Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Stosowanie nikotyny w mysim modelu narażonym na działanie krzemionki w celu promowania przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego płuc

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65127

⸱

3 marca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Industrial Dust Control and Occupational Health of the Ministry of Education, Anhui University of Science and Technology, 2Key Laboratory of Industrial Dust Deep Reduction and Occupational Health and Safety of Anhui Higher Education Institutes, Anhui University of Science and Technology, 3Anhui Province Engineering Laboratory of Occupational Health and Safety, 4School of Medicine, Department of Medical Frontier Experimental Center, Anhui University of Science and Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie opisuje model mysi do badania synergicznego wpływu nikotyny na postęp zwłóknienia płuc u eksperymentalnych myszy z krzemicą. Mysi model podwójnej ekspozycji symuluje patologiczny postęp w płucach po jednoczesnej ekspozycji na nikotynę i krzemionkę. Opisane metody są proste i wysoce powtarzalne.

Streszczenie

Palenie tytoniu i narażenie na krzemionkę są powszechne wśród pracowników zawodowych, a krzemionka jest bardziej podatna na uszkodzenie płuc palaczy niż osób niepalących. Rola nikotyny, głównego uzależniającego składnika papierosów, w rozwoju krzemicy jest niejasna. Model mysi zastosowany w tym badaniu był prosty i łatwy do kontrolowania oraz skutecznie symulował wpływ przewlekłego spożywania nikotyny i powtarzającego się narażenia na krzemionkę na zwłóknienie płuc poprzez przejście nabłonkowo-mezenchymalne u ludzi. Ponadto model ten może pomóc w bezpośrednim badaniu wpływu nikotyny na krzemicę, unikając jednocześnie wpływu innych składników w dymie papierosowym.

Po adaptacji do środowiska, myszom wstrzykiwano podskórnie roztwór nikotyny 0,25 mg/kg do luźnej skóry na szyi codziennie rano i wieczorem w odstępach 12 godzin przez 40 dni. Dodatkowo krystaliczną krzemionkę w proszku (1-5 μm) zawieszono w zwykłej soli fizjologicznej, rozcieńczono do zawiesiny 20 mg/ml i równomiernie zdyspergowano za pomocą ultradźwiękowej łaźni wodnej. Myszy znieczulone izofluranem wdychały 50 μl tej zawiesiny pyłu krzemionkowego przez nos i były budzone poprzez masaż klatki piersiowej. Ekspozycję na krzemionkę podawano codziennie w dniach 5-19.

Podwójnie narażony model myszy był narażony na działanie nikotyny, a następnie krzemionki, co odpowiada historii narażenia pracowników, którzy są narażeni na oba szkodliwe czynniki. Ponadto nikotyna sprzyjała zwłóknieniu płuc poprzez transformację nabłonkowo-mezenchymalną (EMT) u myszy. Ten model zwierzęcy może być wykorzystany do badania wpływu wielu czynników na rozwój krzemicy.

Wprowadzenie

Narażenie pracowników na krzemionkę jest nieuniknione w niektórych środowiskach zawodowych, a raz wystawione na działanie krzemionki, degradacja postępuje nawet po usunięciu ze środowiska. Ponadto większość z tych pracowników pali papierosy, a tradycyjne papierosy zawierają tysiące substancji chemicznych, z których kluczowym składnikiem uzależniającym jest nikotyna1. E-papierosy stają się coraz bardziej popularne w młodszych grupach wiekowych2; Te e-papierosy działają jak system dostarczania nikotyny i zwiększają dostęp do nikotyny, zwiększając w ten sposób podatność płuc i zapalenie płuc3. Dym papierosowy przyspiesza również zwłóknienie płuc u myszy narażonych na działanie bleomycyny4 oraz zwiększa toksyczność płucną i zwłóknienie u myszy narażonych na działanie krzemionki5,6. Jednak to, czy nikotyna może wpływać na proces zapalny i zwłóknienia płuc spowodowany przez krzemionkę, pozostaje do zbadania.

