Izolacja, hodowla i charakterystyka pierwotnych fibroblastów skórnych z ludzkiej tkanki keloidowej

Podsumowanie

To badanie opisuje zoptymalizowany protokół tworzenia pierwotnych fibroblastów z tkanek keloidowych, które mogą skutecznie i stabilnie dostarczać czystych i żywotnych fibroblastów.

Streszczenie

Fibroblasty, główny typ komórek w tkance keloidowej, odgrywają istotną rolę w tworzeniu i rozwoju keloidów. Izolacja i hodowla pierwotnych fibroblastów pochodzących z tkanki keloidowej stanowią podstawę do dalszych badań nad funkcją biologiczną i mechanizmami molekularnymi bliznowców, a także nowych strategii terapeutycznych w ich leczeniu. Tradycyjna metoda otrzymywania fibroblastów pierwotnych ma ograniczenia, takie jak zły stan komórkowy, mieszanie się z innymi typami komórek oraz podatność na zanieczyszczenia. W tym artykule opisano zoptymalizowany i łatwy do odtworzenia protokół, który może zmniejszyć występowanie ewentualnych problemów podczas uzyskiwania fibroblastów. W tym protokole fibroblasty można obserwować 5 dni po izolacji i osiągają prawie 80% zbiegu po 10 dniach hodowli. Następnie fibroblasty są pasażowane i weryfikowane za pomocą PDGFRα i przeciwciał wimentyny do testów immunofluorescencyjnych oraz przeciwciał CD90 do cytometrii przepływowej. Podsumowując, fibroblasty z tkanki keloidowej można łatwo pozyskać za pomocą tego protokołu, który może stanowić obfite i stabilne źródło komórek w laboratorium do badań keloidów.

Wprowadzenie

Keloid, choroba fibroproliferacyjna, objawia się ciągłym wzrostem blaszek, które często atakują otaczającą normalną skórę bez samoograniczenia i powodują różne stopnie swędzenia, bólu oraz kosmetycznych i psychologicznych obciążeń dla pacjentów¹. Fibroblasty, pierwotne komórki zaangażowane w bliznowce, odgrywają zasadniczą rolę w powstawaniu i rozwoju tej choroby poprzez nadmierną proliferację, nadmiarową produkcję macierzy zewnątrzkomórkowej i zdezorganizowane kolageny^2,3. Jednak leżąca u podstaw patogeneza pozostaje niejasna i nadal brakuje skutecznej metody terapeutycznej w przypadku keloidu; W związku z tym istnieje pilna potrzeba dalszych badań^4,5.

Ponieważ nie ma idealnego modelu zwierzęcego do badań nad keloidami in vivo^{6,7,Zbudowanie} modelu in vitro poprzez pozyskanie pierwotnych fibroblastów z tkanek keloidowych może zapewnić wykonalność i wiarygodność dla badań nad keloidami^2,6. Komórki pierwotne to te, które pochodzą bezpośrednio z żywej tkanki i ogólnie uznaje się, że komórki te mogą bardziej przypominać stan fizjologiczny i tło genetyczne wielu osób w porównaniu z liniami komórkowymi^8,9. Hodowla komórek pierwotnych zapewnia potężny środek do badania wzrostu i metabolizmu komórek, a także innych fenotypów komórkowych.

Obecnie istnieją dwie metody pozyskiwania pierwotnych fibroblastów: trawienie enzymatyczne i hodowla eksplantatów. Zidentyfikowano jednak kilka przeszkód w uzyskaniu pierwotnych fibroblastów, takich jak ryzyko zanieczyszczenia różnymi bakteriami lub grzybami, mieszanie się z innymi typami komórek, które nie są łatwe do usunięcia, długi okres cyklu hodowli, późniejsze zmiany w charakterystyce komórek w porównaniu z oryginalnymi komórkami i tak dalej⁹. Dlatego opracowanie wykonalnego i skutecznego procesu otrzymywania pierwotnych fibroblastów jest podstawą do dalszych badań i zastosowań. Badanie to opisuje zoptymalizowany protokół ekstrakcji pierwotnych fibroblastów z tkanek keloidowych, które mogą skutecznie i stabilnie dostarczać czyste i żywotne fibroblasty.

Protokół

To badanie zostało zatwierdzone przez instytucjonalną komisję rewizyjną Szpitala Dermatologicznego Południowego Uniwersytetu Medycznego (2020081). Świadoma zgoda pacjenta została uzyskana przed pobraniem tkanek od osób.

