Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar częstości lipolizy w mysiej tkance tłuszczowej ex vivo i pierwotnych preadipocytach zróżnicowanych in vitro

4.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65106

⸱

17 marca 2023

 , 
1Weill Center for Metabolic Health, Department of Medicine, Weill Cornell Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Lipoliza triglicerydowa w adipocytach jest ważnym procesem metabolicznym, w wyniku którego uwalniane są wolne kwasy tłuszczowe i glicerol. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół pomiaru podstawowej i stymulowanej lipolizy w adipocytach i tkance tłuszczowej ex vivo od myszy.

Streszczenie

Adipocyty magazynują energię w postaci trójglicerydów w kropelkach lipidów. Energia ta może być mobilizowana poprzez lipolizę, w której łańcuchy boczne kwasów tłuszczowych są sekwencyjnie odcinane od szkieletu glicerolu, co powoduje uwolnienie wolnych kwasów tłuszczowych i glicerolu. Ze względu na niską ekspresję kinazy glicerolowej w białych adipocytach, wskaźniki wychwytu zwrotnego glicerolu są znikome, podczas gdy wychwyt zwrotny kwasów tłuszczowych jest podyktowany zdolnością wiązania kwasów tłuszczowych składników pożywki, takich jak albumina. Zarówno uwalnianie glicerolu, jak i kwasów tłuszczowych do pożywki można określić ilościowo za pomocą testów kolorymetrycznych w celu określenia szybkości lipolitycznej. Mierząc te czynniki w wielu punktach czasowych, można z dużą pewnością określić liniową szybkość lipolizy. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół pomiaru lipolizy w adipocytach zróżnicowanych in vitro i tkance tłuszczowej ex vivo od myszy. Protokół ten może być również zoptymalizowany pod kątem innych linii komórkowych preadipocytów lub tkanki tłuszczowej z innych organizmów; Omówiono zagadnienia i parametry optymalizacyjne. Protokół ten został zaprojektowany tak, aby był przydatny w określaniu i porównywaniu szybkości lipolizy adipocytów między modelami mysimi a leczeniem.

Wprowadzenie

Nadmiar składników odżywczych jest magazynowany w białej tkance tłuszczowej w postaci trójglicerydów w neutralnym rdzeniu lipidowym kropel tłuszczowych. Zapasy trójglicerydów są mobilizowane poprzez lipoliza, proces, w którym łańcuchy boczne kwasów tłuszczowych są sekwencyjnie odcinane przez lipazę trójglicerydów tkanki tłuszczowej (ATGL), lipazę wrażliwą na hormony (HSL) oraz lipazę monoglicerydów (MGL), co prowadzi do uwolnienia wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) i szkieletu glicerolu1,2Lipoliza jest aktywowana przez sygnalizację katecholaminową w tkance tłuszczowej. Zakończenia nerwów współczulnych uwalniają lokalnie katecholaminy, które wiążą się z receptorami β-adrenergicznymi na błonie komórkowej adipocytów. Po związaniu ligandu te receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) aktywują cyklazę adenylową. poprzez GαsNastępująca po tym aktywacja kinazy białkowej A (PKA) przez cAMP prowadzi do upregulacji zarówno ATGL, jak i HSL. Fosforylacja perilipiny-1 przez PKA powoduje dysocjację ABHD5 (znanego również jako CGI-58), który wiąże i koaktywuje ATGL.3PKA bezpośrednio fosforyluje HSL, co sprzyja jego translokacji z cytozolu do kropel lipidowych, gdzie interakcja z fosforylowaną perilipiną-1 dodatkowo zwiększa jego aktywność lipazy.4,5,6,7Trzecia lipaza uczestnicząca w lipolizie, MGL, nie wydaje się być regulowana przez sygnalizację katecholaminową.8Ważne jest, że synteza triglicerydów w adipocytach odbywa się za pośrednictwem szlaku syntezy lipidów glicerolowych, w którym nie dochodzi do powstawania monoglicerydów jako produktów pośrednich; zamiast tego acylotransferazy glicerolo-3-fosforanowe katalizują powstawanie kwasu lizofosfatydowego, który łączy się z kolejnym acylo-CoA kwasu tłuszczowego, tworząc kwas fosfatydowy, a następnie ulega izomeryzacji do diglicerydów przed końcową syntezą triglicerydów (Rycina 1)9,10,11.

Schemat szlaków lipolizy i syntezy lipidów glicerolowych z reakcjami TG, DG, MG i enzymami.
Rycina 1: Szlaki lipolizy i syntezy lipidów glicerolowych. Góra: szlak lipolityczny; enzymy zaznaczone na czerwono: lipaza trójglicerydów tkanki tłuszczowej (ATGL), lipaza wrażliwa na hormony (HSL) oraz lipaza monoglicerydów (MGL). Dół: szlak syntezy lipidów glicerolowych; enzymy zaznaczone na zielono: acylotransferaza diglicerydowa (DGAT), fosfatydowa kwasowa fosfataza (PAP), acylotransferaza lizofosfatydowa (LPAT, znana również jako LPAATs) oraz acylotransferaza glicerolo-3-fosforanowa (GPAT). Lipidy: trójglicerydy (TG), diglicerydy (DG), monoglicerydy (MG), wolne kwasy tłuszczowe (FFA), acylo-CoA kwasów tłuszczowych (FA-CoA), kwas lizofosfatydowy (LPA) i kwas fosfatydowy (PA). Inne metabolity: fosforan nieorganiczny (Pi) i glicerolo-3-fosforan (G3P). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Zewnątrzkomórkowa adenozyna jest kolejnym istotnym regulatorem lipolizy, działającym poprzez Gs- oraz Gi-sprzężone receptory GPCR wpływające na aktywność cyklazy adenylowej. Dominującym receptorem adenozyny w adipocytach jest ADORA1, który hamuje cyklazę adenylową, a tym samym lipolizę, poprzez aktywację Gi12Wyrażany na niższym poziomie, głównie w adipocytach brunatnych, receptor ADORA2A aktywuje lipolizę poprzez Gs sygnalizacja13ADORA1 wpływa zarówno na lipolizę podstawową, jak i na odpowiedź na agonistów adrenergicznych. Wpływ adenozyny na lipolizę można kontrolować poprzez dodanie dehydrogenazy adenozynowej w celu neutralizacji adenozyny, a także poprzez zastosowanie swoistego agonisty ADORA1, fenyloizopropyladenozyny.14,15Hormonalna aktywacja białek GqGPCR sprzężone z białkami G mogą również wpływać na lipolizę poprzez aktywacja fosfolipazy C i kinazy białkowej C16,17,18,19Sygnały zapalne wpływają również na tempo lipolizy. Aktywacja TLR4 przez LPS (oraz inne endotoksyny) zwiększa tempo lipolizy poprzez aktywację ERK, która fosforyluje perilipinę-1 oraz HSL.20TNF-α aktywuje również lipolizę poprzez Aktywacja ERK i NF-κB, a także transcriptionalne obniżenie poziomu fosfodiesterazy PDE-3B i białka CIDEC21,22,23IL-6 powiązano również ze zwiększoną lipolizą adipocytów, szczególnie w tkance tłuszczowej krezkowej, której uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) wpływa na stłuszczenie wątroby oraz glukoneogenezę.24,25,26.

