Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Charakterystyka behawioralna mysiego modelu zespołu Angelmana

4.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65182

⸱

20 października 2023

 ,  , 
1Czech Centre for Phenogenomics, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences, 2Laboratory of Transgenic Models of Diseases, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt przedstawia zestaw wysoce powtarzalnych testów behawioralnych do walidacji mysiego modelu zespołu Angelmana.

Streszczenie

Ten manuskrypt opisuje zestaw testów behawioralnych dostępnych do scharakteryzowania fenotypów podobnych do zespołu Angelmana (AS) w ustalonym mysim modelu AS. Używamy paradygmatu uczenia się rotarod, szczegółowej analizy chodu i testu budowy gniazda, aby wykryć i scharakteryzować upośledzenie motoryczne zwierząt. Badamy emocjonalność zwierząt w otwartym terenie i testy podwyższone plus labirynt, a także afekt w teście zawieszenia ogona. Kiedy myszy z AS są testowane w teście w otwartym polu, wyniki należy interpretować ostrożnie, ponieważ dysfunkcje motoryczne wpływają na zachowanie myszy w labiryncie i zmieniają wyniki aktywności.

Powtarzalność i skuteczność prezentowanych testów behawioralnych została już potwierdzona w kilku niezależnych liniach myszy Uba3a z różnymi wariantami nokautu, co czyni ten zestaw testów doskonałym narzędziem walidacji w badaniach nad AS. Modele z odpowiednią konstrukcją i trafnością twarzy będą uzasadniać dalsze badania w celu wyjaśnienia patofizjologii choroby i umożliwienia opracowania metod leczenia przyczynowego.

Wprowadzenie

Zespół Angelmana (AS) jest rzadką chorobą neurorozwojową. Najczęstszym genetycznym pochodzeniem ZA jest duża delecja regionu 15q11-q13 chromosomu pochodzącego od matki, która występuje u prawie 74% pacjentów1. Delecja tego regionu powoduje utratę UBE3A, głównego genu sprawczego ZZSK, który koduje ligazę ubikwityny E3. Ojcowski allel genu UBE3A w neuronach jest wyciszany w procesie znanym jako imprinting. W konsekwencji, ojcowskie wdrukowanie genu pozwala tylko na matczyną ekspresję w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN)2. Dlatego delecja genu UBE3A z chromosomu pochodzącego od matki prowadzi do rozwoju objawów ZZSK. U ludzi AS objawia się w wieku około 6 miesięcy, z opóźnieniem rozwojowym, które utrzymuje się przez wszystkie etapy rozwoju i powoduje poważne objawy wyniszczające u osób dotkniętych chorobą3,4. Do podstawowych objawów zaburzenia należy deficyt zdolności motorycznych małych i dużych, w tym gwałtowny chód ataksyjny, poważne upośledzenie mowy i niepełnosprawność intelektualna. Około 80% pacjentów z ZA cierpi również na zaburzenia snu i epilepsję. Do tej pory jedynym dostępnym sposobem leczenia są leki objawowe, które zmniejszają napady padaczkowe i poprawiają jakość snu1. W związku z tym opracowanie solidnych modeli zwierzęcych z powtarzalnymi fenotypami behawioralnymi wraz z udoskonaloną analizą fenotypowania będzie niezbędne do wyjaśnienia patofizjologicznych mechanizmów zaburzenia i odkrycia skutecznych leków i metod leczenia.

Złożoność ludzkiego zaburzenia wpływającego na OUN wymaga, aby organizmy modelowe posiadały porównywalny genom, fizjologię i zachowanie. Myszy są popularne jako organizmy modelowe ze względu na ich krótki cykl rozrodczy, niewielkie rozmiary i względną łatwość modyfikacji DNA. W 1984 roku Paul Willner zaproponował trzy podstawowe kryteria walidacji modelu choroby: konstrukt, twarz i trafność predykcyjna, które są używane do określenia wartości modelu5. Po prostu trafność konstruktu odzwierciedla mechanizmy biologiczne odpowiedzialne za rozwój zaburzenia, trafność twarzy podsumowuje jego objawy, a trafność predykcyjna opisuje modelową odpowiedź na leki terapeutyczne.

Aby przestrzegać powyższych zasad, wybraliśmy najczęstszą etiologię genetyczną, dużą delecję matczynego locus 15q11.2-13q, w tym genu UBE3A, aby stworzyć model myszy AS. Użyliśmy techniki CRISPR/Cas9 do usunięcia regionu o długości 76 225 pz obejmującego cały gen UBE3A, obejmującego zarówno kodujące, jak i niekodujące elementy genu, u myszy z tła C57BL/6N 6. Następnie wyhodowaliśmy zwierzęta, aby uzyskać myszy heterozygotyczne UBE3A+/-. Do walidacji twarzy modelu wykorzystaliśmy zwierzęta z krzyżówek samic UBE3A+/- i samców typu dzikiego, aby uzyskać potomstwo UBE3A+/- (szczep o nazwie C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph, a następnie przypisane jako UBE3AmGenedel/+) i kontrolne rodzeństwo z miotu. Przetestowaliśmy ich umiejętności motoryczne, emocjonalność i afekt, aby podsumować podstawowe objawy ZZSK. W poprzednim artykule oceniliśmy również funkcje poznawcze zwierząt, ponieważ pacjenci z ZA również cierpią na niepełnosprawność intelektualną6. Nie znaleźliśmy jednak żadnych zaburzeń poznawczych u myszy UBE3AmGenedel/+, być może ze względu na młody wiek zwierząt w czasie testów7. Późniejsze badania starszych zwierząt, w wieku około 18 tygodni, ujawniły deficyt elastyczności behawioralnej podczas uczenia się odwróconego w paradygmacie preferencji miejsca. Jednak złożoność sprzętu zastosowanego do tej analizy wymaga osobnego modułu metodologicznego i nie został on tutaj uwzględniony.

