Artykuł metodologiczny

Komórkowa platforma impedancji elektrycznej do oceny inhibitorów wirusa Zika w czasie rzeczywistym

DOI:

10.3791/65149

⸱

24 marca 2023

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology and Transplantation, Rega Institute for Medical Research, Laboratory of Virology and Chemotherapy, KU Leuven

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj pokazujemy użycie komórkowej impedancji elektrycznej (CEI) jako bardzo łatwej i prostej metody badania infekcji wirusem Zika i jego replikacji w ludzkich komórkach w czasie rzeczywistym. Ponadto test CEI jest przydatny do oceny związków przeciwwirusowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologia impedancji elektrycznej (CEI) opartej na komórkach mierzy zmiany impedancji spowodowane przez rosnącą lub manipulowaną monowarstwę przylegającej komórki na dołkach z płytkami hodowlanymi, w których znajdują się elektrody. Technologia ta może być wykorzystywana do monitorowania konsekwencji zakażenia wirusem Zika (ZIKV) i replikacji przylegających komórek w czasie rzeczywistym, ponieważ wirus ten jest wysoce cytopatogenny. Jest to prosty test, który nie wymaga stosowania etykiet ani metod inwazyjnych i ma tę zaletę, że dostarcza danych w czasie rzeczywistym. Kinetyka zakażenia ZIKV jest w dużym stopniu zależna od zastosowanej linii komórkowej, szczepu wirusa i wielości infekcji (MOI), których nie można łatwo zbadać za pomocą konwencjonalnych testów końcowych. Ponadto test CEI może być również stosowany do oceny i charakterystyki związków przeciwwirusowych, które mogą również mieć dynamiczne właściwości hamujące w przebiegu infekcji. Ten artykuł dotyczący metod zawiera szczegółowe wyjaśnienie praktycznego wykonywania testu CEI i jego potencjalnych zastosowań w badaniach nad ZIKV i ogólnie w badaniach nad lekami przeciwwirusowymi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogniska wirusa Zika (ZIKV) są związane z poważnymi powikłaniami chorobowymi, takimi jak małogłowie i zespół Guillaina-Barrego1,2,3. Chociaż przyszłe epidemie są prawdopodobne ze względu na różne czynniki ryzyka, takie jak rozprzestrzenianie się wektorów komarów i rosnąca urbanizacja, do tej pory żadna szczepionka ani lek przeciwwirusowy nie trafiły jeszcze na rynek3,4. W związku z tym tradycyjne metody badawcze ZIKV powinny zostać uzupełnione o nowatorskie narzędzia do badania tego wirusa i jego potencjalnych związków przeciwwirusowych. Badania przeciwwirusowe często opierają się na testach fenotypowych, w których punktem końcowym jest obecność określonego parametru, takiego jak pojawienie się wywołanego wirusem efektu cytopatycznego (CPE) lub produkcja określonego białka indukowanego wirusem za pomocą genu reporterowego5,6,7. Jednak metody te mają odczyty punktów końcowych, są pracochłonne i mogą wymagać złożonej analizy. Dlatego metody oparte na impedancji stanowią atrakcyjną alternatywę.

Impedancja elektryczna (CEI) oparta na ogniwach jest definiowana jako opór przepływu prądu z jednej elektrody do drugiej, spowodowany przez przylegającą warstwę ogniwa zasianą na studniach zawierających elektrody. Uznaną technologią CEI zastosowaną w tej metodologii jest Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS), pierwotnie opracowana przez Giaevera i Keese8,9. Jest to używane w szerokim zakresie badań biologicznych, takich jak przerzuty raka, toksykologia i gojenie się ran10,11,12. Jego zasada działania opiera się na polu elektrycznym, które jest generowane przez ciągłe przemiatanie napięć prądu przemiennego (AC) w zakresie częstotliwości13. Komórki są wystawione na działanie tych nieinwazyjnych pól elektrycznych, a w określonych odstępach czasu mierzone są zmiany impedancji spowodowane wzrostem komórek lub zmianami w przyleganiu komórek lub morfologii14. Co więcej, zmieniona żywotność komórek prowadzi również do zmian impedancji, co czyni tę technologię użytecznym narzędziem do monitorowania infekcji wirusami cytopatogennymi15,16,17. Ponieważ zmiany morfologiczne warstwy komórkowej będą wykrywane w skali nano, technologia ta stanowi bardzo czułe narzędzie do wykrywania. Test CEI opisany w tym artykule jest łatwą, nieinwazyjną, bezznacznikową metodą pomiaru zmian impedancji warstwy komórkowej w czasie rzeczywistym.

