Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wydłużenie żywotności neutrofili za pomocą CLON-G i testu spontanicznej śmierci in vitro

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65132

⸱

12 maja 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Experimental Hematology, National Clinical Research Center for Blood Diseases, Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, Institute of Hematology & Blood Diseases Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2Tianjin Institutes of Health Science, 3Sichuan Provincial People's Hospital, University of Electronic Science and Technology of China, 4Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, Tianjin Medical University, 5Joint Program in Transfusion Medicine, Department of Pathology, Harvard Medical School; Division of Blood Bank, Department of Laboratory Medicine, The Stem Cell Program, Boston Children's Hospital, Dana-Farber /Harvard Cancer Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół szczegółowo opisuje przygotowanie CLON-G do przedłużenia żywotności neutrofili do ponad 5 dni i zapewnia wiarygodną procedurę oceny śmierci neutrofili za pomocą cytometrii przepływowej i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej.

Streszczenie

Średnia długość życia neutrofili jest krótsza niż 24 godziny, co ogranicza podstawowe badania nad neutrofilami i zastosowanie badań nad neutrofilami. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że wiele szlaków może pośredniczyć w spontanicznej śmierci neutrofili. Opracowano koktajl poprzez jednoczesne ukierunkowanie na te szlaki, kaspazy-lizosomalne hamowanie przenikania błony-utleniacza-nekroptozy oraz czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (CLON-G), który wydłużył żywotność neutrofili do ponad 5 dni bez znaczącego pogorszenia funkcji neutrofili. Równolegle opracowano również wiarygodny i stabilny protokół oceny i oceny śmierci neutrofili. W tej pracy wykazaliśmy, że CLON-G może przedłużyć żywotność neutrofili in vitro do ponad 5 dni, a także wykazujemy wydłużenie życia neutrofili za pomocą FACS i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. W niniejszym raporcie przedstawiono procedury przygotowania CLON-G i przedstawiono test spontanicznego zgonu neutrofili in vitro, który może być wykorzystany do badania neutrofili, a następnie do badania śmierci neutrofili, zapewniając w ten sposób wiarygodne źródło informacji dla społeczności neutrofili.

Wprowadzenie

Neutrofile są znane z tego, że zawierają arsenał obfitych granulek cytoplazmatycznych, oksydazy fosforanu dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADPH), enzymów przeciwdrobnoustrojowych i różnych organelli, które bronią przed inwazją mikrobów; dodatkowo, są bardzo ruchliwe i są pierwszymi komórkami rekrutowanymi do miejsca zapalenia, co oznacza, że neutrofile są pierwszą linią obrony wrodzonego układu odpornościowego1, 2. Terapia transfuzją granulocytów stała się zatem obiecującą metodą leczenia klinicznego zakażeń związanych z neutropenią w celu przejściowego zwiększenia odporności na neutrofile3,4,5. Ostatnie odkrycia wyraźnie pokazały, że neutrofile funkcjonują również jako wielopłaszczyznowe efektory w wielu scenariuszach fizjopatologicznych6. Średnia długość życia neutrofili wynosi mniej niż 24 godziny, a zatem podstawowe badania neutrofili i zastosowanie badań neutrofili są niezwykle trudne ze względu na ograniczenia związane ze stabilnymi manipulacjami genetycznymi i długoterminowym przechowywaniem7,8,9,10,11. Istnieją pewne linie komórkowe, które mogą częściowo wykazywać niektóre funkcje neutrofili, takie jak HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste12. Te linie komórkowe mogą osiągnąć skuteczną edycję genów i krioprezerwację; Jednak nadal różnią się one znacznie od pierwotnych neutrofili i dlatego nie mogą wiernie podsumować funkcji neutrofili13. Tak więc większość badań w tej dziedzinie nadal opiera się na świeżo wyizolowanych pierwotnych neutrofilach. Dziedzina ta nadal opiera się na generowaniu kosztownych i czasochłonnych myszy z warunkowym nokautem w celu zbadania określonych funkcji genów w neutrofilach, ale obecnie nie istnieją żadne modele ludzkie.