Przedstawione tutaj testy behawioralne należą do powszechnie stosowanych narzędzi fenotypowania w badaniach genetycznych, dzięki ich wysokiej wartości predykcyjnej i wystarczającej trafności konstrukcji8,9,10. Wykorzystaliśmy te testy do walidacji mysiego modelu ZZSK poprzez rekapitulację podstawowych objawów choroby u ludzi w powtarzalny, niezależny od wieku sposób. Emocjonalność zwierzęcia oceniano w testach na podwyższonym plusie labiryntu i w otwartym polu. Oba te testy opierają się na konflikcie podejście-unikanie, w którym zwierzęta eksplorują nowe środowisko w poszukiwaniu pożywienia, schronienia lub możliwości krycia, jednocześnie unikając anksjogennych przedziałów11. Dodatkowo, test otwartego pola służy do testowania aktywności lokomotorycznej myszy8. Test zawieszenia ogona jest szeroko stosowany w badaniach nad depresją do badań przesiewowych pod kątem nowych leków przeciwdepresyjnych lub fenotypów podobnych do depresji w modelach nokautujących myszy12. Ten test ocenia rozpacz, jaką zwierzęta rozwijają z czasem w nieuniknionej sytuacji. Uczenie motoryczne i szczegółową charakterystykę chodu określono odpowiednio na rotarod i w DigiGait. Wytrzymałość zwierzęcia na pręcie przyspieszającym charakteryzuje jego umiejętności równowagi i koordynacji ruchów, podczas gdy szczegółowa analiza wzorców kroków myszy jest czułą oceną zaburzeń nerwowo-mięśniowych związanych z wieloma neurogeneracyjnymi zaburzeniami ruchowymi13,14,15. Test rozdrabniania gniazd jest częścią standardowej metodologii wykrywania impulsywnych zachowań u gryzoni, a ponieważ wykorzystuje naturalne zachowanie gryzoni, wskazuje na dobre samopoczucie zwierzęcia16,17.

Wielkość grup eksperymentalnych była wynikiem kompromisu, który miał na celu spełnienie wymagań reguły 3R i efektywne wykorzystanie wydajności hodowli kolonii. Jednak, aby uzyskać moc statystyczną, grupy liczyły nie mniej niż 10 osobników, ze względu na ustanowienie wystarczającej liczby par lęgowych. Niestety, wyniki hodowlane nie zawsze skutkowały wystarczającą liczbą zwierząt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie zwierzęta i eksperymenty użyte w tym badaniu przeszły ocenę etyczną i zostały przeprowadzone zgodnie z Dyrektywą Europejską 2010/63/UE. Badanie zostało zatwierdzone przez Czeską Centralną Komisję ds. Dobrostanu Zwierząt. Myszy trzymano w indywidualnie wentylowanych klatkach i utrzymywano w stałej temperaturze 22 ± 2 °C z 12-godzinnym cyklem światło/ciemność. Myszom podawano karmę dla myszy i wodę ad libitum. Myszy trzymano w grupach po trzy do sześciu zwierząt w klatce. Przed badaniem nie wykonywano żadnych czynności innych niż ważenie. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów i sprzętu użytego w niniejszym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Ogólne uwagi przed i w trakcie testowania

UWAGA: Dla jasności i zrozumiałości, ogólne komentarze są prezentowane przed opisem poszczególnych testów. Odnosi się to do każdego badania, z oczywistym wyjątkiem badania rozdrabniania gniazd, które jest przeprowadzane w pomieszczeniu w pomieszczeniu inwentarskim i nie wymaga użycia żadnego sprzętu doświadczalnego.

  1. Umieść zwierzęta w placówce badawczej na co najmniej 14 dni przed badaniem, aby zminimalizować stres wynikający z transportu i zmian w środowisku.
  2. Rejestruj wagę zwierząt przed badaniem, ponieważ waga jest częstym czynnikiem zakłócającym w badaniach behawioralnych.
  3. Pozostawić zwierzęta do zaaklimatyzowania się w pomieszczeniu doświadczalnym przez co najmniej 1 godzinę po przetransportowaniu z pomieszczenia inwentarskiego, aby zminimalizować stres związany z transportem, w każdym przypadku, gdy taki transport ma miejsce (tj. każde badanie opisane poniżej, z wyjątkiem rozdrabniania gniazd, które przeprowadza się w pomieszczeniu inwentarskim).
  4. Oznacz każde zwierzę na ogonie nietoksycznym markerem na bazie wody, aby umożliwić szybką identyfikację podczas eksperymentu.
  5. Po każdym badaniu usunąć cały mocz i kał zdeponowany przez zwierzęta w aparaturze doświadczalnej podczas badania.
  6. Przetrzyj całą aparaturę doświadczalną 75% alkoholem przed i po każdym badanym zwierzęciu. Czyszczenie usuwa ślady węchowe zdeponowane podczas badań i pomaga utrzymać stabilne warunki eksperymentalne.
  7. Zwierzęta należy przetransportować z ich klatki domowej do aparatury doświadczalnej z jak największą ostrożnością, najlepiej w małym nieprzezroczystym pojemniku, a następnie swobodnie je wypuścić, chyba że potrzebne są inne manipulacje.
  8. Po przeprowadzeniu testów każde zwierzę należy umieścić w tymczasowej klatce, aby zapobiec wpływowi zwierzęcia na niebadane zwierzęta w klatce domowej.
  9. Testuj samce i samice w kolejnych dniach. Zmieniaj kolejność różnych genotypów podczas testowania, aby zrównoważyć nieprzewidywalne czynniki środowiskowe między grupami eksperymentalnymi.
  10. Umieść zwierzęta z powrotem w ich klatce domowej po przetestowaniu wszystkich zwierząt i zwróć je z powrotem do pomieszczenia socjalnego.
  11. W przypadku powtarzania badań na zwierzętach należy zachować co najmniej 1-dniowy odstęp między każdym badaniem.

