Artykuł metodologiczny

Łagodzenie choroby zwyrodnieniowej stawów u myszy za pomocą nanocząstek srebra

4.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65111

⸱

2 czerwca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół użycia nanocząsteczek srebra do skutecznego łagodzenia ostrych objawów u myszy z chorobą zwyrodnieniową stawów wywołaną kolagenazą typu II, w tym zapalenie błony maziowej, przerost błony maziowej, przerost naczyń krwionośnych, itp.

Streszczenie

Choroba zwyrodnieniowa stawu kolanowego (KOA) jest jedną z najczęściej spotykanych chorób zwyrodnieniowych stawów u osób powyżej 45 roku życia. Obecnie nie ma żadnych skutecznych metod leczenia KOA, a jedyną strategią punktu końcowego jest całkowita endoprotezoplastyka stawu kolanowego (TKA); w związku z tym KOA wiąże się z obciążeniami ekonomicznymi i kosztami społecznymi. Immunologiczna odpowiedź zapalna bierze udział w występowaniu i rozwoju KOA. Wcześniej ustaliliśmy mysi model KOA przy użyciu kolagenu typu II. W modelu stwierdzono przerost tkanki maziowej wraz z dużą liczbą naciekanych komórek zapalnych. Nanocząsteczki srebra mają znaczne działanie przeciwzapalne i są szeroko stosowane w terapii nowotworów i chirurgicznym dostarczaniu leków. W związku z tym oceniliśmy efekty terapeutyczne nanocząstek srebra w modelu KOA indukowanym kolagenazą II. Wyniki eksperymentów wykazały, że nanocząstki srebra istotnie zmniejszyły przerost błony maziowej i infiltrację neutrofili w tkance maziowej. W związku z tym praca ta demonstruje identyfikację nowej strategii dla otwartego dostępu i dostarcza teoretycznych podstaw do zapobiegania postępowi KOA.

Wprowadzenie

Choroba zwyrodnieniowa stawu kolanowego (KOA) jest jedną z najczęstszych form choroby zwyrodnieniowej stawów i obejmuje złożony proces chorobowy w całym stawie maziowym1. Ponieważ światowa populacja stopniowo się starzeje, częstość występowania KOA znacznie wzrasta. Stały ból w stawie kolanowym często skłania pacjentów z KOA do szukania leczenia. Etiologia bólu w KOA może być związana z reakcją zapalną, przerostem błony maziowej i zwyrodnieniem chrząstki2. Tkanki maziowe składają się z dwóch typów komórek: fibroblastów maziowych i makrofagów3,4,5. Fibroblasty maziowe wytwarzają płyn maziowy. Makrofagi maziowe są zwykle uśpione i są aktywowane przez reakcję zapalną. Początkowe zapalenie błony maziowej powoduje ból stawu kolanowego6.

Zapalna odpowiedź immunologiczna tkanki maziowej odgrywa kluczową rolę w patogenezie KOA. Wcześniejsze badania potwierdziły, że w tkankach maziowych KOA występują reakcje zapalne, znane jako zapalenie błony maziowej, a stopień zapalenia błony maziowej KOA jest ściśle związany z zapalnym naciekaniem komórek w tkankach maziowych 7,8,9. Zapalenie błony maziowej jest reakcją zapalną błony maziowej, a jej patologiczne cechy to proliferacja komórek maziowych, tworzenie nowych naczyń i infiltracja komórek zapalnych5,10,11.

Celem leczenia KOA jest złagodzenie reakcji zapalnej błony maziowej i opóźnienie postępu choroby. Obecnie głównymi lekami klinicznymi stosowanymi w leczeniu KOA są niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ); Wykazują jednak znaczące skutki uboczne, takie jak nefrotoksyczność12,< klasa SUP = "xref">13. Dostawowe zastrzyki glikokortykosteroidowe są inną opcją leczenia KOA; Jednak glikokortykosteroid rozprzestrzenia się szybko i może być szybko metabolizowany przez wysięk stawowy. Tymczasem pacjenci z cukrzycą z hiperglikemią powinni zachować ostrożność w związku z trwającymi zastrzykami sterydowymi14. Podsumowując, nie ma dostępnej strategii leczenia farmakologicznego KOA. W związku z tym niezwykle pilne jest badanie nowych leków stosowanych w leczeniu KOA.

