Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie cybridów transmiscyjnych przy użyciu linii komórek rakowych

DOI:

10.3791/65186

⸱

17 marca 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Zaragoza, 2Institute for Biocomputation and Physics of Complex Systems, University of Zaragoza, 3Sequencing and Functional Genomics Unit, University of Zaragoza-IACS

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje technikę generowania cybrydów z komórek nowotworowych rosnących w zawiesinie jako narzędzie do badania roli mitochondriów w procesie nowotworowym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich latach znacznie wzrosła liczba badań poświęconych ustaleniu związku między mitochondriami a rakiem. Jednak nadal potrzebne są dalsze wysiłki, aby w pełni zrozumieć związek między zmianami w mitochondriach a nowotworzeniem nowotworów, a także zidentyfikować fenotypy mitochondrialne związane z nowotworem. Na przykład, aby ocenić udział mitochondriów w procesach nowotworzenia i przerzutów, konieczne jest zrozumienie wpływu mitochondriów z komórek nowotworowych w różnych środowiskach jądrowych. W tym celu jednym z możliwych podejść jest przeniesienie mitochondriów w inne tło jądrowe w celu uzyskania tzw. komórek cybridowych. W tradycyjnych technikach cybrydyzacji linia komórkowa pozbawiona mtDNA (ρ0, komórka dawcy jądra) jest ponownie zasiedlana mitochondriami pochodzącymi z komórek wyłuszczonych lub płytek krwi. Jednak proces enukleacji wymaga dobrej adhezji komórek do płytki hodowlanej, cechy, która w wielu przypadkach jest częściowo lub całkowicie tracona w komórkach inwazyjnych. Ponadto kolejną trudnością występującą w tradycyjnych metodach jest osiągnięcie całkowitego usunięcia endogennego mtDNA z linii komórkowej mitochondrialnego biorcy w celu uzyskania czystego tła jądrowego i mitochondrialnego DNA, unikając obecności dwóch różnych gatunków mtDNA w wygenerowanym cybridzie. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół wymiany mitochondrialnej stosowany do komórek nowotworowych rosnących w zawiesinie w oparciu o ponowne zasiedlenie komórek leczonych rodaminą 6G z izolowanymi mitochondriami. Metodologia ta pozwala nam przezwyciężyć ograniczenia tradycyjnych podejść, a tym samym może być wykorzystana jako narzędzie do poszerzenia zrozumienia roli mitochondriów w progresji raka i przerzutach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprogramowanie metabolizmu energetycznego jest cechą charakterystyczną raka1, który został zaobserwowany po raz pierwszy przez Otto Warburga w latach 30. XX wieku2. W warunkach tlenowych normalne komórki przekształcają glukozę w pirogronian, który następnie wytwarza acetylo-coA, napędzając maszynerię mitochondrialną i promując oddychanie komórkowe. Niemniej jednak Warburg wykazał, że nawet w warunkach normoksyjnych większość komórek nowotworowych przekształca pirogronian uzyskany w procesie glikolizy w mleczan, przestawiając się w celu uzyskania energii. Ta zmiana metaboliczna jest znana jako "efekt Warburga" i umożliwia niektórym komórkom nowotworowym zaspokojenie ich zapotrzebowania energetycznego na szybki wzrost i podział, pomimo generowania ATP mniej wydajnie niż proces tlenowy3,4,5. W ostatnich dziesięcioleciach liczne prace potwierdziły implikacje przeprogramowania metabolizmu w progresji raka. W związku z tym energetyka nowotworów jest uważana za interesujący cel przeciwko rakowi1. Jako centralny ośrodek metabolizmu energetycznego i dostarczania niezbędnych prekursorów, mitochondria odgrywają kluczową rolę w tych adaptacjach komórkowych, które do tej pory rozumiemy tylko częściowo.

Zgodnie z powyższym, mutacje mitochondrialnego DNA (mtDNA) zostały zaproponowane jako jedna z możliwych przyczyn tego przeprogramowania metabolicznego, co może prowadzić do pogorszenia wydajności łańcucha transportu elektronów (ETC)6 i wyjaśniałoby, dlaczego niektóre komórki rakowe zwiększają swój metabolizm glikolityczny, aby przetrwać. Rzeczywiście, doniesiono, że mtDNA kumuluje mutacje w komórkach rakowych, będąc obecnym w co najmniej 50% nowotworów7. Na przykład, niedawne badanie przeprowadzone przez Yuan i wsp. wykazało obecność hipermutowanych i skróconych cząsteczek mtDNA w raku nerki, jelita grubego i tarczycy8. Ponadto wiele prac wykazało, że niektóre mutacje mtDNA są związane z bardziej agresywnym fenotypem guza i wzrostem potencjału przerzutowego komórek nowotworowych9, 10,11,12,13,14,15,16.