Model myszy oparty na krzemicy powstały w wyniku jednorazowego wdychania dużej dawki krzemionki do tchawicy jest traumatyczny dla myszy. Chociaż metoda ta szybko dostarcza modelu krzemicy, nie pasuje do rzeczywistości środowiska, w którym pracownicy są wielokrotnie narażeni na działanie krzemionki. Dlatego ustaliliśmy model myszy wystawiony na działanie krzemionki, wielokrotnie podając niską dawkę zawiesiny krzemionki przez kroplówkę z nosa; Dawka ta może powodować stan zapalny i zwłóknienie u myszy.

Aby obejść działanie innych składników papierosów, temu mysiemu modelowi wstrzyknięto podskórnie nikotynę w luźną skórę szyi w celu określenia wpływu uzależniającego składnika, nikotyny, na krzemicę. Poprzez podawanie zastrzyków podskórnych można uzyskać dokładne dawkowanie, co umożliwia tworzenie modeli ekspozycji na nikotynę i obserwację reakcji na toksyczność dawki, a także uzależnienie. Model uzależnienia od nikotyny został opracowany u samców myszy, z dawką iniekcji nikotyny 0,2-0,4 mg/kg7,8. W tym modelu, aby zaspokoić potrzeby uzależnionych myszy w poszukiwaniu narkotyków, podawano dwa zastrzyki podskórne w odstępach 12 godzin. Ten mysi model uzależnienia od nikotyny jest przydatny do symulacji nawyków palenia u ludzi i narażenia na krzemionkę.

Jednoczynnikowe modele zwierzęce mają ograniczenia w badaniach nad chorobami, podczas gdy opisana tutaj metoda obejmuje dwuczynnikowy mysi model jednoczesnej ekspozycji na nikotynę i krzemionkę. Przed ekspozycją na krzemionkę myszy były wstępnie wystawione na nikotynę, aby odtworzyć ekspozycję na nikotynę u osób palących. Następnie ekspozycja na krzemionkę miała miejsce od 5 do 19 dnia w celu imitacji ekspozycji na krzemionkę w środowisku pracy dla osób z historią palenia.

Wiadomo, że makrofagi pęcherzykowe odgrywają znaczącą rolę w regulacji stanu zapalnego i zwłóknienia płuc. Makrofagi nie mogą rozkładać krzemionki po wdychaniu krzemionki, co prowadzi do polaryzacji makrofagów lub apoptozy9 i uwalniania cytokin, takich jak czynnik martwicy nowotworu alfa (TNF-α) i transformujący czynnik wzrostu beta (TGF-β). Makrofagi M1, które są identyfikowane przez obecność markera powierzchniowego CD86, są głównymi inicjatorami odpowiedzi zapalnej w krzemicy, podczas gdy makrofagi M2, które są oznaczone przez CD206, są odpowiedzialne za fazę zwłóknienia stanu10. U myszy z podwójną ekspozycją nikotyna indukowała polaryzację makrofagów w kierunku fenotypu M2 w płucach uszkodzonych przez krzemionkę, sprzyjając w ten sposób zwłóknieniu płuc. Ponadto TGF-β1 jest kluczem do indukcji zwłóknienia i EMT11; zwiększona ekspresja TGF-β1 przyspieszyła postęp zwłóknienia płuc poprzez EMT. Model ten z powodzeniem przeanalizował wpływ nikotyny na krzemicę i dodatkowo podkreślił znaczenie zaprzestania palenia nikotyny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi wydanymi przez National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8. edycja NRC) i zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu Nauki i Technologii Anhui.

1. Przygotowanie zwierząt

  1. Trzymaj 32 samce myszy C57/BL6 w wieku 8 tygodni w laboratorium z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności. Upewnij się, że myszy mają swobodny dostęp do jedzenia i wody.
  2. Po 2 tygodniach aklimatyzacji do środowiska, gdy 10-tygodniowe myszy ważą 23-26 g, użyj liczb losowych wygenerowanych przez komputer, aby losowo pogrupować zwierzęta bez podziału, w wyniku czego otrzymasz cztery grupy myszy: grupę kontrolną (Con), grupę nikotynową (Nic), grupę krzemionkową (SiO2) i nikotynę połączoną z grupą krzemionkową (Nic+ SiO2).