1. Przygotowanie

UWAGA: Następujące procedury powinny być wykonywane w sterylnym środowisku pod koterią bezpieczeństwa biologicznego.

1. Przygotować kompletną pożywkę hodowlaną, dodając 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% roztworu penicyliny, streptomycyny i amfoterycyny B (PSA) do zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy.
2. Przygotować buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej (PBS) z PSA, dodając 1% PSA do 1x PBS. Przygotuj PBS z FBS, dodając 1% FBS do 1x PBS.
3. Przygotuj kilka wysterylizowanych nożyczek, kleszczyków i skalpeli przez autoklawowanie.

2. Uzyskiwanie usuniętych tkanek

1. Uzyskaj tkanki od pacjentów z bliznowcami za pomocą operacji. Zebrać świeże tkanki keloidu do sterylnej torby do pakowania lub sterylnej probówki wirówkowej i przenieść je do szafy bezpieczeństwa biologicznego w laboratorium tak szybko, jak to możliwe.
   UWAGA: W tym protokole rozmiar nabytej tkanki keloidowej wynosił około ~20 x 20 x 10 mm³, a rozmiar może się różnić w zależności od operacji.

3. Izolacja

1. Usuń tkankę keloidową za pomocą sterylnej pęsety i umieść ją w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 10-25 ml PBS z 1% PSA na 10 minut. Następnie przygotuj płytkę 6-dołkową i dodaj 4 ml PBS uzupełnionego 1% PSA do każdej studzienki. Wyjmij chusteczkę za pomocą wysterylizowanej pęsety i umyj ją dwukrotnie PBS uzupełnionym 1% PSA. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś tkankę sekwencyjnie z jednego dołka do drugiego.
2. Usuń warstwy tkanki tłuszczowej i naskórka za pomocą nożyczek chirurgicznych lub skalpela chirurgicznego i pozostaw warstwę skóry właściwej nietkniętą. Przytnij i rozetnij warstwę skóry właściwej na^{3-5 mm 2} kawałki nożyczkami, przenieś te kawałki za pomocą sterylnych kleszczy do następnej studzienki i ponownie umyj je w PBS z 1% roztworem PSA.

4. Kultura

1. Umieść kawałki tkanki skóry właściwej na szalkach Petriego za pomocą wysterylizowanych kleszczy; upewnij się, że liczba kawałków wynosi od 10 do 30, a odległość między każdym kawałkiem wynosi >5 mm. Umieść szalki Petriego do góry nogami w inkubatorze o stężeniu 5% CO₂ w temperaturze 37 °C przez 30-60 minut, aż kawałki tkanek trochę wyschną i przykleją się do szalki Petriego. Następnie dodać DMEM uzupełniony 10% FBS i 1% PSA i ostrożnie umieścić szalki Petriego w inkubatorze o stężeniu 5% CO₂ w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Fibroblasty to morfologicznie i funkcjonalnie niejednorodna populacja komórek. Biorąc pod uwagę tę złożoność, etapy izolacji i hodowli należy wykonywać ostrożnie; Równomiernie wybierz kawałki keloidowej tkanki skórnej i dobrze wymieszaj te kawałki przed umieszczeniem ich na szalce Petriego.
2. Po 3 dniach zastąp połowę supernatantu kompletną pożywką hodowlaną. Zmieniaj pożywkę co 2-3 dni. Obserwuj fibroblasty pod mikroskopem w 40-krotnym powiększeniu każdego dnia.
   UWAGA: Wszystkie czynności należy wykonywać delikatnie. Nie przesuwaj szalki Petriego przez 2 dni po izolacji, ponieważ kawałki tkanki potrzebują czasu, aby przylgnąć do szalek Petriego.
3. Gdy fibroblasty rosnące wokół fragmentów tkanek osiągną około 90% zbieżności, usuń fragmenty tkanki i pożywkę hodowlaną. Umyj fibroblasty sterylnym 1x PBS i dodaj 2 ml sterylnego 1x roztworu trypsyny-EDTA do płytek. Inkubować komórki przez około ~3-5 minut w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 .} Delikatnie postukaj w naczynie hodowlane i obserwuj je pod mikroskopem. Gdy większość komórek oderwie się od płytki, dodaj 2 ml kompletnej pożywki, aby zakończyć proces trawienia.
4. Przenieść zawiesinę komórek do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować probówkę o masie 300 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w kompletnym podłożu. Wysiewać fibroblasty do 9-centymetrowego naczynia do hodowli komórkowej i inkubować w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5%_CO2
.