Pomimo oczywistego znaczenia genomu mitochondrialnego w progresji raka, badanie tych mutacji i ich udziału w chorobie było trudne ze względu na ograniczenia w obecnie dostępnych modelach eksperymentalnych i technologiach17. W związku z tym potrzebne są nowe techniki, aby zrozumieć rzeczywisty wpływ DNA mitochondriów na rozwój i progresję choroby nowotworowej. W tej pracy wprowadzamy protokół generowania cybrydów transmisyjnych z komórek nowotworowych rosnących w zawiesinie, oparty na ponownym zasiedleniu komórek wstępnie potraktowanych rodaminą 6G z izolowanymi mitochondriami, który pokonuje główne wyzwania tradycyjnych metod cybrydyzacji18,19. Metodologia ta pozwala na wykorzystanie dowolnego dawcy jąder niezależnie od dostępności odpowiadającej im linii komórkowej ρ0 oraz transfer mitochondriów z komórek, które przy użyciu tradycyjnych technik byłyby trudne do wyłuszczenia (tj. nieprzylegających linii komórkowych).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie podłoża hodowlane i kompozycje buforowe są określone w Tabeli 1. Przed generacją cybridów należy typować zarówno mitochondrialne, jak i jądrowe profile DNA z komórek dawcy i biorcy, aby potwierdzić obecność różnic genetycznych w obu genomach między liniami komórkowymi. W tym badaniu wykorzystano dostępną na rynku linię komórkową L929 i jej pochodną linię komórkową, L929dt, która została spontanicznie wygenerowana w naszym laboratorium (więcej informacji można znaleźć w 13). Te linie komórkowe wykazują dwie różnice w sekwencji ich genu mt-Nd2, które mogą być wykorzystane do potwierdzenia czystości mtDNA po zakończeniu procesu cybrydyzacji13. W tym przypadku czystość tła jądrowego została potwierdzona wrażliwością na antybiotyki, ponieważ w przeciwieństwie do komórek L929dt, L929 były oporne na genetycynę.

1. Zubożenie mitochondriów przez leczenie rodaminą 6G (komórki biorcze)

UWAGA: Pierwszym krokiem do udanego generowania cybridów jest całkowite i nieodwracalne zniesienie funkcji mitochondriów w komórkach biorcy. W tym celu konieczne jest wcześniejsze określenie, dla każdej linii komórkowej, odpowiedniego stężenia i czasu trwania leczenia rodaminą 6G. To odpowiednie stężenie powinno być tuż poniżej śmierci komórek wywołanej lekiem (najwyższej, która nie zabija komórek podczas leczenia). Po zdefiniowaniu optymalnych warunków wykonaj następujące czynności.

  1. Wysiew 106 komórek na 6-dołkowej płytce przy użyciu kompletnej pożywki hodowlanej (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 1) i traktuj je codziennie optymalnym stężeniem rodaminy 6G przez 3-10 dni, w zależności od linii komórkowej. Tradycyjne stężenia wahają się od 2 do 5 μg/ml przez 3-10 dni20,21. W tym badaniu, dla komórek pochodzących z L929, 2,5 μg/ml rodaminy 6G przez 7 dni było wybranym leczeniem13,22.
  2. Aby utrzymać komórki przy życiu, należy uzupełnić pożywkę do hodowli komórkowych o 50 μg/ml urydyny i 100 μg/ml pirogronianu i odnawiać co 24 godziny.
  3. Po poddaniu działaniu substancji, a przed fuzją, należy zmienić pożywkę komórek poddanych działaniu rodaminy 6G na kompletną pożywkę do hodowli komórkowych bez rodaminy 6G i pozostawić je w tym podłożu na 3-4 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
    UWAGA: Toksyczny efekt rodaminy 6G jest nieodwracalny, a komórki z niefunkcjonalnymi mitochondriami nie powinny się zregenerować20. Tak więc po leczeniu komórki, które nie otrzymują funkcjonalnych mitochondriów, powinny umrzeć nawet w pożywce hodowlanej uzupełnionej urydyną. W związku z tym nie powinna być konieczna żadna selekcja jądrowa. Zaleca się jednak kontrolną fuzję komórek traktowanych rodaminą 6G bez mitochondriów.