Rozmiar nanocząsteczek srebra jest mniejszy niż 100 nm. Ze względu na ich wyraźne działanie przeciwzapalne, przeciwbakteryjne i przeciwutleniające, są szeroko stosowane w różnych aspektach opieki zdrowotnej i medycyny, takich jak gojenie się ran i oparzeń15,16. Są one również wykorzystywane w celowanym dostarczaniu leków, obrazowaniu medycznym i diagnostyce molekularnej17. Srebro (Ag) ma silniejsze działanie przeciwzapalne i przeciwbakteryjne niż inne nanocząstki metali, takie jak miedź (Cu), (Zn) i żelazo (Fe)15. Nanocząstki srebra, nowy rodzaj nanomateriału, mają szerokie spektrum działania i silne właściwości przeciwdrobnoustrojowe. Poprzednie badanie wykazało, że w modelach oparzeń i zapalenia otrzewnejmysów18,19, nanocząsteczki srebra mogą skutecznie hamować produkcję czynników zapalnych i wspomagać gojenie się ran. Poprzednie badanie wykazało również, że nanocząsteczki srebra poprawiają gojenie się ran cukrzycowych poprzez promowanie syntezy czynników wzrostu i odkładania kolagenu20.

Opierając się na przeciwzapalnym działaniu nanocząsteczek srebra, naszym celem było użycie nanocząsteczek srebra do leczenia KOA wywołanego kolagenem typu II u myszy. Wyniki sugerowały, że liczba zapalnych komórek naciekających staw maziowy u myszy została znacznie zmniejszona dzięki temu leczeniu. Wyniki sugerują również, że nanocząstki srebra mogą znacznie złagodzić objawy KOA u myszy. W związku z tym zastosowanie nanocząstek srebra może wspierać rozwój nowych opcji leczenia klinicznego KOA.

Protokół

Wszystkie prace na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki i Dobrostanu Zwierząt (AEWC) w Guangzhou Forevergen Medical Laboratory Animal Center (2018-0186).

1. Ustanowienie modelu myszy KOA

  1. Utrzymuj myszy BALB/c (18-24 g; w wieku 12-14 tygodni) w środowisku o wilgotności 70% i temperaturze 26 °C z cyklem światła/ciemności trwającym 12 godzin. Na potrzeby tego eksperymentu zwierzęta były trzymane w Guangzhou Forevergen Medical Laboratory Animal Center.
  2. Użyj kolagenu typu II, aby stworzyć model myszy KOA, jak opisano wcześniej21. Wykonać wstrzyknięcie dostawowe w sposób opisany poniżej.
    1. Zastosuj 2% pentobarbital sodu (40 mg/kg) do znieczulenia i buprenorfinę (0,05 mg/kg, wstrzyknięcie podskórne) do znieczulenia. Następnie przymocuj kończyny myszy taśmą, usuń włosy maszynką do golenia i trzykrotnie zdezynfekuj naprzemiennym peelingiem 0,1% jodoforu i alkoholu.
    2. Noś sterylne rękawiczki i używaj sterylnych nożyczek, aby sekwencyjnie odsłaniać skórę, tkankę podskórną i więzadło podrzepkowe. Utrzymuj obszar nacięcia poniżej 0,5 cm.
      UWAGA: Do utrzymania temperatury ciała myszy podczas operacji użyto koca grzewczego.
    3. Użyj strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml, aby wstrzyknąć 10 j. kolagenazy typu II o sile 30 mg/kg (0,4 mg/ml) do jamy stawowej (poniżej więzadła podrzepkowego)22.
      UWAGA: Kąt między igłą a skórą powinien wynosić około 15°; Następnie należy zmienić kierunek igły i całkowicie wycofać igłę.
    4. Po wstrzyknięciu należy najpierw zszyć tkankę podskórną, a następnie skórę. Wysterylizuj obszar szwu 0,1% jodoforem. Umieść myszy w indywidualnie wentylowanych klatkach (IVC) oddzielnie po wybudzeniu się ze znieczulenia.

2. Synteza nanocząstek srebra

UWAGA: Przygotowanie nanocząsteczek srebra zostało wcześniej szczegółowo opisane19. Cały proces formulacji odbywa się na lodzie. Po przygotowaniu mieszaninę przechowuje się w temperaturze 4 °C; W przeciwnym razie mieszanina łatwo krzepnie w temperaturze pokojowej.

