Tutaj pokazujemy użycie komórkowej impedancji elektrycznej (CEI) jako bardzo łatwej i prostej metody badania infekcji wirusem Zika i jego replikacji w ludzkich komórkach w czasie rzeczywistym. Ponadto test CEI jest przydatny do oceny związków przeciwwirusowych.
Artykuł metodologiczny
Komórkowa platforma impedancji elektrycznej do oceny inhibitorów wirusa Zika w czasie rzeczywistym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Technologia impedancji elektrycznej (CEI) opartej na komórkach mierzy zmiany impedancji spowodowane przez rosnącą lub manipulowaną monowarstwę przylegającej komórki na dołkach z płytkami hodowlanymi, w których znajdują się elektrody. Technologia ta może być wykorzystywana do monitorowania konsekwencji zakażenia wirusem Zika (ZIKV) i replikacji przylegających komórek w czasie rzeczywistym, ponieważ wirus ten jest wysoce cytopatogenny. Jest to prosty test, który nie wymaga stosowania etykiet ani metod inwazyjnych i ma tę zaletę, że dostarcza danych w czasie rzeczywistym. Kinetyka zakażenia ZIKV jest w dużym stopniu zależna od zastosowanej linii komórkowej, szczepu wirusa i wielości infekcji (MOI), których nie można łatwo zbadać za pomocą konwencjonalnych testów końcowych. Ponadto test CEI może być również stosowany do oceny i charakterystyki związków przeciwwirusowych, które mogą również mieć dynamiczne właściwości hamujące w przebiegu infekcji. Ten artykuł dotyczący metod zawiera szczegółowe wyjaśnienie praktycznego wykonywania testu CEI i jego potencjalnych zastosowań w badaniach nad ZIKV i ogólnie w badaniach nad lekami przeciwwirusowymi.
Wprowadzenie
Ogniska wirusa Zika (ZIKV) są związane z poważnymi powikłaniami chorobowymi, takimi jak małogłowie i zespół Guillaina-Barrego1,2,3. Chociaż przyszłe epidemie są prawdopodobne ze względu na różne czynniki ryzyka, takie jak rozprzestrzenianie się wektorów komarów i rosnąca urbanizacja, do tej pory żadna szczepionka ani lek przeciwwirusowy nie trafiły jeszcze na rynek3,4. W związku z tym tradycyjne metody badawcze ZIKV powinny zostać uzupełnione o nowatorskie narzędzia do badania tego wirusa i jego potencjalnych związków przeciwwirusowych. Badania przeciwwirusowe często opierają się na testach fenotypowych, w których punktem końcowym jest obecność określonego parametru, takiego jak pojawienie się wywołanego wirusem efektu cytopatycznego (CPE) lub produkcja określonego białka indukowanego wirusem za pomocą genu reporterowego5,6,7. Jednak metody te mają odczyty punktów końcowych, są pracochłonne i mogą wymagać złożonej analizy. Dlatego metody oparte na impedancji stanowią atrakcyjną alternatywę.
Impedancja elektryczna (CEI) oparta na ogniwach jest definiowana jako opór przepływu prądu z jednej elektrody do drugiej, spowodowany przez przylegającą warstwę ogniwa zasianą na studniach zawierających elektrody. Uznaną technologią CEI zastosowaną w tej metodologii jest Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS), pierwotnie opracowana przez Giaevera i Keese8,9. Jest to używane w szerokim zakresie badań biologicznych, takich jak przerzuty raka, toksykologia i gojenie się ran10,11,12. Jego zasada działania opiera się na polu elektrycznym, które jest generowane przez ciągłe przemiatanie napięć prądu przemiennego (AC) w zakresie częstotliwości13. Komórki są wystawione na działanie tych nieinwazyjnych pól elektrycznych, a w określonych odstępach czasu mierzone są zmiany impedancji spowodowane wzrostem komórek lub zmianami w przyleganiu komórek lub morfologii14. Co więcej, zmieniona żywotność komórek prowadzi również do zmian impedancji, co czyni tę technologię użytecznym narzędziem do monitorowania infekcji wirusami cytopatogennymi15,16,17. Ponieważ zmiany morfologiczne warstwy komórkowej będą wykrywane w skali nano, technologia ta stanowi bardzo czułe narzędzie do wykrywania. Test CEI opisany w tym artykule jest łatwą, nieinwazyjną, bezznacznikową metodą pomiaru zmian impedancji warstwy komórkowej w czasie rzeczywistym.