Po włożeniu wysiłku w zbadanie heterogenicznych procesów związanych ze śmiercią neutrofili i wielu szlaków, które regulują te procesy14,15, niedawno zgłoszono nową terapię o nazwie CLON-G (kaspazy-lizosomalne przenikanie błony-utleniacz-necroptoza hamowanie plus czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów)16. CLON-G składa się z Q-VD-oph (chinolilo-valyl-O-methyllaspartyl-[-2,6-difluorofenoksy]-ketonu metylowego), Hsp70 (białko szoku cieplnego 70), DFO (deferoksamina), NAC (N-acetylocysteina), Nec-1s (nekrostyna-1) i G-CSF (czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów). Spontaniczna śmierć neutrofili odbywa się za pośrednictwem wielu szlaków, w tym apoptozy, nekroptozy i piroptozy. Q-VD-oph hamuje apoptozę neutrofili jako inhibitor pan-kaspazy poprzez celowanie w kaspazę 1, kaspazę 3, kaspazę 8 i kaspazę 917. Nekroptoza neutrofili jest zależna od szlaku sygnałowego obejmującego kinazę białkową-1 oddziałującą z receptorem (RIPK1) i białko podobne do domeny kinazy o mieszanej linii (MLKL)18. Jako inhibitor RIPK1, Nec-1 hamują nekroptozę neutrofili. Hsp70 i DFO mogą hamować przepuszczalność błony lizosomalnej (LMP), co może indukować apoptozę neutrofili19 i pyroptozę20. Reaktywne formy tlenu (ROS) odgrywają istotną rolę w śmierci neutrofili, pośrednicząc w LMP19 i apoptozie21 oraz hamując sygnały przeżycia22. Jako przeciwutleniacz, który może zmniejszać akumulację ROS, NAC opóźnia śmierć neutrofili. Jako czynnik wzrostu, G-CSF aktywuje sygnały przeżycia neutrofili i hamuje apoptozę wywołaną kalpainą23,24. Dzięki jednoczesnemu celowaniu w wiele szlaków spontanicznej śmierci neutrofili, długość życia neutrofili może zostać skutecznie wydłużona do ponad 5 dni bez uszczerbku dla ich funkcji. Leczenie CLON-G rozszerza możliwości zachowania, transportu i manipulacji genami neutrofili, co może przyspieszyć badania w społeczności neutrofili. Tymczasem, w oparciu o wiedzę na temat śmierci neutrofili, obecnie zatwierdzone protokoły oznaczania śmierci komórek mogą powodować nieoczekiwane uszkodzenia neutrofili14, więc protokoły te zostały dopracowane, aby były bardziej odpowiednie do badań neutrofili. Niniejszy raport zawiera szczegółowe protokoły hodowli neutrofili za pomocą CLON-G oraz test śmierci komórkowej in vitro neutrofili myszy przy użyciu cytometrii przepływowej i obrazowania fluorescencyjnego. CLON-G jest skuteczny zarówno w przypadku neutrofili myszy, jak i ludzi; Jednak próbki myszy są tutaj pokazane, aby uprościć ten protokół. Stężenie NAC wynosi 1 mM dla neutrofili myszy i 10 μM dla neutrofili ludzkich. Hsp70 jest specyficzny dla gatunku i dlatego powinien być stosowany w zależności od źródła neutrofili. W przypadku tego protokołu nie ma znaczenia, czy neutrofile są izolowane z krwi obwodowej lub szpiku kostnego i w jaki sposób są izolowane.

Na potrzeby obecnego badania, neutrofile zostały wyizolowane ze szpiku kostnego myszy, aby uzyskać wystarczającą ilość neutrofili do eksperymentów, ponieważ około 1 x 10 7-1,5 x 107 neutrofili można uzyskać ze szpiku kostnego, podczas gdy tylko 1 x 106 neutrofili można wyizolować z krwi obwodowej pojedynczej 8-12 tygodniowej myszy C57BL/6 (dowolnej płci). Wirowanie gradientowe przeprowadzono w celu uniknięcia możliwych uszkodzeń i aktywacji w wyniku mechanicznej stymulacji sortowania FACS lub sortowania MACS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami w Szpitalu Dziecięcym w Bostonie oraz Państwowym Kluczowym Laboratorium Hematologii Eksperymentalnej (SKLEH) zatwierdziły i monitorowały wszystkie procedury. Rysunek 1 przedstawia schemat hodowli neutrofili za pomocą CLON-G i testu zgonu in vitro.

1. Wydłużenie żywotności neutrofili za pomocą CLON-G

UWAGA: Wszystkie wymienione operacje i materiały muszą być sterylne. Upewnij się, że wszystkie roztwory są dobrze wymieszane i równomiernie rozprowadzone.