2. Testy behawioralne

  1. Podwyższony labirynt plus (EPM)
    UWAGA: Obie płcie szczepów myszy C57BL / 6NCrl i UBE3AmGenedel / + zostały przetestowane w tym badaniu w wieku 9-12 tygodni. Waga zwierząt wahała się od 22 do 36 g w przypadku samców i od 18 do 28 g w przypadku samic.
    1. Umieść labirynt w kształcie plusa na platformie testowej tuż pod kamerą. Za pomocą potencjometru na ścianie ustaw natężenie światła na 70 luksów w jego środku za pomocą luksomierza, z czujnikiem umieszczonym na środku labiryntu podczas regulacji.
    2. Otwórz oprogramowanie, klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania Viewer i załaduj konfigurację do testowania EPM, klikając ikonę w lewym górnym rogu zakładki Konfiguracja. Załaduj wtyczkę EPM z menu Plik. Wypełnij informacje o zwierzęciu za pomocą klawiatury komputera - identyfikator zwierzęcia, genotyp, płeć i informacje o eksperymencie (data, natężenie światła) - w odpowiednich polach zakładki Eksperyment. Sprawdź, czy położenie strefy, otwarte i zamknięte ramiona są prawidłowo skonfigurowane. Za pomocą kontroli wizualnej i myszy komputerowej upewnij się, że wirtualne zarysowane strefy pasują do odpowiednich stref EPM na podglądzie wideo.
    3. EPM to test stosowany do oceny ogólnego lęku zwierzęcia, który opiera się na konflikcie podejście – unikanie. Gryzonie naturalnie mają tendencję do unikania dobrze oświetlonych, niechronionych obszarów (otwarte ramiona), na rzecz bezpieczniejszych (zamknięte ramiona). Ponieważ ten w pełni zautomatyzowany test opiera się na systemie śledzenia wideo, oprogramowanie pozwala oprogramowaniu automatycznie obliczać czas spędzony w każdej strefie, a także liczbę wejść.
    4. Podczas testów nagrywaj zwierzęta na wideo za pomocą przemysłowej kamery światłoczułej na podczerwień. Pozwól oprogramowaniu wykrywać pozycję zwierzęcia w czasie rzeczywistym podczas nagrywania. Następnie pozwól oprogramowaniu automatycznie ocenić ślady zwierzęcia, aby obliczyć wszystkie parametry opisujące zachowanie zwierzęcia w labiryncie. Wykorzystaj czas spędzony w przeciwlękowych otwartych ramionach i odsetek wizyt w otwartych ramionach, aby ocenić poziom zachowań podobnych do lęku u zwierząt.
      UWAGA: Wykonany na zamówienie labirynt wykonany jest z materiału przepuszczającego światło podczerwone i jest umieszczony na platformie źródła światła podczerwonego z diodą elektroluminescencyjną (LED).
    5. Umieść kursor myszy na ikonie strzałki w lewym górnym rogu zakładki Akwizycja. Wyjmij zwierzę ręcznie z klatki domowej i delikatnie umieść je na środku EPM. Uruchom protokół, klikając lewym przyciskiem myszy na komputerze i natychmiast opuść pomieszczenie eksperymentalne.
    6. Gdy protokół nagrywania zakończy się po 5 minutach swobodnej eksploracji labiryntu, zapisz nagrane dane, klikając OK w oknie, które pojawi się po zakończeniu protokołu, nazwij plik odpowiednio i kliknij Zapisz. Eksportuj wyniki do pliku .csv dla każdego badanego zwierzęcia w celu analizy off-line, klikając ikonę w lewym panelu pionowym zakładki Analiza danych.
    7. Usuń zwierzę z labiryntu ręcznie i umieść je w tymczasowej klatce. Kontynuuj testowanie wszystkich zwierząt w ten sam sposób. Skopiuj wyniki dla wszystkich badanych zwierząt do pliku Notatnika w celu analizy off-line, klikając ikonę Kopiuj wyniki w zakładce wyników wtyczki labiryntu Elevated Plus.
      UWAGA: Oprogramowanie i sprzęt mogą się różnić i należy postępować zgodnie z odpowiednimi instrukcjami. Ponadto konfiguracja eksperymentalna, taka jak oświetlenie lub rozmieszczenie komputera, może się różnić w zależności od konstrukcji obiektu dla zwierząt.
  2. Test w otwartym polu (OF)
    UWAGA: Test na otwartym polu ocenia ogólny ruch zwierzęcia, który jest wywoływany przez zachowanie eksploracyjne w nowym środowisku. Ponadto jest powszechnie stosowany jako narzędzie przesiewowe do wykrywania ogólnego lęku w niezabezpieczonej, dobrze oświetlonej przestrzeni. Jest to w pełni zautomatyzowany test, który wykorzystuje system śledzenia wideo, który został również wykorzystany w poprzednim teście.
    1. Umieść cztery pudełka testowe OF na platformie testowej tuż pod kamerą. Za pomocą potencjometru na ścianie ustaw natężenie światła na 200 luksów w środku każdego testu OF za pomocą luksomierza, z czujnikiem umieszczonym na środku każdego pudełka podczas regulacji.
