Artykuł metodologiczny

Izolacja i identyfikacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej szczurów Sprague Dawley

DOI:

10.3791/65172

⸱

7 kwietnia 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Doctorado en Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, 2Medical Research Unit in Biochemistry, Specialties Hospital, National Medical Center SXXI, Instituto Mexicano de Seguro Social, 3Department of Agricultural and Animal Production, Division of Biological and Health Science, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, 4Molecular Biology Research Laboratory, Center for Congenital Malformations, Children Hospital of Mexico Federico Gomez (HIMFG)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodologię izolowania i identyfikacji mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (MSC) od szczurów Sprague Dawley.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dorosłe komórki mezenchymalne zrewolucjonizowały biologię molekularną i komórkową w ostatnich dziesięcioleciach. Mogą różnicować się w różne wyspecjalizowane typy komórek, oprócz ich dużej zdolności do samoodnawiania, migracji i proliferacji. Tkanka tłuszczowa jest jednym z najmniej inwazyjnych i najbardziej dostępnych źródeł komórek mezenchymalnych. Doniesiono również, że ma wyższe plony w porównaniu z innymi źródłami, a także lepsze właściwości immunomodulujące. Ostatnio opublikowano różne procedury pozyskiwania dorosłych komórek mezenchymalnych z różnych źródeł tkankowych i gatunków zwierząt. Po ocenie kryteriów niektórych autorów ustandaryzowaliśmy metodologię, która ma zastosowanie do różnych celów i jest łatwa do odtworzenia. Pula zrębu frakcji naczyniowej (SVF) z tkanki tłuszczowej okołonerkowej i najądrza pozwoliła nam na opracowanie kultur pierwotnych o optymalnej morfologii i funkcjonalności. Komórki obserwowano przylegające do powierzchni tworzywa sztucznego przez 24 godziny i wykazywały morfologię podobną do fibroblastów, z wydłużeniami i tendencją do tworzenia kolonii. Techniki cytometrii przepływowej (FC) i immunofluorescencji (IF) zastosowano do oceny ekspresji markerów błonowych CD105, CD9, CD63, CD31 i CD34. Zdolność komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) do różnicowania się w linię adipogenną oceniano również za pomocą koktajlu czynników (4 μM insuliny, 0,5 mM 3-metylo-izobutyl-ksantyny i 1 μM deksametazonu). Po 48 godzinach zaobserwowano stopniową utratę morfologii fibroblastoidów, a po 12 dniach potwierdzono obecność kropelek lipidów dodatnich na czerwone zabarwienie olejem. Podsumowując, zaproponowano procedurę uzyskania optymalnych i funkcjonalnych kultur ASC do zastosowania w medycynie regeneracyjnej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) silnie wpłynęły na medycynę regeneracyjną ze względu na ich wysoką zdolność do samoodnawiania, proliferacji, migracji i różnicowania się w różne linie komórkowe1,2. Obecnie wiele badań koncentruje się na ich potencjale w leczeniu i diagnostyce różnych chorób.

Istnieją różne źródła komórek mezenchymalnych: między innymi szpik kostny, mięśnie szkieletowe, płyn owodniowy, mieszki włosowe, łożysko i tkanka tłuszczowa. Są one uzyskiwane od różnych gatunków, w tym ludzi, myszy, szczurów, psów i koni3. MSC pochodzące ze szpiku kostnego (BMSC) są stosowane od wielu lat jako główne źródło komórek macierzystych w medycynie regeneracyjnej oraz jako alternatywa dla stosowania embrionalnych komórek macierzystych4. Jednak MSCs pochodzące z tkanki tłuszczowej, czyli komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC), są ważną alternatywą o ogromnych zaletach ze względu na łatwość pobierania i izolacji, a także wydajność komórek uzyskanych na gram tkanki tłuszczowej5,6. Doniesiono, że wskaźnik zbioru ASC jest na ogół wyższy niż w przypadku BMSC7. Początkowo zaproponowano, że zdolność reparatywna/regeneracyjna ASC wynika z ich zdolności do różnicowania się w inne linie komórkowe8. Jednak badania przeprowadzone w ostatnich latach potwierdziły podstawową rolę czynników parakrynnych uwalnianych przez ASC w ich potencjale naprawczym9,10.