Lipoliza jest hamowana podczas stanu sytości przez insulinę. AKT fosforyluje i aktywuje PDE-3B, aby stłumić sygnalizację cAMP i zapobiec aktywacji PKA27. Insulina powoduje również transkrypcyjne obniżenie poziomu ATGL28. Otyłość sprzyja oporności na katecholaminy poprzez szereg mechanizmów, w tym obniżenie poziomu receptorów β-adrenergicznych w adipocytach29,30,31,32,33. Adipocyty wykazują ekspresję wszystkich trzech receptorów β-adrenergicznych (β-1, β-2 i β-3). Podczas gdy receptory β-1 i β-2 adrenergiczne są wykazane powszechnie, receptor β-3 adrenergiczny jest ekspresjonowany głównie w adipocytach myszy34,35. Ekspresja Adrb3 jest indukowana przez C/EBPα podczas adipogenezy36. Receptor β-3 adrenergiczny jest silnie ekspresjonowany w dojrzałych adipocytach. Aktywacja receptorów β-1 i β-2 adrenergicznych jest samograniczająca ze względu na hamowanie zwrotne przez β-arestynę37. Hamowanie zwrotne receptora β-3 adrenergicznego jest zapśredniczone przez inne szlaki sygnalizacyjne, które obniżają ekspresję Adrb333,38,39.

Do aktywacji lipolizy w adipocytach można wykorzystać liczne związki. Głównymi fizjologicznymi aktywatorami lipolizy są katecholaminy. Norepinefryna (lub noradrenalina) oraz epinefryna (lub adrenalina) aktywują wszystkie trzy rodzaje receptorów β-adrenergicznych40. Norepinefryna i epinefryna wpływają również na lipolizę via aktywację sygnalizacji receptora α-adrenergicznego41. Do powszechnie stosowanych agonistów receptorów β-adrenergicznych należą izoproterenol, który jest nieselektywnym agonistą receptorów β-adrenergicznych, oraz agoniści receptora β-3 adrenergicznego: CL-316,243 i mirabegron42. Biorąc pod uwagę, że adipocyty wykazują nadekspresję receptora β-3 adrenergicznego, w niniejszym przykładzie zastosowano CL-316,243. Jego specyficzność względem receptora β-3 adrenergicznego sprawia, że jest on stosunkowo specyficznym aktywatorem sygnalizacji katecholaminowej w adipocytach, który może być również bezpiecznie stosowany in vivo. Należy zauważyć, że powszechnie stosowane w hodowlach komórkowych stężenie 10 µM CL-316,243 jest o wiele rzędów wielkości wyższe niż dawka ~0.1 µM wymagana do uzyskania maksymalnej odpowiedzi33. Forskolina omija receptor adrenergiczny, bezpośrednio aktywując cyklazę adenylową i downstreamową sygnalizację lipolityczną. Istnieje wiele innych aktywatorów, a także supresorów lipolizy. Podczas wyboru związku do stymulacji lipolizy, specyficzność receptorowa oraz downstreamowe szlaki sygnalizacyjne powinny zostać dokładnie rozważone w ramach projektu eksperymentalnego.

Szybkość lipolizy w białej tkance tłuszczowej jest istotnym czynnikiem metabolicznym wpływającym na odporność na zimno oraz dostępność składników odżywczych podczas głodzenia lub wysiłku fizycznego.43,44,45,46Celem niniejszego protokołu jest pomiar szybkości lipolizy w adipocytach i tkance tłuszczowej, co ułatwi zrozumienie metabolizmu adipocytów oraz wpływu tego procesu na fenotyp metaboliczny różnych modeli mysich. W celu ilościowego oznaczenia szybkości lipolizy mierzy się pojawianie się produktów lipolizy w medium (tj. wolnych kwasów tłuszczowych i glicerolu). Metoda ta opiera się na uwalnianiu produktów lipolizy z adipocytu do medium. Ponieważ białe adipocyty wykazują niską ekspresję kinazy glicerolowej, szybkość ponownego wychwytu glicerolu jest niewielka.47Z drugiej strony należy również wziąć pod uwagę produkcję wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) i glicerolu poprzez szlaki metaboliczne inne niż lipoliza. Adipocy wydają się wykazuje ekspresję fosfatazy o aktywności wobec glicerolu-3-fosforanu, co umożliwia produkcję glicerolu z glicerolu-3-fosforanu pochodzącego z glukozy.48,49,50Glikoliza stanowi źródło glicerolu-3-fosforanu wykorzystywanego do reestryfikacji wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) w białych adipocytach. W przypadku ograniczonej dostępności glukozy glikeryoneogeneza wymaga innych źródeł trzech węgli, takich jak mleczan i pirogronian.51Kierunek transportu wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) uwalnianych w wyniku lipolizy wewnątrzkomórkowej oraz ich dalszy los metaboliczny nie są dobrze poznane; FFA uwalniane podczas lipolizy muszą zostać przekształcone w acylo-CoA przed ponowną estryfikacją lub poddaniem $\beta$-oksydacji. Wydaje się, że FFA uwalniane w wyniku lipolizy najprawdopodobniej opuszczają komórkę, zanim zostaną ponownie pobrane i przekształcone w acylo-CoA.52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62Wolne kwasy tłuszczowe (FFA) mogą być wiązane poza komórką przez albuminy. Co istotne, wiadomo, że długołańcuchowe FFA wywierają hamujące działanie zwrotne na lipolizę, jeśli nie zostaną one związane przez albuminy.63,64,65,66,67Zatem optymalizacja zdolności buforującej wolne kwasy tłuszczowe (FFA) w pożywkach podczas testu lipolizy ma kluczowe znaczenie. Opisana tutaj procedura jest podobna do wcześniej opublikowanych metod pomiaru szybkości lipolizy w adipocytach i ex vivo tkanka tłuszczowa myszy i ludzi15,68,69,70,71Protokół ten różni się zastosowaniem próbkowania seryjnego; dzięki niemu możemy wewnętrznie potwierdzić, że lipoliza jest mierzona w fazie liniowej, oraz wykorzystać wielokrotne pomiary do obliczenia szybkości lipolizy, co redukuje błąd pomiarowy i zwiększa pewność końcowej obliczonej wartości. Wadą próbkowania seryjnego jest fakt, że analiza wymaga więcej czasu i odczynników; jednak dłuższy czas trwania badania zmniejsza wpływ błędu pomiarowego na błąd standardowy szacunków szybkości. Ponadto protokół ten mierzy uwalnianie zarówno wolnych kwasów tłuszczowych (FFA), jak i glicerolu, oraz analizuje stosunek uwalniania FFA do glicerolu z celem osiągnięcia proporcji 3:1, czego należałoby oczekiwać przy pełnej lipolizie i uwalnianiu produktów lipolitycznych do medium.72.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Zastosowanie wszystkich zwierząt zostało zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) w Weill Cornell Medical College Uniwersytetu Cornell.