  1. Dodaj łącznie 400 μl kolagenu typu I (4 mg/ml) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i umieść na lodzie.
  2. Dodaj w sumie 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do powyższego kolagenu, dobrze wymieszaj roztwór i umieść go na lodzie.
  3. Na koniec dodaj 400 μl nanocząstek srebra do powyższego roztworu, a następnie wystarczająco wymieszaj. Końcowe stężenie roztworu nanocząstek wynosi 1 mM.
    UWAGA: Średnia średnica nanocząstek srebra waha się od 5 nm do 15 nm23. Zostało to potwierdzone za pomocą mikroskopii elektronowej.

3. Leczenie nanocząstkami srebra myszy KOA wywołanych kolagenazą typu II

  1. Usuń myszy KOA wywołane kolagenazą typu II z ich klatek 1 tydzień później i wstrzyknij im nanocząsteczki srebra. Nanocząstki srebra należy wstrzykiwać raz w tygodniu, a próbki pobierać 30 dni później.
  2. Wstrzyknąć łącznie 2% pentobarbitalu sodu (dawka: 2 ml/kg) do znieczulenia poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe, a następnie utrwalić, przygotować skórę i wysterylizować zgodnie z opisem w krokach 1.2.
  3. Noś sterylne rękawiczki i używaj sterylnych nożyczek, aby sekwencyjnie odsłaniać skórę, tkankę podskórną i więzadła kolana.
  4. Użyj strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml i wprowadź igłę do jamy stawowej pod kątem 15°. Powoli wstrzyknąć około 20 μl mieszaniny kolagenu z nanocząsteczkami srebra i powoli wycofać igłę24.
  5. Zszyj kolejno tkankę podskórną i skórę i wysterylizuj. Umieść myszy w indywidualnie wentylowanych klatkach (IVC) oddzielnie po wybudzeniu się ze znieczulenia.
  6. Wykonaj to wstrzyknięcie mieszaniny kolagenu z nanocząstkami srebra (20 μl) cztery razy z częstotliwością raz w tygodniu.
    UWAGA: Myszy leczone mieszaniną kolagenu z nanocząsteczkami srebra powinny być trzymane w indywidualnych klatkach. Walki myszy mogą mieć miejsce, gdy są trzymane razem, a to wpłynęłoby na wyniki eksperymentalne. Podczas iniekcji pojawi się uczucie napięcia, gdy igła dotrze do jamy stawowej, a po wstrzyknięciu pojawi się obrzęk w stawie kolanowym. Połączenie tych dwóch metod pozwala badaczowi upewnić się, że lek został pomyślnie wstrzyknięty do stawu kolanowego.

4. Pobranie tkanki stawu kolanowego i maziowego

  1. Uśmierc myszy za pomocą uduszenia dwutlenkiem węgla lub innego protokołu zatwierdzonego przez odpowiednią komisję etyczną ds. zwierząt.
  2. Sterylizuj i preparuj kolejno skórę i tkankę podskórną oraz całkowicie odsłaniaj staw kolanowy.
  3. Zbierz stawy kolanowe, w tym kość udową i piszczelową, i usuń tkanki mięśniowe.
  4. Zbierz tkanki stawu kolanowego, w tym kość udową, piszczel i otaczające tkanki miękkie (więzadło i torebkę), w 10% formalinie w celu zachowania i utrwalenia.

5. Barwienie hematoksyliną-eozyną

  1. Po utrwaleniu przez noc zanurz skrawki w parafinie i za pomocą mikrotomu pokrój tkankę zatopioną w parafinie na grubość 0,4 μm. Przygotowane skrawki wykorzystać do dalszego barwienia (barwienie hematoksyliną-eozyną, Safranin O/Fast Green i barwienie immunohistochemiczne (IHC)) ).
  2. Odparafinować skrawki dwukrotnie ksylenem, moczyć kolejno w 100%, 95%, 80% i 70% etanolu przez 5 minut każdy i ponownie uwodnić.
  3. Wybarwić skrawki hematoksyliną (0,1 g/100 ml) przez 5 min, a następnie bezpośrednio umieścić w 1% HCl na 10 s i eozynie (0,5 g/100 ml) na 1 min.
  4. Obserwuj zmiany histopatologiczne błony maziowej pod mikroskopem.