Chociaż CEI nie był używany do oceny przebiegu infekcji ZIKV lub jej potencjalnych leków przeciwwirusowych, jego użycie jako narzędzia diagnostycznego było już wcześniej badane18. W niedawnym badaniu po raz pierwszy zwalidowano użycie testu CEI do określenia aktywności przeciwwirusowej kilku inhibitorów ZIKV w komórkach A54919. W tym artykule dotyczącym metod opisano ten test CEI bardziej szczegółowo i rozszerzono go na różne przylegające linie komórkowe, a także różne szczepy ZIKV o różnej liczebności infekcji (MOI). W ten sposób wykazano wszechstronne zastosowanie tej metody w badaniach nad przeciwwirusowymi flawiwirusami. Kluczową zaletą tej metody jest monitorowanie komórek w czasie rzeczywistym, co pozwala na wykrycie ważnych punktów czasowych infekcji i dynamicznej aktywności hamującej przez potencjalne związki przeciwwirusowe. Podsumowując, technologia CEI stanowi potężne i cenne narzędzie, które uzupełnia obecny zakres metodologii leczenia przeciwwirusowego.
Protokół
Wszystkie opisane kroki są przeprowadzane w sterylnych warunkach w komorze z przepływem laminarnym w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2. Wszystkie użyte wirusy zostały pozyskane i wykorzystane zgodnie z zatwierdzonymi, zgodnie z zasadami belgijskiej instytucjonalnej komisji rewizyjnej (Departement Leefmilieu, Natuur en Energie, protokół SBB 219 2011/0011) oraz Komitetu ds. Bezpieczeństwa Biologicznego przy KU Leuven.
1. Utrzymanie hodowli komórkowej
UWAGA: Ten protokół jest wykonywany z wybranymi liniami komórkowymi, ale oczywiście może być dostosowany do dowolnej przylegającej linii komórkowej, wymagając jedynie optymalizacji gęstości wysiewu komórek.
- Hodować ludzką linię komórkową gruczolakoraka płuc A549, ludzką linię komórkową glejaka złośliwego U87 oraz ludzkie zarodkowe komórki fibroblastów płuc HEL 299 w kolbach hodowlanych T75 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.
- Subkulturuj komórki przy zbiegu 80%-95%. Wszystkie odczynniki powinny mieć temperaturę pokojową (RT) przed hodowlą komórek.
- Usunąć kondycjonowaną pożywkę hodowlaną z komórek. Użyj 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco, aby raz przepłukać monowarstwę komórkową.
- Rozprowadź 1 ml 0,25% kwasu trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) równomiernie na monowarstwie komórki. Następnie inkubować przez maksymalnie 3 minuty w temperaturze 37 °C, aż komórki zaczną się odłączać.
- Dodać 9 ml świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli Materiałów). Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić komórki.
- Przenieść żądaną objętość zawiesiny komórkowej do nowej kolby hodowlanej T75 i dodać odpowiednią objętość świeżej pożywki wzrostowej, aby uzyskać całkowitą objętość 15 ml.
UWAGA: Linie komórkowe in vitro użyte w tym protokole są subhodowane w rozcieńczeniach od 1:4 do 1:10, w zależności od konkretnej linii komórkowej, aby zapewnić idealne warunki wzrostu. Subkultury wykonuje się co 3-4 dni, więc pożądana objętość zawiesiny komórkowej może się również różnić w zależności od liczby dni inkubacji.
2. Przygotowanie tabliczki CEI
- Weź 96-dołkową płytkę z elektrodami międzypalcowymi (patrz Tabela materiałów) i wypełnij wszystkie studzienki 100 μl pożywki do hodowli wzrostu.
- Wypełnij przestrzenie między studzienkami DPBS.
UWAGA: Ma to na celu zmniejszenie efektu krawędzi spowodowanego parowaniem, które obserwuje się podczas hodowli komórek na płytkach 96-dołkowych. - Inkubować płytkę przez 4 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .
3. Sadzenie komórek
- Oderwać komórki od kolby hodowlanej, jak opisano w sekcji 1, i ponownie zawiesić je w świeżej pożywce wzrostowej w probówce o pojemności 50 ml.
- Policz liczbę żywotnych komórek przy użyciu wybranej metody.