    2. Otwórz oprogramowanie, klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania przeglądarki i załaduj konfigurację do testowania OF, klikając ikonę w lewym górnym rogu zakładki Konfiguracja. Wypełnij informacje o zwierzęciu za pomocą klawiatury komputera - identyfikator zwierzęcia, genotyp, płeć i informacje o eksperymencie (data, natężenie światła) - w odpowiednich polach eksperymentu zakładka. Sprawdź, czy położenie strefy (środek i obrzeża) pasuje do pól testowych OF i dostosuj je w razie potrzeby. Za pomocą kontroli wizualnej i myszy komputerowej upewnij się, że wirtualne zarysowane centrum i strefy peryferyjne pasują do odpowiednich stref testowych OF na podglądzie wideo.
    3. Podczas testów nagraj zwierzęta na wideo za pomocą przemysłowej kamery światłoczułej na podczerwień. Pozwól oprogramowaniu wykryć pozycję zwierzęcia w czasie rzeczywistym podczas nagrywania i automatycznie ocenić ślady zwierzęcia w celu obliczenia wszystkich parametrów opisujących zachowanie zwierzęcia w polu testowym OF. Przebyty dystans, średnia prędkość i czas odpoczynku są parametrami używanymi do oceny aktywności zwierząt w nowym środowisku, podczas gdy liczba wejść do centrum i czas trwania w ośrodku opisują zachowania podobne do lęku u zwierząt.
      UWAGA: Wykonany na zamówienie labirynt wykonany jest z materiału przepuszczającego światło podczerwone i jest umieszczony na platformie źródła światła podczerwonego LED.
    4. Umieść kursor myszy na ikonie strzałki w lewym górnym rogu zakładki Akwizycja. Wyjmij ręcznie cztery zwierzęta z klatki domowej i delikatnie umieść je w rogu każdego pudełka testowego OF. Uruchom protokół, klikając lewym przyciskiem myszy na komputerze i natychmiast opuść pomieszczenie eksperymentalne.
    5. Gdy protokół zakończy się po 10 minutach swobodnej eksploracji labiryntu, zapisz dane, klikając OK w oknie, które pojawi się po zakończeniu protokołu, nazwij plik odpowiednio i kliknij Zapisz. Eksportuj wyniki do pliku .csv dla każdego badanego zwierzęcia w celu analizy off-line, klikając ikonę w lewym panelu pionowym zakładki Analiza danych.
    6. Usuń zwierzęta z labiryntu ręcznie i umieść je w tymczasowej klatce. Kontynuuj testowanie wszystkich zwierząt w ten sam sposób. Analizowanie wyeksportowanych danych.
      UWAGA: Oprogramowanie i sprzęt mogą się różnić i należy postępować zgodnie z odpowiednimi instrukcjami. Ponadto konfiguracja eksperymentalna, taka jak oświetlenie, liczba labiryntów lub rozmieszczenie komputerów, może się różnić w zależności od konstrukcji obiektu dla zwierząt.
  3. Test zawieszenia ogonowego (TST)
    UWAGA: Trzy myszy są testowane jednocześnie za pomocą automatycznego aparatu do zawieszania ogona.
    1. Utrzymuj natężenie światła w pomieszczeniu na poziomie 100-120 luksów.
    2. Połącz system TST z komputerem za pomocą USB. Włóż klucz USB do komputera i uruchom oprogramowanie, klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania BIO-TST. Na karcie Ustawienia w obszarze Globalne dostosuj czas trwania akwizycji na 360 s. Na karcie Eksperyment wybierz opcję Nowa lista tematów i utwórz nowy plik eksperymentu oraz nową listę badanych obiektów, postępując zgodnie z instrukcjami w otwartej karcie.
    3. Rozpocznij bieg, klikając przycisk Rozpocznij bieg | kontynuuj w zakładce Akwizycja. Przygotuj zwierzęta do testu, owijając jednostronną taśmę klejącą, taką jak taśma medyczna transpore, wokół 3/4 ogona zwierzęcia, zaczynając od podstawy.
    4. Przełóż hak do zawieszania przez taśmę i zawieś na nim zwierzę. Rozpocznij zbieranie danych dla każdego zwierzęcia z osobna natychmiast po zawieszeniu go na haku, klikając ikonę Start pod wizualizacją pozycji dla każdego zwierzęcia i obserwuj zwierzęta w sposób ciągły podczas testu.
    5. Po zakończeniu pozyskiwania pierwszego zestawu zwierząt kliknij przycisk Zainicjuj następny bieg, zdejmij zwierzęta z haka, odłącz taśmę klejącą od ich ogonów, ostrożnie przecinając taśmę nożyczkami wzdłuż ogona i umieść zwierzęta w tymczasowej klatce.
    6. Oczyść aparat 75% alkoholem i chusteczkami papierowymi i postępuj z resztą zwierząt zgodnie z powyższym opisem. Na karcie Analiza wybierz ostatnie 4 minuty akwizycji do analizy, a następnie zaznacz wszystkie ważne przebiegi w okresie Analizy, kliknij Analizuj wybrane obiekty, wybierz żądany format danych, a następnie kliknij Eksportuj wybrane dane, aby wyeksportować zebrane dane do dalszej analizy.