2. Preparat nikotynowy

UWAGA: Gęstość nikotyny wynosi 1,01 g/ml.

  1. Rozpuść nikotynę w bezwodnym etanolu i rozcieńcz 20x, aby przygotować roztwór podstawowy nikotyny o stężeniu 50 mg/ml.
  2. Rozcieńczyć roztwór podstawowy nikotyny 1000x sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aby uzyskać roztwór roboczy o stężeniu 0,05 mg/mL.
    UWAGA: Przechowuj nikotynę z dala od światła. Roztwór podstawowy można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.

3. Przygotowanie krzemionki

  1. Zawiesić sterylną krzemionkę krystaliczną w soli fizjologicznej, aby przygotować zawiesinę krzemionki o stężeniu 20 mg/ml i oscylować w ultradźwiękowej łaźni wodnej wstrząsającej przez 25 minut.
  2. Potrząsaj zawiesiną krzemionki za pomocą oscylatora wirowego przez 3 minuty, zanim myszy otrzymają kroplówkę z nosa. Wymieszaj zawiesinę krzemionkową, pipetując w górę i w dół 2x-3x za pomocą pipety 200 μl, a następnie pobierz 50 μl do kroplówki donosowej.
    UWAGA: Zawiesinę dwutlenku krzemu należy jak najszybciej wymieszać i podać w kroplówce do nosa.

4. Chwytanie myszy i ekspozycja na nikotynę

  1. Zważ myszy i zapisuj wagę codziennie przed ekspozycją.
  2. W dniach 1-40 wstrzykuj podskórnie nikotynę dwa razy dziennie (w odstępie 12 godzin) myszom w grupach Nic i Nic+ SiO2. Stosować dawkę nikotyny 0,25 mg/kg; Na przykład upewnij się, że mysz o wadze 25 g otrzymuje 6,25 μg nikotyny. W przypadku tej myszy objętość wstrzyknięcia byłaby następująca: 6,25/0,05 = 125 μL. Jednocześnie wstrzyknij myszom z grupy Con równą objętość soli fizjologicznej.
  3. Przygotuj wymagane strzykawki o pojemności 1 ml dla każdej grupy i użyj ich do odessania objętości nikotyny lub soli fizjologicznej do wstrzyknięcia. Przed zażyciem nikotyny należy najpierw wciągnąć do strzykawki 0,1-0,2 ml powietrza, a następnie pobrać 125 μl nikotyny. Ostrożnie postukać w strzykawkę, aby napełnić igłę i przedni koniec strzykawki nikotyną. Umieść strzykawkę zawierającą nikotynę w tacce zabezpieczonej przed światłem.
    UWAGA: W momencie wstrzyknięcia 0,1-0,2 ml powietrza znajduje się za nikotyną, co gwarantuje, że cały płyn zostanie pomyślnie dostarczony myszy.
  4. Chwyć ogon myszy prawą ręką, a gdy zwierzę się zrelaksuje, użyj lewego kciuka i palca wskazującego, aby docisnąć skórę z tyłu szyi od ogona do głowy aż do krawędzi ucha, wywierając umiarkowany nacisk. Następnie zwolnij prawą rękę i użyj lewego małego kciuka i palca serdecznego, aby uszczypnąć ogon i tylne kończyny, w którym to momencie mysz zostanie całkowicie unieruchomiona przez lewą rękę.
    UWAGA: Chwyć mysz z odpowiednią siłą. Niewystarczająca siła ułatwia myszom gryzienie, podczas gdy nadmierna siła może spowodować uduszenie myszy.
  5. Prawą ręką należy wstrzyknąć strzykawkę skórę z tyłu szyi w pobliżu krawędzi ucha myszy w kierunku od głowy do ogona i wstrzykiwać nikotynę w jednakowej dawce. Poszukaj półkolistego wybrzuszenia skóry, które wskazuje na udane wstrzyknięcie.
    UWAGA: Gdy igła wbije się w skórę, pojawi się uczucie oporu; Opór znika po wkłuciu igły. W tym momencie igłę należy lekko wycofać, aby wstrzykiwać powoli i równomiernie.