UWAGA: W przypadku ogniw A549 żywotność na ogół osiąga ~100%. Aby określić liczbę komórek, używamy zautomatyzowanego systemu analizy komórek opartego na barwieniu pomarańczem akrydynowym/jodkiem propydyny (patrz tabela materiałów). Inne metody liczenia komórek działają równie dobrze. - Ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce wzrostowej, aby uzyskać pożądaną gęstość komórek. W tym badaniu optymalna gęstość komórek A549 wynosi 0,15 × 106 (żywotnych) komórek/ml.
- Wyjąć z inkubatora 96-dołkową płytkę z elektrodami międzypalcowymi i usunąć pożywkę za pomocą pipety wielokanałowej.
- Dozować 100 μl zawiesiny komórek (odpowiadającej w tym przypadku 15 × 103 komórkom) na dołek w płytce 96-dołkowej.
- Pozwól komórkom zrównoważyć się przez 15 minut w temperaturze pokojowej przed umieszczeniem ich w urządzeniu CEI.
4. Konfiguracja i uruchamianie testu CEI
- Umieścić inkubator, w którym znajduje się uchwyt na płytkę urządzenia CEI, w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Umieść 96-dołkową płytkę w urządzeniu.
- Otwórz oprogramowanie urządzenia i skonfiguruj nowy eksperyment, klikając przycisk Ustawienia w okienku Zbieranie danych. Poczekaj, aż laptop połączy się z urządzeniem ECIS i skonfiguruj płytkę, sprawdzając impedancje studni. Sprawdź, czy wszystkie studzienki są poprawnie skonfigurowane, na co wskazuje zielony kolor. Jeśli nie, powtarzaj krok 4.2, aż wszystkie studzienki będą zielone.
- W okienku Konfiguracja studni wybierz typ tablicy zgodnie z używanym oprogramowaniem kulturowym.
- Wybierz tryb wielu częstotliwości/czasu.
UWAGA: W tym trybie urządzenie mierzy zmiany impedancji w zakresie częstotliwości. - Rozpocznij pomiar, klikając przycisk Start.
UWAGA: Impedancję w czasie rzeczywistym można monitorować w interfejsie oprogramowania. Wybierz żądaną częstotliwość, która ma być wyświetlana. W tym przykładzie wybrano 16 kHz.
5. Przygotowanie i inkubacja związków
UWAGA: Jako przykład związku przeciwwirusowego, labyrintopeptyna A1 jest używana (Zobacz Tabelę Materiałów). Ponieważ protokół ten można uogólnić na wszystkie związki o potencjalnej aktywności przeciwwirusowej, nazywamy go "związkiem".
- Pozostawić pełną pożywkę do hodowli komórkowych bez dodatku płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (określanej jako "bufor do oznaczania") w celu zrównoważenia w temperaturze pokojowej.
- Utrzymuj związki na lodzie.
- Przygotować 10-krotnie skoncentrowane rozcieńczenie każdego związku w pożywce do oznaczania w probówkach polipropylenowych o pojemności 5 ml.
- Seryjnie rozcieńczyć związki w pożywce testowej w probówkach polipropylenowych o pojemności 5 ml, aby uzyskać pożądane 10-krotne stężenie.
- Wstrzymaj urządzenie CEI, klikając przycisk Wstrzymaj w okienku Ustawienia zbierania danych. Poczekaj, aż bieżący punkt czasu zostanie zakończony i wyjmij 96-dołkową płytkę.
- Sprawdź przyleganie i tworzenie się monowarstw komórek pod mikroskopem świetlnym.
- Usunąć 20 μl z każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej.
- Dodać 20 μl roztworu złożonego lub nośnika do żądanych studzienek. Przygotuj układ z określonymi warunkami prawidłowego pipetowania.
- Inkubować płytkę przez 15 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
UWAGA: Do tego etapu inkubacji używany jest normalny inkubator komórkowy zamiast urządzenia CEI. Studnie kontroli komórkowej (CC) są studniami uzdatnionymi nośnikiem.
6. Przygotowanie wirusa i infekcja
- Rozmrozić fiolkę z zapasem wirusa. W tym przykładzie używane są PRVABC59 ZIKV MR766 i ZIKV.
- Przygotować rozcieńczenia wirusa w żądanym MOI lub rozcieńczenia w pożywce do oznaczania w probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml.
UWAGA: W tym reprezentatywnym przykładzie używane są MOI 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,005 i 0,00005. - Dodać 100 μl rozcieńczenia wirusa do wyznaczonych studzienek płytki 96-dołkowej. Dodaj pożywkę testową do dołków CC.