  1. Konserwacja komponentów CLON-G
    1. Rozpuścić 50 mg Q-VD-oph (patrz tabela materiałów) do końcowego stężenia 100 mM przez dodanie 973,7 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) i pipetować ciecz do momentu, aż mieszanina stanie się klarowna. Podwielokrotność 50 μl na probówkę i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: DMSO jest szkodliwą cieczą chemiczną. Noś fartuch laboratoryjny, okulary i maskę, aby uniknąć kontaktu ze skórą, kontaktu z oczami i wdychania.
    2. Rozmrozić Hsp70 (patrz Tabela Materiałów) w temperaturze 4 °C i odwirować zawartość fiolki. Podaniec 1 μl Hsp70 na probówkę na lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Hsp70 jest białkiem; Bardzo zimne przechowywanie jest konieczne, aby utrzymać go stabilnie. Unikaj cyklu zamrażania i rozmrażania.
    3. Rozpuścić 1 mg DFO (patrz tabela materiałów) w 7,61 ml RPMI 1640 w celu uzyskania zapasu 200 μM. Podwielokrotność 500 μl na probówkę i zachować w temperaturze -20 °C.
    4. Rozpuścić 0,1 g NAC (patrz tabela materiałów) w 2,5 ml RPMI 1640 w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml i dostosować pH do 7-7,4 za pomocą NaOH. Dodaj RPMI 1640 do końcowej objętości 3,06 ml, aby uzyskać zapas NAC o pojemności 200 mM. Przefiltruj go za pomocą jednostki filtrującej 0,2 μm. Porcja 500 μl na probówkę i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Rozpuszczanie NAC w tak wysokim stężeniu nie jest łatwe, a wirowanie może pomóc w jego rozpuszczeniu. Czerwień fenolowa w RPMI 1640 jest doskonałym wskaźnikiem pH; kiedy NAC jest po prostu rozpuszczony, kolor jest żółtawy; Dostosuj go, aż stanie się różowawy. Roztwory podstawowe NAC są stabilne przez okres do 1 miesiąca w temperaturze -20 °C.
    5. Rozpuścić 10 mg Nec-1s (patrz Tabela Materiałów) w 20 mM za pomocą 1,8 ml DMSO i pipetować mieszaninę, aż stanie się klarowna. Porcjować 50 μl na probówkę i przechowywać w temperaturze -20 °C. Chronić przed światłem.
    6. Rozpuścić 250 μg G-CSF (patrz tabela materiałów) do 200 μg/ml w 1.25 ml RPMI 1640. Podwielokrotność 50 μl na probówkę i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotowanie 2x pożywki hodowlanej CLON-G
    1. Przygotuj podłoże podstawowe. Dodaj 39,5 ml RPMI 1640, 10 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 0,5 ml pen-strep (antybiotyki) do probówki o pojemności 50 ml, aby uzyskać RPMI 1640 z 20% FBS i 1% PS jako pożywką zasadową.
      UWAGA: To wysokie stężenie FBS jest wykorzystywane do zapewnienia przedłużonej hodowli neutrofili, która może być większa niż 5 dni. Jeśli czas hodowli wynosi 1-2 dni, wystarczy 10%-15% FBS.
    2. Rozmrozić wszystkie roztwory podstawowe składników CLON-G na lodzie.
    3. Rozcieńczyć 1 μl Hsp70 do 20 μM, dodając 606 μl podłoża zasadowego. Rozcieńczyć 1 μl z 200 μg/mL G-CSF do 20 μg/ml przez dodanie 9 μl pożywki zasadowej.
    4. Dodać 976 μl podłoża zasadowego do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodać 1 μL Q-VD-oph (100 mM), 10 μL DFO (200 μM), 1 μL Hsp70 (20 μM), 10 μL NAC (200 mM), 1 μL Nec-1s (20 mM) i 1 μL G-CSF (20 μg / ml), aby uzyskać 1 ml 2x pożywki CLON-G.
      UWAGA: Pożywkę 2x CLON-G należy zużyć natychmiast po przygotowaniu. 2x CLON-G można przechowywać tymczasowo w temperaturze 4 °C. Resztki 20 μM Hsp70 należy wyrzucić.
  3. Posiew neutrofili
    1. Wyizoluj mysie neutrofile przez wirowanie gradientowe zgodnie z poprzednim raportem25. Zawiesić wyizolowane mysie neutrofile w pożywce podstawowej (1 milion komórek/100 μl).
      UWAGA: Unikaj aktywacji neutrofili poprzez delikatne obchodzenie się z nimi. Unikaj pienienia się podczas całego procesu.
    2. Dodać 500 μl 2x pożywki CLON-G, 400 μl pożywki zasadowej i 100 μl zawiesiny komórkowej do 24-dołkowych płytek do hodowli nietkankowych (patrz tabela materiałów) i delikatnie pipetować trzy do czterech razy.
      UWAGA: Wysokie stężenia składników w pożywce 2x CLON-G mogą uszkodzić neutrofile; Unikaj dodawania ich do siebie bez podłoża podstawowego. Płytka hodowlana bez hodowli tkankowej jest konieczna, aby uniknąć adhezji neutrofili.
    3. Umieścić płytkę hodowlaną w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5 % CO2 bez zakłóceń.
      UWAGA: Nie ma potrzeby wymiany pożywki komórkowej w ciągu 7 dni. Końcowe stężenia kompozycji CLON-G to 50 μM Q-VD-Oph, 1 μM DFO, 10 pM Hsp70, 1 mM NAC, 10 μM Nec-1 s i 10 ng/mL G-CSF.
    4. Wybarwić hodowane neutrofile barwnikiem złożonym Wrighta Giemsy (patrz Tabela Materiałów) i przeanalizować za pomocą mikroskopu świetlnego (Rysunek 2A-D). Alternatywnie, wybarwić przeciwciałami APC-CD11b i PE-Cy7-Ly6G i przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 2E-I), jak opisano wcześniej26.