6. Safranin O/Fast Green

  1. Zanurz tkankę w parafinie i przygotuj skrawki histologiczne zgodnie z opisem w kroku 5.1.
  2. Odparafinować skrawki dwukrotnie ksylenem i ponownie uwodnić je serią etanolu (np. 100%, 95%, 80% i 70% etanolu w wodzie destylowanej, każdy przez 5 minut).
  3. Przygotowane skrawki zabarwić hematoksyliną i umyć je PBS trzykrotnie po 2 minuty każde.
  4. Rozdzielić skrawki alkoholem kwasu solnego i przemyć je PBS trzy razy przez 2 minuty każda.
  5. Zanurz skrawki w 0,02% roztworze barwiącym Fast Green na 5-10 minut, a następnie w 0,1% barwieniu Safraniną O na 1-2 minuty.
  6. Rozróżnicuj skrawki za pomocą 1% kwasu octowego, a następnie przepłucz PBS.
  7. Wykryj i przeanalizuj tworzenie się chrząstki włóknistej w sekcjach.

7. Barwienie immunohistochemiczne (IHC)

  1. Zanurz tkankę w parafinie i przygotuj skrawki histologiczne zgodnie z opisem w kroku 5.1.
  2. Odparafinować skrawki dwukrotnie ksylenem i ponownie uwodnić je serią etanolu (np. 100%, 95%, 80% i 70% etanolu w wodzie destylowanej, każdy przez 5 minut). Zanurzyć skrawki w buforze Tris-EDTA (10 mM zasady Tris, 1 mM roztwór EDTA; pH 9,0) i podgrzewać w kuchence mikrofalowej w temperaturze 95 °C przez 10 minut w celu pobrania antygenu.
  3. Wystawić skrawki na działanie 3% roztworu nadtlenku wodoru przez 10 minut, aby usunąć endogenną peroksydazę.
  4. Potraktuj skrawki 5% kozim surowicą, aby zablokować niespecyficzne wiązanie.
  5. Dodać rozcieńczone przeciwciała pierwszorzędowe (rozcieńczenie 1:1000) przeciwko CD177 i inkubować przez noc w temperaturze 4°C. Następnie trzykrotnie umyj skrawki PBS.
  6. Namocz skrawki PBS i inkubuj skrawki z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym (system antykrólików sprzężony z HRP) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Wykonaj wizualizację barwienia IHC przy użyciu 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) jako chromogenu.
  8. Obejrzyj skrawki pod mikroskopem i przeanalizuj uzyskane obrazy.

Wyniki

Model myszy z KOA indukowano za pomocą kolagenazy typu II. Począwszy od 1 tygodnia po indukcji modelu, przygotowaną mieszaninę kolagenu z nanocząsteczkami srebra wstrzykiwano do jamy stawowej raz w tygodniu przez 4 tygodnie (Rysunek 1). Masę ciał myszy w każdej grupie obserwowano i zapisywano codziennie. Wyniki wykazały, że średnia masa ciała myszy z KOA była znacząco niższa niż w normalnej grupie kontrolnej. Jednak średnia masa ciała myszy w grupie kolagenaza typu II + AgNPs była wyższa w porównaniu z myszami z KOA, choć różnica ta nie była istotna statystycznie (Rysunek 2). Po 30 dniach od myszy pobrano tkanki błony maziowej stawów kolanowych i poddano je badaniu patologicznemu. Analizowano hiperplazję, proliferację naczyń, naciek zapalny błony maziowej oraz uszkodzenia chrząstki5,10,11. Wyniki wykazały, że grubość błony maziowej u myszy w grupie KOA była znacząco większa w porównaniu z normalną grupą kontrolną. W grupie leczonej mieszaniną kolagenu z nanocząsteczkami srebra grubość błony maziowej była zmniejszona w porównaniu z grupą KOA (Rysunek 3). W błonie maziowej myszy z KOA stwierdzono hiperplazję naczyń w porównaniu z normalną grupą kontrolną, natomiast hiperplazja naczyń była znacząco zredukowana w błonie maziowej myszy leczonych mieszaniną kolagenu z nanocząsteczkami srebra (Rysunek 4). Wyniki barwienia Safranin-O wykazały, że macierz chrząstki u myszy z KOA była zniszczona, podczas gdy myszy leczone mieszaniną kolagenu z nanocząsteczkami srebra wykazywały znacząco lepszą macierz chrząstki (Rysunek 5). Punktację cech morfologicznych w każdej grupie oceniano zgodnie z wcześniejszym opisem22. Wyniki były następujące: 0 ± 0 dla grupy soli fizjologicznej, 7 ± 0,63 dla grupy kolagenu typu II oraz 4,2 ± 1,17 dla grupy kolagenaza typu II + AgNPs (Rysunek 6). CD177 jest głównym markerem neutrofili25. CD177 jest eksprymowany w 40%–60% neutrofili w warunkach prawidłowych. Jednak ekspresja CD177 w neutrofilach znacząco wzrasta podczas ostrego stanu zapalnego. Wyniki barwienia IHC wykazały, że liczba naciekających neutrofili w obszarze błony maziowej była znacząco mniejsza w grupie leczonej AgNPs w porównaniu z grupą KOA (Rysunek 7), co sugeruje, że leczenie AgNPs może łagodzić objawy KOA.