- Odkazić zastosowane pojemniki z wirusem.
- Włóż płytkę z powrotem do urządzenia CEI i kontynuuj pomiary przez 6 kolejnych dni, klikając Wznów eksperyment.
UWAGA: Studzienki do kontroli wirusów (VC) są zakażonymi komórkami poddanymi działaniu nośnika, podczas gdy w studzienkach CC zamiast rozcieńczania wirusa dodaje się pożywkę testową. Jeżeli oceniana jest cytotoksyczność związków, należy dodać 100 μl buforu do oznaczania zamiast rozcieńczenia wirusa.
7. Analiza danych
- Zakończ eksperyment, klikając przycisk Zakończ i dodaj opcjonalne komentarze podsumowujące, takie jak informacje o konkretnych warunkach eksperymentu w wyświetlonym oknie. Kliknij przycisk OK po zakończeniu zbierania danych.
- Wybierz żądaną częstotliwość w okienku Wykres, w którym na końcu eksperymentu mierzona jest największa różnica impedancji między CC i VC.
- Aby określić najlepszą częstotliwość, przeprowadź eksperyment pilotażowy z niezainfekowanymi i zainfekowanymi komórkami i wybierz częstotliwość, która - w momencie, gdy impedancja zainfekowanych komórek spadła do poziomu wyjściowego - prowadzi do największej obserwowanej różnicy impedancji między niezainfekowanymi i zainfekowanymi komórkami. W przypadku komórek A549 zakażonych wirusem ZIKV jest to 16 kHz.
- Aby wyeksportować wszystkie dane w formacie arkusza kalkulacyjnego, upewnij się, że wszystkie studnie są zaznaczone w okienku Konfiguracja studni i kliknij Plik | Eksport danych | Wykres danych.
- Znormalizuj dane, odejmując średnią wartość impedancji VC zmierzoną na końcu eksperymentu od wszystkich punktów danych i dzieląc ją przez średnią wartość impedancji CC ostatniego punktu czasowego zmierzonego przed infekcją.
- Wykreśl znormalizowane dane w funkcji czasu, aby uzyskać wykresy profilu CEI.
- Obliczyć znormalizowaną powierzchnię pod krzywą (AUCn) każdego warunku, aby określić parametry, takie jak 50% stężenia hamujące (IC50).
- Oblicz inne przydatne parametry, takie jak CIT50, aby na przykład porównać zakaźność różnych szczepów wirusa.
Wyniki
W niniejszym artykule szczegółowo opisano zastosowanie testu CEI w badaniach nad ZIKV. Schemat postępowania w tym teście przedstawiono na Rysunku 1. Wykazujemy zalety monitorowania infekcji ZIKV w czasie rzeczywistym w wybranym typie komórek, a także ocenę hamowania infekcji przez związek przeciwwirusowy. Jako przykład związku przeciwwirusowego wykorzystujemy dobrze opisany peptyd labyrinthopeptyna A1 (Laby A1); określamy go mianem „związku”, ponieważ jego specyficzne właściwości wykraczają poza zakres niniejszego artykułu metodologicznego i są omawiane w innych publikacjach20,21. Należy zaznaczyć, że w sekcji wyników nie omawiano powtarzalności metody, ponieważ chcemy skupić się na poszczególnych profilach impedancji uzyskanych za pomocą tej metodologii. Zostało to jednak opisane wcześniej19.
W pierwszym zestawie eksperymentów demonstrujemy znaczenie optymalizacji gęstości komórek podczas przeprowadzania testów infekcji CEI (Rysunek 2). Gdy wysiane zostanie zbyt wiele komórek, monowarstwa komórkowa w pełni urośnie i nie będzie mogła dalej rozprzestrzeniać się w poprzek elektrod CEI. Prowadzi to do mniejszej różnicy między CC a VC, a tym samym do niższej rozdzielczości, co zwęża okno detekcji aktywności przeciwwirusowej. Jest to dobrze zobrazowane na Rysunku 2E. W przypadku niektórych większych typów komórek, takich jak komórki U87, zbyt gęste wysiewanie może nawet doprowadzić do całkowitego oderwania monowarstwy komórkowej podczas manipulowania płytką, co pokazano tutaj (Rysunek 2F). Jest to również obserwowane mikroskopowo.