Chociaż CEI nie był używany do oceny przebiegu infekcji ZIKV lub jej potencjalnych leków przeciwwirusowych, jego użycie jako narzędzia diagnostycznego było już wcześniej badane18. W niedawnym badaniu po raz pierwszy zwalidowano użycie testu CEI do określenia aktywności przeciwwirusowej kilku inhibitorów ZIKV w komórkach A54919. W tym artykule dotyczącym metod opisano ten test CEI bardziej szczegółowo i rozszerzono go na różne przylegające linie komórkowe, a także różne szczepy ZIKV o różnej liczebności infekcji (MOI). W ten sposób wykazano wszechstronne zastosowanie tej metody w badaniach nad przeciwwirusowymi flawiwirusami. Kluczową zaletą tej metody jest monitorowanie komórek w czasie rzeczywistym, co pozwala na wykrycie ważnych punktów czasowych infekcji i dynamicznej aktywności hamującej przez potencjalne związki przeciwwirusowe. Podsumowując, technologia CEI stanowi potężne i cenne narzędzie, które uzupełnia obecny zakres metodologii leczenia przeciwwirusowego.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane kroki są przeprowadzane w sterylnych warunkach w komorze z przepływem laminarnym w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2. Wszystkie użyte wirusy zostały pozyskane i wykorzystane zgodnie z zatwierdzonymi, zgodnie z zasadami belgijskiej instytucjonalnej komisji rewizyjnej (Departement Leefmilieu, Natuur en Energie, protokół SBB 219 2011/0011) oraz Komitetu ds. Bezpieczeństwa Biologicznego przy KU Leuven.

1. Utrzymanie hodowli komórkowej

UWAGA: Ten protokół jest wykonywany z wybranymi liniami komórkowymi, ale oczywiście może być dostosowany do dowolnej przylegającej linii komórkowej, wymagając jedynie optymalizacji gęstości wysiewu komórek.

  1. Hodować ludzką linię komórkową gruczolakoraka płuc A549, ludzką linię komórkową glejaka złośliwego U87 oraz ludzkie zarodkowe komórki fibroblastów płuc HEL 299 w kolbach hodowlanych T75 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.
  2. Subkulturuj komórki przy zbiegu 80%-95%. Wszystkie odczynniki powinny mieć temperaturę pokojową (RT) przed hodowlą komórek.
  3. Usunąć kondycjonowaną pożywkę hodowlaną z komórek. Użyj 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco, aby raz przepłukać monowarstwę komórkową.
  4. Rozprowadź 1 ml 0,25% kwasu trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) równomiernie na monowarstwie komórki. Następnie inkubować przez maksymalnie 3 minuty w temperaturze 37 °C, aż komórki zaczną się odłączać.
  5. Dodać 9 ml świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli Materiałów). Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić komórki.
  6. Przenieść żądaną objętość zawiesiny komórkowej do nowej kolby hodowlanej T75 i dodać odpowiednią objętość świeżej pożywki wzrostowej, aby uzyskać całkowitą objętość 15 ml.
    UWAGA: Linie komórkowe in vitro użyte w tym protokole są subhodowane w rozcieńczeniach od 1:4 do 1:10, w zależności od konkretnej linii komórkowej, aby zapewnić idealne warunki wzrostu. Subkultury wykonuje się co 3-4 dni, więc pożądana objętość zawiesiny komórkowej może się również różnić w zależności od liczby dni inkubacji.

2. Przygotowanie tabliczki CEI

  1. Weź 96-dołkową płytkę z elektrodami międzypalcowymi (patrz Tabela materiałów) i wypełnij wszystkie studzienki 100 μl pożywki do hodowli wzrostu.
  2. Wypełnij przestrzenie między studzienkami DPBS.
    UWAGA: Ma to na celu zmniejszenie efektu krawędzi spowodowanego parowaniem, które obserwuje się podczas hodowli komórek na płytkach 96-dołkowych.
  3. Inkubować płytkę przez 4 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .

3. Sadzenie komórek

  1. Oderwać komórki od kolby hodowlanej, jak opisano w sekcji 1, i ponownie zawiesić je w świeżej pożywce wzrostowej w probówce o pojemności 50 ml.
  2. Policz liczbę żywotnych komórek przy użyciu wybranej metody.
    UWAGA: W przypadku ogniw A549 żywotność na ogół osiąga ~100%. Aby określić liczbę komórek, używamy zautomatyzowanego systemu analizy komórek opartego na barwieniu pomarańczem akrydynowym/jodkiem propydyny (patrz tabela materiałów). Inne metody liczenia komórek działają równie dobrze.
  3. Ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce wzrostowej, aby uzyskać pożądaną gęstość komórek. W tym badaniu optymalna gęstość komórek A549 wynosi 0,15 × 106 (żywotnych) komórek/ml.
  4. Wyjąć z inkubatora 96-dołkową płytkę z elektrodami międzypalcowymi i usunąć pożywkę za pomocą pipety wielokanałowej.
  5. Dozować 100 μl zawiesiny komórek (odpowiadającej w tym przypadku 15 × 103 komórkom) na dołek w płytce 96-dołkowej.
  6. Pozwól komórkom zrównoważyć się przez 15 minut w temperaturze pokojowej przed umieszczeniem ich w urządzeniu CEI.

4. Konfiguracja i uruchamianie testu CEI

  1. Umieścić inkubator, w którym znajduje się uchwyt na płytkę urządzenia CEI, w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Umieść 96-dołkową płytkę w urządzeniu.
  3. Otwórz oprogramowanie urządzenia i skonfiguruj nowy eksperyment, klikając przycisk Ustawienia w okienku Zbieranie danych. Poczekaj, aż laptop połączy się z urządzeniem ECIS i skonfiguruj płytkę, sprawdzając impedancje studni. Sprawdź, czy wszystkie studzienki są poprawnie skonfigurowane, na co wskazuje zielony kolor. Jeśli nie, powtarzaj krok 4.2, aż wszystkie studzienki będą zielone.
  4. W okienku Konfiguracja studni wybierz typ tablicy zgodnie z używanym oprogramowaniem kulturowym.
  5. Wybierz tryb wielu częstotliwości/czasu.
    UWAGA: W tym trybie urządzenie mierzy zmiany impedancji w zakresie częstotliwości.
  6. Rozpocznij pomiar, klikając przycisk Start.
    UWAGA: Impedancję w czasie rzeczywistym można monitorować w interfejsie oprogramowania. Wybierz żądaną częstotliwość, która ma być wyświetlana. W tym przykładzie wybrano 16 kHz.

5. Przygotowanie i inkubacja związków

UWAGA: Jako przykład związku przeciwwirusowego, labyrintopeptyna A1 jest używana (Zobacz Tabelę Materiałów). Ponieważ protokół ten można uogólnić na wszystkie związki o potencjalnej aktywności przeciwwirusowej, nazywamy go "związkiem".

  1. Pozostawić pełną pożywkę do hodowli komórkowych bez dodatku płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (określanej jako "bufor do oznaczania") w celu zrównoważenia w temperaturze pokojowej.
  2. Utrzymuj związki na lodzie.
  3. Przygotować 10-krotnie skoncentrowane rozcieńczenie każdego związku w pożywce do oznaczania w probówkach polipropylenowych o pojemności 5 ml.
  4. Seryjnie rozcieńczyć związki w pożywce testowej w probówkach polipropylenowych o pojemności 5 ml, aby uzyskać pożądane 10-krotne stężenie.
  5. Wstrzymaj urządzenie CEI, klikając przycisk Wstrzymaj w okienku Ustawienia zbierania danych. Poczekaj, aż bieżący punkt czasu zostanie zakończony i wyjmij 96-dołkową płytkę.
  6. Sprawdź przyleganie i tworzenie się monowarstw komórek pod mikroskopem świetlnym.
  7. Usunąć 20 μl z każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej.
  8. Dodać 20 μl roztworu złożonego lub nośnika do żądanych studzienek. Przygotuj układ z określonymi warunkami prawidłowego pipetowania.
  9. Inkubować płytkę przez 15 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
    UWAGA: Do tego etapu inkubacji używany jest normalny inkubator komórkowy zamiast urządzenia CEI. Studnie kontroli komórkowej (CC) są studniami uzdatnionymi nośnikiem.