5. Ekspozycja na krzemionkę in vivo

  1. W dniach 5-19 wkraść zawiesinę dwutlenku krzemu do jamy nosowej myszy w grupach SiO2 i Nic+ SiO2. Szybko znieczulić każdą mysz 2% izofluranem w aparacie do znieczulenia w dawce 3,6 ml / h. Po znieczuleniu umieść mysz na dłoni jednej ręki i odsłoń jamę nosową myszy. Wkroplić 50 μl zawiesiny krzemionki do jamy nosowej w ciągu 4-8 sekund.
  2. Aby zawiesina krzemionkowa mogła dostać się do płuc tak szybko, jak to możliwe, po wkropleniu delikatnie naciskaj palec wskazujący na serce myszy przez 3-5 sekund, 3x-5x na sekundę, aby przyspieszyć jej częstość oddechów.
  3. Gdy oddychanie myszy stopniowo stanie się jednolite, umieść mysz w klatce, aby obserwować przez 3 minuty.
  4. Dla wszystkich myszy otrzymujących zawiesinę krzemionki powtórz kroki 1-3. W grupie kontrolnej wkraść 50 μl sterylnej soli fizjologicznej do jamy nosowej w dniach 5-19.

6. Pobieranie świeżych i utrwalonych tkanek płucnych

  1. W 41. dniu należy zastosować 50 mg/kg pentobarbitalu sodu do znieczulenia myszy dootrzewnowo w dawce 0,1 ml/20 g w zależności od ich masy ciała. Przymocuj kończyny na piankowej płytce testowej i spryskaj futro 75% alkoholem.
  2. Wykonaj perfuzję serca, aby uzyskać świeżą tkankę płucną, przetnij linię środkową brzucha, aby odsłonić jamę klatki piersiowej i wykonaj mały otwór na wierzchołku prawego serca. Następnie wstrzyknij 20 ml wstępnie schłodzonego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) powoli i równomiernie z wierzchołka lewego serca, powodując wypływ krwi z otworu utworzonego na wierzchołku prawego serca. Wyjąć cały płat płuca, umieścić go we wstępnie schłodzonej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i przenieść do temperatury -80 °C w celu przechowywania w oczekiwaniu na ekstrakcję białka.
  3. Perfuzję u innych myszy za pomocą 20 ml wstępnie schłodzonego PBS, a następnie 10 ml 4% paraformaldehydu w tym samym miejscu, aby naprawić całe płuca; zachowaj każde płuco w 30 ml 4% PFA.
  4. Po 72 godzinach zatopić utrwalone tkanki płucne w parafinie.
    1. Zanurzyć tkankę płucną w przygotowanym utrwalaczu w ultradźwiękowej łaźni wodnej o temperaturze 40 °C na 30 minut, a następnie w procesie odwadniania w 75% etanolu, 95% etanolu i bezwodnym etanolu przez 50 minut każdy.
    2. Myć 2x ksylenem przez 50 min każdy.
    3. Umieścić tkankę w stopionym wosku parafinowym w temperaturze 55-60 °C na 2-3 godziny, tak aby ksylen w tkance płucnej był stopniowo zastępowany woskiem parafinowym.
    4. Przymocuj tkankę płucną w ramce do osadzania za pomocą parafiny i poczekaj, aż blok wosku stwardnieje. Po stwardnieniu bloku wosku użyj maszyny do cięcia parafiny, aby przeciąć płuco na głębokość 4-5 μm.
  5. Umieścić odcinki płuc w ultraczystej wodzie o temperaturze 45 °C. Gdy parafina się stopi, załaduj wycinek płuca na przylegające szkiełko mikroskopowe.