1. Przygotowanie buforów i płytek do zbierania próbek

  1. Przygotuj 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), rozpuszczając 5 g BSA w 100 mL pożywki Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) bez czerwieni fenolowej. Delikatnie mieszaj BSA do całkowitego rozpuszczenia (wstrząsanie jest nieskuteczne). Po całkowitym rozpuszczeniu BSA wysterylizuj pożywkę za pomocą filtra 0,2 µm. Przechowuj pożywkę z BSA w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 1 miesiąc.
  2. Przygotuj robocze stężenia pożywek kontrolnych i stymulujących. Pożywka kontrolna: pożywka z 5% BSA z kontrolą nośnika. Pożywka stymulująca: pożywka z 5% BSA z 0,5 µM CL-316,243. Świeżą pożywkę stymulującą przygotowuj dla każdego eksperymentu.
  3. Podgrzej używane pożywki do 37 °C. Oznacz płytkę 96-dołkową przeznaczoną do zbierania pożywek.

2. Przygotowanie próbek

  1. Przeprowadź hodowlę komórkową zgodnie z poniższym opisem. Wszystkie prace z komórkami wykonuj w sterylnej komorze z wyciągiem, aby zminimalizować kontaminację zewnętrzną.
    1. Izoluj i różnicuj pierwotne preadipocyty, zgodnie z opisem w73,74.
      1. Wysiej pierwotne preadipocyty z wysoką gęstością, np. 1 x 105 komórek/dołek w płytce 24-dołkowej w 1 mL/dołek pożywki hodowlanej (15% surowicy z płodu bydlęcego (FBS) i 1x penicylina-streptomycyna-glutamina w DMEM/F12).
      2. Po osiągnięciu przez komórki 100% konfluencji, różnicuj je przez 3 dni w pożywce hodowlanej z dodatkiem 5 µM deksametazonu, 0,5 mM 3-izobutyl-1-metylksantyny, 1 µg/mL insuliny oraz 1 µM tiazolidynedionu (TZD). Następnie zmień pożywkę na pożywkę hodowlaną z 1 µg/mL insuliny na co najmniej 3 dni, aby umożliwić wzrost kropli lipidowych. W płytce 24-dołkowej stosuj 1 mL/dołek pożywki.
      3. Wymieniaj pożywkę hodowlaną (1 ml/dołek) z insuliną co 2 lub 3 dni. Komórki mogą być utrzymywane w pożywce z insuliną do 2 tygodni. Do tego testu wykorzystuj tylko hodowle, w których stopień różnicowania przekracza 90% i jest zbliżony we wszystkich grupach, ponieważ obniżone różnicowanie mogłoby zostać błędnie zinterpretowane jako spadek tempa lipolizy.
      4. Przez 24 h przed pomiarem lipolizy hoduj komórki w pożywce bez insuliny.
        UWAGA: Insulina w pożywce utrzymuje krople lipidowe, ale jednocześnie hamuje lipolizę. Inkubacja bez insuliny przez 24 h pozwala na pełną aktywację lipolityczną bez utraty objętości kropli lipidowych. W niektórych systemach czas hodowli bez insuliny może wymagać skrócenia lub wydłużenia.
    2. Przemyj komórki raz DPBS, aby usunąć resztki surowicy z pożywki hodowlanej.
      UWAGA: Niniejszy protokół nie obejmuje głodzenia surowiczego, które może aktywować lipolizę. Głodzenie surowicze może zostać zastosowane według uznania badacza.
  2. Przeprowadź hodowlę ex vivo zgodnie z poniższym opisem.
    1. Przygotuj płytkę 6-dołkową, przeznaczając jeden dołek dla każdej tkanki pobieranej od każdej myszy. Do każdego używanego dołka wlej 4 mL DMEM o temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Dodawanie BSA do pożywki zbierającej nie jest konieczne.
    2. Przygotuj płytkę 48-dołkową do testu lipolizy, z jednym dołkiem dla każdej replikacji. Do każdego używanego dołka wlej 400 µL DMEM o temperaturze pokojowej. Dla każdej tkanki od każdej myszy przygotuj od dwóch do czterech dołków kontrolnych i od dwóch do czterech dołków stymulowanych.
    3. Uśmierć mysz poprzez zwichnięcie karku pod narkozą, stosując metodę wtórną, taką jak obustronny odma opłucnowa. W tym przypadku użyto 7-miesięcznej samicy myszy C57BL/6J o masie 32 g, karmionej przez 4 miesiące dietą wysokotłuszczową (45%).
      UWAGA: Protokół ten można stosować również w przypadku samców, jak i innych szczepów, diet oraz grup wiekowych.
    4. Spryskaj 70% etanolem i za pomocą nożyczek wykonaj niewielkie (~ 1 cm) nacięcie poprzeczne w centrum skóry brzucha; rozsunie skórę, chwytając kciukiem i palcem wskazującym obie strony, i odchyl skórę dolnego brzucha, aby odsłonić tylne magazyny podskórne. Zlokalizuj i usuń węzeł chłonny pachwinowy, a następnie przeprowadź tępą dyssekcję tkanki tłuszczowej pachwinowej znajdującej się bezpośrednio za węzłem chłonnym, używając pincety.
    5. Aby pobrać tkankę tłuszczową gonadalną, wykonaj nacięcie poprzeczne i pionowe w otrzewnej, aby uzyskać dostęp do jamy otrzewnej. Chwyć pęczek tłuszczowy gonadalny pęsetą i przetnij wzdłuż macicy (lub najdائدka u samców), aby usunąć tkankę tłuszczową gonadalną. Umieść pobrane magazyny tłuszczowe w płytce 6-dołkowej.
    6. Wyjmij tkankę z dołka, połóż na macie silikonowej i potnij nożyczkami na kawałki o masie od 5 do 7 mg.
    7. Odważ od 25 do 30 mg (pięć lub sześć kawałków) do każdego dołka testowego i umieść w 48-dołkowej płytce testowej. Przed ważeniem osusz tkankę czystym ręcznikiem, aby usunąć resztki pożywki. Zważ łódeczkę po usunięciu tkanki i zapisz masę wszelkich pozostałości. Przetrzyj łódeczkę do czystości między próbkami i w razie potrzeby ponownie ustaw tarę. Dla każdej tkanki używaj nowej łódeczki.
    8. Po zważeniu wszystkich próbek tkanek umieść 48-dołkową płytkę testową w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 10% CO2 na 15 min.