Rycina 2 pokazuje również, że test ten jest bardzo użyteczny w badaniach podatności komórek. Z Ryciny 2A,B jasno wynika, że kinetyka infekcji jest w dużym stopniu zależna od typu komórek. Rycina 2C wykazuje, że komórki U87 są podatne na zakażenie ZIKV jedynie przy wysokich wartościach MOI.
W drugim zestawie eksperymentów podkreślono wszechstronność zastosowania testu infekcji CEI, wykorzystując różne szczepy ZIKV przy różnych MOI oraz w obecności dobrze opisanego związku przeciwwirusowego (Rycina 3). Eksperymenty te przeprowadzono na komórkach A549, modelu powszechnie stosowanym w badaniach nad flawiwirusami22,23. Linia komórkowa ta była wykorzystywana również w innych badaniach, które wykazały jej przydatność w testach CEI24. Najpierw porównano kinetykę infekcji reprezentatywnego szczepu ZIKV z linii afrykańskiej MR766 z kinetyką szczepu z linii azjatyckiej PRVABC59. Rycina 3A pokazuje, że oba szczepy wykazują porównywalne wzorce CEI, przy czym PRVABC59 wykazuje nieco wolniejsze właściwości indukujące CPE. Odzwierciedlają to również wartości CIT50 (Rycina 3B). Ten interesujący parametr został po raz pierwszy wprowadzony przez Fang i współpracowników16 i uwzględnia kinetykę pomiarów CEI. Jest on definiowany jako czas potrzebny do zmniejszenia impedancji o 50% w porównaniu z kontrolą komórkową.
Następnie komórki zainfekowano trzema różnymi MOI wirusa ZIKV MR766 lub PRVABC59, w obecności lub w nieobecności różnych stężeń związku, a następnie monitorowano profile impedancji. Jak wynika z Rysunku 3C-H, niektóre stężenia związku hamują lub opóźniają spadek impedancji wywołany infekcją ZIKV. Odzwierciedla się to również w obliczonych wartościach AUC. Wyniki testu CEI wykazują ponadto wizualnie, że aktywność przeciwwirusowa zależy od MOI oraz od punktu czasowego oceny skuteczności. Obliczenia AUCn mogą być wykorzystane do wyznaczenia wartości IC50, co przedstawiono na Rysunku 3I. Na koniec, Rysunek 3H pokazuje, że wartości CIT50 mogą również służyć do określania i porównywania skuteczności związków. Związki nieaktywne lub stężenia związków charakteryzują się profilami CEI, AUC oraz wartościami CIT50 porównywalnymi z wartościami dla VC.
Rycina 1: Schematyczny przegląd workflow testu. Przedstawiono tutaj oś czasu oraz poszczególne etapy manipulacji i inkubacji w teście CEI. Skróty: CEI = impedancja elektryczna oparta na komórkach; ZIKV = wirus Zika; D = dni. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Znormalizowane profile CEI komórek zainfekowanych ZIKV przy różnych gęstościach. (A,D) A549, (B,E) HEL 299 lub (C,F) komórki U87 wysiano w gęstości (A-C) 15 000-20 000 („optymalna”) lub (D-F) 75 000 („nieoptymalna”) komórek na dołek w 96-dołkowej płytce CEI. Po 24 h monitorowania impedancji komórki zainfekowano dziesięciokrotnymi rozcieńczeniami MOI ZIKV MR766. Impedancję monitorowano dalej przez 5 kolejnych dni. Przedstawiono profile CEI (średnia ± zakres dwóch powtórzeń technicznych) z reprezentatywnego eksperymentu. Skróty: CEI = cell-based electrical impedance; MOI = multiplicity of infection; ZIKV = Zika virus; Norm = znormalizowany. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Znormalizowane profile CEI komórek A549 po zakażeniu dwoma szczepami ZIKV i inhibicji za pomocą związku przeciwwirusowego. (A) Adherentne komórki A549 zakażono różnymi MOI ZIKV MR766 lub ZIKV PRVABC59, a następnie stale monitorowano impedancję. Przedstawiono średnią ± SD z trzech powtórzeń technicznych reprezentatywnego eksperymentu. (B) Obliczono i porównano wartości CIT50 na podstawie profilu CEI z punktu A. Przedstawiono średnią ± SD z trzech wykonanych powtórzeń technicznych. (C-H) Adherentne komórki A549 poddano działaniu różnych stężeń związku, a następnie zakażono określoną MOI ZIKV MR766 (C-E) lub ZIKV PRVABC59 (F-H). Impedancję monitorowano stale. Przedstawiono średnią ± zakres z dwóch powtórzeń technicznych reprezentatywnego eksperymentu. (I) Aby porównać inhibicję związku w odniesieniu do różnych szczepów ZIKV i rozcieńczeń, obliczono AUCn, a procenty inhibicji wyznaczono poprzez odjęcie wartości AUCn kontroli komórkowej (CC) od wszystkich warunków i podzielenie wyników przez AUCn kontroli wirusowej (VC). (J) Obliczono wartości CIT50 dla eksperymentu przedstawionego w punktach C-H w celu porównania różnych szczepów ZIKV i MOI. Przedstawiono średnią ± zakres z dwóch powtórzeń technicznych. Skróty: CEI = impedancja elektryczna oparta na komórkach; MOI = wielokrotność zakażenia; ZIKV = wirus Zika; Norm = znormalizowany; CIT50 = czas, w którym impedancja spadła o 50% w stosunku do kontroli nieleczonej; AUC = pole pod krzywą; CC = kontrola komórkowa; VC = kontrola wirusowa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Dyskusja
W artykule opisano zastosowanie testu CEI w badaniach nad lekami przeciwwirusowymi ZIKV. Test ma tę zaletę, że umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym i dlatego może być wykorzystany do oceny kinetyki infekcji ZIKV i hamowania działania przeciwwirusowego za pomocą selektywnych związków. Dane uzyskane tą metodą pozwalają na obiektywną i wizualną obserwację CPE wywołanego przez wirusa oraz siły działania potencjalnego związku przeciwwirusowego.
Ponieważ CEI jest bardzo czułą metodą, należy zachować szczególną ostrożność podczas wykonywania tego testu komórkowego. Bardzo ważne jest, aby pipetowanie było precyzyjne, aby w jak największym stopniu uniknąć zmian w pipetowaniu. Co więcej, inne czynniki, które mogą mieć wpływ na wyniki eksperymentu, takie jak liczba komórek i wykorzystany zapas wirusa, muszą być utrzymywane na stałym poziomie między powtórzeniami eksperymentu. Są to czynniki, które mają duży wpływ na kinetykę wzrostu komórek i infekcji, a zatem mogą prowadzić do różnic w obliczonych wartościach CIT50 i/lub innych parametrach.
Podczas wykonywania testu CEI w obecności (potencjalnych) związków przeciwwirusowych ważne jest ustalenie, czy wpływają one na impedancję komórek przy braku wirusa. Technika ta jest tak czuła, że zmiany impedancji mogą być mierzone znacznie poniżej stężeń cytotoksycznych związku19.
Chociaż w tym artykule przedstawiono tylko dane dotyczące ZIKV, test można łatwo zastosować do innych wirusów cytopatogennych (flawi), przy minimalnym wysiłku optymalizacyjnym, takim jak optymalne określenie częstotliwości monitorowania CEI. Adaptacje testu CEI zastosowano w przypadku różnych wirusów ludzkich i zwierzęcych, takich jak chikungunya, grypa A oraz herpeswirusy ludzkie i końskie 25,26,27,28. W tym przypadku jest również stosowana jako prosta metoda do oznaczania ilościowego miana wirusa lub do identyfikacji związków przeciwwirusowych. W badaniach tych wykorzystano analizę komórkową w czasie rzeczywistym, alternatywną metodę CEI.
Zastosowanie technologii CEI jest ograniczone do typów komórek adherentnych, ponieważ zasada testu opiera się na właściwościach komórek przylegających, które rozprzestrzeniają się w studzienkach osadzonych w elektrodach. Cóż, powłoki powierzchniowe, takie jak fibronektyna, mogą być stosowane w celu poprawy przyczepiania komórek29. Metodologia ma kilka innych wad, z których pierwsza związana jest z jej kosztem. Oprócz inwestycji w urządzenie monitorujące CEI i towarzyszący mu sprzęt i oprogramowanie, materiały eksploatacyjne są również nieco drogie. Ponadto, ponieważ protokół wymaga monitorowania infekcji wirusowej przez kilka dni, można ocenić jedną 96-dołkową płytkę tygodniowo. W połączeniu z wysokimi kosztami ogranicza to użycie do ustawień o niskiej i średniej przepustowości.
