To badanie opisuje zoptymalizowany protokół tworzenia pierwotnych fibroblastów z tkanek keloidowych, które mogą skutecznie i stabilnie dostarczać czystych i żywotnych fibroblastów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja, hodowla i charakterystyka pierwotnych fibroblastów skórnych z ludzkiej tkanki keloidowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Fibroblasty, główny typ komórek w tkance keloidowej, odgrywają istotną rolę w tworzeniu i rozwoju keloidów. Izolacja i hodowla pierwotnych fibroblastów pochodzących z tkanki keloidowej stanowią podstawę do dalszych badań nad funkcją biologiczną i mechanizmami molekularnymi bliznowców, a także nowych strategii terapeutycznych w ich leczeniu. Tradycyjna metoda otrzymywania fibroblastów pierwotnych ma ograniczenia, takie jak zły stan komórkowy, mieszanie się z innymi typami komórek oraz podatność na zanieczyszczenia. W tym artykule opisano zoptymalizowany i łatwy do odtworzenia protokół, który może zmniejszyć występowanie ewentualnych problemów podczas uzyskiwania fibroblastów. W tym protokole fibroblasty można obserwować 5 dni po izolacji i osiągają prawie 80% zbiegu po 10 dniach hodowli. Następnie fibroblasty są pasażowane i weryfikowane za pomocą PDGFRα i przeciwciał wimentyny do testów immunofluorescencyjnych oraz przeciwciał CD90 do cytometrii przepływowej. Podsumowując, fibroblasty z tkanki keloidowej można łatwo pozyskać za pomocą tego protokołu, który może stanowić obfite i stabilne źródło komórek w laboratorium do badań keloidów.
Wprowadzenie
Keloid, choroba fibroproliferacyjna, objawia się ciągłym wzrostem blaszek, które często atakują otaczającą normalną skórę bez samoograniczenia i powodują różne stopnie swędzenia, bólu oraz kosmetycznych i psychologicznych obciążeń dla pacjentów1. Fibroblasty, pierwotne komórki zaangażowane w bliznowce, odgrywają zasadniczą rolę w powstawaniu i rozwoju tej choroby poprzez nadmierną proliferację, nadmiarową produkcję macierzy zewnątrzkomórkowej i zdezorganizowane kolageny2,3. Jednak leżąca u podstaw patogeneza pozostaje niejasna i nadal brakuje skutecznej metody terapeutycznej w przypadku....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
To badanie zostało zatwierdzone przez instytucjonalną komisję rewizyjną Szpitala Dermatologicznego Południowego Uniwersytetu Medycznego (2020081). Świadoma zgoda pacjenta została uzyskana przed pobraniem tkanek od osób.
1. Przygotowanie
UWAGA: Następujące procedury powinny być wykonywane w sterylnym środowisku pod koterią bezpieczeństwa biologicznego.
- Przygotować kompletną pożywkę hodowlaną, dodając 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% roztworu penicyliny, streptomycyny i amfoterycyny B (PSA) do zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy.
- Przygoto....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Harmonogram protokołu przedstawiono w Rysunku 1A. Reprezentatywne obrazy procesu izolacji pokazano na Rysunku 2; warstwy naskórka i tkanki tłuszczowej zostały ostrożnie usunięte, a warstwę skóry właściwej podzielono na małe fragmenty o wielkości 3-4 mm2, które następnie zaszczepiono w szalkach Petriego.
Jak pokazano na rycinie 3A, kilka wypustek fibroblastów z fragmentów tkanki zaobserwowan.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Uzyskanie pierwotnych fibroblastów z tkanek keloidowych stanowi krytyczną podstawę do dalszych badań. Do tej pory istniały dwie metody pozyskiwania pierwotnych fibroblastów: trawienie enzymatyczne i hodowla eksplantatów 11,12,13,14. Jednak obie tradycyjne metody mają ograniczenia, takie jak podatność na zanieczyszczenie, mieszanie z innymi typami komórek, długi okres hodowli i niski wskaźnik su.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie ma żadnych konfliktów interesów, które można by zadeklarować.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (granty o numerach 81903189 i 82073418) oraz Fundacji Nauki i Technologii w Kantonie (grant numer 202102020025).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1,5 ml sterylna probówka wirówkowa | JETBIOFIL | CFT002015 | |
| 15 ml sterylna probówka wirówkowa | JETBIOFIL | 8076 | |
| 4% poliformaldehyd | Beyotime Biotechnology | P0099 | Utrwalanie komórek |
| 50 ml sterylna probówka wirówkowa | JETBIOFIL | 8081 | Umieść tkankę keloidową |
| Alexa Fluor-555 koza anty-królik IgG | Abcam | Alexa Fluor 555 | Drugie przeciwciało do testu barwienia immunofluorescencyjnego |
| Anti human CD90 | BioLegend | B301002 | Zidentyfikuj czystość fibroblastów |
| Rozcieńczalnik przeciwciał | Beyotime Biotechnology | P0262 | |
| Szafa bezpieczeństwa biologicznego | Thermo Scientific | 1300 seria A2 | Izolacja i hodowla komórek |
| Albumina surowicy bydlęcej | aladyn B265993 | Blokowanie do testu barwienia immunofluorescencyjnego | |
| Inkubator dwutlenku węgla | ESCO | CCL-170B-8 | Służy do hodowli komórek |
| Krioprobówki komórkowe | Corning | 43513 | Przechowuj komórki w niskotemperaturowej |
| maszynie odśrodkowej | Thermo Fisher | ST 16R | Odrzutowy supernatant |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1006 | Barwienie jądra komórkowego |
| DMSO | MP Biomedicals | 196055 | Stosowanie do konserwacji komórek |
| Zmodyfikowane podłoże orła firmy Dulbecco | Gibco | C11995500BT | Roztwór pożywki hodowlanej |
| Surowica bydlęca | płodu BI | 04-001-1A | |
| Cytometr przepływowy | BD | BD FACSCelesta | Obserwacja tożsamość komórek |
| zamrożonych w pudełku | Thermo Scientific | 5100-0050 | |
| Mikroskop odwrócony | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| Laserowy mikroskop konfokalny | Nikon | AIR-HD25 | Obserwacja testu barwienia immunofluorescencyjnego |
| Przeciwciało PDGFR-&alpha | CST | 3174T | Pierwsze przeciwciało do barwienia immunofluorescencyjnego |
| Roztwór penicyliny-streptomycyny-Am | Solarbio | P1410 | Dodać roztwór pożywki hodowlanej, aby uniknąć zanieczyszczenia |
| Szalka Petriego | JETBIOFIL | 7556 | Hodowla fibroblastów |
| Roztwór soli buforowany | fosforanem Gibco | C10010500BT | Roztwór pożywki hodowlanej |
| Królik (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE) | Technologia sygnalizacji komórkowej | 5742S | Jako kontrola cytometrii przepływowej |
| Okrągłe szkiełko nakrywkowe | Biosharp | 801007 | Hodowla komórkowa |
| Triton X 100 | Solarbio | T8200 | Wybij otwory w błonie komórkowej |
| Trypsyna-EDTA | Gibco | 25200072 | Stosowany do pasażowania komórek |
| Przeciwciało wimentyny | Abcam | ab8978 | Pierwsze przeciwciało do testu barwienia immunofluorescencyjnego |
Bibliografia
- Zhu, Y. Q., et al. Genome-wide analysis of Chinese keloid patients identifies novel causative genes. Annals Of Translational Medicine. 10 (16), 883(2022).
- Feng, F., et al. Biomechanical regulatory factors and th....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