      UWAGA: Test trwa 6 min. W ciągu pierwszych 2 minut zwierzęta będą energicznie walczyć, ale ponieważ reakcja rozpaczy staje się powszechna w ciągu pozostałych 4 minut, do analizy bierze się czas bezruchu w tym okresie. Oprogramowanie i sprzęt mogą się różnić i należy postępować zgodnie z odpowiednimi instrukcjami. Dodatkowo sam sprzęt może się różnić (np. liczba stanowisk testowych).
  4. Analiza chodu
    1. Włącz bieżnię i ręcznie ustaw prędkość taśmy na 20 cm/s na panelu wyposażenia, klikając symbol + lub - znajdujący się obok wskaźnika prędkości. Włącz lampkę urządzenia, obracając pokrętło zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Uruchom oprogramowanie DigiGait Imager, klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania i ustaw czas otwarcia migawki na 100 dla myszy albinosów lub 130 dla czarnych/ciemnych myszy w terenie dla czasu otwarcia migawki.
    2. Wyjmij ręcznie pierwsze zwierzę z domowej klatki i delikatnie umieść je na pasie bieżni. Zamknij drzwi przedziału dla zwierząt. Sprawdź wzrokowo, aby upewnić się, że ogon zwierzęcia nie utknął między drzwiami a ościeżnicą.
    3. Pozwól myszy zbadać pas bieżni przed nagrywaniem. Upewnij się, że zwierzę jest w stanie wykonać test, ustawiając bieżnię na niską prędkość chodzenia na ~3 s, a następnie zatrzymując ją, obserwując zwierzę w sposób ciągły.
    4. Uruchom pas, naciskając przycisk Start na panelu urządzenia i nagrywaj przez około 10 sekund. Upewnij się, że można zaobserwować wyraźną i płynną lokomocję o długości co najmniej 10-15 kroków. Zatrzymaj pasek, naciskając przycisk Stop na panelu sprzętu i ręcznie umieść mysz w tymczasowej klatce.
    5. Zekranuj nagranie pod kątem sekwencji obrazów z płynnymi krokami, klikając przycisk ODTWÓRZ i przeglądając nagranie za pomocą kontroli wizualnej w trybie EDYCJI. Wybierz 10-15 płynnych ruchów, ręcznie wpisując ich początkowe i końcowe numery klatek w odpowiednich polach (Od klatki# dla pierwszej klatki i Do dla ostatniej klatki). Wypełnij informacje o zwierzęciu - identyfikator zwierzęcia, datę urodzenia, płeć, wagę, prędkość pasa i kąt nachylenia pasa - i w razie potrzeby skomentuj w odpowiednich polach. Zapisz plik do dalszej analizy, klikając przycisk Zapisz.
    6. Wyczyść taśmę wodą i postępuj w ten sam sposób z resztą zwierząt. Wybierz KAMERA, aby kontynuować nagrywanie następnego spaceru ze zwierzęciem. Po uzyskaniu nagrań dla wszystkich zwierząt przejdź do analizy.
      UWAGA: Zwierzęta, które nie są w stanie chodzić z ustaloną prędkością pasa, są wyłączone z badań. Na podstawie naszego doświadczenia obserwujemy, że starsze zwierzęta (powyżej 50 tygodnia) doświadczają większych trudności z chodzeniem po bieżni, ze zmienną częstością od 2% do 50% w zależności od genotypu. Odchody zwierzęce są zbierane na tacach z przodu lub z tyłu bieżni. Tace są opróżniane po każdym badaniu i myte ciepłą wodą z mydłem. Pasek przeciera się wilgotną szmatką.
    7. Wykonuj analizę chodu w oparciu o w pełni zautomatyzowaną analizę nagrań wideo odcisków stóp zwierząt. Dostosuj dane w oprogramowaniu DigiGait Analysis.
      UWAGA: Analiza chodu dostarcza nie tylko miary koordynacji ruchowej, ale także szczegółowego opisu kinematycznego opartego na analizie dynamicznego sygnału chodu, reprezentującego czasową historię ułożenia łapy poprzez sekwencyjne kroki. Następujące parametry są automatycznie mierzone przez oprogramowanie: czas trwania wymachu, procent czasu trwania kroku podczas wymachu, czas hamowania, procent czasu trwania kroku podczas hamowania, czas trwania napędu, procent kroku w napędzie, czas trwania podpory, procent kroku w podporze, czas trwania kroku, procent hamowania w postawie, procent napędu w fazie podporu, stosunek wymachu do podporu, długość kroku, częstotliwość kroku, kąt łapy, zmienność kąta łapy, szerokość podparcia, kąt kroku, zmienność długości kroku, zmienność szerokości kroku, zmienność kąta kroku, współczynnik zmienności długości kroku, współczynnik zmienności szerokości podpory, współczynnik zmienności kąta kroku, współczynnik zmienności czasu trwania wymachu, powierzchnia łapy w postawie szczytowej, zmienność powierzchni łapy w postawieniu szczytowym, czas trwania wspólnej postawy kończyn tylnych, procent wspólnej postawy, stosunek czasu trwania lewego i prawego tylnego podparcia, symetria chodu, maksymalna szybkość zmiany powierzchni łapy stykającej się z pasem bieżni podczas fazy hamowania, maksymalna szybkość zmiany powierzchni łapy stykającej się z pasem bieżni podczas fazy napędu, napęd tau, odległość nakładania się łap, Ułożenie łapy, umiejscowienie, współczynnik ataksji, odległość od linii środkowej, odległość osi i opór łapy. Oprogramowanie pozwala na niewielką korektę szumu śladu krokowego, która powinna zostać wykonana przed analizą statystyczną. Oprogramowanie i sprzęt mogą się różnić i należy postępować zgodnie z odpowiednimi instrukcjami.