Oś czasu eksperymentu na zwierzętach, schemat wstrzykiwania kolagenazy, analiza stawu kolanowego, więzadło podrzepkowe.
Rysunek 1: Miejsce wstrzyknięcia. (A) Reprezentatywne obrazy wstrzykiwania kolagenazy typu II. (B) Reprezentatywne obrazy po wstrzyknięciu kolagenazy typu II. (C) Reprezentatywne obrazy wstrzyknięcia mieszaniny kolagenu z nanocząsteczkami srebra w modelu mysim KOA. (D) Reprezentatywne obrazy po wstrzyknięciu mieszaniny kolagenu z nanocząsteczkami srebra w modelu mysim KOA. Czerwona przerywana linia reprezentuje linię równoległą do więzadeł kolana myszy. Czarna strzałka reprezentuje kąt między igłą strzykawki insulinowej a skórą. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres zmian masy ciała po wstrzyknięciu kolagenu typu II; analizowane krzywe dla soli fizjologicznej, kolagenu oraz kolagenu+AgNP.
Rysunek 2: Zmiany masy ciała myszy w każdej z grup. Ten panel przedstawia średnią masę ciała myszy w każdej grupie w różnych punktach czasowych; oś x oznacza liczbę dni po wstrzyknięciu kolagenazy typu II, a oś y wskazuje krotność zmiany masy ciała. Grupa soli fizjologicznej (n = 7), grupa kolagenazy typu II (n = 5), grupa kolagenazy typu II + AgNPs (n = 5). *p < 0.05. Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Prשcijeny preparaty histologiczne porównujące sól fizjologiczną, kolagen typu II oraz kolagen typu II z AgNP; wyniki mikroskopowe.
Rysunek 3: Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) wykazujące hiperplazję błony maziowej. Pobrano, utrwalono, pocięto i zabarwiono H&E tkanki maziowe z każdej grupy myszy 30 dni po operacji. Podwójne strzałki wskazują zmierzoną grubość błony maziowej. Pasek skali = 0,1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Porównanie histologiczne traktowania solą fizjologiczną, kolagenem typu II oraz kolagenem typu II+AgNP, skala 50 µm.
Rysunek 4: Reprezentatywny obraz hiperplazji naczyń okołobłonkowych. Strzałki wskazują naczynia. Pasek skali = 0,05 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Barwienie Safraniną-O, porównanie przekrojów chrząstki stawowej, kolagen typu II, analiza leczenia AgNP.
Rysunek 5: Barwienie Safraniną-O stawu kolanowego w każdej grupie myszy. Pasek skali = 0.2 mm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy porównujący oceny morfologiczne dla grup z solą fizjologiczną, kolagenem typu II oraz kolagenem+AgNP.
Rysunek 6: Wyniki oceny cech morfologicznych w każdej grupie. Do pomiaru oceny cech morfologicznych u myszy w każdej grupie wykorzystano tkankę błony maziowej. W każdej grupie wybrano pięć przekrojów tkanki w celu analizy stopnia hiperplazji/powiększenia warstwy komórek wyściełających błonę maziową, stopnia nacieku neutrofilów w tkance maziowej oraz stopnia aktywacji zrębu błony maziowej (Tabela 1). Jako ostateczny wynik przyjęto wartość średnią. **p < 0,01 oraz ***p < 0,001 w teście t-Studenta dla każdej kohorty w porównaniu z nieleczoną grupą KOA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki barwienia CD177; obrazy mikroskopowe; porównanie soli fizjologicznej, kolagenu typu II oraz kolagenu+AgNP.
Rycina 7: Barwienie immunohistochemiczne markera neutrofili w tkance maziowej w każdej grupie myszy. Do wykrycia ekspresji markera neutrofili CD177 w tkance maziowej myszy w każdej z grup zastosowano barwienie immunohistochemiczne. Strzałki wskazują neutrofile. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela 1: Punktacja cech morfologicznych. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Nanocząstki srebra wykazują działanie przeciwzapalne, przeciwbakteryjne, przeciwutleniające i immunomodulujące, co oznacza, że mogą chronić komórki i tkanki przed uszkodzeniem poprzez zmniejszenie produkcji reaktywnych form tlenu26. Niektórzy badacze są zaniepokojeni toksycznością nanocząstek srebra27. Toksyczność nanocząstek srebra jest bezpośrednio związana z obecnością wolnych jonów srebra. Ze względu na nanoskalowy rozmiar nanocząstek srebra, mogą one łatwo zakłócać działanie biomolekuł, komórek i narządów ludzkich 15,28,29. Kilka badań wykazało, że nanocząstki srebra mogą indukować stres oksydacyjny i upośledzać funkcję mitochondriów w komórkach ludzkich30. Ponadto Ag może być wykrywany w narządach człowieka, zwłaszcza w wątrobie i śledzionie, po zastosowaniu dużych ilości nanocząsteczek srebra. Naukowcy poinformowali również, że nanocząsteczki srebra mają zdolność przekraczania bariery krew-mózg poprzez transport transsynaptyczny i gromadzą sięw mózgu. Nie przeprowadzono systematycznego raportu na temat biotoksyczności nanocząstek srebra, chociaż niektórzy badacze przyznają bezpieczeństwo nanocząstek srebra32.