3. Analiza lipolizy

  1. Przeprowadzić pobieranie pożywki. Przeniesienie pożywki i następujące po nim pobieranie próbek należy wykonać w sterylnej komorze z wyciągiem, aby zminimalizować możliwość kontaminacji z zewnętrznych źródeł.
    1. W czasie t = 0 usunąć pożywkę, dodać 400 µL na studzienkę pożywki kontrolnej lub stymulującej, a następnie umieścić płytkę testową w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 10% CO2. W przypadku hodowli tkanek ex vivo pożywkę należy ostrożnie usunąć za pomocą pipety; nie wolno używać odsysania.
      UWAGA: Alternatywnie można przygotować drugą płytkę z pożywką kontrolną i stymulującą, a następnie przenieść tkanki.
    2. W czasie t = 1, 2, 3 i 4 h pobrać 200 µL pożywki, zastąpić ją 200 µL odpowiedniej pożywki kontrolnej lub stymulującej i zwrócić płytkę testową do inkubatora. Płytkę z pobranymi próbkami przechowywać w temperaturze 4 °C. Aby określić pojemność buforową FFA pożywki BSA, należy pobrać dodatkową próbkę w 24 h.
      UWAGA: Eksperymenty można przerwać na tym etapie, a pobraną pożywkę przechowywać w temperaturze -20 °C.

4. Kolorymetryczny test FFA

  1. Ogrzać odczynniki do temperatury pokojowej, a następnie rozpuścić jedną butelkę odczynnika barwnego A w jednej butelce rozpuszczalnika A oraz jedną butelkę odczynnika barwnego B w jednej butelce rozpuszczalnika B. Od daty przygotowania odczynniki te najlepiej wykorzystać w ciągu 1 tygodnia. Utylizować po 1 miesiącu od przygotowania.
  2. Rozmrozić i wymieszać próbki.
  3. Sporządzić krzywą wzorcową dla FFA. Roztwór wzorcowy ma stężenie 1 mM. Do sporządzenia krzywej wzorcowej z odczynnikami należy użyć następujących objętości: 25 µL, 20 µL, 15 µL, 10 µL, 10 µL (rozcieńczenie 1:2), 10 µL (rozcieńczenie 1:4), 10 µL (rozcieńczenie 1:8) oraz 10 µL wody dla maksymalnego zakresu. W przypadku niskich poziomów FFA bardziej odpowiednie może być zastosowanie 10 µL standardu o stężeniach 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM i 0,05 mM.
  4. Nanieść standardy i próbki do płytki testowej 96-dołkowej. Zalecana objętość próbki wynosi 10 µL. W celu korekcji tła należy uwzględnić trzy dołki z taką samą objętością medium BSA jak w przypadku próbek.
    UWAGA: Jeśli stężenia próbek wykraczają poza zakres krzywej wzorcowej, należy powtórzyć test, dostosowując objętość próbki do zakresu 2-25 µL.
  5. Do każdego dołka dodać 150 µL odczynnika A i wymieszać. Unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Ewentualne pęcherzyki należy przebić cienką igłą. Inkubować płytkę testową w temperaturze 37 °C przez 5 min.
  6. Odczytać absorbancję płytki przy 550 nm oraz referencyjnie przy 660 nm (Odczyt A).
  7. Do każdego dołka dodać 75 µL odczynnika B i wymieszać. Unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Ewentualne pęcherzyki należy przebić cienką igłą. Inkubować płytkę testową w temperaturze 37 °C przez 5 min.
  8. Ponownie odczytać absorbancję płytki przy 550 nm oraz referencyjnie przy 660 nm (Odczyt B).

5. Kolorymetryczny test glicerolu

  1. Zrekonstytuuj odczynnik do wolnego glicerolu, dodając 36 mL wody ultrapurej, i doprowadź do temperatury pokojowej. Odczynniki te najlepiej zużyć w ciągu kilku tygodni. Usuń je po 2 miesiącach od rekonstytucji.
  2. Rozmroź i wymieszaj próbki.
  3. Utwórz krzywą standardową glicerolu, wykonując siedmiopunktowe, dwukrotne rozcieńczenie seryjne roztworu standardu glicerolu oraz próbę ślepą z wodą.
    UWAGA: Krzywa standardowa jest względnie liniowa do 25 µL glicerolu o stężeniu 2,8 mM, lecz nie jest liniowa przy wyższych stężeniach.
  4. Pipetuj po 25 µL standardu i próbek do płytki testowej z 96 dołkami. Uwzględnij trzy dołki z podłożem BSA do korekcji tła.
  5. Dodaj 175 µL odczynnika do wolnego glicerolu do każdego dołka i wymieszaj. Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza. Pęcherzyki usuwaj za pomocą cienkiej igły. Inkubuj płytkę testową w temperaturze 37 °C przez 5 min.
  6. Zreaduj absorbancję płytki przy 540 nm.