Tkanka tłuszczowa (AT), oprócz tego, że jest rezerwą energii, oddziałuje z układem hormonalnym, nerwowym i sercowo-naczyniowym. Bierze również udział we wzroście i rozwoju po urodzeniu, utrzymaniu homeostazy tkanek, naprawie i regeneracji tkanek. AT składa się z adipocytów, komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych, komórek śródbłonka, fibroblastów, monocytów, makrofagów, limfocytów, preadipocytów i ASC. Te ostatnie odgrywają ważną rolę w medycynie regeneracyjnej ze względu na ich niską immunogenność11,12. ASC można uzyskać przez trawienie enzymatyczne i obróbkę mechaniczną lub przez eksplantaty tkanki tłuszczowej. Pierwotne kultury ASC są łatwe w utrzymaniu, uprawie i ekspansji. Charakterystyka fenotypowa ASC jest niezbędna do zweryfikowania tożsamości komórek poprzez ocenę ekspresji specyficznych markerów błonowych przy użyciu metod takich jak immunofluorescencja i cytometria przepływowa13. Międzynarodowa Federacja Terapii i Nauki o Tłuszczu (IFATS) oraz Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowej (ISCT) zdefiniowały, że ASC wyrażają CD73, CD90 i CD105, podczas gdy brakuje im ekspresji CD11b, CD14, CD19, CD45 i HLA-DR14. Markery te, zarówno dodatnie, jak i ujemne, są zatem uważane za wiarygodne w charakterystyce ASC.

Ten projekt skupiał się na opisaniu procedury izolacji i identyfikacji dorosłych komórek mezenchymalnych pobranych z AT-u szczurów, ponieważ to źródło komórek nie stanowi etycznego wyzwania, w przeciwieństwie do embrionalnych komórek macierzystych. To sprawia, że procedura jest realną opcją ze względu na łatwość dostępu i minimalnie inwazyjną metodę w porównaniu z komórkami macierzystymi pochodzącymi ze szpiku kostnego.

Komórki mezenchymalne z tego źródła tkankowego odgrywają ważną rolę w medycynie regeneracyjnej ze względu na ich zdolności immunomodulacyjne i niskie odrzucenie immunologiczne. Dlatego niniejsze badanie jest fundamentalną częścią przyszłych badań nad ich sekretomem i ich zastosowaniem jako terapii regeneracyjnej w różnych chorobach, w tym chorobach metabolicznych, takich jak cukrzyca.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z meksykańskimi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami, opartymi na zaleceniach Międzynarodowego Stowarzyszenia Oceny i Akredytacji Międzynarodowej Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Meksyk). Protokół został sprawdzony, zatwierdzony i zarejestrowany przez Komitet Etyki ds. Badań nad Zdrowiem Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092).