6. Przygotowanie wirusa i infekcja

  1. Rozmrozić fiolkę z zapasem wirusa. W tym przykładzie używane są PRVABC59 ZIKV MR766 i ZIKV.
  2. Przygotować rozcieńczenia wirusa w żądanym MOI lub rozcieńczenia w pożywce do oznaczania w probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml.
    UWAGA: W tym reprezentatywnym przykładzie używane są MOI 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,005 i 0,00005.
  3. Dodać 100 μl rozcieńczenia wirusa do wyznaczonych studzienek płytki 96-dołkowej. Dodaj pożywkę testową do dołków CC.
  4. Odkazić zastosowane pojemniki z wirusem.
  5. Włóż płytkę z powrotem do urządzenia CEI i kontynuuj pomiary przez 6 kolejnych dni, klikając Wznów eksperyment.
    UWAGA: Studzienki do kontroli wirusów (VC) są zakażonymi komórkami poddanymi działaniu nośnika, podczas gdy w studzienkach CC zamiast rozcieńczania wirusa dodaje się pożywkę testową. Jeżeli oceniana jest cytotoksyczność związków, należy dodać 100 μl buforu do oznaczania zamiast rozcieńczenia wirusa.

7. Analiza danych

  1. Zakończ eksperyment, klikając przycisk Zakończ i dodaj opcjonalne komentarze podsumowujące, takie jak informacje o konkretnych warunkach eksperymentu w wyświetlonym oknie. Kliknij przycisk OK po zakończeniu zbierania danych.
  2. Wybierz żądaną częstotliwość w okienku Wykres, w którym na końcu eksperymentu mierzona jest największa różnica impedancji między CC i VC.
    1. Aby określić najlepszą częstotliwość, przeprowadź eksperyment pilotażowy z niezainfekowanymi i zainfekowanymi komórkami i wybierz częstotliwość, która - w momencie, gdy impedancja zainfekowanych komórek spadła do poziomu wyjściowego - prowadzi do największej obserwowanej różnicy impedancji między niezainfekowanymi i zainfekowanymi komórkami. W przypadku komórek A549 zakażonych wirusem ZIKV jest to 16 kHz.
  3. Aby wyeksportować wszystkie dane w formacie arkusza kalkulacyjnego, upewnij się, że wszystkie studnie są zaznaczone w okienku Konfiguracja studni i kliknij Plik | Eksport danych | Wykres danych.
  4. Znormalizuj dane, odejmując średnią wartość impedancji VC zmierzoną na końcu eksperymentu od wszystkich punktów danych i dzieląc ją przez średnią wartość impedancji CC ostatniego punktu czasowego zmierzonego przed infekcją.
  5. Wykreśl znormalizowane dane w funkcji czasu, aby uzyskać wykresy profilu CEI.
  6. Obliczyć znormalizowaną powierzchnię pod krzywą (AUCn) każdego warunku, aby określić parametry, takie jak 50% stężenia hamujące (IC50).
  7. Oblicz inne przydatne parametry, takie jak CIT50, aby na przykład porównać zakaźność różnych szczepów wirusa.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule szczegółowo opisano użycie testu CEI w badaniach ZIKV. Przebieg tego testu jest zilustrowany na Rysunek 1. Pokazujemy wygodę monitorowania w czasie rzeczywistym infekcji ZIKV w pożądanym typie komórki, a także oceny hamowania infekcji przez związek przeciwwirusowy. Jako przykład przeciwwirusowy używamy dobrze opisanego peptydu labiryntopaptyny A1 (Laby A1); Nazywamy to 'związkiem', ponieważ jego specyficzne właściwości wykraczają poza zakres tego artykułu o metodach i są omówione gdzie indziej20,21. Warto zauważyć, że odtwarzalność metody nie jest omawiana w sekcji wyników, ponieważ chcemy skupić się na poszczególnych profilach impedancji uzyskanych przy użyciu tej metodologii. Zostało to jednak opisane wcześniej19.

W pierwszym zestawie eksperymentów pokazujemy znaczenie optymalizacji gęstości komórek podczas przeprowadzania testów infekcji CEI (Rysunek 2). Gdy zasieje się zbyt wiele komórek, monowarstwa ogniwa będzie w pełni rozrosła się i nie będzie w stanie dalej rozprzestrzeniać się po elektrodach CEI. Prowadzi to do mniejszej różnicy między CC i VC, a tym samym do niższej rozdzielczości, co zmniejsza okno wykrywania aktywności przeciwwirusowej. Dobrze ilustruje to Rysunek 2E. W przypadku niektórych większych typów komórek, takich jak komórki U87, zbyt gęste wysiewanie komórek może nawet prowadzić do całkowitego oderwania monowarstwy komórki podczas manipulowania płytką, jak pokazano tutaj (Rysunek 2F). Jest to również obserwowane pod mikroskopem.