2. Ekspansja i izolacja mitochondriów (komórki dawcy)

  1. Rozszerz komórki dawcy mitochondriów w czasie upływu czasu leczenia rodaminą 6G, aby uzyskać około 25 x 106 komórek.
  2. W dniu 7 zbierz wykładniczo rosnące komórki w probówce o pojemności 50 ml i zbierz je przez wirowanie przy 520 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Przemyć komórki 3x zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) i osadzać je przez odwirowanie przy 520 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Od tej pory wykonuj wszystkie etapy ekstrakcji mitochondrialnej w temperaturze 4 °C, używając zimnych odczynników i trzymając probówki z komórkami lub mitochondriami na lodzie.
  3. Po trzecim odwirowaniu odrzucić supernatant przez aspirację za pomocą szklanej pipety sprzężonej z pompą próżniową i ponownie zawiesić wypełnione komórki w objętości hipotonicznego buforu równej 7-krotności objętości osadu komórkowego. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do probówki homogenizatora i pozwól komórkom pęcznieć, inkubując je na lodzie przez 2 minuty.
  4. Przerwij błony komórkowe, wykonując od 8 do 10 uderzeń w homogenizatorze sprzężonym z napędzanym silnikiem tłuczkiem obracającym się z prędkością 600 obr./min.
    UWAGA: Etap przerwania błony komórkowej może się różnić w zależności od typu komórki; W związku z tym należy go zoptymalizować dla każdego typu ogniwa.
  5. Dodaj tę samą objętość buforu hipertonicznego do zawiesiny komórki (7x objętość osadu komórkowego), aby wytworzyć środowisko izotoniczne.
  6. Przenieść homogenat do probówki o pojemności 15 ml i odwirować w stałym wirniku o sile 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Następnie należy zebrać tylko 3/4 supernatantu, pozostawiając duży margines od osadu, aby uniknąć zanieczyszczenia jądrami lub nienaruszonymi komórkami, i przenieść go do innej probówki. Powtórz ten sam proces dwa razy. Należy pamiętać, że supernatant musi być przechowywany, a osad odrzucony.
  7. Zachowaj frakcję mitochondrialną (supernatant). Przenieść go do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować z maksymalną prędkością (18 000 x g) przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
  8. Odrzucić supernatant i przemyć osad wzbogacony w mitochondria buforem A, łącząc zawartość dwóch probówek w jedną i odwirować w tych samych warunkach, jak opisano w kroku 2.7. Powtarzaj ten sam proces, aż cały materiał znajdzie się tylko w jednej tubie.
  9. Wykonaj dodatkowe płukanie 300 μl buforu A i określ ilościowo stężenie białka mitochondrialnego za pomocą testu Bradforda23. Dla każdego testu cybrydyzacyjnego należy określić optymalną ilość mitochondriów do procedury transferu (w naszym przypadku stężenie między 10-40 μg białka mitochondrialnego na10-6 komórek).
  10. Jednocześnie przygotuj komórki wstępnie poddane działaniu rodaminy 6G do fuzji, zbierając je do probówki o pojemności 15 ml i odwirowując przy 520 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Należy pamiętać, że granulka nabiera neonowo-różowego koloru dzięki traktowaniu rodaminą 6G.
  11. Aby upewnić się, że zarówno zniesienie funkcji mitochondriów w komórkach receptorowych, jak i oczyszczanie organelli od dawców zostały prawidłowo przeprowadzone, wysiewaj niewielką liczbę komórek traktowanych rodaminą 6G i izolowane mitochondria przy użyciu kompletnej pożywki hodowlanej na 6-dołkowej płytce i hoduj je przez miesiąc, aby sprawdzić, czy w żadnym z dołków nie pozostały żadne komórki, które przeżyły (Ryc. 2).
  12. Równolegle oceniaj brak zanieczyszczeń jąder we frakcji mitochondrialnej poprzez immunodetekcję białek jądrowych (tj. laminy beta, histonu H3 itp.) lub przez ilościową amplifikację genu jądrowego (qPCR) w reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) (tj. SDH, 18S rRNA itp.).
    UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczeń, zaleca się wykonywanie wszystkich czynności w warunkach aseptycznych podczas pracy pod okapem z przepływem laminarnym.

3. Fuzja i generacja cybrydów

  1. Aby kontynuować fuzję, ostrożnie dodaj 106 komórek traktowanych rodaminą 6G do izolowanego osadu mitochondriów (10-40 μg białka mitochondrialnego) i wiruj przy 520 x g przez 5 minut, aby komórki mogły wymieszać się z mitochondriami.
  2. Dodać 100 μl glikolu polietylenowego (PEG, 50%) i delikatnie zawiesić granulkę na 30 s. Następnie pozostaw nietknięte na kolejne 30 sekund.
  3. Na koniec przenieść mieszaninę na 6-dołkową płytkę ze świeżą, kompletną pożywką do hodowli komórkowych i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Po kilku dniach (zwykle 1 tygodniu) cybrydy transmishondrialne powinny zacząć rosnąć (Rysunek 2), dając początek klonom, które mogą być indywidualnie selekcjonowane lub mieszane w puli przed ich analizą.