6. Obliczanie szybkości lipolizy

  1. Zacznij od wartości gęstości optycznej (OD). W przypadku glicerolu użyj bezpośrednio wartości OD A540. Oblicz OD dla analizy FFA zgodnie z następującym wzorem:
    OD = (Odczyt B: A550 - A660) - (Odczyt A: A550 - A660)
  2. Wykorzystaj krzywą wzorcową do obliczenia poziomów FFA i glicerolu w zebranych próbkach. Wykres wartości wzorcowych OD nanieś na oś y, a na osi x umieść wzorcowe stężenia w stosunku do objętości próbki (np. stężenie w studzienkach z 20 µL standardu 1 mM FFA na płytce z próbkami 10 µL jest równe 2 mM). Dopasuj liniową linię trendu:
    y = mx + b
  3. Dokonaj wizualnej oceny krzywej wzorcowej i usuń wszelkie punkty znajdujące się poza zakresem liniowości analizy. Oblicz stężenia próbek, korzystając z równania:
    Stężenie próbki: x = (OD - b) ÷ m
  4. Skoryguj i ponownie przeanalizuj próbki wykraczające poza liniowy zakres analizy. Aby uzyskać końcowe stężenie próbki, od stężenia próbek odejmij stężenie studzienek tła zawierających jedynie medium z BSA.
  5. Oblicz liczbę moli FFA i glicerolu wytworzonych przez każdą próbkę w każdym punkcie czasowym zgodnie ze wzorem:
    Obliczanie masy cząsteczkowej, wzór Mn=Cn×Vt+ΣCkVs, metoda analizy chemicznej.
    gdzie Cn = stężenie w czasie t = n; Vt = całkowita objętość w studzience; Vs = objętość pobranej próbki; a Mn = mole wytworzone w czasie t = n (jeśli stężenia podano w mM, a objętości w mL, wynikiem są µMol).
    Przykłady dla różnych punktów czasowych:
    M1 = C1 × Vt
    M4 = C4 × Vt + (C1 + C2+ C3)Vs
    lub
    M4 = C4 × Vt + C3 × Vs + C2 × Vs + C1 ×Vs
  6. Znormalizuj wynik do masy tkanki, dzieląc go przez masę tkanki dla każdej próbki w gramach, aby uzyskać jednostki µmol/g. Dla komórek hodowlanych wartości przedstawia się jako µmol/studzienkę. Upewnij się, że liczba komórek i efektywność różnicowania są porównywalne między poszczególnymi studzienkami.
    UWAGA: Różnice w proliferacji lub efektywności różnicowania utrudnią interpretację wyników i będą wymagać innej metody normalizacji (np. normalizacji do białka; patrz sekcja dyskusja).
  7. Oblicz nachylenie krzywej wytworzonych µmol/g (oś y) względem czasu (oś x) oddzielnie dla każdej próbki.
    1. W arkuszu kalkulacyjnym można to zrobić za pomocą funkcji =SLOPE(known_ys,known_xs). W nowej komórce wpisz "=SLOPE" (następnie użyj kursora, aby zaznaczyć wartości glicerolu lub FFA dla próbki w µmol/g, a potem odpowiednie wartości czasu).
    2. Zweryfikuj liniowość danych. Wartości R2 są szybkim sposobem określenia liniowości próbek. W arkuszu kalkulacyjnym można to zrobić za pomocą funkcji =RSQ(known_ys,known_xs), w ten sam sposób, jak opisano w kroku 6.7.1, jednak początkowym wpisem jest =RSQ. Upewnij się, że wartości R2 są > 0,98; niższe wartości wskazują na odchylenie od liniowości. Może to wynikać z błędu pomiarowego/pobierania próbek lub utraty liniowości.
      1. Innym sposobem testowania liniowości jest przeprowadzenie regresji liniowej dla każdej próbki i wykreślenie reszt. W programie do analizy statystycznej wygeneruj tabelę XY z pojedynczą wartością Y dla każdego punktu czasowego. Wybierz Analyze > Simple linear regression i zaznacz pole Residual Plot przed zatwierdzeniem przyciskiem OK. Wykres reszt pojawi się jako nowy wykres.
  8. Wykorzystaj tempo produkcji FFA i glicerolu (tj. nachylenie [µmol/g/h]) dla każdej próbki jako pojedynczy punkt danych do przeprowadzenia analizy statystycznej i nanieś wartości na wykres, jeśli porównywane są różne warunki lipolizy. Jeśli tempo lipolizy jest porównywane między genotypami, użyj dwóch lub trzech próbek od jednego zwierzęcia jako powtórzeń technicznych i wykorzystaj średnią jako jeden punkt danych na zwierzę, tak aby wielkość próby była równa liczbie zwierząt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zmierzyliśmy podstawowe i stymulowane tempo lipolizy w adipocytach zróżnicowanych in vitro. Pierwotne preadipocyty z białej tkanki tłuszczowej pachwinowej zróżnicowano do adipocytów poprzez traktowanie konfluencyjnych komórek 5 µM deksametazonem, 0,5 mM IBMX, 1 µg/mL insuliną oraz 1 µM troglitazonem przez 4 dni, a następnie dodatkowym 3-dniowym traktowaniem 1 µg/mL insuliną. Przed testem lipolizy komórki inkubowano w pośrodku bez insuliny przez 24 h. W czasie t = 0 h komórki przemyto raz PBS, a następnie do każd...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy podstawowy protokół pomiaru szybkości lipolizy w adipocytach i tkance tłuszczowej ex vivo . Aby określić ilościowo lipolizę, ważne jest zmierzenie szybkości lipolitycznej w fazie liniowej. Stosujemy technikę próbkowania seryjnego, w której duża część pożywki jest zbierana i zastępowana świeżą pożywką w regularnych odstępach czasu. Ta półkonserwatywna metoda pozwala na dodanie świeżego BSA o pojemności buforowej FFA i opóźnia hamowanie sprzężenia zwrotnego, wydłużając czas trwania lipo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant Narodowych Instytutów Zdrowia Stanów Zjednoczonych R01DK126944 dla S.M.R.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
24-dołkowa płytka poddana hodowli tkankowejCorning Inc3527Musi być poddana hodowli tkankowej pod kątem różnicowania adipocytów
48-dołkowa płaska płytka dolna z pokrywkąCorning Inc353078Może być poddana obróbce kultur tkankowych
6-dołkowa płaska płyta dolna z pokrywkąCorning Inc353046Może być traktowana kulturą tkankową
96-dołkowa płytka PCRUSA sceintific1402-9100Każda stożkowa płytka PCR 0,2 ml będzie wygodna 
również albumina surowicy bydlęcejSigma AldrichA9418FFA free BSA, taka jak A8806. BSA nie powinno mieć wykrywalnego FFA, również wiele zmian w BSA może wpływać na obserwowaną szybkość lipolizy
CL-316,243Sigma AldrichC5976CAS #: 138908-40-4 dostępne u innych dostawców
Inkubator CO2PHCBIMCO-170AICUVHCO2 powinien być idealnie ustawiony na 10% dla tkanki tłuszczowej, jednak 5% CO2 będzie również działać
DMEM, niska glukoza, brak czerwieni fenolowejThermofischer11054020Wszelkie podłoża wolne od czerwieni fenolowej powinny działać, DMEM/F12, RPMI, ale powinny zawierać lotną zdolność buforową, tj.
albuminę surowicy bydlęcej wolną od biowęglanu FFAEquitech-Bio, Inc, BAH66
Wolny odczynnik glicerolowySigma AldrichF6428
Roztwór wzorcowy gliceroluSigma AldrichG7793 Można to również osiągnąć poprzez rozcieńczenie glicerolu do pożądanego stężenia
Standardowe rozwiązanie NEFA serii HR Fujifilm276-76491
Seria HR NEFA-HR (2) Odczynnik kolorowy AFujifilm999-34691
Seria HR NEFA-HR (2) Odczynnik kolorystyczny BFujifilm991-34891
Seria HR NEFA-HR (2) Rozpuszczalnik A Fujifilm995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Rozpuszczalnik B Fujifilm993-35191
Inkubator mikrobiologicznyFischer ScientificS28668Można użyć dowolnego inkubatora o temperaturze 37C
Nunc MicroWell 96-dołkowe płytkiThermo Scientific269620Dowolna optycznie przezroczysta, 96-dołkowa płytka z płaskim dnem działa
Silikonowa laboratoryjna mata stołowaVWR76045-300Można również użyć szklanej płyty. Powierzchnie chłonne nie są zalecane
Spektrofotometr/czytnik mikropłytekUrządzenia molekularneSpectraMax i3x Każdy czytnik płytek, który może odczytywać na 540, 550 i 660 mm, będzie działał
V Albumina surowicy bydlęcejSigma-Aldrich810531
WypAll X70 WycieraczkiKimberly-Clark41200Każdy wysokiej jakości ręcznik papierowy będzie działał
Powszechnie stosowana jest