2. Test in vitro spontanicznej śmierci neutrofili

  1. Analiza cytometrii przepływowej
    1. Hodowla izolowała neutrofile o gęstości 1 miliona komórek/ml w pożywce podstawowej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . 24-dołkowa płytka hodowlana nie jest hodowana tkankowo. Dodaj 1 ml pożywki komórkowej na dołek.
    2. Rozpuścić 1 g CaCl2 w 45 ml soli fizjologicznej, aby uzyskać 200 mM CaCl2. Przefiltruj go za pomocą jednostki filtrującej 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Przygotuj mieszankę barwiącą. Dodać 7 μl soli fizjologicznej na próbkę do probówki o pojemności 1,5 ml i dodać 0,4 mg/ml FITC-Annexin-V, 0,5 mg/ml jodku propydu (PI) i 200 mM roztworu CaCl2 w ilości 1 μl każdy na próbkę. Dobrze wymieszaj. Roztwór należy zużyć natychmiast po przygotowaniu.
    4. Delikatnie odpipetować pożywkę komórkową pięć do siedmiu razy, aby dobrze wymieszać, a następnie przenieść 100 μl do probówki do cytometrii przepływowej w żądanych punktach czasowych.
      UWAGA: Unikaj pienienia się podczas całego procesu.
    5. Zliczaj kulki do liczenia wirów (patrz tabela materiałów), aby dobrze je wymieszać. Pobrać pipetę z 10 μl dobrze wymieszanych kulek liczących do tej samej probówki do cytometrii przepływowej, jak w kroku 2.1.4.
    6. Dodać 10 μl przygotowanej mieszaniny barwiącej (krok 2.1.3) do probówki do cytometrii przepływowej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut z dala od światła.
    7. Dodaj 100 μl soli fizjologicznej do probówki i dobrze wymieszaj, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie kulek i komórek do liczenia.
    8. Wykonaj analizę cytometrii przepływowej pożywki komórkowej. Zbieraj komórki z niską szybkością z ~400 zdarzeniami/s. Bramkować ogniwa APC-PE-Cy7- do FSC-A i SSC-A oraz bramkować nienaruszone komórki z pośrednimi pozycjami FSC-A i SSC-A do FITC-Annexin-V i PE-PI; populacja Aneksyny-V−PI− jest klasyfikowana jako zdrowe komórki.
      UWAGA: Poniższe równania określają całkowitą liczbę zdrowych komórek w próbce i żywotność neutrofili:
      Całkowita liczba zdrowych komórek w próbce27 = (1,000/liczba koralików do liczenia) × liczba populacji Annexin-V−PI− × 10
      Żywotność neutrofili = całkowita liczba zdrowych komórek we wskazanym czasie/całkowita liczba zdrowych komórek w czasie zero
  2. Test obrazu fluorescencyjnego
    1. Hodowla izolowanych neutrofili o gęstości 1 miliona komórek/ml w pożywce podstawowej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na płytce konfokalnej z 2 ml pożywki komórkowej na płytkę.
      UWAGA: Konfokalny mikroskop fluorescencyjny ma najlepszą jakość obrazu, ale każdy mikroskop fluorescencyjny z kanałami 488/561/DIC jest wystarczający do wsparcia tego eksperymentu.
    2. Delikatnie wyjmij płytkę we wskazanym momencie. Równomiernie dodać do płytki po 10 μl 0,4 mg/ml FITC-Annexin-V, 0,5 mg/ml PI i 200 mM CaCl2. Bejcować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
      UWAGA: Unikaj potrząsania podczas całego procesu. Równomiernie i delikatnie dodawać środki barwiące.
    3. Rejestruj obrazy fluorescencji w kanałach 488 (annexin-V)/561 (PI)/DIC za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego z soczewką obiektywową 20x (patrz tabela materiałów). Ustaw czas ekspozycji kanału 488 na 500 ms, kanału 561 na 200 ms, a kanału DIC na 100 ms. Wybierz 5-10 losowych obszarów dla każdej płyty. Typy komórek są zdefiniowane w naszym wcześniej opublikowanym raporcie14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Morfologia po barwieniu metodą Wrighta-Giemsy (Rycina 2A-D) oraz fenotypy FACS (Rycina 2E-J) neutrofili traktowanych CLON-G nie uległy zmianie. Żywotność neutrofili traktowanych CLON-G po 24 h wynosiła około 90%+ na podstawie analizy cytometrii przepływowej (Rycina 3) i testów obrazowania fluorescencyjnego (Rycina 4). Niższa żywotność m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Neutrofile odgrywają istotną rolę w odporności wrodzonej i nabytej, a ich homeostaza jest ściśle regulowana. Neutrofile są najliczniejszymi leukocytami w ludzkiej krwi obwodowej i mają solidny i szybki obrót. Zdrowa osoba dorosła może uwalniać 1 x 109 neutrofili/kg dziennie ze szpiku kostnego28. Śmierć neutrofili stała się więc jedną z zagadkowych zagadek w tej dziedzinie i wiele wysiłku włożono w ich lepsze zrozumienie. Udowodniono, że kaspaza 29,30,31,32, LMP 3...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że badania zostały przeprowadzone przy braku konfliktu interesów.