W tym badaniu przygotowaliśmy mieszaninę kolagenu z nanocząstkami srebra. Rzeczywiście, okres trwania nanocząstek srebra w tkankach ludzkich jest krótki, ale okres trwania nanocząstek srebra można przedłużyć po zastosowaniu z mieszaniną kolagenu; To nie tylko zmniejsza uraz, ale także dawkę leków. Biorąc pod uwagę toksyczność nanocząstek srebra, dawka nanocząstek srebra zastosowana w tym badaniu wyniosła 30 mg/kg, zgodnie z wcześniejszymi badaniami33.

Oto kilka istotnych kwestii związanych z operacją eksperymentalną. Kolagenaza typu II powinna być przechowywana w temperaturze -20 °C po przygotowaniu, aby zapobiec degradacji w wyniku rozszczepienia enzymatycznego. Przygotowanie mieszaniny kolagenu z nanocząstkami srebra musi odbywać się na lodzie w sposób ciągły w temperaturze pokojowej, ponieważ mieszanina kolagenu z nanocząstkami srebra szybko staje się żelem półstałym, a następnie nie może być używana do wstrzykiwań. Po przygotowaniu roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Do podawania dostawowego należy wybrać strzykawkę insulinową o pojemności 1 ml z mniejszą igłą, co może skutecznie zapobiec wyciekowi wstrzykiwanych leków. Igłę należy wprowadzić pod kątem 15°, aby wstrzyknąć mieszaninę kolagenu z nanocząstkami srebra. Gdy igła jest nieoporna, oznacza to, że igła dotarła do jamy stawu kolanowego. Po wstrzyknięciu należy zmienić kąt wstrzyknięcia, a igłę należy powoli wyjmować, aby uniknąć wycieku wstrzykniętego leku.

W tym badaniu nanocząstki srebra skutecznie poprawiły objawy KOA wywołanego kolagenazą typu II u myszy, wykazując przeciwzapalne działanie nanocząstek srebra. Kilka badań wykazało obecność apoptozy w komórkach inkubowanych in vitro z nanocząstkami srebra 34,35,36. Zmniejszenie przerostu błony maziowej mogło być spowodowane przez nanocząstki srebra ze względu na ich udział w upośledzeniu funkcji mitochondriów lub wyniki te mogły być spowodowane przez reaktywne formy tlenu. Przerost naczyń zaobserwowano w błonie maziowej myszy w grupie modelu KOA. Możliwe, że chemokiny wypychały neutrofile z naczyń krwionośnych do tkanki maziowej podczas tego procesu i że wybuch stanu zapalnego spowodował, że komórki zużywały więcej tlenu, prowadząc w ten sposób do przerostu naczyń. W związku z tym potrzebne są dalsze eksperymenty, aby udowodnić wiarygodność tej hipotezy. Badanie to dostarcza teoretycznych korzyści dla badań nad leczeniem klinicznego KOA. W przyszłych badaniach zamierzamy połączyć metodę więzadła krzyżowego przedniego (ACL) wraz z chemicznie indukowaną metodą modelowego KOA w celu obserwacji wpływu nanocząstek srebra. Wyniki eksperymentów pokazują, że nanocząstki srebra mogą znacznie zmniejszyć infiltrację komórek zapalnych w błonie maziowej u myszy KOA, ale mechanizmy tego efektu nadal wymagają dalszych badań, które mogą rozwikłać patogenezę KOA.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Guangdong (Numer: 2019A1515010209) oraz Projekt Naukowo-Technologiczny Miasta Guangzhou, Chiny (Numer: 202102010164).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 ml strzykawka insulinowaBD305932Brak
CD177 Przeciwciało poliklonalneThermoFisher ScientificPA5-98759Brak
Hydrat chloraluSigma-Aldrich302-17-0Brak
DABMCEHY-15912Brak
EozynaBeyotime BiotechnologyC0109Brak
FormalinaSigma-AldrichHT501128Brak
HematoxylinBeyotime BiotechnologyC0107Brak Mikroskopia
LekkaLeicaDM500Brak
Nanocząstka srebraWolcacvi S-10-20Przechowywać produkt w ciemności pod kątem 4& stopni; C
Safranine O-Fast Green FCF Zestaw do barwienia chrząstkiSolarbio90-15-3Brak
Kolagen typu IISigma-AldrichC6885-500mgBrak