1. Usuwanie tkanki tłuszczowej od szczurów za pomocą chirurgicznej resekcji

  1. Przygotować dwie stożkowe probówki z 20 ml sterylnego roztworu 1x antybiotyku z solą fizjologiczną i antybiotykiem buforowanym fosforanem (PBS-AA) (1x PBS, gentamycyna [20 μg/ml] i amfoterycyna [0,5 μg/ml]) i przechowywać na lodzie.
  2. Wybierz dwa dorosłe samce szczura Sprague Dawley (R. norvegicus) w dobrej kondycji zdrowotnej. Upewnij się, że szczury są w wieku 3-4 miesięcy i mają masę kopalną 350-450 g.
  3. Przejdź do sedacji chlorowodorkiem ksylazyny w dawce 20 mg/kg, a 5 minut później podaj dootrzewnowo środek znieczulający w dawce 120 mg/kg chlorowodorku ketaminy. Nasmaruj oba oczy maścią okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu. Następnie potwierdź głębokość znieczulenia poprzez brak odruchu pedałowania.
  4. Ogolić i zdezynfekować okolice brzucha i pachwinów roztworem jodu. Zastosuj obłożenia chirurgiczne, aby zachować sterylność. Następnie wykonaj środkowe nacięcie podłużne od mostka do okolicy jąder.
  5. Usuń tkankę tłuszczową otaczającą zarówno najądrza, jak i nerki za pomocą sterylnych kleszczy i umieść w 1x roztworze PBS-AA. Próbki należy przechowywać na lodzie.
  6. Zszyj nacięcie zamknięte, jeśli jest to wymagane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i poddaj zwierzęta eutanazji dawką dosercową 40 mg/kg pentobarbitalu sodu. Po stwierdzeniu zgonu zwłoki należy usunąć zgodnie z procedurami instytucjonalnymi.
    UWAGA: Śmierć wywołuje mechanizmy sygnalizacyjne , które wpływają na immunofenotyp, zdolność różnicowania i efekt parakrynny komórek mezenchymalnych. W związku z tym pobranie tkanek odbywa się przed eutanazją.

2. Izolacja komórek mezenchymalnych z tkanki tłuszczowej

  1. Usuń tkankę tłuszczową za pomocą sterylnych kleszczy w komorze bezpieczeństwa biologicznego i umieść ją na sterylnej bibule filtracyjnej na szalce Petriego o średnicy 100 mm, aby wchłonąć nadmiar PBS.
  2. Przenieś tkankę tłuszczową na inną szalkę Petriego i wykonaj trzy płukania po 5 minut każde 10 ml 1x roztworu PBS-AA za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
  3. Mechanicznie rozdrobnić tkankę na fragmenty o wielkości około 1cm2 za pomocą nożyczek i skalpela.
  4. Przygotuj kolagenazę typu IV (0,075%) w 20 ml niesuplementowanej modyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco. Przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,22 μm i utrzymać w temperaturze 37 °C.
  5. Dodać roztwór kolagenazy (20 ml) przygotowany w kroku 2.4 do kryształowej zlewki z rozdrobnioną tkanką i prętem magnetycznym. Zamknąć pojemnik i inkubować w powolnym i ciągłym mieszaniu w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Trawienie enzymatyczne trwa około 90 minut (utrzymuj powolne mieszanie, aby zachować integralność błon komórkowych).
  6. Przefiltrować homogenat przez filtr ze stali nierdzewnej o oczkach 40 mm i aperturze 0,38 mm na szalce Petriego o średnicy 100 mm i zebrać zawiesinę komórek w sterylnej probówce stożkowej o pojemności 50 ml.
  7. Dodaj 20 ml podgrzanego, uzupełnionego DMEM (10% płodowej surowicy bydlęcej [FBS], 2 mM glutaminy, 2 mM pirogronianu sodu, 100x roztworu aminokwasów endogennych i 100x roztworu przeciwgrzybiczego antybiotyku [AA]). Ostrożnie zawiesić frakcję naczyniową zrębu (SVE).
  8. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 290 x g przez 10 minut, odrzucić supernatant za pomocą pipety o pojemności 25 ml i delikatnie przemyć komórki 40 ml nieuzupełnionej pożywki DMEM.
  9. Powtórz ten krok. Użyj nowej sterylnej stożkowej rurki między stopniami, aby przeciągnąć jak najmniejszą ilość detrytusu komórkowego i tłuszczu.
  10. Zawiesić osad w 5 ml uzupełnionego DMEM za pomocą pipety o pojemności 5 ml i przenieść do butelki T-25 cm2. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  11. Następnego dnia wykonaj trzy płukania 5 ml podgrzanego 1x PBS-AA i dwa przemycia nieuzupełnionym DMEM, aby usunąć resztki komórek i nieprzylegające komórki. Dodaj 5 ml świeżego, podgrzanego, uzupełnionego DMEM za pomocą pipety o pojemności 5 ml i zmieniaj podłoże co 3-4 dni.