7. Barwienie hematoksyliną i eozyną (HE)

  1. Piecz szkiełka w temperaturze 60 °C przez 2 godziny i umieść je w ksylenie w celu odwoskowania na 2 x 30 min. Następnie umieść szkiełka w bezwodnym etanolu, 95% etanolu, 85% etanolu i 75% etanolu na 5 minut każda. Na koniec myj je przez 3 x 5 min ultraczystą wodą.
  2. Upuść 50 μl roztworu barwiącego hematoksylinę na tkankę płucną za pomocą pistoletu do pipet i barwić przez 5 minut, a następnie myć plastry pod bieżącą wodą przez 5 minut.
  3. Na sekcję dodać 50 μl 2% kwasu solnego w etanolu i płukać wodą destylowaną przez 30 s. Następnie dodaj 50 μl roztworu barwiącego eozynę na tkankę płucną, aby barwić przez 1 minutę.
  4. Odwodnić, przeźroczyścić i uszczelnić sekcje parafiny.
    1. Dodaj 100-150 ml 75% etanolu, 85% etanolu, 95% etanolu, bezwodnego etanolu i ksylenu w połączonym plastikowym zbiorniku do barwienia. Umieść szkiełka w 75%, 85%, 95% i bezwodnym etanolu na 5 minut każda, aby się odwodniły.
    2. Następnie umieść szkiełka w ksylenie na 5 minut, aby były przezroczyste.
    3. Na koniec upuść 20 μl neutralnej gumy na część płucną i umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku, aby je uszczelnić.
      UWAGA: Powyższe kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej.

8. Barwienie Massona

  1. Odwoskować, uwodnić i umyć skrawki parafiny zgodnie z opisem w kroku 7.1.
  2. Zabarwić skrawki 50 μl skonfigurowanego roztworu barwiącego hematoksyliną Weigerta przez 7 minut, a następnie 50 μl kwaśnego roztworu frakcjonowania etanolu przez 10 s i przemyć bieżącą wodą, aby jądra zmieniły kolor na niebieski.
  3. Zabarwić skrawki 50 μl roztworu trichromu Masson przez 4 minuty i zmyć wodą.
  4. Skrawki płukać wodą destylowaną przez 1 min, a następnie barwić czerwonym kwasem magenta Lichun przez 7 min.
  5. Sekcje przemywać roztworem roboczym o słabym kwasie (30% kwas solny) przez 1-2 min, roztworem kwasu fosfomolibdenowego przez 1-2 min i roztworem roboczym o słabym kwasie przez 1-2 min.
  6. Zabarwić skrawki w roztworze barwienia na niebiesko anilinę przez 2 minuty, a następnie myć słabym kwasowym roztworem roboczym przez 1 minutę.
  7. Odwodnić skrawki 95% etanolem, a następnie bezwodnym etanolem przez 1 s, przeźroczyścić ksylenem przez 1 s, a na koniec uszczelnić neutralną żywicą, jak opisano w kroku 7.4.

9. Immunohistochemia

  1. Piecz plastry w temperaturze 60 °C przez 6 godzin. Odwoskuj, uwodnij i umyj skrawki parafiny zgodnie z opisem w kroku 7.1.
  2. Pobieranie antygenu: umieść plastry w żaroodpornym plastikowym pudełku do krojenia zawierającym wystarczającą ilość roztworu do pobierania antygenu cytrynianowego, aby zanurzyć plastry i gotuj przez 20-30 minut.
  3. Schłodzić do temperatury pokojowej, usunąć sekcje i spłukać wodą dejonizowaną. Następnie moczyć przez 2 x 5 minut w PBS zawierającym 0,5% Tween-20 (PBST).
  4. Narysuj pętlę w pobliżu części płucnej na szkiełku za pomocą hydrofobowego pisaka, aby utworzyć hydrofobowy okrąg.
  5. Dodać kroplami 50 μl 3% roztworu nadtlenku wodoru (3%H2O2) do plastrów i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem w celu inaktywacji endogennej peroksydazy.
  6. Namocz plastry w PBST przez 3 x 5 min.
  7. Dodać kroplami 50 μl 5% białka surowicy bydlęcej (BSA)-PBST do plastrów i blokować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  8. Odrzucić roztwór blokujący, dodać kroplami 50 μl rozcieńczonych przeciwciał pierwszorzędowych CD206 (rozcieńczenie: 1:1,500), TGF-β1 (rozcieńczenie: 1:200) i wimentynę (rozcieńczenie: 1:2,000) do plasterków i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: W tej pracy wszystkie przeciwciała rozcieńczono w 5% BSA.
  9. Następnego dnia przywróć plastry do temperatury pokojowej (40 min). Umyj plastry zgodnie z opisem w kroku 9.6.
  10. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w 5% BSA. Dodać kroplami 50 μl przeciwciała drugorzędowego znakowanego peroksydazą chrzanową (rozcieńczenie: 1:500) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj plastry zgodnie z opisem w kroku 9.6.
  11. Wlać 50 μl roztworu 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) odpowiadającego przeciwciału wtórnemu znakowanemu enzymem na tkankę płucną i inkubować przez 5-10 minut w czarnym mokrym pudełku immunohistochemicznym. Obserwuj pod mikroskopem, aż kolor zmieni się w mocny brąz. Opłucz plastry wodą destylowaną, aby zakończyć reakcję.
    UWAGA: Brązowe barwienie jest uważane za barwienie pozytywne.
  12. Zaplamić 50 μl barwnika hematoksylinowego przez 30 s i zmyć pod bieżącą wodą. Następnie namocz plastry w 75%, 85%, 95% i bezwodnym etanolu przez 3 minuty każdy, a następnie w ksylenie przez 2 x 10 minut. Uszczelnij suwaki zgodnie z opisem w kroku 7.4.