Bibliografia

  1. Vaughan, M., Berger, J. E., Steinberg, D. Hormone-sensitive lipase and monoglyceride lipase activities in adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 239, 401-409 (1964).
  2. Zimmermann, R., et al. Fat mobilization in adipose tissue is promoted by adipose triglyceride lipase. Science. 306 (5700), 1383-1386 (2004).
  3. Lass, A., et al. Adipose triglyceride lipase-mediated lipolysis of cellular fat stores is activated by CGI-58 and defective in Chanarin-Dorfman syndrome. Cell Metabolism. 3 (5), 309-319 (2006).
  4. Stralfors, P., Bjorgell, P., Belfrage, P. Hormonal regulation of hormone-sensitive lipase in intact adipocytes: identification of phosphorylated sites and effects on the phosphorylation by lipolytic hormones and insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 81 (11), 3317-3321 (1984).
  5. Miyoshi, H., et al. Perilipin promotes hormone-sensitive lipase-mediated adipocyte lipolysis via phosphorylation-dependent and -independent mechanisms. The Journal of Biological Chemistry. 281 (23), 15837-15844 (2006).
  6. Sztalryd, C., et al. Perilipin A is essential for the translocation of hormone-sensitive lipase during lipolytic activation. The Journal of Cell Biology. 161 (6), 1093-1103 (2003).
  7. Lafontan, M., Langin, D. Lipolysis and lipid mobilization in human adipose tissue. Progress in Lipid Research. 48 (5), 275-297 (2009).
  8. Grabner, G. F., Xie, H., Schweiger, M., Zechner, R. Lipolysis: cellular mechanisms for lipid mobilization from fat stores. Nature Metabolism. 3 (11), 1445-1465 (2021).
  9. Weiss, S. B., Kennedy, E. P., Kiyasu, J. Y. The enzymatic synthesis of triglycerides. The Journal of Biological Chemistry. 235, 40-44 (1960).
  10. Kennedy, E. P. Biosynthesis of complex lipids. Federation Proceedings. 20, 934-940 (1961).
  11. Wendel, A. A., Lewin, T. M., Coleman, R. A. Glycerol-3-phosphate acyltransferases: rate limiting enzymes of triacylglycerol biosynthesis. Biochimica et Biophysica Acta. 1791 (6), 501-506 (2009).
  12. Johansson, S. M., Lindgren, E., Yang, J. N., Herling, A. W., Fredholm, B. B. Adenosine A1 receptors regulate lipolysis and lipogenesis in mouse adipose tissue-interactions with insulin. European Journal of Pharmacology. 597 (1-3), 92-101 (2008).
  13. Gnad, T., et al. Adenosine activates brown adipose tissue and recruits beige adipocytes via A2A receptors. Nature. 516 (7531), 395-399 (2014).
  14. Fried, S. K., et al. Resistance to the antilipolytic effect of insulin in adipocytes of African-American compared to Caucasian postmenopausal women. Journal of Lipid Research. 51 (5), 1193-1200 (2010).
  15. Lee, M. J., Fried, S. K. Optimal protocol for the differentiation and metabolic analysis of human adipose stromal cells. Methods in Enzymology. 538, 49-65 (2014).
  16. Fricke, K., Heitland, A., Maronde, E. Cooperative activation of lipolysis by protein kinase A and protein kinase C pathways in 3T3-L1 adipocytes. Endocrinology. 145 (11), 4940-4947 (2004).
  17. Bergan, H. E., Kittilson, J. D., Sheridan, M. A. PKC and ERK mediate GH-stimulated lipolysis. Journal of Molecular Endocrinology. 51 (2), 213-224 (2013).
  18. Schmitz-Peiffer, C. The tail wagging the dog--regulation of lipid metabolism by protein kinase C. The FEBS Journal. 280 (21), 5371-5383 (2013).
  19. Carmen, G. Y., Victor, S. M. Signalling mechanisms regulating lipolysis. Cellular Signalling. 18 (4), 401-408 (2006).
  20. Zu, L., et al. Bacterial endotoxin stimulates adipose lipolysis via toll-like receptor 4 and extracellular signal-regulated kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 284 (9), 5915-5926 (2009).
  21. Zhang, H. H., Halbleib, M., Ahmad, F., Manganiello, V. C., Greenberg, A. S. Tumor necrosis factor-alpha stimulates lipolysis in differentiated human adipocytes through activation of extracellular signal-related kinase and elevation of intracellular cAMP. Diabetes. 51 (10), 2929-2935 (2002).
  22. Tan, X., et al. TNF-α downregulates CIDEC via MEK/ERK pathway in human adipocytes. Obesity. 24 (5), 1070-1080 (2016).
  23. Laurencikiene, J., et al. NF-kappaB is important for TNF-alpha-induced lipolysis in human adipocytes. Journal of Lipid Research. 48 (5), 1069-1077 (2007).
  24. van Hall, G., et al. Interleukin-6 stimulates lipolysis and fat oxidation in humans. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 88 (7), 3005-3010 (2003).
  25. Wueest, S., et al. Mesenteric fat lipolysis mediates obesity-associated hepatic steatosis and insulin resistance. Diabetes. 65 (1), 140-148 (2016).
  26. Trujillo, M. E., et al. Interleukin-6 regulates human adipose tissue lipid metabolism and leptin production in vitro. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 89 (11), 5577-5582 (2004).