3. Utrzymanie i rozwój kultur pierwotnych ASC

  1. Gdy komórki osiągną 90%-100% konfluencji (8 ± 2 dni), przemyj dwukrotnie 5 ml niesuplementowanego DMEM. Dodać 1 ml podgrzanego 0,025% Trypsyna-2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i inkubować przez 5-7 minut w temperaturze 37 °C.
  2. Po odłączeniu monowarstwy komórek dodaj 4 ml uzupełnionego DMEM i delikatnie zdezagreguj zawiesinę komórkową.
  3. Przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, dodaj 5 ml podgrzanego, uzupełnionego DMEM i delikatnie zawiesij do homogenizacji.
  4. Wirować przy 290 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i delikatnie wymieszać osad w 1 ml uzupełnionego DMEM. Policz komórki w komorze Neubauera po zabarwieniu błękitem trypanowym.
  5. Na koniec wysiewaj 2,5 x 103 komórki/cm2 w stosunku podziału 1:4 w kolbach T-75. Ten krok zapewnia tworzenie kolonii i wysokie tempo proliferacji.

4. Charakterystyka morfologiczna kultur pierwotnych ASC

  1. Obserwuj morfologię ASC pod mikroskopem odwróconym.
    UWAGA: Przed montażem w celu identyfikacji histologicznej i ASC, szkiełka nakrywkowe należy potraktować 1% roztworem żelatyny. Naświetlać promieniami UV przez 15 min.
    1. Usuń szkiełka nakrywkowe z 70% roztworu etanolu i pozostaw do wyschnięcia na 5 minut.
    2. Zanurz szkiełka nakrywkowe w sterylnym 1% roztworze żelatyny, odcedź i wysusz w temperaturze pokojowej (RT).
    3. Umieścić każde szkiełko nakrywkowe w każdym dołku płytki 6-dołkowej i naświetlać płytki światłem UV przez 15 minut.
    4. Wysiew kroplę zawierającą 25 x 103 komórek w środku dołka, odczekaj 1 minutę i dodaj 1 ml uzupełnionej pożywki DMEM. Inkubować przez 96 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    5. Usuń pożywkę i wykonaj trzy płukania 1x PBS-AA za pomocą pipety transferowej.
    6. Dodać 1 ml 3,5% neutralnej formaliny do każdej studzienki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć formalinę i dodać 1 ml zimnego 70% etanolu do każdej studzienki.
    7. Uszczelnij płytkę parafilmem do czasu użycia, aby zapobiec wysychaniu.
      UWAGA: Morfologia komórkowa ASC jest również oceniana przez barwienie hematoksyliną-eozyną podczas różnych pasaży.
    8. Usuń 70% etanolu z każdej studzienki i nawadniaj komórki przez 5 minut wodą destylowaną. W międzyczasie przefiltruj roztwory barwiące.
    9. Usuń wodę i zabarwij komórki pod powolnym mieszaniem przez 15 minut roztworem hematoksyliny Harrisa.
    10. Usuń roztwór barwiący i wykonaj dwa mycia 1x PBS.
    11. Zabarwić komórki roztworem eozyny pod powolnym mieszaniem przez 1 minutę. Następnie usuń roztwór i wykonaj dwa płukania 1x PBS.
    12. Ostrożnie usunąć szkiełka nakrywkowe z każdej studzienki i zamontować szkiełka na kropli roztworu montażowego PBS-glicerol (1:1 v/v).
    13. Umieść linię lakieru do paznokci wokół szkiełka nakrywkowego i obserwuj szkiełka histologiczne pod mikroskopem świetlnym.