10. Analiza Western blot

  1. Wyjmij tkankę płucną z zamrażarki i zważ ją. Następnie dodać 150 μl buforu do lizy RIPA zawierającego PMSF na 20 mg tkanki płucnej. Płuca myszy należy otrząsnąć z lodu przez 3-5 minut za pomocą ręcznego homogenizatora, delikatnie wstrząsać przez 2 godziny w temperaturze 4 °C, aby umożliwić odpowiednią lizę tkanki płucnej, odwirować w temperaturze 4 °C i 14 800 × g przez 15 minut i zebrać supernatant.
    UWAGA: Dodać 100 mM fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF) na kilka minut przed użyciem buforu do lizy RIPA. Końcowe stężenie PMSF wynosi 1 mM (np. 10 μL PMSF + 990 μL RIPA).
  2. Użyj zestawu do koncentracji białka BCA, aby określić stężenie białka w próbce, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Po oznaczeniu, używając najmniejszego stężenia lizatu białkowego jako bazy, rozcieńczyć tę samą partię lizatu białkowego RIPA do najmniejszego stężenia, aby uzyskać tę samą masę i objętość.
    UWAGA: Całkowita ilość obciążenia tkanki płucnej wynosi 30 μg.
  3. Dodać 40 μl 5x buforu ładującego do 160 μl lizatu białkowego i podgrzewać w temperaturze 100 °C przez 10 min.
  4. Przygotować 10% żel do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) w systemie elektroforezy western blotting, dodać bufor do elektroforezy SDS-PAGE, delikatnie wyciągnąć grzebień do elektroforezy i powoli i równomiernie dodawać 20 μl próbki białka na studzienkę. Włącz zasilanie i rozpocznij elektroforezę przy napięciu 80 V na 30 minut. Po dotarciu białek do dolnej warstwy żelu przełącz na 100 V i kontynuuj elektroforezę przez 60-70 min.
    UWAGA: Elektroforeza wymaga świeżego buforu do elektroforezy.
  5. Przenieś białka do membrany PVDF przez transfer na mokro. Wcześniej aktywuj membranę PVDF metanolem (5-30 s). Wyjmij płytkę żelową do elektroforezy, ostrożnie ją podważ, umieść żel separatora w mokrym buforze transferowym, wykonaj elektryczną kanapkę transferową i zmontuj mokry system przenoszenia. Napełnij zbiornik do elektroforezy buforem transferowym i przenieś pod ciśnieniem 400 mA przez 90 min.
    UWAGA: Bufor transferowy jest wcześniej schładzany, aby uniknąć skutków wysokich temperatur podczas transferu na mokro.
  6. Przemyć membranę PVDF solą fizjologiczną buforowaną Tris z 0,5% Tween-20 (TBST) przez 3 x 5 min. Zablokować membranę PVDF 5% odtłuszczonym mlekiem rozcieńczonym w TBST i inkubować na wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez 60 min; następnie myć TBST przez 2 min. Po przemyciu inkubować błonę przez noc w temperaturze 4 °C z pierwotnym przeciwciałem wimentyną (1:5 000) i GAPDH (1:10 000) rozcieńczonymi w 5% BSA.
  7. Umieść membranę w temperaturze pokojowej na 30 minut i myj TBST przez 5 x 5 min. Po umyciu inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym (1:10 000) rozcieńczonym w 5% odtłuszczonym mleku przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Umieścić membranę białkiem do góry, upuść przygotowany roztwór roboczy ECL, inkubować przez 1-2 minuty i obserwować wyniki za pomocą markera żelowego. Użyj wartości skali szarości zmierzonych przez oprogramowanie w obrazie żelowym, aby ocenić poziomy ekspresji białek.