  5. Rotarod
    UWAGA: Test rotarodu służy do oceny funkcji motorycznych gryzoni - równowagi i koordynacji ruchowej. Badanie wymaga, aby mysz chodziła po obracającym się pręcie o stałej średnicy (5 cm), przy czym obrót przyspiesza w określonym czasie (5 minut), aż zwierzę nie może już na nim uchodzić.
    1. Włącz sprzęt rotarod, naciskając włącznik/wyłącznik na urządzeniu i uruchom oprogramowanie, klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania Rod. Zainicjuj nowy plik na karcie Plik i zapisz go pod odpowiednią nazwą. W oknie Setup (Konfiguracja) wypełnij szczegóły eksperymentu, takie jak data, nazwa użytkownika i ewentualne komentarze. Ustaw profil prędkości na 300 s, prędkość początkową na 4 obr./min, a prędkość końcową na 40 obr./min.
    2. Przygotuj harmonogram dla badanych zwierząt w polu Zwierzę i przypisz każde zwierzę do swojej pozycji na pręcie. Pozycje nie są wyraźnie wskazane w oprogramowaniu, ale odpowiadają wierszowi listy; Na przykład pierwsza linia wskazywałaby pierwszą pozycję pręta, piąta linia wskazywałaby piątą pozycję pręta i tak dalej. Pamiętaj, aby zrównoważyć każdą pozycję pręta między grupami eksperymentalnymi.
      UWAGA: Jednocześnie można testować pięć zwierząt.
    3. Zamknij panel Ustawienia, klikając przycisk Zamknij, a następnie otwórz panel pomiarowy, klikając przycisk Zmierz. Rozpocznij początkowy obrót pręta przy 4 obr./min, klikając Start/Stop i umieść pierwsze pięć zwierząt na przypisanych im pozycjach. Gdy wszystkie zwierzęta znajdą się na pręcie, rozpocznij protokół testowania, klikając Start Profile, a pręt będzie stopniowo przyspieszał do 40 obr./min w ciągu 5 minut. Jeśli zwierzę spadnie z pręta, włóż je z powrotem do pręta przed rozpoczęciem protokołu.
      UWAGA: Zwierzęta zwykle nie pozostają na pręcie wystarczająco długo, aby umieścić na nim wszystkie myszy naraz podczas pierwszej próby. Ważne jest, aby uzbroić się w cierpliwość podczas umieszczania zwierząt na pręcie ze stałą prędkością obrotową na początku. Celem badania nie jest określenie wytrzymałości zwierzęcia na pręcie przy ustalonej prędkości obrotowej, ale określenie prędkości, przy której zwierzę nie jest w stanie utrzymać się na pręcie. Prędkość pręta jest proporcjonalna do opóźnienia przebywania na nim; W ten sposób służy do wyrażania równowagi zwierzęcia.
    4. Przenieść zwierzęta do tymczasowej klatki, gdy wszystkie spadną z pręta lub po upływie 5 minut. Usuń wszelkie odchody zwierzęce i wyczyść pręt i tacę alkoholem.
    5. Kliknij Zwierzęta ->, aby kontynuować z następną grupą zwierząt w ten sam sposób. Po przetestowaniu wszystkich zwierząt zamknij okno Miara, klikając przycisk Zamknij, a następnie kliknij przycisk Pokaż, aby wyświetlić zebrane dane. Wyeksportuj pozyskane dane w .csv formacie pliku do dalszej analizy, klikając przycisk Eksportuj plik CSV.
    6. Przetestuj każde zwierzę na pręcie trzy razy w 15-minutowych odstępach międzypróbnych. Użyj uśrednionej wartości opóźnienia, aby przeskoczyć przez trzy próby w celu dalszej analizy statystycznej. Oceń uczenie się motoryczne zwierzęcia, powtarzając test przez 5 kolejnych dni.
      UWAGA: Oprogramowanie i sprzęt mogą się różnić i należy postępować zgodnie z odpowiednimi instrukcjami. Dodatkowo sam sprzęt może się różnić, na przykład liczbą stanowisk testowych, ogólną konstrukcją i wymiarami pręta.
  6. Budynek gniazda do rozdrabniania gniazd
    1. Podziel zwierzęta na pojedyncze klatki dla myszy z poliwęglanu ze standardowym wyposażeniem (ściółka, siatka na żywność i zapas wody) na 1 tydzień. Weź około 12 g bawełnianego gniazda za pomocą kleszczy, zarejestruj jego wagę ręcznie za pomocą wagi i umieść je losowo w klatce, ale po przeciwnej stronie do źródła wody. Zwróć klatki ze zwierzętami do pomieszczenia inwentarskiego.
    2. Waż każde gniazdo codziennie o tej samej porze przez następne 4 dni ręcznie za pomocą wagi. Zapisz wagi na papierze lub w gotowym arkuszu kalkulacyjnym. Upewnij się, że każde gniazdo jest suche po zważeniu; Jeśli nie, wysusz na poduszce grzewczej i włóż wszystkie gniazda z powrotem do przypisanych im klatek w tym samym czasie w miejscu, w którym mysz założyła gniazdo. Jeśli gniazdo jest rozdarte na kilka części, zważ największą.