Rysunek 2 pokazuje również, że test jest bardzo przydatny do przeprowadzania badań podatności komórek. Z Rysunek 2A,B jasno wynika, że kinetyka infekcji jest w dużym stopniu zależna od typu komórki. Rysunek 2C pokazuje, że komórki U87 są podatne na infekcję ZIKV tylko przy wysokich MOI.

W drugim zestawie eksperymentów, podkreślono wszechstronne zastosowanie testu na infekcję CEI przy użyciu różnych szczepów ZIKV w różnych MOI i w obecności dobrze opisanego związku przeciwwirusowego (Rysunek 3). Eksperymenty te są przeprowadzane na komórkach A549, modelu powszechnie używanym w badaniach nad flawiwirusami22,23. Ta linia komórkowa została również wykorzystana w innych badaniach, które wykazały jej przydatność w testach CEI24. Po pierwsze, kinetyka infekcji reprezentatywnym szczepem ZIKV z afrykańskiej linii MR766 jest porównywana z kinetyką azjatyckiej linii PRVABC59. Rysunek 3A pokazuje, że oba szczepy mają porównywalne wzorce CEI, przy czym PRVABC59 mają nieco wolniejsze właściwości indukujące CPE. Znajdują to również odzwierciedlenie w wartościach CIT50 (Rysunek 3B). Ten interesujący parametr został po raz pierwszy wprowadzony przez Fang et al.16 i uwzględnia kinetykę pomiarów CEI. Definiuje się go jako czas potrzebny do zmniejszenia impedancji o 50% w porównaniu ze sterowaniem ogniwem.

Następnie, komórki zostały zainfekowane trzema różnymi MOI ZIKV MR766 lub PRVABC59, w obecności lub braku różnych stężeń związków, a profile impedancji były monitorowane. Jak można zaobserwować na stronie Rysunek 3C-H, pewne stężenia związków hamują lub opóźniają spadek impedancji spowodowany infekcją ZIKV. Jest to również odzwierciedlane przy obliczaniu wartości AUC. Wyniki testu CEI pokazują również wizualnie, że aktywność przeciwwirusowa zależy od MOI i punktu czasowego oceny siły działania. ObliczeniaAUC n mogą być wykorzystane do wyznaczenia wartości IC50, jak pokazano na Rysunek 3I. Na koniec, Rysunek 3H pokazuje, że wartości CIT50 mogą być również używane do określania i porównywania mocy złożonych. Związki nieaktywne lub stężenia związków charakteryzują się profilami CEI, wartościami AUC i CIT50 porównywalnymi z wartościami VC.

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczny przegląd przebiegu testu. Poniżej przedstawiono harmonogram oraz różne etapy postępowania i inkubacji testu CEI. Skróty: CEI = cell-based electric impedancja (impedancja elektryczna oparta na komórkach); ZIKV = wirus Zika; D = dni. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Znormalizowane profile CEI komórek zakażonych ZIKV o różnych gęstościach. (A,D) A549, (B,E) HEL 299 lub (C,F) U87 zostały wysiane na (A-C) 15 000-20 000 ("optymalne") lub (D-F) 75 000 ("nieoptymalnych") komórek na studzienkę w 96-dołkowej płytce CEI. Po 24 godzinach monitorowania impedancji komórki zostały zakażone dziesięciokrotnymi rozcieńczeniami MOI ZIKV MR766. Impedancja była dalej monitorowana przez 5 kolejnych dni. Przedstawiono profile CEI (średnia ± zakresie dwóch kontrprób technicznych) reprezentatywnego eksperymentu. Skróty: CEI = cell-based electric impedancja (impedancja elektryczna oparta na komórkach); MOI = mnogość infekcji; ZIKV = wirus Zika; Norma = znormalizowana. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Znormalizowane profile CEI komórek A549 po zakażeniu dwoma szczepami ZIKV i zahamowaniu przez związek przeciwwirusowy. (A) Przylegające komórki A549 były zakażone różnymi MOI ZIKV MR766 lub ZIKV PRVABC59, a impedancja była monitorowana w sposób ciągły. Pokazano średnią ± SD trzech powtórzeń technicznych reprezentatywnego eksperymentu. (B) Wartości CIT50 zostały obliczone na podstawie profilu CEI A i porównane. Pokazana jest średnia ± SD z trzech przeprowadzonych kontrprób technicznych. (C-H) Przylegające komórki A549 traktowano różnymi stężeniami związków, a następnie zakażono specyficznym MOI ZIKV MR766 (CE) lub ZIKV PRVABC59 (F-H). Impedancja była stale monitorowana. Pokazano średnią ± zakresie dwóch powtórzeń technicznych reprezentatywnego eksperymentu. (I) Aby porównać inhibicję związku z różnymi szczepami i rozcieńczeniami ZIKV, obliczono AUCn, a procentowe wartości hamujące określono przez odjęcie wszystkich warunków przez CC AUCn i podzielenie przez VC AUCn. (J) Wartości CIT50 w eksperymencie pokazane w C-H zostały obliczone w celu porównania różnych szczepów ZIKV i MOI. Przedstawiono średnią ± zakresie dwóch kontrprób technicznych. Skróty: CEI = cell-based electric impedancja (impedancja elektryczna oparta na komórkach); MOI = mnogość infekcji; ZIKV = wirus Zika; Norma = znormalizowana; CIT50 = czas, w którym impedancja zmniejszyła się o 50% w stosunku do kontroli nieleczonej; AUC = pole pod krzywą; CC = kontrola komórki; VC = kontrola wirusów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule opisano zastosowanie testu CEI w badaniach nad lekami przeciwwirusowymi ZIKV. Test ma tę zaletę, że umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym i dlatego może być wykorzystany do oceny kinetyki infekcji ZIKV i hamowania działania przeciwwirusowego za pomocą selektywnych związków. Dane uzyskane tą metodą pozwalają na obiektywną i wizualną obserwację CPE wywołanego przez wirusa oraz siły działania potencjalnego związku przeciwwirusowego.