5. Markery ekspresji ASC metodą immunofluorescencji

  1. Przygotuj bufor do płukania zawierający 1x PBS-0,05% Tween 20. Pranie wykonuj w temperaturze pokojowej i z powolnym potrząsaniem. Umyć płytki trzy razy 2 ml buforu/studzienki (inkubować przez 3 minuty na każde przemycie).
  2. Umieścić 1 ml odczynnika blokującego (1:10) i inkubować z powolnym mieszaniem przez 20 minut.
  3. Dodać 200 μl (rozcieńczenie 1:50) następujących pierwszorzędowych przeciwciał do każdego dołka: CD9 (mysz monoklonalna), CD34 (poliklonalny królik) i anty-CD63 (poliklonalna koza). Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  4. Ponownie umyć płytki trzy razy i inkubować w 200 μl (rozcieńczenie 1:50) następujących przeciwciał drugorzędowych: koza sprzężona przeciwko mysim IgG FITC, antykozioł IgG DyeLight 550 i kozioł anty królik IgG Cy3.
  5. Przemyć trzykrotnie 1x PBS-0,05% Tween 20 i przeciwbarwić jądra komórkowe 100 μl DRAQ-7 (rozcieńczenie: 17 μl w 1 ml podwójnie destylowanej wody) przez 20 min.
  6. Umyj jeszcze trzy razy i zamontuj prowadnice zgodnie z krokami 4.1.12-4.1.13. Próbki należy przechowywać w sposób chroniony przed światłem i zamrożony do czasu użycia.
  7. Wizualizuj próbki pod mikroskopią konfokalną epifluorescencyjną przy użyciu odpowiednich ustawień i oprogramowania zalecanego dla tego sprzętu.

6. Markery ekspresji ASC metodą cytometrii przepływowej

  1. Dostosuj zawiesinę pojedynczej komórki z komórek trypsynizowanych lub rozmrożonych (podpasaże 3 lub 4) w stężeniu 1 x 106 komórek/ml 1x PBS-5% FBS. Porcja 100 μl ze 100 000 komórek w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Użyć jednej podwielokrotności bez etykietowania do kontroli autofluorescencji.
  2. Dodaj do reszty wszystkie odpowiednie ilości Anti-CD105 AF-594 i Anti-CD31 AF-680, zgodnie z instrukcjami producenta. Inkubować w ciemności przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Nadmiar plamy zmyć 1 ml 1x PBS-5% FBS przez odwirowanie przy 250 x g przez 5 minut i zawiesić w 300 μl 1% formaliny.
  4. Pobrać próbkę za pomocą cytometru przepływowego. Strategia bramkowania komórek opiera się na bramkowaniu FSC-A vs. SSC-A, pojedyncze komórki bramkowane przy użyciu SSC-H vs. SSC-A, a następnie FSC-A vs. FSC-H.
  5. Użyj detektora Y610-mCherry-A dla CD105 AF-594 i detektora R660-APC-A dla CD31 AF-680.