Podziękowania

Ten projekt był wspierany przez Haihe Laboratory of Cell Ecosystem Innovation Fund (22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), Fundusz Innowacji Chińskiej Akademii Nauk Medycznych (CAMS) dla Nauk Medycznych (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), Specjalny Fundusz Badawczy dla Uniwersytetów Centralnych, Peking Union Medical College (3332022062) oraz Program Wsparcia Nauki i Technologii Prowincji Syczuan (NO. 2021YJ0480).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 &mikro; m filtr strzykawkowyPall Corporation4612Filtrat przygotowany Składniki CLON-G.
Mikroprobówka wirówkowa 1,5 mlLABSELECTMCT-001-150Laboratoryjny materiał eksploatacyjny.
Probówki wirówkowe 15 mlLABSELECTCT-002-15Materiał eksploatacyjny laboratoryjny.
24-dołkowa płytka do hodowli komórkowejFalcon351147Płytka do hodowli neutrofili.
Probówki wirówkowe 50 mlLABSELECTCT-002-50Materiał eksploatacyjny laboratoryjny.
BD LSRIIBDPrzyrząd do analizy śmierci neutrofili za pomocą cytometrii przepływowej.
Chlorek wapnia (CaCl2)Sigma AldrichC4901Pomocnik wiązania Aneksyny-V z fosfatydyloseryną.
Mikroskop konfokalnyPerkinelmerUltraVIEW VOXInstrument do fluorescencyjnej analizy śmierci neutrofili.
Płytka konfokalnaNEST801001-20mmLaboratoryjny materiał eksploatacyjny do badania obrazu fluorescencyjnego.
Liczenie kulekThermo FisherC36950Kwantyfikacja w analizie cytometrii przepływowej śmierci neutrofili.
DFOSigma AldrichD9533Element CLON-G. Inhibitor LMP.
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma AldrichD2650Rozpuszczalnik do Q-VD-oph i Nec-1s.
Surowica bydlęca płoduGibco10099141CSkładnik pożywki podstawowej do hodowli neutrofili. Zaopatrzenie w składniki odżywcze.
FITC-Annexin-VBD51-65874XAnnexin-V może wiązać się z fosfatydyloseryną starzejących się komórek. To jest na kanale FITC.
HSP70Abcamab113187Składnik CLON-G. Inhibitor LMP.
NACSigma AldrichA9165Komponent CLON-G. Antyoksydant.
Nec-1sEMD Millipore852391-15-2Składnik CLON-G. Inhibitor nekroptozy.
Roztwór penicyliny-streptomycyny (PS)Gibco15070063Składnik pożywki podstawowej do hodowli neutrofili. Antybiotyki chroniące komórki przed komutacją bakterii.
Jodek propidyny (PI)BioLegend421301Do oznaczania śmierci neutrofili. Mała cząsteczka fluorescencyjna, która wiąże się z DNA  ale nie może biernie przenikać do komórek, które mają nienaruszoną błonę plazmatyczną.
Q-VD-ophSelleck chemS7311Składnik CLON-G. Inhibitor pan-kaspazy.
Rekombinowany ludzki czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów do wstrzykiwań (komórka CHO)(G-CSF)Chugai Pharma ChinaGRANOCYTESkładnik CLON-G.  Promuj przeżycie neutrofili poprzez szlak Akt.
Rurki z polistyrenu okrągłodennegoFalcon100-0102Laboratoryjny materiał eksploatacyjny do analizy cytometrii przepływowej.
RPMI1640GibcoC11875500BTSkładnik podstawowej pożywki do hodowli neutrofili.
Sól fizjologicznaLEAGENER00641Roztwór do analizy śmierci neutrofili za pomocą cytometrii przepływowej.
Wodorotlenek sodu (NaOH)FENG CHUAN13-011-00029Regulacja pH dla NAC.
Roztwór barwienia Wright-GiemsaSolarbioG1020Barwienie cytospinowe neutrofili
.