Ponieważ CEI jest bardzo czułą metodą, należy zachować szczególną ostrożność podczas wykonywania tego testu komórkowego. Bardzo ważne jest, aby pipetowanie było precyzyjne, aby w jak największym stopniu uniknąć zmian w pipetowaniu. Co więcej, inne czynniki, które mogą mieć wpływ na wyniki eksperymentu, takie jak liczba komórek i wykorzystany zapas wirusa, muszą być utrzymywane na stałym poziomie między powtórzeniami eksperymentu. Są to czynniki, które mają duży wpływ na kinetykę wzrostu komórek i infekcji, a zatem mogą prowadzić do różnic w obliczonych wartościach CIT50 i/lub innych parametrach.

Podczas wykonywania testu CEI w obecności (potencjalnych) związków przeciwwirusowych ważne jest ustalenie, czy wpływają one na impedancję komórek przy braku wirusa. Technika ta jest tak czuła, że zmiany impedancji mogą być mierzone znacznie poniżej stężeń cytotoksycznych związku19.

Chociaż w tym artykule przedstawiono tylko dane dotyczące ZIKV, test można łatwo zastosować do innych wirusów cytopatogennych (flawi), przy minimalnym wysiłku optymalizacyjnym, takim jak optymalne określenie częstotliwości monitorowania CEI. Adaptacje testu CEI zastosowano w przypadku różnych wirusów ludzkich i zwierzęcych, takich jak chikungunya, grypa A oraz herpeswirusy ludzkie i końskie 25,26,27,28. W tym przypadku jest również stosowana jako prosta metoda do oznaczania ilościowego miana wirusa lub do identyfikacji związków przeciwwirusowych. W badaniach tych wykorzystano analizę komórkową w czasie rzeczywistym, alternatywną metodę CEI.

Zastosowanie technologii CEI jest ograniczone do typów komórek adherentnych, ponieważ zasada testu opiera się na właściwościach komórek przylegających, które rozprzestrzeniają się w studzienkach osadzonych w elektrodach. Cóż, powłoki powierzchniowe, takie jak fibronektyna, mogą być stosowane w celu poprawy przyczepiania komórek29. Metodologia ma kilka innych wad, z których pierwsza związana jest z jej kosztem. Oprócz inwestycji w urządzenie monitorujące CEI i towarzyszący mu sprzęt i oprogramowanie, materiały eksploatacyjne są również nieco drogie. Ponadto, ponieważ protokół wymaga monitorowania infekcji wirusowej przez kilka dni, można ocenić jedną 96-dołkową płytkę tygodniowo. W połączeniu z wysokimi kosztami ogranicza to użycie do ustawień o niskiej i średniej przepustowości.