Ze względu na te problemy z przepustowością technologia ta nie nadaje się do badań przesiewowych przeciwwirusowych. Jest jednak bardzo atrakcyjny w początkowych fazach eksperymentalnych, na przykład podczas oceny podatności komórek na badanie zakażenia ZIKV w określonych warunkach związanych z chorobą. Technologia ta jest również przydatna w przypadku transfekowanych lub nokautujących linii komórkowych, aby łatwo obserwować zmiany w kinetyce infekcji, na przykład w obecności lub braku określonych receptorów wejściowych. Jest to interesujące przy badaniu udziału czynników komórkowych w zakażeniu ZIKV. Ponadto, w późniejszych fazach przedklinicznych, gdy wybrany zostanie określony główny kandydat, test CEI może być wykorzystany do dalszej dogłębnej charakterystyki wybranego związku. Bioczujniki CEI mogą być również modyfikowane poprzez unieruchomienie niektórych elementów rozpoznawania biologicznego, takich jak przeciwciała specyficzne dla wirusa, w celu wykrywania wirusów18. Wszystko to podkreśla wszechstronne zastosowanie CEI w środowisku wirusologicznym.
Oświadczenia
Autorzy potwierdzają, że nie ma konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują Clémentowi Heymannowi i Gorritowi Lootsmie za korektę rękopisu. Badania były wspierane przez wewnętrzne granty Laboratorium Wirusologii i Chemoterapii (Rega Institute, KU Leuven).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Komórki A549 | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-185 | Komórki te są hodowane w MEM Rega-3 uzupełnionym 10% FBS, 2 mM L-glutaminą, 0,075% wodorowęglanem sodu. |
| Barwnik z pomarańczy akrydyny/jodku propidium | Logos Biosystems | F23001 | Żywa/martwa plama |
| Probówki polipropylenowe Cellstar, 15 ml | Greiner bio-one | 1,88,271 | |
| Probówki polipropylenowe Cellstar, 50 ml | Greiner bio-one | 2,27,261 | |
| Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 41965-039 | Pożywka do hodowli komórkowych dla U87 i HEL 299 komórek |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| ECIS cultureware 96W20idf | Applied BioPhysics | 96W20idf Płytka testowa PET | do urządzenia CEI |
| Wykrywanie impedancji podłoży komórek elektrycznych (ECIS) Stacja macierzowa Z | Biofizyka | stosowanaUrządzenie CEI, w tym stacja 96-dołkowa, zewnętrzny moduł sterujący i laptop z oprogramowaniem sterującym, akwizycyjnym i wyświetlającym. Niezbędne oprogramowanie jest instalowane przed wysyłką. UWAGA: to urządzenie jest obecnie wycofane z produkcji i zostało zastąpione przez bardziej zaawansowane urządzenie ECIS Z-Theta | |
| Rurki polistyrenowe Falcon, 5 ml | Corning | 352054 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Cytiva | SV30160.03 | Dodatek do pożywki do hodowli komórkowych dla wszystkich używanych komórek |
| Komórki HEL 299 | ATCC | CCL-137 | Komórki te są hodowane w DMEM uzupełnionym 10% FBS i 0,01 M HEPES. |
| Bufor HEPES, 1 M | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15630-056 | Dodatek do pożywki do hodowli komórkowych dla komórek U87 |
| Labiryntopeptyna A1 | Miły prezent od Prof. Dr. Rodericha Sü ssmuth, Technische Universitä t Berlin, Niemcy | Związek przeciwwirusowy użyty jako przykład w tym protokole. Jest rozpuszczony w DMSO. | |
| L-Glutamina, 200 mM | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | Dodatek do pożywki do hodowli komórkowych dla komórek A549 |
| Szkiełka do liczenia komórek Luna | Logos Biosystems | L12001 | |
| Luna-FL licznik komórek podwójnej fluorescencji | Logos Biosystems | L20001 | Licznik żywotności komórek |
| Minimum Essential Medium Rega-3 (MEM Rega-3) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 19993013 | Pożywka do hodowli komórkowych dla komórek A549 |
| Wodorowęglan sodu, 7,5% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25080-060 | Dodatek do pożywki do hodowli komórkowych dla komórek A549 |
| Kolba do hodowli tkankowych T75 | TPP | Y9076 | |
| Trypsyna-EDTA, 0,25% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25200-056 | Odczynnik dysocjacyjny |
| U87 komórki | ATCC | HTB-14 | Komórki te są hodowane w DMEM z dodatkiem 10% FBS i 0,01 M HEPES. |
| Tabletki Virkon Rely+On | Lanxess | 115-0020 | Roztwór środka dezynfekującego |
| Wirus Zika (ZIKV) MR766 | ATCC | VR-84 | Prototyp szczepu ZIKV wyizolowany od małpy rezusa wartownika w Ugandzie w 1968 |
| Szczep ZIKV PRVABC59 | ATCC | VR-1843 | ZIKV wyizolowany od pacjenta w Portoryko w 2015 |
Bibliografia
- Cao-Lormeau, V. M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
- Mlakar, J., et al. Zika virus associated with microcephaly. The New England. Journal of Medicine. 374 (10), 951-958 (2016).
