Lipoliza triglicerydowa w adipocytach jest ważnym procesem metabolicznym, w wyniku którego uwalniane są wolne kwasy tłuszczowe i glicerol. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół pomiaru podstawowej i stymulowanej lipolizy w adipocytach i tkance tłuszczowej ex vivo od myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar częstości lipolizy w mysiej tkance tłuszczowej ex vivo i pierwotnych preadipocytach zróżnicowanych in vitro
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Adipocyty magazynują energię w postaci trójglicerydów w kropelkach lipidów. Energia ta może być mobilizowana poprzez lipolizę, w której łańcuchy boczne kwasów tłuszczowych są sekwencyjnie odcinane od szkieletu glicerolu, co powoduje uwolnienie wolnych kwasów tłuszczowych i glicerolu. Ze względu na niską ekspresję kinazy glicerolowej w białych adipocytach, wskaźniki wychwytu zwrotnego glicerolu są znikome, podczas gdy wychwyt zwrotny kwasów tłuszczowych jest podyktowany zdolnością wiązania kwasów tłuszczowych składników pożywki, takich jak albumina. Zarówno uwalnianie glicerolu, jak i kwasów tłuszczowych do pożywki można określić ilościowo za pomocą testów kolorymetrycznych w celu określenia szybkości lipolitycznej. Mierząc te czynniki w wielu punktach czasowych, można z dużą pewnością określić liniową szybkość lipolizy. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół pomiaru lipolizy w adipocytach zróżnicowanych in vitro i tkance tłuszczowej ex vivo od myszy. Protokół ten może być również zoptymalizowany pod kątem innych linii komórkowych preadipocytów lub tkanki tłuszczowej z innych organizmów; Omówiono zagadnienia i parametry optymalizacyjne. Protokół ten został zaprojektowany tak, aby był przydatny w określaniu i porównywaniu szybkości lipolizy adipocytów między modelami mysimi a leczeniem.
Wprowadzenie
Nadmiar składników odżywczych jest magazynowany w białej tkance tłuszczowej w postaci trójglicerydów w neutralnym rdzeniu lipidowym kropel tłuszczowych. Zapasy trójglicerydów są mobilizowane poprzez lipoliza, proces, w którym łańcuchy boczne kwasów tłuszczowych są sekwencyjnie odcinane przez lipazę trójglicerydów tkanki tłuszczowej (ATGL), lipazę wrażliwą na hormony (HSL) oraz lipazę monoglicerydów (MGL), co prowadzi do uwolnienia wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) i szkieletu glicerolu1,2Lipoliza jest aktywowana przez sygnalizację katecholaminową w tkance tłuszczowej. Zakończenia nerwów współczulnych ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Zastosowanie wszystkich zwierząt zostało zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) w Weill Cornell Medical College Uniwersytetu Cornell.
1. Przygotowanie buforów i płytek do zbierania próbek
- Przygotuj 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), rozpuszczając 5 g BSA w 100 mL pożywki Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) bez czerwieni fenolowej. Delikatnie mieszaj BSA do całkowitego rozpuszczenia (wstrząsanie jest nieskuteczne). Po całkowitym rozpuszczeniu BSA wysterylizuj pożywkę za pomocą filtra 0,2 µm. Przechowuj pożywkę z BSA w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 1 miesią....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zmierzyliśmy podstawowe i stymulowane tempo lipolizy w adipocytach zróżnicowanych in vitro. Pierwotne preadipocyty z białej tkanki tłuszczowej pachwinowej zróżnicowano do adipocytów poprzez traktowanie konfluencyjnych komórek 5 µM deksametazonem, 0,5 mM IBMX, 1 µg/mL insuliną oraz 1 µM troglitazonem przez 4 dni, a następnie dodatkowym 3-dniowym traktowaniem 1 µg/mL insuliną. Przed testem lipolizy komórki inkubowano w pośrodku bez insuliny przez 24 h. W czasie t = 0 h komórki przemyto raz PBS, a następnie do każd.