7. Różnicowanie ASC do linii adipogennej

  1. Na płytce 6-dołkowej wysiewać 1 x 104 komórki (P-4) nacm2 i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , aż do 60-80% konfluencji (~ 72-96 h). Wywołać różnicowanie, stosując bezpośrednio do pożywki hodowlanej: 4 μM insuliny, 1 μM 21-octanu deksametazonu (Dxa) i 0,5 mM 3-izobutylo-1-metyloksantyny (MIX). Zmieniaj podłoże różnicujące co 2-3 dni.
  2. Przygotować roztwór podstawowy insuliny o stężeniu 800 μM w 2 ml sterylnej wody ultraczystej (dodać 20 μl 1 N HCl, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie) i przechowywać w temperaturze -20 °C. Dodać 10 μl insuliny wyjściowej, uprzednio rozcieńczonej w stosunku 1:100, i zastosować 10 μl w końcowej objętości 2 ml na studzienkę.
  3. Przygotować roztwór podstawowy 1 mM Dxa w 5 ml sterylnej ultraczystej wody (należy pamiętać, że nie następuje pełne rozpuszczenie). Przechowywać w temperaturze 4 °C. Dodać 40 μl/basenik bulionu Dxa rozcieńczonego w stosunku 1:4.
  4. Przygotować zapas 100 mM MIX w 2,5 ml 0,1 N NaOH, odwirować i dodać 40 μl 1 N NaOH do całkowitego rozpuszczenia. Przechowywać w temperaturze -70 °C. Dodać 10 μl/dołek bulionu MIX.
  5. Przed przechowywaniem przefiltrować roztwory podstawowe przez sterylny filtr strzykawkowy 0,22 μm.
  6. W dniu 12 przemyć komórki trzykrotnie 1x PBS i inkubować z 500 μl 4 % formaliny przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć każdą studzienkę dwukrotnie wodą destylowaną, a następnie 60% izopropanolem przez 5 minut i pozostawić do wyschnięcia.
  7. Dodać 0,5% czerwonego oleju O rozcieńczonego w 60% izopropanolu (500 μl/studzienkę) i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć trzykrotnie 1 ml wody destylowanej i obserwować pod mikroskopem odwróconym.
    UWAGA: Aby uzyskać informacje o wymaganych odczynnikach, sprzęcie i materiałach, zapoznaj się z Tabelą materiałów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanka tłuszczowa została uzyskana od dorosłych szczurów Sprague Dawley w wieku 3-4 miesięcy i o masie ciała 401 ± 41 g (średnia geometryczna ± SD). Średnia wartość 3,8 g tkanki tłuszczowej najądrza i okołonerkowej odpowiadała analizie 15 ekstrakcji eksperymentalnych. Po 24 godzinach hodowli populacje komórek pozostały przyklejone do powierzchni tworzywa sztucznego i wykazywały niejednorodną morfologię. Pierwsze pasaże przeprowadzono po 8 ± 2 dniach, z wydajnością 1,4 ± 0,6 x 106 komórek w sumie w ośmiu eksper...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich czterdziestu lat, które upłynęły od odkrycia MSC, kilka grup badaczy opisało procedury pozyskiwania MSCs z różnych tkanek i gatunków. Jedną z zalet wykorzystania szczurów jako modelu zwierzęcego jest ich łatwa pielęgnacja i szybki rozwój, a także łatwość pozyskiwania MSCs z tkanki tłuszczowej. Opisano różne źródła tkanek do uzyskiwania ASC, takie jak tłuszcz trzewny, okołonerkowy, najądrza i podskórny 12,13,14,15,16....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są wdzięczni Meksykańskiemu Instytutowi Zabezpieczenia Społecznego (IMSS) i Szpitalowi Dziecięcemu Meksyku, Federico Gomezowi (HIMFG) oraz personelowi Bioterio z IMSS Research Coordination, za wsparcie udzielone do realizacji tego projektu. Dziękujemy Narodowej Radzie Nauki i Technologii za stypendium AOC (815290) oraz Antonio Duarte Reyesowi za wsparcie techniczne w zakresie materiałów audiowizualnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Amfoterycyna BHyCloneSV30078.01
Waga analitycznaSartoriusAX224
Przeciwciało anty-CD9 (C-4)Santa CruzSc-13118
Przeciwciało anty-CD34 (C-18)Santa CruzSc-7045
Przeciwciało anty-C63Santa CruzSc-5275
Przeciwciało anty-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 Santa CruzSc-18838A594