  27. Kitamura, T., et al. Insulin-induced phosphorylation and activation of cyclic nucleotide phosphodiesterase 3B by the serine-threonine kinase Akt. Molecular and Cellular Biology. 19 (9), 6286-6296 (1999).
  28. Chakrabarti, P., et al. Insulin inhibits lipolysis in adipocytes via the evolutionarily conserved mTORC1-Egr1-ATGL-mediated pathway. Molecular and Cellular Biology. 33 (18), 3659-3666 (2013).
  29. Collins, S., Daniel, K. W., Petro, A. E., Surwit, R. S. Strain-specific response to beta 3-adrenergic receptor agonist treatment of diet-induced obesity in mice. Endocrinology. 138 (1), 405-413 (1997).
  30. Surwit, R. S., Dixon, T. M., Petro, A. E., Daniel, K. W., Collins, S. Diazoxide restores beta3-adrenergic receptor function in diet-induced obesity and diabetes. Endocrinology. 141 (10), 3630-3637 (2000).
  31. Gettys, T. W., et al. Age-dependent changes in beta-adrenergic receptor subtypes and adenylyl cyclase activation in adipocytes from Fischer 344 rats. Endocrinology. 136 (5), 2022-2032 (1995).
  32. Mowers, J., et al. Inflammation produces catecholamine resistance in obesity via activation of PDE3B by the protein kinases IKKε and TBK1. eLife. 2, e01119(2013).
  33. Valentine, J. M., et al. β3-Adrenergic receptor downregulation leads to adipocyte catecholamine resistance in obesity. The Journal of Clinical Investigation. 132 (2), e153357(2022).
  34. Collins, S., et al. Impaired expression and functional activity of the beta 3- and beta 1-adrenergic receptors in adipose tissue of congenitally obese (C57BL/6J ob/ob) mice. Molecular Endocrinology. 8 (4), 518-527 (1994).
  35. Collins, S., Surwit, R. S. The beta-adrenergic receptors and the control of adipose tissue metabolism and thermogenesis. Recent Progress in Hormone Research. 56, 309-328 (2001).
  36. Dixon, T. M., Daniel, K. W., Farmer, S. R., Collins, S. CCAAT/enhancer-binding protein alpha is required for transcription of the beta 3-adrenergic receptor gene during adipogenesis. The Journal of Biological Chemistry. 276 (1), 722-728 (2001).
  37. Lohse, M. J., Benovic, J. L., Codina, J., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), 1547-1550 (1990).
  38. Nantel, F., et al. The human beta 3-adrenergic receptor is resistant to short term agonist-promoted desensitization. Molecular Pharmacology. 43 (4), 548-555 (1993).
  39. Liggett, S. B., Freedman, N. J., Schwinn, D. A., Lefkowitz, R. J. Structural basis for receptor subtype-specific regulation revealed by a chimeric beta 3/beta 2-adrenergic receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (8), 3665-3669 (1993).
  40. Baker, J. G. The selectivity of beta-adrenoceptor agonists at human beta1-, beta2- and beta3-adrenoceptors. British Journal of Pharmacology. 160 (5), 1048-1061 (2010).
  41. Lafontan, M. Inhibition of epinephrine-induced lipolysis in isolated white adipocytes of aging rabbits by increased alpha-adrenergic responsiveness. Journal of Lipid Research. 20 (2), 208-216 (1979).
  42. Baker, J. G. The selectivity of beta-adrenoceptor antagonists at the human beta1, beta2 and beta3 adrenoceptors. British Journal of Pharmacology. 144 (3), 317-322 (2005).
  43. Jensen, M. D., Nielsen, S. Insulin dose response analysis of free fatty acid kinetics. Metabolism. 56 (1), 68-76 (2007).
  44. Jensen, M. D., Haymond, M. W., Gerich, J. E., Cryer, P. E., Miles, J. M. Lipolysis during fasting. Decreased suppression by insulin and increased stimulation by epinephrine. The Journal of Clinical Investigation. 79 (1), 207-213 (1987).
  45. Heckmann, B. L., et al. Defective adipose lipolysis and altered global energy metabolism in mice with adipose overexpression of the lipolytic inhibitor G0/G1 switch gene 2 (G0S2). The Journal of Biological Chemistry. 289 (4), 1905-1916 (2014).
  46. Shin, H., et al. Lipolysis in brown adipocytes is not essential for cold-induced thermogenesis in mice. Cell Metabolism. 26 (5), 764.e5-777.e5 (2017).
  47. Treble, D. H., Mayer, J. Glycerolkinase activity in white adipose tissue of obese-hyperglycaemic mice. Nature. 200, 363-364 (1963).
  48. Possik, E., et al. New mammalian glycerol-3-phosphate phosphatase: role in beta-cell, liver and adipocyte metabolism. Frontiers in Endocrinology. 12, 706607(2021).
  49. Romero Mdel, M., Sabater, D., Fernandez-Lopez, J. A., Remesar, X., Alemany, M. Glycerol production from glucose and fructose by 3T3-L1 cells: a mechanism of adipocyte defense from excess substrate. PLoS One. 10 (10), e0139502(2015).
  50. Mugabo, Y., et al. Identification of a mammalian glycerol-3-phosphate phosphatase: Role in metabolism and signaling in pancreatic beta-cells and hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (4), E430-E439 (2016).
  51. Hanson, R. W., Reshef, L. Glyceroneogenesis revisited. Biochimie. 85 (12), 1199-1205 (2003).