    3. Na potrzeby analizy danych należy wyrazić spadek masy gniazda w każdym dniu w stosunku do masy początkowej i przedstawić go jako procent użytego materiału.
      UWAGA: Powrót samców do wspólnej klatki może prowadzić do zwiększenia agresji i niepożądanych obrażeń wśród zwierząt. W związku z tym badanie rozdrabniania gniazd powinno być zaplanowane pod koniec schematu badania, aby uniknąć pogorszenia dobrostanu zwierząt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Test podwyższonego labiryntu plus oraz test otwartej przestrzeni
Testy EPM i OF wykorzystują naturalną tendencję gryzoni do eksploracji nowych środowisk18,19. Eksploracja jest sterowana konfliktem podejście-unikanie, w którym gryzonie wybierają między badaniem nowego otoczenia a unikaniem potencjalnego niebezpieczeństwa. Zwierzęta eksplorują nieznane miejsca w poszukiwaniu schronienia, kontaktu społecznego lub pożywienia. Jednakże nowe miejsc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Modele AS stworzone w różnych szczepach myszy są powszechnie walidowane za pomocą testów stanu emocjonalnego zwierząt, funkcji motorycznych i zdolności poznawczych, aby ułatwić porównanie z objawami ludzkimi31,32. Deficyt motoryczny w modelach AS jest najbardziej spójnym odkryciem we wszystkich laboratoriach, po którym następuje niezmieniony stan emocjonalności mutantów i trudności w budowaniu gniazd 31,32,33.<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez RVO 68378050 Czeskiej Akademii Nauk, LM2018126 Czeskie Centrum Fenogenomiki dostarczone przez MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (Modernizacja Czeskiego Centrum Fenogenomiki: rozwój w kierunku badań transgenicznych przez MEYS i ESIF), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (Modernizacja infrastruktury CCP II przez MEYS i ESIF) oraz OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (wyższa jakość i zdolność do modeli transgenicznych przez MEYS i Europejskiego Funduszu Rozwoju Obszarów Wiejskich). Ponadto badanie to otrzymało finansowanie od organizacji pozarządowej "Stowarzyszenie Terapii Genowej (ASGENT)", Czechy (https://asgent.org/) oraz LM2023036 Czeskie Centrum Fenogenomiki zapewnione przez Ministerstwo Edukacji, Młodzieży i Sportu Republiki Czeskiej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Klatki indywidualnie wentylowaneTechniplast
DigiGaitMouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level
Unit 110
Framingham, MA 01701, USA		Sprzęt został ogłoszony w przetargu, nie podano numeru katalogu , ani nie można go było znaleźć na stronie internetowej firmySzczegółowa analiza chodu myszy, dostarczony sprzęt i oprogramowanie. 
FDA Nestletsquares Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, Wielka BrytaniaMateriał został zakupiony od dostawcy Velaz za pośrednictwem bezpośredniego zapytania e-mail. Velaz nie podaje żadnego numeru katalogowego.Bawełniane gniazda do testu budowy gniazda. Opis gniazda: 2-3 g każdy, o średnicy około 5 x 5 x 0,5 cm.
Wóz dla myszyAltramion
RotarodTSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4
12489 Berlin, Niemcy		Sprzęt został ogłoszony w drodze przetargu, nie podano numeru katalogu, ani nie można go było znaleźć na stronie internetowej firmyRotarod dla 5 myszy, dostarczony sprzęt i oprogramowanie. Wymiary bębna: średnica: 30 mm, szerokość na pas: 50 mm, odległość spadania 147 mm.
Test zawieszenia ogonaBioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles
FRANCJA		Indeks: BIO-TST5W pełni zautomatyzowany sprzęt do oceny czasu bezruchu 3 myszy zawieszonych na ogonie, dostarczony sprzęt i oprogramowanie
Taśma medyczna TransporeMedical M, Ltd.P-AIRO1291Taśma służąca do przytwierdzania zwierzęcia do haka za ogon.
Przeglądarka - Video Tracking SystemBiobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A
53111 Bonn, Niemcy		Sprzęt wraz z oprogramowaniem został zamówiony, nie podano numeru katalogu, ani nie można go było znaleźć na stronie internetowej firmy Oprogramowaniez niestandardowym sprzętem: labirynt, baza IR, kamery czułe na podczerwień. Wymiary na wymiary: powierzchnia 42 x 42 cm, ściana o wysokości 49 cm, powierzchnia strefy środkowej: 39 cm2. Wykonany na zamówienie EPM został podniesiony 50 cm nad podłogą, z otwartym ramieniem o długości 79 cm,   9 cm szerokości i zamknięte ramię 77 cm długości, 7,6 cm szerokości.

