór płuczący (bufor FACS)	Miltenyi	130-091-222
Aparat BD Accuri C6 (przyrząd do cytometrii przepływowej)	BD zgodnie z
komorą Burkera	Blaubrand	717810
Pojemnik do zamrażania komórek	corning	CLS432002
CellTiter 96 AQueous One Solution Test proliferacji komórek	Promega	G3582
CoolCell Pojemnik do zamrażania	Corning
Cryovials	clearline	390701
Siarczek dimetylu	Sigma Aldrich	D2650-100mL
Skalpel jednorazowego ostrza	Paragon	BS 2982
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - wysoki poziom glukozy	GIBCO	11965092
Ludzki lizat płytkowy FD (klasa GMP)	Stemulate	PL-NH-500
Nieskończony spektrofotometr F50		Tecan-Mikroskop
optyczny z obiektywami o powiększeniu 4x i 10x	Olympus	CKX41
szalka Petriego 10 cm	Greiner bio-one	664160
Sterylne skalpele	Reda	07104-00
Nożyczki sterylne	Bochem	4071
Pęseta sterylna	Bochem	1152
Wirówka kubełkowa wahadłowa	Kolby Sigma	3-16K
T25	Greiner bio-one	6910170
TrypLe (substytut trypsyny bez zwierząt)	GIBCO	12604-013

CLS432002