  52. Vaughan, M. The production and release of glycerol by adipose tissue incubated in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 237, 3354-3358 (1962).
  53. Jensen, M. D., Ekberg, K., Landau, B. R. Lipid metabolism during fasting. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 281 (4), E789-E793 (2001).
  54. Ballard, F. J., Hanson, R. W., Leveille, G. A. Phosphoenolpyruvate carboxykinase and the synthesis of glyceride-glycerol from pyruvate in adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 242 (11), 2746-2750 (1967).
  55. Reshef, L., Hanson, R. W., Ballard, F. J. A possible physiological role for glyceroneogenesis in rat adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 245 (22), 5979-5984 (1970).
  56. Gorin, E., Tal-Or, Z., Shafrir, E. Glyceroneogenesis in adipose tissue of fasted, diabetic and triamcinolone treated rats. European Journal of Biochemistry. 8 (3), 370-375 (1969).
  57. Elia, M., Zed, C., Neale, G., Livesey, G. The energy cost of triglyceride-fatty acid recycling in nonobese subjects after an overnight fast and four days of starvation. Metabolism. 36 (3), 251-255 (1987).
  58. Reshef, L., et al. Glyceroneogenesis and the triglyceride/fatty acid cycle. Journal of Biological Chemistry. 278 (33), 30413-30416 (2003).
  59. Edens, N. K., Leibel, R. L., Hirsch, J. Mechanism of free fatty acid re-esterification in human adipocytes in vitro. Journal of Lipid Research. 31 (8), 1423-1431 (1990).
  60. Vaughan, M., Steinberg, D. Effect of hormones on lipolysis and esterification of free fatty acids during incubation of adipose tissue in vitro. Journal of Lipid Research. 4, 193-199 (1963).
  61. Brooks, B., Arch, J. R., Newsholme, E. A. Effects of hormones on the rate of the triacylglycerol/fatty acid substrate cycle in adipocytes and epididymal fat pads. Federation of European Biochemical Societies Letters. 146 (2), 327-330 (1982).
  62. Bjorntorp, P., Karlsson, M., Hovden, A. Quantitative aspects of lipolysis and reesterification in human adipose tissue in vitro. Acta Medica Scandinavica. 185 (1-2), 89-97 (1969).
  63. Angel, A., Desai, K., Halperin, M. L. Free fatty acid and ATP levels in adipocytes during lipolysis. Metabolism. 20 (1), 87-99 (1971).
  64. Husted, A. S., et al. Autocrine negative feedback regulation of lipolysis through sensing of NEFAs by FFAR4/GPR120 in WAT. Molecular Metabolism. 42, 101103(2020).
  65. Fain, J. N., Shepherd, R. E. Free fatty acids as feedback regulators of adenylate cyclase and cyclic 3':5'-AMP accumulation in rat fat cells. The Journal of Biological Chemistry. 250 (16), 6586-6592 (1975).
  66. Burns, T. W., Langley, P. E., Terry, B. E., Robinson, G. A. The role of free fatty acids in the regulation of lipolysis by human adipose tissue cells. Metabolism. 27 (12), 1755-1762 (1978).
  67. Kalderon, B., et al. Suppression of adipose lipolysis by long-chain fatty acid analogs. Journal of Lipid Research. 53 (5), 868-878 (2012).
  68. Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods in Enzymology. 538, 171-193 (2014).
  69. Decaunes, P., Bouloumie, A., Ryden, M., Galitzky, J. Ex vivo analysis of lipolysis in human subcutaneous adipose tissue explants. Bio-Protocol. 8 (3), e2711(2018).
  70. Roy, D., Myers, J. M., Tedeschi, A. Protocol for assessing ex vivo lipolysis of murine adipose tissue. STAR Protocols. 3 (3), 101518(2022).
  71. Baskaran, P., Thyagarajan, B. Measurement of basal and forskolin-stimulated lipolysis in inguinal adipose fat pads. Journal of Visualized Experiments. 125 (125), 55625(2017).
  72. Reilly, S. M., et al. Catecholamines suppress fatty acid re-esterification and increase oxidation in white adipocytes via STAT3. Nature Metabolism. 2 (7), 620-634 (2020).
  73. Liu, L., et al. Isolation of mouse stromal vascular cells for monolayer culture. Methods in Molecular Biology. 1566, 9-16 (2017).
  74. DeLuca, J. H., Reilly, S. M. Methods in Molecular Biology. , Springer Nature. (2023).
  75. Richard, G., Vernon, R. A. C. New Perspectives in Adipose Tissue. Butterworth-Heinemann. , (1985).
  76. Brito, M. N., Botion, L. M., Brito, N. A., Kettelhut, I. C., Migliorini, R. H. Lipolysis and glycerokinase activity in brown adipose tissue of rat fed a high protein, carbohydrate-free diet. Hormone and Metabolic Research. 26 (1), 51-52 (1994).
  77. Bertin, R. Glycerokinase activity and lipolysis regulation in brown adipose tissue of cold acclimated rats. Biochimie. 58 (4), 431-434 (1976).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Szybkość lipolizytest ex vivoróżnicowanie in vitrowolne kwasy tłuszczoweuwalnianie glicerolutest kolorymetrycznyalbumina surowicy bydlęcejmobilizacja triglicerydów
Pomiar częstości lipolizy w mysiej tkance tłuszczowej ex vivo i pierwotnych preadipocytach zróżnicowanych in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.