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym miejscu przedstawiamy podstawowy protokół pomiaru szybkości lipolizy w adipocytach i tkance tłuszczowej ex vivo . Aby określić ilościowo lipolizę, ważne jest zmierzenie szybkości lipolitycznej w fazie liniowej. Stosujemy technikę próbkowania seryjnego, w której duża część pożywki jest zbierana i zastępowana świeżą pożywką w regularnych odstępach czasu. Ta półkonserwatywna metoda pozwala na dodanie świeżego BSA o pojemności buforowej FFA i opóźnia hamowanie sprzężenia zwrotnego, wydłużając czas trwania lipo.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez grant Narodowych Instytutów Zdrowia Stanów Zjednoczonych R01DK126944 dla S.M.R.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 24-dołkowa płytka poddana hodowli tkankowej | Corning Inc | 3527 | Musi być poddana hodowli tkankowej pod kątem różnicowania adipocytów |
| 48-dołkowa płaska płytka dolna z pokrywką | Corning Inc | 353078 | Może być poddana obróbce kultur tkankowych |
| 6-dołkowa płaska płyta dolna z pokrywką | Corning Inc | 353046 | Może być traktowana kulturą tkankową |
| 96-dołkowa płytka PCR | USA sceintific | 1402-9100 | Każda stożkowa płytka PCR 0,2 ml będzie wygodna |
| również albumina surowicy bydlęcej | Sigma Aldrich | A9418 | FFA free BSA, taka jak A8806. BSA nie powinno mieć wykrywalnego FFA, również wiele zmian w BSA może wpływać na obserwowaną szybkość lipolizy |
| CL-316,243 | Sigma Aldrich | C5976 | CAS #: 138908-40-4 dostępne u innych dostawców |
| Inkubator CO2 | PHCBI | MCO-170AICUVH | CO2 powinien być idealnie ustawiony na 10% dla tkanki tłuszczowej, jednak 5% CO2 będzie również działać |
| DMEM, niska glukoza, brak czerwieni fenolowej | Thermofischer | 11054020 | Wszelkie podłoża wolne od czerwieni fenolowej powinny działać, DMEM/F12, RPMI, ale powinny zawierać lotną zdolność buforową, tj. |
| albuminę surowicy bydlęcej wolną od biowęglanu FFA | Equitech-Bio, Inc, | BAH66 | |
| Wolny odczynnik glicerolowy | Sigma Aldrich | F6428 | |
| Roztwór wzorcowy glicerolu | Sigma Aldrich | G7793 | Można to również osiągnąć poprzez rozcieńczenie glicerolu do pożądanego stężenia |
| Standardowe rozwiązanie NEFA serii HR Fujifilm | 276-76491 | ||
| Seria HR NEFA-HR (2) Odczynnik kolorowy A | Fujifilm | 999-34691 | |
| Seria HR NEFA-HR (2) Odczynnik kolorystyczny B | Fujifilm | 991-34891 | |
| Seria HR NEFA-HR (2) Rozpuszczalnik A | Fujifilm | 995-34791 | |
| HR Series NEFA-HR (2) Rozpuszczalnik B | Fujifilm | 993-35191 | |
| Inkubator mikrobiologiczny | Fischer Scientific | S28668 | Można użyć dowolnego inkubatora o temperaturze 37C |
| Nunc MicroWell 96-dołkowe płytki | Thermo Scientific | 269620 | Dowolna optycznie przezroczysta, 96-dołkowa płytka z płaskim dnem działa |
| Silikonowa laboratoryjna mata stołowa | VWR | 76045-300 | Można również użyć szklanej płyty. Powierzchnie chłonne nie są zalecane |
| Spektrofotometr/czytnik mikropłytek | Urządzenia molekularne | SpectraMax i3x | Każdy czytnik płytek, który może odczytywać na 540, 550 i 660 mm, będzie działał |
| V Albumina surowicy bydlęcej | Sigma-Aldrich | 810531 | |
| WypAll X70 Wycieraczki | Kimberly-Clark | 41200 | Każdy wysokiej jakości ręcznik papierowy będzie działał |
Bibliografia
- Vaughan, M., Berger, J. E., Steinberg, D. Hormone-sensitive lipase and monoglyceride lipase activities in adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 239, 401-409 (1964).
- Zimmermann, R., et al. Fat mobilization in adipose tiss....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