    UWAGA: W tym przypadku GAPDH służył jako wewnętrzne odniesienie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W celu zbadania potencjalnej roli nikotyny w progresji krzemicy u myszy opracowano model mysi do badania ekspozycji na nikotynę w połączeniu z krzemionką. Rysunek 1 przedstawia procedurę eksperymentalną z wykorzystaniem modelu mysiego z podwójną ekspozycją, łączącego wstrzyknięcie nikotyny z donasalną instylacją zawiesiny krzemionki. Zmiany patologiczne u myszy w każdej grupie obserwowano przy użyciu barwienia HE. Myszy poddane ekspozycji na nikotynę w połączeniu z krzemionką wykazały znaczn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Model zwierzęcy z podwójną ekspozycją jest niezbędny do zbadania roli i potencjalnych mechanizmów jednoczesnego narażenia na nikotynę i krystaliczny dwutlenek krzemu. Model ten został osiągnięty w tej pracy poprzez podskórne wstrzyknięcie nikotyny i kroplówkę krzemionki do nosa. Aby zapewnić udane wstrzyknięcie nikotyny, operator musi zapoznać się z chwytaniem myszy, ponieważ chwytanie skóry z tyłu szyi może być dla nich bolesne. Dlatego ważne jest, aby myszy stopniowo przystosowywały się do chwytania. Ponadto krytycznym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy deklarują, że nie mają konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez University Synergy Innovation Program of Anhui Province (GXXT-2021-077) oraz Anhui University of Science and Technology Graduate Innovation Fund (2021CX2120).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10% neutralny formalin utrwalaczNanchang Yulu Experimental Equipment Co.
alkoholowy środek dezynfekującyXintai Kanyuan Disinfection Products Co.
BSA, frakcja VBeyotime BiotechnologyST023-200g
CD206 Przeciwciało monoklonalneProteintech60143-1-IG
Roztwór do odzyskiwania antygenu cytrynianubiosharp nauki przyrodniczeBL619A
dimetylobenzenTechnologia chemiczna Azji Zachodniej (Shandong) Co
Ulepszony zestawdo oznaczania białek BCABeyotime BiotechnologyP0009
GAPDH Przeciwciało poliklonalneProteintech10494-1-AP
Hematoksylina i eozyna (H& E)Beyotime BiotechnologyC0105S
Substrat HRPMillipore CorporationP90720
Affinipure Goat Conjugated HRP Anti-Mouse IgG (H + L)ProteintechSA00001-1
HRP sprzężone Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)ProteintechSA00001-2
ImmPACT[R] DAB EqV Peroksydaza Peroksydazy (HRP) Wektor substratuLaboratoriaSK-4103-100
Zestaw do barwienia trichromowego MassonaSolarbioG1340
MetanolMacklin
NicotineSigmaN-3876
fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) BiosharpBL601A
Sól fizjologiczna Pierwszy Szpital Ludowy w mieście
PMSFBeyotime BiotechnologicznyST505
Mikroskop fluorescencji dodatniejOlympusCorporationBX53 + DP74
Wstępnie barwione białko barwione Masa cząsteczkowa  Marker lub wstępnie wybarwiona drabina białkowaBeyotime BiotechnologyP0071
Membrany PVDFMillipore3010040001
RIPA Bufor do lizyBeyotime BiotechnologyP0013B
SDS-PAGE zestaw do przygotowania żeluBeyotime BiotechnologyP0012A
Dwutlenek krzemuSigma#BCBV6865
TGF- βBiossbs-0086R
Przeciwciało poliklonalne wimentynyProteintech10366-1-AP
strong>Nazwa materiału / sprzętu< / strong>Numerkatalogowy firmy Probówka
0,5 mlBiosharpBS-05-M
Oscylacyjna termostatyczna kąpiel metalowaMaszyna
Precyzyjny (Changzhou) sprzęt medyczny Co.PBM-A
Krajalnica do parafinyJinhua Kratai Instruments Co.
PipetyEppendorf
Mikroskop światła spolaryzowanegoOlympusBX51
Waga precyzyjnaAcculabALC-110.4
RODI IOT inteligentny wielofunkcyjny system oczyszczania wodyRSJRODI-220BN
Scilogex SK-D1807-E Wytrząsarka 3DScilogex
Mała maszyna do znieczulenia zwierzątAnhui Yaokun Biotech Co., Ltd.ZL-04A Uniwersalne końcówki
do pipetKIRGENKG1011
Uniwersalne końcówki do pipetKIRGENKG1212
Uniwersalne końcówki do pipetKIRGENKG1313
Vortex  Mieszalniki VWR
strong>Nazwa materiału
Adobe Illustrator
ImageJ
Photoshop
Prism7.0
sól Huainan< do zatapiania parafiny Abson <