Ze względu na te problemy z przepustowością technologia ta nie nadaje się do badań przesiewowych przeciwwirusowych. Jest jednak bardzo atrakcyjny w początkowych fazach eksperymentalnych, na przykład podczas oceny podatności komórek na badanie zakażenia ZIKV w określonych warunkach związanych z chorobą. Technologia ta jest również przydatna w przypadku transfekowanych lub nokautujących linii komórkowych, aby łatwo obserwować zmiany w kinetyce infekcji, na przykład w obecności lub braku określonych receptorów wejściowych. Jest to interesujące przy badaniu udziału czynników komórkowych w zakażeniu ZIKV. Ponadto, w późniejszych fazach przedklinicznych, gdy wybrany zostanie określony główny kandydat, test CEI może być wykorzystany do dalszej dogłębnej charakterystyki wybranego związku. Bioczujniki CEI mogą być również modyfikowane poprzez unieruchomienie niektórych elementów rozpoznawania biologicznego, takich jak przeciwciała specyficzne dla wirusa, w celu wykrywania wirusów18. Wszystko to podkreśla wszechstronne zastosowanie CEI w środowisku wirusologicznym.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy potwierdzają, że nie ma konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Clémentowi Heymannowi i Gorritowi Lootsmie za korektę rękopisu. Badania były wspierane przez wewnętrzne granty Laboratorium Wirusologii i Chemoterapii (Rega Institute, KU Leuven).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki A549American Type Culture Collection (ATCC)CCL-185Komórki te są hodowane w MEM Rega-3 uzupełnionym 10% FBS, 2 mM L-glutaminą, 0,075% wodorowęglanem sodu.
Barwnik z pomarańczy akrydyny/jodku propidiumLogos BiosystemsF23001Żywa/martwa plama
Probówki polipropylenowe Cellstar, 15 mlGreiner bio-one1,88,271
Probówki polipropylenowe Cellstar, 50 mlGreiner bio-one2,27,261
Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM)Gibco, Thermo Fisher Scientific41965-039Pożywka do hodowli komórkowych dla U87 i HEL 299 komórek
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific14190-094
ECIS cultureware 96W20idfApplied BioPhysics96W20idf Płytka testowa PETdo urządzenia CEI
Wykrywanie impedancji podłoży komórek elektrycznych (ECIS) Stacja macierzowa ZBiofizykastosowanaUrządzenie CEI, w tym stacja 96-dołkowa, zewnętrzny moduł sterujący i laptop z oprogramowaniem sterującym, akwizycyjnym i wyświetlającym. Niezbędne oprogramowanie jest instalowane przed wysyłką. UWAGA: to urządzenie jest obecnie wycofane z produkcji i zostało zastąpione przez bardziej zaawansowane urządzenie ECIS Z-Theta
Rurki polistyrenowe Falcon, 5 mlCorning352054
Płodowa surowica bydlęca (FBS)CytivaSV30160.03Dodatek do pożywki do hodowli komórkowych dla wszystkich używanych komórek
Komórki HEL 299ATCCCCL-137Komórki te są hodowane w DMEM uzupełnionym 10% FBS i 0,01 M HEPES.
Bufor HEPES, 1 MGibco, Thermo Fisher Scientific15630-056Dodatek do pożywki do hodowli komórkowych dla komórek U87
Labiryntopeptyna A1Miły prezent od Prof. Dr. Rodericha Sü ssmuth, Technische Universitä t Berlin, NiemcyZwiązek przeciwwirusowy użyty jako przykład w tym protokole. Jest rozpuszczony w DMSO.
L-Glutamina, 200 mMGibco, Thermo Fisher Scientific25030-024Dodatek do pożywki do hodowli komórkowych dla komórek A549
Szkiełka do liczenia komórek LunaLogos BiosystemsL12001
Luna-FL licznik komórek podwójnej fluorescencjiLogos BiosystemsL20001Licznik żywotności komórek
Minimum Essential Medium Rega-3 (MEM Rega-3)Gibco, Thermo Fisher Scientific19993013Pożywka do hodowli komórkowych dla komórek A549
Wodorowęglan sodu, 7,5%Gibco, Thermo Fisher Scientific25080-060Dodatek do pożywki do hodowli komórkowych dla komórek A549
Kolba do hodowli tkankowych T75TPPY9076
Trypsyna-EDTA, 0,25%Gibco, Thermo Fisher Scientific25200-056Odczynnik dysocjacyjny
U87 komórkiATCCHTB-14Komórki te są hodowane w DMEM z dodatkiem 10% FBS i 0,01 M HEPES.
  Tabletki Virkon Rely+OnLanxess115-0020Roztwór środka dezynfekującego
Wirus Zika (ZIKV) MR766ATCCVR-84Prototyp szczepu ZIKV wyizolowany od małpy rezusa wartownika w Ugandzie w 1968
Szczep ZIKV PRVABC59ATCCVR-1843ZIKV wyizolowany od pacjenta w Portoryko w 2015
r. r.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cao-Lormeau, V. M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
  2. Mlakar, J., et al. Zika virus associated with microcephaly. The New England. Journal of Medicine. 374 (10), 951-958 (2016).
  3. Pierson, T. C., Diamond, M. S. The emergence of Zika virus and its new clinical syndromes. Nature. 560 (7720), 573-581 (2018).