Bibliografia

  1. Kalsner, L., Chamberlain, S. J. Prader-Willi, Angelman, and 15q11-q13 duplication syndromes. Pediatric Clinics of North America. 62 (3), 587-606 (2015).
  2. Yamasaki, K., et al. Neurons but not glial cells show reciprocal imprinting of sense and antisense transcripts of Ube3a. Human Molecular Genetics. 12 (8), 837-847 (2003).
  3. Clayton-Smith, J., Laan, L. Angelman syndrome: a review of the clinical and genetic aspects. Journal of Medical Genetics. 40 (2), 87-95 (2003).
  4. Jolleff, N., Ryan, M. M. Communication development in Angelman's syndrome. Archives of Disease in Childhood. 69 (1), 148-150 (1993).
  5. Willner, P. The validity of animal models of depression. Psychopharmacology. 83 (1), 1-16 (1984).
  6. Syding, L. A., et al. Generation and characterization of a novel Angelman syndrome mouse model with a full deletion of the Ube3a gene. Cells. 11 (18), 2815(2022).
  7. Huang, H. -S., et al. Behavioral deficits in an Angelman syndrome model: effects of genetic background and age. Behavioural Brain Research. 243, 79-90 (2013).
  8. Choleris, E., Thomas, A. W., Kavaliers, M., Prato, F. S. A detailed ethological analysis of the mouse open field test: effects of diazepam, chlordiazepoxide and an extremely low frequency pulsed magnetic field. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 25 (3), 235-260 (2001).
  9. Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: review of pharmacological and genetic studies in mice. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 29 (4-5), 571-625 (2005).
  10. Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature Protocols. 2 (2), 322-328 (2007).
  11. Carola, V., D'Olimpio, F., Brunamonti, E., Mangia, F., Renzi, P. Evaluation of the elevated plus-maze and open-field tests for the assessment of anxiety-related behaviour in inbred mice. Behavioural Brain Research. 134 (1-2), 49-57 (2002).
  12. Yan, H. -C., Cao, X., Das, M., Zhu, X. -H., Gao, T. -M. Behavioral animal models of depression. Neuroscience Bulletin. 26 (4), 327-337 (2010).
  13. Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behavioural Brain Research. 311, 340-353 (2016).
  14. Knippenberg, S., Thau, N., Dengler, R., Petri, S. Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Behavioural Brain Research. 213 (1), 82-87 (2010).
  15. Farr, T. D., Liu, L., Colwell, K. L., Whishaw, I. Q., Metz, G. A. Bilateral alteration in stepping pattern after unilateral motor cortex injury: a new test strategy for analysis of skilled limb movements in neurological mouse models. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 104-113 (2006).
  16. Jirkof, P. Burrowing and nest building behavior as indicators of well-being in mice. Journal of Neuroscience Methods. 234, 139-146 (2014).
  17. Wulaer, B., et al. Repetitive and compulsive-like behaviors lead to cognitive dysfunction in Disc1Δ2-3/Δ2-3 mice. Genes, Brain, and Behavior. 17 (8), 12478(2018).
  18. Glickman, S. E., Hartz, K. E. Exploratory behavior in several species of rodents. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 58, 101-104 (1964).
  19. La-Vu, M., Tobias, B. C., Schuette, P. J., Adhikari, A. To approach or avoid: an introductory overview of the study of anxiety using rodent assays. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 145(2020).
  20. Karolewicz, B., Paul, I. A. Group housing of mice increases immobility and antidepressant sensitivity in the forced swim and tail suspension tests. European Journal of Pharmacology. 415 (2-3), 197-201 (2001).
  21. Liu, X., Gershenfeld, H. K. Genetic differences in the tail-suspension test and its relationship to imipramine response among 11 inbred strains of mice. Biological Psychiatry. 49 (7), 575-581 (2001).
  22. Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. Journal of the American Pharmaceutical Association. 46 (3), 208-209 (1957).
  23. Dorman, C. W., Krug, H. E., Frizelle, S. P., Funkenbusch, S., Mahowald, M. L. A comparison of DigiGait and TreadScan imaging systems: assessment of pain using gait analysis in murine monoarthritis. Journal of Pain Research. 7, 25-35 (2013).
  24. Stroobants, S., Gantois, I., Pooters, T., D'Hooge, R. Increased gait variability in mice with small cerebellar cortex lesions and normal rotarod performance. Behavioural Brain Research. 241, 32-37 (2013).
  25. Vandeputte, C., et al. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92(2010).
  26. Amende, I., et al. Gait dynamics in mouse models of Parkinson's disease and Huntington's disease. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 2, 20(2005).
  27. Hampton, T. G., et al. Gait disturbances in dystrophic hamsters. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 235354(2011).
  28. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3 (4), 335-350 (2013).
  29. Li, X., Morrow, D., Witkin, J. M. Decreases in nestlet shredding of mice by serotonin uptake inhibitors: comparison with marble burying. Life Sciences. 78 (17), 1933-1939 (2006).
  30. Murphy, M., et al. Chronic adolescent Δ9-tetrahydrocannabinol treatment of male mice leads to long-term cognitive and behavioral dysfunction, which are prevented by concurrent cannabidiol treatment. Cannabis and Cannabinoid Research. 2 (1), 235-246 (2017).
  31. Sonzogni, M., et al. A behavioral test battery for mouse models of Angelman syndrome: A powerful tool for testing drugs and novel Ube3a mutants. Molecular Autism. 9, 47(2018).
  32. Dodge, A., et al. Generation of a novel rat model of Angelman syndrome with a complete Ube3a gene deletion. Autism Research. 13 (3), 397-409 (2020).
  33. Born, H. A., et al. Strain-dependence of the Angelman syndrome phenotypes in Ube3a maternal deficiency mice. Scientific Reports. 7 (1), 8451(2017).
  34. File, S. E., Mabbutt, P. S., Hitchcott, P. K. Characterisation of the phenomenon of "one-trial tolerance" to the anxiolytic effect of chlordiazepoxide in the elevated plus-maze. Psychopharmacology. 102 (1), 98-101 (1990).
  35. Liu, N., et al. Single housing-induced effects on cognitive impairment and depression-like behavior in male and female mice involve neuroplasticity-related signaling. The European Journal of Neuroscience. 52 (1), 2694-2704 (2020).
  36. Ueno, H., et al. Effects of repetitive gentle handling of male C57BL/6NCrl mice on comparative behavioural test results. Science Reports. 10 (1), 3509(2020).
  37. Rodgers, R. J., Dalvi, A. Anxiety, defence and the elevated plus-maze. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 21 (6), 801-810 (1997).
  38. Deacon, R. M. J., Penny, C., Rawlins, J. N. P. Effects of medial prefrontal cortex cytotoxic lesions in mice. Behavioural Brain Research. 139 (1-2), 139-155 (2003).
  39. Fernagut, P. O., Diguet, E., Labattu, B., Tison, F. A simple method to measure stride length as an index of nigrostriatal dysfunction in mice. Journal of Neuroscience Methods. 113 (2), 123-130 (2002).
  40. Wooley, C. M., Xing, S., Burgess, R. W., Cox, G. A., Seburn, K. L. Age, experience and genetic background influence treadmill walking in mice. Physiology & Behavior. 96 (2), 350-361 (2009).
  41. Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
  42. Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284(2017).
  43. Tanas, J. K., et al. Multidimensional analysis of behavior predicts genotype with high accuracy in a mouse model of Angelman syndrome. Translational Psychiatry. 12 (1), 426(2022).
  44. Silva-Santos, S., et al. Ube3a reinstatement identifies distinct developmental windows in a murine Angelman syndrome model. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2069-2076 (2015).
  45. Milazzo, C., et al. Antisense oligonucleotide treatment rescues UBE3A expression and multiple phenotypes of an Angelman syndrome mouse model. JCI Insight. 6 (15), e145991(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Testy behawioralnetest rotarodanaliza chodubudowanie gniazdatest otwartego polalabirynt podwyższonego krzyżatest zawieszenia za ogonknockout UBE3A
Charakterystyka behawioralna mysiego modelu zespołu Angelmana
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.