Bibliografia

  1. Segal, A. W. How neutrophils kill microbes. Annual Review of Immunology. 23, 197-223 (2005).
  2. Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Frontiers in Physiology. 9, 113(2018).
  3. Chung, S., Armstrong-Scott, O., Charlewood, R. Therapeutic granulocyte infusion for patients with severe neutropaenia and neutrophilic dysfunction: New Zealand experience. Vox Sanguinis. 117 (2), 220-226 (2021).
  4. Zhou, B., et al. Clinical outcome of granulocyte transfusion therapy for the treatment of refractory infection in neutropenic patients with hematological diseases. Annals of Hematology. 97 (11), 2061-2070 (2018).
  5. Covas, D. T., et al. Granulocyte transfusion combined with granulocyte colony stimulating factor in severe infection patients with severe aplastic anemia: A single center experience from China. PLoS One. 9 (2), e88148(2014).
  6. Tecchio, C., Cassatella, M. A. Uncovering the multifaceted roles played by neutrophils in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 905-918 (2021).
  7. Lahoz-Beneytez, J., et al. Human neutrophil kinetics: Modeling of stable isotope labeling data supports short blood neutrophil half-lives. Blood. 127 (26), 3431-3438 (2016).
  8. Pillay, J., et al. In vivo labeling with 2H2O reveals a human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 116 (4), 625-627 (2010).
  9. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
  10. Tofts, P. S., Chevassut, T., Cutajar, M., Dowell, N. G., Peters, A. M. Doubts concerning the recently reported human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 117 (22), 6050-6052 (2011).
  11. McDonald, J. U., et al. In vivo functional analysis and genetic modification of in vitro-derived mouse neutrophils. FASEB Journal. 25 (6), 1972-1982 (2011).
  12. Pedruzzi, E., Fay, M., Elbim, C., Gaudry, M., Gougerot-Pocidalo, M. -A. Differentiation of PLB-985 myeloid cells into mature neutrophils, shown by degranulation of terminally differentiated compartments in response to N-formyl peptide and priming of superoxide anion production by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. British Journal of Haematology. 117 (3), 719-726 (2002).
  13. Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: Cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
  14. Teng, Y., Luo, H. R., Kambara, H. Heterogeneity of neutrophil spontaneous death. American Journal of Hematology. 92 (8), E156-E159 (2017).
  15. Luo, H. R., Loison, F. Constitutive neutrophil apoptosis: Mechanisms and regulation. American Journal of Hematology. 83 (4), 288-295 (2008).
  16. Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
  17. Caserta, T. M. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis. 8, 345-352 (2003).
  18. Wang, X., Yousefi, S., Simon, H. U. Necroptosis and neutrophil-associated disorders. Cell Death and Disorders. 9 (2), 111(2018).
  19. Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
  20. Kambara, H., et al. Gasdermin D exerts anti-inflammatory effects by promoting neutrophil death. Cell Reports. 22 (11), 2924-2936 (2018).
  21. Zhu, D., et al. Deactivation of phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate/Akt signaling mediates neutrophil spontaneous death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (40), 14836-14841 (2006).
  22. Xu, Y., Loison, F., Luo, H. R. Neutrophil spontaneous death is mediated by down-regulation of autocrine signaling through GPCR, PI3Kgamma, ROS, and actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 2950-2955 (2010).
  23. van Raam, B. J., Drewniak, A., Groenewold, V., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor delays neutrophil apoptosis by inhibition of calpains upstream of caspase-3. Blood. 112 (5), 2046-2054 (2008).