Bibliografia

  1. Wonnacott, S. Presynaptic nicotinic ACh receptors. Trends in Neurosciences. 20 (2), 92-98 (1997).
  2. Berry, K., et al. Association of electronic cigarette use with subsequent initiation of tobacco cigarettes in US youths. JAMA Network Open. 2 (2), 187794(2019).
  3. Masso-Silva, J., et al. Chronic e-cigarette aerosol inhalation alters the immune state of the lungs and increases ACE2 expression, raising concern for altered response and susceptibility to SARS-CoV-2. Frontiers in Physiology. 12, 649604(2021).
  4. Cisneros-Lira, J., Gaxiola, M., Ramos, C., Selman, M., Pardo, A. Cigarette smoke exposure potentiates bleomycin-induced lung fibrosis in guinea pigs. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 285 (4), 949-956 (2003).
  5. Sager, T., et al. Tobacco smoke exposure exacerbated crystalline silica-induced lung toxicity in rats. Toxicological Sciences. 178 (2), 375-390 (2020).
  6. Zhou, L., et al. Cigarette smoking aggravates bleomycin-induced experimental pulmonary fibrosis. Toxicology Letters. 303, 1-8 (2019).
  7. Liu, J., et al. Behavior and hippocampal Epac signaling to nicotine CPP in mice. Translational Neuroscience. 10, 254-259 (2019).
  8. Cao, J., et al. RNA deep sequencing analysis reveals that nicotine restores impaired gene expression by viral proteins in the brains of HIV-1 transgenic rats. PLoS One. 8 (7), 68517(2013).
  9. Zhao, Y., et al. Silica particles disorganize the polarization of pulmonary macrophages in mice. Ecotoxicology and Environmental Safety. 193, 110364(2020).
  10. Tang, Q., et al. Pirfenidone ameliorates pulmonary inflammation and fibrosis in a rat silicosis model by inhibiting macrophage polarization and JAK2/STAT3 signaling pathways. Ecotoxicology and Environmental Safety. 244, 114066(2022).
  11. Hinz, B., et al. The myofibroblast: One function, multiple origins. The American Journal of Pathology. 170 (6), 1807-1816 (2007).
  12. Liu, Y., et al. Long non-coding RNA-ATB promotes EMT during silica-induced pulmonary fibrosis by competitively binding miR-200c. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (2), 420-431 (2018).
  13. Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
  14. Chellian, R., et al. Rodent models for nicotine withdrawal. Journal of Psychopharmacology. 35 (10), 1169-1187 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekspozycja na nikotynmysi model krzemionkowyw knienie p ucw knienie p ucnewstrzykni cie podsk rneekspozycja na krzemionk drog donosowbarwienie immunohistochemiczneodk adanie kolagenuTGF Beta One
Stosowanie nikotyny w mysim modelu narażonym na działanie krzemionki w celu promowania przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego płuc
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.