5. Konserwacja i konserwacja

1. Około 3-4 dni później, gdy fibroblasty osiągną 80% zbieżności, powtórz kroki 4.2-4.4 i pasażuj fibroblasty w stosunku 1:3. Użyj pasażowanych fibroblastów do dalszych eksperymentów.
   UWAGA: Hodowlę fibroblastów należy zatrzymać po 10 pasażach, ponieważ komórki mogą zacząć wykazywać zmienione cechy w porównaniu z oryginalnymi komórkami.
2. Kriokonserwuj pasażowane komórki P1-P3 w ciekłym azocie do dalszego wykorzystania.
   1. Powtórz kroki 4.2-4.3. Przenieść zawiesinę komórek do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować probówkę przez 3 minuty przy stężeniu 300 × g. Ostrożnie wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki do zamrażania komórek zawierającej 90% FBS i 10% DMSO, a następnie przenieść zawiesinę do krioprobówek komórkowych.
   2. Przenieś komórki do zamrożonego pudełka, a następnie umieść zamrożone pudełko w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Po 1 dniu przenieś komórki do ciekłego azotu w celu długotrwałej konserwacji.

6. Identyfikacja fibroblastów za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego

1. Umieść okrągłe szkiełka nakrywkowe na 24-dołkowej płytce i posaz pasażowane fibroblasty w stężeniu 1 ×^{10 4} komórek/basenik. Gdy fibroblasty osiągną 60% zbieżności, usuń pożywkę hodowlaną. Dodaj 1 ml 4% paraformaldehydu, aby utrwalić fibroblasty przez 20 minut w temperaturze pokojowej i przemyj 3x PBS przez 1 minutę za każdym razem.
   UWAGA: Policz liczbę komórek za pomocą szkiełka hemocytometrycznego pod mikroskopem lub automatycznego licznika komórek.
2. Usunąć PBS, inkubować z 0,5% Triton X-100 przez 20 minut w celu przepuszczalności błon komórkowych, a następnie przemywać 3x PBS przez 1 minutę za każdym razem. Dodaj PBS z 0,5% albuminą surowicy bydlęcej i moczyć przez 30 minut. Następnie usuń go i dodaj przeciwciało PDGFR-α/wimentyny rozcieńczone w rozcieńczalniku przeciwciał w stosunku 1:1,000. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
3. Następnego dnia usuń przeciwciało pierwszorzędowe, przemyj komórki 3x PBS przez 3 minuty i dodaj przeciwciało drugorzędowe Alexa Fluor-555 kozie przeciwciało anty-królicze IgG rozcieńczone rozcieńczalnikiem przeciwciał w stosunku 1:200 do moczenia przez 1 godzinę.
4. Usuń przeciwciało drugorzędowe i przemyj komórki 3x PBS. Wyjmij okrągłe szkiełka nakrywkowe za pomocą kleszków, umieść je na szkiełkach i dodaj 50 μl 5 μg/ml roztworu 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) w celu zabarwienia jąder komórkowych. Przechowuj próbki w wilgotnym, ciemnym pudełku i obserwuj je pod laserowym konfokalnym mikroskopem fluorescencyjnym.
   UWAGA: Dodaj ujemną grupę kontrolną bez przeciwciała pierwszorzędowego, ale z przeciwciałem drugorzędowym, aby wykluczyć barwienie niespecyficzne.

7. Identyfikacja fibroblastów za pomocą cytometrii przepływowej

1. Zebrać osad komórkowy do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i ponownie zawiesić z 50 μl PBS zawierającego 1% FBS. Inkubować z anty-CD90 przez 30 minut w ciemności i dodać kontrolną izotyp anty-IgG do grupy kontrolnej. Następnie dodać 200 μl PBS zawierającego 1% FBS i odwirować probówkę przez 10 minut w temperaturze 300 × g w temperaturze 4 °C.
2. Usunąć supernatant i dodać 200 μl PBS zawierającego 1% FBS. Zawiesić zawiesinę i przefiltrować przez sitko komórkowe (siatka 70). Dodać do przesączu roztwór podstawowy DAPI o stężeniu 5 μg/ml w stosunku 1:100, a następnie uzyskać wyniki za pomocą cytometrii przepływowej. Ustaw rozproszenie do przodu (FSC) jako odciętą, a rozproszenie boczne (SSC) jako rzędną i zakreśl główną populację komórek. Wybierz populację komórek i ustaw fikoerytrynę jako odciętą, a liczbę jako rzędną do analizy.