Bibliografia

  1. Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: Classification, update, and measurement of outcomes. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 11, 19(2016).
  2. Kraus, V. B., Blanco, F. J., Englund, M., Karsdal, M. A., Lohmander, L. S. Call for standardized definitions of osteoarthritis and risk stratification for clinical trials and clinical use. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (8), 1233-1241 (2015).
  3. Smith, M. D. The normal synovium. Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).
  4. de Sousa, E. B., Casado, P. L., Moura, N. V., Duarte, M. E., Aguiar, D. P. Synovial fluid and synovial membrane mesenchymal stem cells: Latest discoveries and therapeutic perspectives. Stem Cell Research and Therapy. 5 (5), 112(2014).
  5. Scanzello, C. R., Goldring, S. R. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 51 (2), 249-257 (2012).
  6. Glyn-Jones, S., et al. Osteoarthritis. Lancet. 386 (9991), 376-387 (2015).
  7. Roemer, F. W., et al. Presence of MRI-detected joint effusion and synovitis increases the risk of cartilage loss in knees without osteoarthritis at 30-month follow-up: The MOST study. Annals of Rheumatic Diseases. 70 (10), 1804-1809 (2011).
  8. Furman, B. D., et al. Articular ankle fracture results in increased synovitis, synovial macrophage infiltration, and synovial fluid concentrations of inflammatory cytokines and chemokines. Arthritis and Rheumatology. 67 (5), 1234-1239 (2015).
  9. Ayral, X., Pickering, E. H., Woodworth, T. G., Mackillop, N., Dougados, M. Synovitis: A potential predictive factor of structural progression of medial tibiofemoral knee osteoarthritis -- Results of a 1 year longitudinal arthroscopic study in 422 patients. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (5), 361-367 (2005).
  10. Henrotin, Y., Lambert, C., Richette, P. Importance of synovitis in osteoarthritis: Evidence for the use of glycosaminoglycans against synovial inflammation. Seminars in Arthritis and Rheumatism. 43 (5), 579-587 (2014).
  11. Liu-Bryan, R. Synovium and the innate inflammatory network in osteoarthritis progression. Current Rheumatology Reports. 15 (5), 323(2013).
  12. Towheed, T., Shea, B., Wells, G., Hochberg, M. Analgesia and non-aspirin, non-steroidal anti-inflammatory drugs for osteoarthritis of the hip. Cochrane Database of Systematic Reviews. (2), (2000).
  13. Co, C. M., et al. Click chemistry-based pre-targeting cell delivery for cartilage regeneration. Regenerative Biomaterials. 8 (3), (2021).
  14. Oo, W. M., Liu, X., Hunter, D. J. Pharmacodynamics, efficacy, safety and administration of intra-articular therapies for knee osteoarthritis. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 15 (12), 1021-1032 (2019).
  15. Morozova, O. V. Silver nanostructures: Limited sensitivity of detection, toxicity and anti-inflammation effects. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 9928(2021).
  16. He, M., et al. A pH-responsive mesoporous silica nanoparticles-based drug delivery system with controlled release of andrographolide for OA treatment. Regenerative Biomaterials. 8 (4), (2021).
  17. Samuel, M. S., Jose, S., Selvarajan, E., Mathimani, T., Pugazhendhi, A. Biosynthesized silver nanoparticles using Bacillus amyloliquefaciens; Application for cytotoxicity effect on A549 cell line and photocatalytic degradation of p-nitrophenol. Journal of Photochemistry and Photobiology B. 202, 111642(2020).
  18. Liu, X., et al. Silver nanoparticles mediate differential responses in keratinocytes and fibroblasts during skin wound healing. ChemMedChem. 5 (3), 468-475 (2010).