Przeciwciało anty-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680Santa CruzSc-18916AF680
Przeciwciało Koza anty-rabitt IgG (H+L) Cy3 NovusNB 120-6939
Przeciwciało przeciw kozom IgG (H+L) DyLight 550 InvitrogenSA5-10087
Przeciwciało anty-mysie IgG FITC sprzężona koza F (acute;)Systemy RD.Nr F103B
Filtr butelkowy SterylnyCORNING10718003
Kolby do hodowli komórkowych i tkankowychBIOFIL170718-312B
Licznik komórek Hemacytometr Bright-Line ze szkiełkami komory do liczenia komórekSIGMA Aldrich Z359629
Studnie komórkowe: 6 dołków z pokrywkąCORNING25810
Probówki stożkowe wirówki wirówkoweHeTTICHROTANA460R
Wirówka Probówki eppendorfFischer ScientificM0018242_44797
Collagen IV WorthingtonLS004186
CryovialSPL Life Science43112
ProbówkiGreiner Bio-One 191180
CytExpert 2.0Beckman CoulterWersja
Cytometr CytoFlex LXBeckman CoulterFLOW-2463VID03.17
DMEMGIBCO31600-034
DMSOSIGMA Aldrich 67-68-5
DraQ7 DyeThermo Sc. D15106
EDTASIGMA Aldrich60-00-4
Eozyna żółtawaHycel300
Etanol 96%Baker64-17-5
Probówki Falcon 15 mlGreiner Bio-One 188271
Falcon probówki 50 mlGreiner Bio-One 227261
Płodowa surowica bydlęca CORNING35-010-CV
ŻelatynaSIGMA Aldrich128111163
GentamycynaGIBCO15750045
Gliceryna-wysoka czystośćHerschi Trading 56-81-5
HematoksylinaAMRESCO 0701-25G
Heracell 240i CO2 Inkubator Thermo Sc.
Ketamin Pet (klorydenian ketaminy)ArandaSV057430
L-glutamina GIBCO/ Thermo Sc. 25030-081
Oprogramowanie LSM Zen 2009 V5.5Wersja
Szafa bezpieczeństwa biologicznego Klasa IINuAire12082100801
Mikroskop epifluorescencyjny Zeiss Axiovert 100M21.0028.001
Mikroskop odwrócony Olympus CK40CK40-G100
Aminokwasy endogenne 100XGIBCO11140050
Mikroprobówki 2 ml Sarstedt 72695400
Mikroprobówki 1,5 mlSarstedt 72706400
Mikropipety 0,2-2 μ LFinnpipetteE97743
Mikropipety 2-20 μ LFinnpipetteF54167
Mikropipety 20-200 μ LFinnpipetteG32419
Mikropipety 100-1000 μ LFinnpipetteFJ39895
Płyn zbiornikowy azotuTaylor-Wharton681-021-06
ParaformaldehydSIGMA Aldrich SLBC3029V
Penicylina / Streptomycyna GIBCO / Thermo Sc.
szalka Petriego Hodowla komórkowaCORNING Inc480167
Końcówki do pipetAxygen Scientific301-03-201
Pisabental (pentobarbital sodu)PISA AgropecuariaQ-7833-215
Chlorek potasu J.T.Baker7447-40-7
Fosforan potasu dwuzasadowyJ.T Baker2139900
Napełniacze do pipet S1Thermo Sc9531
Pipeta serologiczna 5 mlPYREXL010005
Pipeta serologiczna 10 mlPYREXL010010
Wodorowęglan soduJ.T Baker144-55-8
Chlorek sodu J.T.Baker15368426
Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodnyJ.T Baker7558-79-4
Pirogronian soduGIBCO BRL11840-048
Filtr strzykawkowy Sterylny
PerkinElmer Lambda 25L6020060
Wytrząsarka płytkowaLAB-LINE1250
Pipety transferoweSamco/Thermo Sc728NL
Trypan Blue plamaGIBCO1198566
Trypsyna z trzustki świniSIGMA Aldrich102H0234
Tween 20SIGMA Aldrich9005-64-5
Uniwersalny odczynnik blokujący 10xBioGenexHK085-GP
Xilapet 2% (chlorowodorek ksylazyny)Pet' s PharmaQ-7972-025
hodowlane darmowa50116047darmowa15140122 spektrofotometr CORNING 431222 Wytrząsarka płytkowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
  2. Greenwood, M. R., Hirsch, J. Postnatal development of adipocyte cellularity in the normal rat. Journal of Lipid Research. 15 (5), 474-483 (1974).
  3. González, M. Engineering of the cartilage tissue: application of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow for use in cartilage tissue regeneration. , Universidad de León. PhD thesis, http://hdl.handle.net/10612/3600 (2014).
  4. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
  5. Sherman, L. S., Conde-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419(2019).
  6. Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
  7. Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68(2019).