  4. Pergolizzi, J., et al. The Zika virus: Lurking behind the COVID-19 pandemic. Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics. 46 (2), 267-276 (2021).
  5. Bernatchez, J. A., et al. Development and validation of a phenotypic high-content imaging assay for assessing the antiviral activity of small-molecule inhibitors targeting Zika virus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (10), e00725(2018).
  6. Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
  7. Mottin, M., et al. Discovery of new Zika protease and polymerase inhibitors through the open science collaboration Project OpenZika. Journal of Chemical Information and Modeling. 62 (24), 6825-6843 (2022).
  8. Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences. 81 (12), 3761-3764 (1984).
  9. Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
  10. Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. Journal of Visualized Experiments. (50), e2792(2011).
  11. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300(2014).
  12. Li, X., et al. Hsp70 suppresses mitochondrial reactive oxygen species and preserves pulmonary microvascular barrier integrity following exposure to bacterial toxins. Frontiers in Immunology. 9, 1309(2018).
  13. Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Experimental Cell Research. 259 (1), 158-166 (2000).
  14. Xu, Y., et al. A review of impedance measurements of whole cells. Biosensors and Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).
  15. Pennington, M. R., Van de Walle, G. R. Electric cell-substrate impedance sensing to monitor viral growth and study cellular responses to infection with alphaherpesviruses in real time. mSphere. 2 (2), e00039(2017).
  16. Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
  17. McCoy, M. H., Wang, E. Use of electric cell-substrate impedance sensing as a tool for quantifying cytopathic effect in influenza a virus infected MDCK cells in real-time. Journal of Virological Methods. 130 (1-2), 157-161 (2005).
  18. Stukovnik, Z., Bren, U. Recent developments in electrochemical-impedimetric biosensors for virus detection. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 15922(2022).
  19. Oeyen, M., Meyen, E., Doijen, J., Schols, D. In-depth characterization of Zika virus inhibitors using cell-based electrical impedance. Microbiology Spectrum. 10 (4), e0049122(2022).
  20. Prochnow, H., et al. Labyrinthopeptins exert broad-spectrum antiviral activity through lipid-binding-mediated virolysis. Journal of Virology. 94 (2), e01471(2020).
  21. Oeyen, M., et al. Labyrinthopeptin A1 inhibits dengue and Zika virus infection by interfering with the viral phospholipid membrane. Virology. 562, 74-86 (2021).
  22. Vicenti, I., et al. Comparative analysis of different cell systems for Zika virus (ZIKV) propagation and evaluation of anti-ZIKV compounds in vitro. Virus Research. 244, 64-70 (2018).
  23. Gobillot, T. A., Humes, D., Sharma, A., Kikawa, C., Overbaugh, J. The robust restriction of Zika virus by type-I interferon in A549 cells varies by viral lineage and is not determined by IFITM3. Viruses. 12 (5), 503(2020).
  24. Verma, N. K., Moore, E., Blau, W., Volkov, Y., Babu, P. R. Cytotoxicity evaluation of nanoclays in human epithelial cell line A549 using high content screening and real-time impedance analysis. Journal of Nanoparticle Research. 14, 1137(2012).
  25. Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
  26. Labadie, T., Grassin, Q., Batéjat, C., Manuguerra, J. -C., Leclercq, I. Monitoring influenza virus survival outside the host using real-time cell analysis. Journal of Visualized Experiments. (168), e61133(2021).
  27. Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
  28. Zandi, K. A real-time cell analyzing assay for identification of novel antiviral compounds against chikungunya virus. Methods in Molecular Biology. 1426, 255-262 (2016).
  29. Ebrahim, A. S., et al. Functional optimization of electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) using human corneal epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 14126(2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Impedancja oparta na kom rkachmonitorowanie w czasie rzeczywistymtest impedancji elektrycznejocena zwi zk w przeciwwirusowychkinetyka infekcji wirusowejwielokrotno infekcjitworzenie monowarstwy kom rkowejefekt cytopatycznywyznaczanie IC50

Powiązane artykuły