- Pierson, T. C., Diamond, M. S. The emergence of Zika virus and its new clinical syndromes. Nature. 560 (7720), 573-581 (2018).
- Pergolizzi, J., et al. The Zika virus: Lurking behind the COVID-19 pandemic. Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics. 46 (2), 267-276 (2021).
- Bernatchez, J. A., et al. Development and validation of a phenotypic high-content imaging assay for assessing the antiviral activity of small-molecule inhibitors targeting Zika virus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (10), e00725(2018).
- Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
- Mottin, M., et al. Discovery of new Zika protease and polymerase inhibitors through the open science collaboration Project OpenZika. Journal of Chemical Information and Modeling. 62 (24), 6825-6843 (2022).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences. 81 (12), 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. Journal of Visualized Experiments. (50), e2792(2011).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300(2014).
- Li, X., et al. Hsp70 suppresses mitochondrial reactive oxygen species and preserves pulmonary microvascular barrier integrity following exposure to bacterial toxins. Frontiers in Immunology. 9, 1309(2018).
- Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Experimental Cell Research. 259 (1), 158-166 (2000).
- Xu, Y., et al. A review of impedance measurements of whole cells. Biosensors and Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).
- Pennington, M. R., Van de Walle, G. R. Electric cell-substrate impedance sensing to monitor viral growth and study cellular responses to infection with alphaherpesviruses in real time. mSphere. 2 (2), e00039(2017).
- Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
- McCoy, M. H., Wang, E. Use of electric cell-substrate impedance sensing as a tool for quantifying cytopathic effect in influenza a virus infected MDCK cells in real-time. Journal of Virological Methods. 130 (1-2), 157-161 (2005).
- Stukovnik, Z., Bren, U. Recent developments in electrochemical-impedimetric biosensors for virus detection. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 15922(2022).
- Oeyen, M., Meyen, E., Doijen, J., Schols, D. In-depth characterization of Zika virus inhibitors using cell-based electrical impedance. Microbiology Spectrum. 10 (4), e0049122(2022).
- Prochnow, H., et al. Labyrinthopeptins exert broad-spectrum antiviral activity through lipid-binding-mediated virolysis. Journal of Virology. 94 (2), e01471(2020).
- Oeyen, M., et al. Labyrinthopeptin A1 inhibits dengue and Zika virus infection by interfering with the viral phospholipid membrane. Virology. 562, 74-86 (2021).
- Vicenti, I., et al. Comparative analysis of different cell systems for Zika virus (ZIKV) propagation and evaluation of anti-ZIKV compounds in vitro. Virus Research. 244, 64-70 (2018).
- Gobillot, T. A., Humes, D., Sharma, A., Kikawa, C., Overbaugh, J. The robust restriction of Zika virus by type-I interferon in A549 cells varies by viral lineage and is not determined by IFITM3. Viruses. 12 (5), 503(2020).
- Verma, N. K., Moore, E., Blau, W., Volkov, Y., Babu, P. R. Cytotoxicity evaluation of nanoclays in human epithelial cell line A549 using high content screening and real-time impedance analysis. Journal of Nanoparticle Research. 14, 1137(2012).
- Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
- Labadie, T., Grassin, Q., Batéjat, C., Manuguerra, J. -C., Leclercq, I. Monitoring influenza virus survival outside the host using real-time cell analysis. Journal of Visualized Experiments. (168), e61133(2021).
- Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
- Zandi, K. A real-time cell analyzing assay for identification of novel antiviral compounds against chikungunya virus. Methods in Molecular Biology. 1426, 255-262 (2016).
- Ebrahim, A. S., et al. Functional optimization of electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) using human corneal epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 14126(2022).
Przedruki i uprawnienia