  8. Gittel, C., et al. Isolation of equine multipotent mesenchymal stromal cells by enzymatic tissue digestion or explant technique: comparison of cellular properties. BMC Veterinary Research. 9, 221(2013).
  9. Aliborzi, G., Vahdati, A., Mehrabani, D., Hosseini, S. E., Tamadon, A. Isolation, characterization and growth kinetic comparison of bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells of guinea pig. International Journal of Stem Cells. 9 (1), 115-123 (2016).
  10. Jurgens, W. J., et al. Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies. Cell and Tissue Research. 332 (3), 415-426 (2008).
  11. Secunda, R., et al. Isolation, expansion and characterisation of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood and matrix: a comparative study. Cytotechnology. 67 (5), 793-807 (2015).
  12. Tholpady, S. S., Katz, A. J., Ogle, R. C. Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 272 (1), 398-402 (2003).
  13. Yoshimura, K., et al. Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation: supportive use of adipose-derived stem/stromal cells. Aesthetic Plastic Surgery. 32 (1), 48-57 (2008).
  14. Si, Z., et al. Adipose-derived stem cells: Sources, potency, and implications for regenerative therapies. Biomedicine & Pharmacotherapy. 114, 108765(2019).
  15. Hammoud, S. H., AlZaim, I., Al-Dhaheri, Y., Eid, A. H., El-Yazbi, A. F. Perirenal adipose tissue inflammation: Novel insights linking metabolic dysfunction to renal diseases. Frontiers in Endocrinology. 12, 707126(2021).
  16. Liu, B. X., Sun, W., Kong, X. Q. Perirenal fat: A unique fat pad and potential target for cardiovascular disease. Angiology. 70 (7), 584-593 (2019).
  17. Lee, J., Han, D. J., Kim, S. C. In vitro differentiation of human adipose tissue-derived stem cells into cells with pancreatic phenotype by regenerating pancreas extract. Biochemical and Biophysical Research Communications. 375 (4), 547-551 (2008).
  18. Chandra, V., et al. Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice. PLoS One. 6 (6), e20615(2011).
  19. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
  20. Huang, S. J., Yang, W. S., Lin, Y. W., Wang, H. C., Chen, C. C. Increase of insulin sensitivity and reversal of age-dependent glucose intolerance with inhibition of ASIC3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 729-734 (2008).
  21. Jang, H. J., Cho, K. S., Park, H. Y., Roh, H. J. Adipose tissue-derived stem cells for cell therapy of airway allergic diseases in mouse. Acta Histochemica. 113 (5), 501-507 (2011).
  22. Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. Journal of Anatomy. 214 (5), 759-767 (2009).
  23. Zhang, S., et al. Identification and characterization of pig adipose-derived progenitor cells. Canadian Journal of Veterinary Research. 80 (4), 309-317 (2016).
  24. Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells and Development. 16 (1), 91-104 (2007).
  25. Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897(2018).
  26. Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
  27. Maumus, M., et al. Native human adipose stromal cells: localization, morphology, and phenotype. International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).
  28. Helmy, M. A., Mohamed, A. F., Rasheed, H. M., Fayad, A. I. A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile. Alexandria Journal of Medicine. 56 (1), 42-50 (2020).
  29. He, Q., Ye, Z., Zhou, Y., Tan, W. S. Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue. Turkish Journal of Biology. 42 (6), 477-489 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja kom rek macierzystychfrakcja naczyniowo zr bowcytometria przep ywowaanaliza immunofluorescencyjnar nicowanie adipogennemarkery powierzchniowe kom rekmedycyna regeneracyjna

Powiązane artykuły