  19. Tian, J., et al. Topical delivery of silver nanoparticles promotes wound healing. ChemMedChem. 2 (1), 129-136 (2007).
  20. Vendidandala, N. R., et al. Gallocatechin-silver nanoparticle impregnated cotton gauze patches enhance wound healing in diabetic rats by suppressing oxidative stress and inflammation via modulating the Nrf2/HO-1 and TLR4/NF-kappaB pathways. Life Sciences. 286, 120019(2021).
  21. Kikuchi, T., Sakuta, T., Yamaguchi, T. Intra-articular injection of collagenase induces experimental osteoarthritis in mature rabbits. Osteoarthritis and Cartilage. 6 (3), 177-186 (1998).
  22. Lorenz, J., Grässel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).
  23. Zhao, Z., et al. Design and synthesis of Ag NPs/chitosan-starch nano-biocomposite as a modern anti-human malignant melanoma drug. International Journal of Biological Macromolecules. 236, 123823(2023).
  24. Ahmed, E., et al. Decellularized extracellular matrix-rich hydrogel-silver nanoparticle mixture as a potential treatment for acute liver failure model. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 108 (12), 2351-2367 (2020).
  25. Bai, M., et al. CD177 modulates human neutrophil migration through activation-mediated integrin and chemoreceptor regulation. Blood. 130 (19), 2092-2100 (2017).
  26. Singh, D., Chaudhary, D., Kumar, V., Verma, A. Amelioration of diethylnitrosamine (DEN) induced renal oxidative stress and inflammation by Carissa carandas embedded silver nanoparticles in rodents. Toxicology Reports. 8, 636-645 (2021).
  27. Singh, N., et al. NanoGenotoxicology: The DNA damaging potential of engineered nanomaterials. Biomaterials. 30 (23-24), 3891-3914 (2009).
  28. Noronha, V. T., et al. Silver nanoparticles in dentistry. Dental Materials. 33 (10), 1110-1126 (2017).
  29. Ahamed, M., Alsalhi, M. S., Siddiqui, M. K. Silver nanoparticle applications and human health. Clinica Chimica Acta. 411 (23-24), 1841-1848 (2010).
  30. Palacios-Hernandez, T., et al. cellular uptake and apoptotic responses in human coronary artery endothelial cells exposed to ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Journal of Applied Toxicology. 40 (7), 918-930 (2020).
  31. Lebda, M. A., et al. Potential role of alpha-lipoic acid and Ginkgo biloba against silver nanoparticles-induced neuronal apoptosis and blood-brain barrier impairments in rats. Life Sciences. 212, 251-260 (2018).
  32. Yin, I. X., et al. The antibacterial mechanism of silver nanoparticles and its application in dentistry. International Journal of Nanomedicine. 15, 2555-2562 (2020).
  33. Kim, Y. S., et al. Subchronic oral toxicity of silver nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 7, 20(2010).
  34. Pascarelli, N. A., et al. Effects of gold and silver nanoparticles in cultured human osteoarthritic chondrocytes. Journal of Applied Toxicology. 33 (12), 1506-1513 (2013).
  35. Braydich-Stolle, L. K., et al. Silver nanoparticles disrupt GDNF/Fyn kinase signaling in spermatogonial stem cells. Toxicological Sciences. 116 (2), 577-589 (2010).
  36. Eom, H. J., Choi, J. p38 MAPK activation, DNA damage, cell cycle arrest and apoptosis as mechanisms of toxicity of silver nanoparticles in Jurkat T cells. Environmental Science and Technology. 44 (21), 8337-8342 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Choroba zwyrodnieniowa stawu kolanowegomodel mysihiperplazja błony maziowejwtryskiwanie kolagenazyodpowiedź zapalnawstrzyknięcie miejscowebarwienie immunohistochemicznemacierz chrzęstnainfiltracja neutrofili
Łagodzenie choroby zwyrodnieniowej stawów u myszy za pomocą nanocząstek srebra
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.