  24. Klein, J. B., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor delays neutrophil constitutive apoptosis through phosphoinositide 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase pathways. Journal of Immunology. 164 (8), 4286-4291 (2000).
  25. Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
  26. Xie, X., et al. Single-cell transcriptome profiling reveals neutrophil heterogeneity in homeostasis and infection. Nature Immunology. 21 (9), 1119-1133 (2020).
  27. Cosimo, E., et al. Inhibition of NF-kappaB-mediated signaling by the cyclin-dependent kinase inhibitor CR8 overcomes prosurvival stimuli to induce apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells. Clinical Cancer Research. 19 (9), 2393-2405 (2013).
  28. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
  29. Porter, A. G., Jänicke, R. U. Emerging roles of caspase-3 in apoptosis. Cell Death and Differentiation. 6 (2), 99-104 (1999).
  30. Scheel-Toellner, D., et al. Clustering of death receptors in lipid rafts initiates neutrophil spontaneous apoptosis. Biochemical Society Transactions. 32, 679-681 (2004).
  31. Geering, B., Simon, H. U. Peculiarities of cell death mechanisms in neutrophils. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1457-1469 (2011).
  32. Gabelloni, M. L., Trevani, A. S., Sabatté, J., Geffner, J. Mechanisms regulating neutrophil survival and cell death. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 423-437 (2013).
  33. Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
  34. Cho, Y. S., et al. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).
  35. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
  36. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
  37. Zhang, D. -W., et al. RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis. Science. 325 (5938), 332-336 (2009).
  38. Wang, X., He, Z., Liu, H., Yousefi, S., Simon, H. -U. Neutrophil necroptosis is triggered by ligation of adhesion molecules following GM-CSF priming. Journal of Immunology. 197 (10), 4090-4100 (2016).
  39. Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837(2021).
  40. George, B., Bhattacharya, S. Infections in hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) patients. Contemporary Bone Marrow Transplantation. Chandy, M., Radhakrishnan, V. S., Sukumaran, R. , Springer. Cham, Switzerland. (2020).
  41. Lucena, C. M., et al. Pulmonary complications in hematopoietic SCT: A prospective study. Bone Marrow Transplant. 49 (10), 1293-1299 (2014).
  42. Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: A global perspective. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (10), 1143-1238 (2009).
  43. Wingard, J. R., Hiemenz, J. W., Jantz, M. A. How I manage pulmonary nodular lesions and nodular infiltrates in patients with hematologic malignancies or undergoing hematopoietic cell transplantation. Blood. 120 (9), 1791-1800 (2012).
  44. Wingard, J. R., Hsu, J., Hiemenz, J. W. Hematopoietic stem cell transplantation: An overview of infection risks and epidemiology. Infectious Disease Clinics of North America. 24 (2), 257-272 (2010).
  45. Netelenbos, T., et al. The burden of invasive infections in neutropenic patients: incidence, outcomes, and use of granulocyte transfusions. Transfusion. 59 (1), 160-168 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

leczenie CLON-Gzachowanie neutrofilicytometria przepływowamikroskopia konfokalnahodowla neutrofiliżywotność komórekczynnik stymulujący kolonie granulocytówbarwienie aneksyną V
Wydłużenie żywotności neutrofili za pomocą CLON-G i testu spontanicznej śmierci in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.