Wyniki

Oś czasu protokołu jest podsumowana w Rysunek 1A. Niektóre reprezentatywne obrazy procesu izolacji są pokazane w Rysunek 2; naskórek i warstwy tłuszczowe zostały starannie usunięte, a warstwa skóry właściwej została rozdzielona na małe fragmenty o wielkości 3-4^mm2, które zostały zaszczepione na szalkach Petriego.

Jak pokazano na rysunku 3A, kilka wyrostków fibroblastów z kawałków tkanki zao...

Dyskusja

Uzyskanie pierwotnych fibroblastów z tkanek keloidowych stanowi krytyczną podstawę do dalszych badań. Do tej pory istniały dwie metody pozyskiwania pierwotnych fibroblastów: trawienie enzymatyczne i hodowla eksplantatów 11,12,13,14. Jednak obie tradycyjne metody mają ograniczenia, takie jak podatność na zanieczyszczenie, mieszanie z innymi typami komórek, długi okres hodowli i niski wskaźnik su...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,5 ml sterylna probówka wirówkowa	JETBIOFIL	CFT002015
15 ml sterylna probówka wirówkowa	JETBIOFIL	8076
4% poliformaldehyd	Beyotime Biotechnology	P0099	Utrwalanie komórek
50 ml sterylna probówka wirówkowa	JETBIOFIL	8081	Umieść tkankę keloidową
Alexa Fluor-555 koza anty-królik IgG	Abcam	Alexa  Fluor  555	Drugie przeciwciało do testu barwienia immunofluorescencyjnego
Anti human CD90	BioLegend	B301002	Zidentyfikuj czystość fibroblastów
Rozcieńczalnik przeciwciał	Beyotime Biotechnology	P0262
Szafa bezpieczeństwa biologicznego	Thermo Scientific	1300 seria A2	Izolacja i hodowla komórek
Albumina surowicy bydlęcej	aladyn B265993		Blokowanie do testu barwienia immunofluorescencyjnego
Inkubator dwutlenku węgla	ESCO	CCL-170B-8	Służy do hodowli komórek
Krioprobówki komórkowe	Corning	43513	Przechowuj komórki w niskotemperaturowej
maszynie odśrodkowej	Thermo Fisher	ST 16R	Odrzutowy supernatant
DAPI	Beyotime Biotechnology	C1006	Barwienie jądra komórkowego
DMSO	MP Biomedicals	196055	Stosowanie do konserwacji komórek
Zmodyfikowane podłoże orła firmy Dulbecco	Gibco	C11995500BT	Roztwór pożywki hodowlanej
Surowica bydlęca	płodu BI	04-001-1A
Cytometr przepływowy	BD	BD FACSCelesta	Obserwacja tożsamość komórek
zamrożonych w pudełku	Thermo Scientific	5100-0050
Mikroskop odwrócony	Nikon	ECLIPSE Ts2
Laserowy mikroskop konfokalny	Nikon	AIR-HD25	Obserwacja testu barwienia immunofluorescencyjnego
Przeciwciało PDGFR-&alpha	CST	3174T	Pierwsze przeciwciało do barwienia immunofluorescencyjnego
Roztwór penicyliny-streptomycyny-Am	Solarbio	P1410	Dodać roztwór pożywki hodowlanej, aby uniknąć zanieczyszczenia
Szalka Petriego	JETBIOFIL	7556	Hodowla fibroblastów
Roztwór soli buforowany	fosforanem Gibco	C10010500BT	Roztwór pożywki hodowlanej
Królik (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE)	Technologia sygnalizacji komórkowej	5742S	Jako kontrola cytometrii przepływowej
Okrągłe szkiełko nakrywkowe	Biosharp	801007	Hodowla komórkowa
Triton X 100	Solarbio	T8200	Wybij otwory w błonie komórkowej
Trypsyna-EDTA	Gibco	25200072	Stosowany do pasażowania komórek
Przeciwciało wimentyny	Abcam	ab8978	Pierwsze przeciwciało do testu barwienia immunofluorescencyjnego