4. Weryfikacja zarówno tła mitochondrialnego, jak i jądrowego

UWAGA: Gdy nowa linia komórkowa zostanie ustanowiona, a komórki zaczną rosnąć wykładniczo, czystość ich mitochondrialnych i jądrowych DNA musi zostać zweryfikowana. W związku z tym oryginalne linie komórkowe powinny zawierać różne mutacje lub polimorfizmy w swoich genomach, aby były rozpoznawalne.

  1. Całkowita izolacja DNA
    1. Wyizoluj genomowe DNA wszystkich linii komórkowych używanych do generowania cybridów, stosując komercyjny zestaw do ekstrakcji genomowego DNA (patrz Tabela Materiałów) lub wykonując standardowy protokół z użyciem ekstrakcji alkoholem fenolowo-chloroformowo-izoamylowym i wytrącania alkoholu24.
  2. Ocena mtDNA (Rysunek 3)
    UWAGA: W celu analizy czystości mtDNA można przeprowadzić kilka technik, takich jak sekwencjonowanie, analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) lub qPCR specyficzny dla alleli. Aby potwierdzić obecność wariacji sekwencji mtDNA przez RFLP, postępuj zgodnie z kolejnymi krokami protokołu.
    1. Amplifikuj fragment mtDNA zawierający zmianę nukleotydu metodą PCR.
      1. W tym przypadku komórki L929dt prezentują mutację mtDNA w pozycji 4206, w genie mt-Nd2 (m.4206C>T), którego nie ma w komórkach L929. Aby potwierdzić obecność tej substytucji w transmisjąsterkwialnych cybrydach, amplifikuj fragment o długości 397 pz metodą PCR przy użyciu standardowego protokołu i następujących starterów: 1) 5'-AAGCTATCGGG
        CCCATACCCCG-3' (pozycje 3862-3884) i 2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGGG -3' (pozycje 4236-4258).
    2. Przeanalizuj obecność pożądanej substytucji nukleotydów przez RFLP, używając specyficznej endonukleazy, która rozpoznaje zmianę sekwencji i generuje inny wzór cięcia dla obu linii komórkowych.
      UWAGA: Gdy obecny jest wariant mtDNA L929dt (4206T), amplikon uzyskany w kroku 4.2.1 zawiera dwa miejsca restrykcyjne dla SspI (patrz tabela materiałów), które wytwarzają trzy fragmenty DNA o długości 306 pz, 52 pz i 39 pz. Miejsce ograniczenia, które generuje pasma 52 i 39, jest zakłócane, gdy obecna jest wersja C4206 typu dzikiego (WT) i pojawia się nowe pasmo 91 pz. W związku z tym analiza obejmuje kontrolę wewnętrzną w celu pełnego roztrawienia SspI. Reakcję trawienia przeprowadza się w temperaturze 37 °C, zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Oddziel fragmenty restrykcyjne za pomocą elektroforezy i porównaj wzór pasma.
      1. Po przeprowadzeniu trawienia należy przeanalizować otrzymane fragmenty restrykcyjne za pomocą elektroforezy w 10% żelach poliakrylamidowo-tris-boranowych-EDTA (TBE) (patrz Tabela 1 dla składu 1x TBE). Uruchomić elektroforezę przy napięciu 80 V przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Uwidocznić fragmenty DNA po barwieniu żelem w roztworze bromku etydyny w 1x TBE przez 15 minut w temperaturze pokojowej (patrz Tabela 1 dla składu roztworu do barwienia żelu).
  3. Genotypowanie jądrowego DNA
    UWAGA: Genotypowanie jądrowego DNA musi być przeprowadzone przy użyciu poprzedniej próbki ekstrakcji DNA użytej do analizy RFLP.
    1. Amplifikuj 16 loci (D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433 i AMEL) przy użyciu puli oligonukleotydów specyficznych dla handlu (patrz tabela materiałów).
    2. Wykonać elektroforezę za pomocą analizatora genetycznego w celu oddzielenia wcześniej uzyskanych fragmentów.
      UWAGA: Po amplifikacji różne loci są analizowane za pomocą elektroforezy przy użyciu systemu kapilarnego (patrz Tabela materiałów). Fragmenty są rozdzielane w kapilarze o długości 50 cm wypełnionym dostępnym w handlu polimerem. katodowe i anodowe są również dostępne w handlu, jak pokazano w tabeli materiałów. Elektroforezę wykonuje się przy napięciu 19,5 kV przez 20 min w temperaturze 60 °C.
    3. Użyj narzędzi bioinformatycznych, aby określić allele odpowiadające każdemu amplifikowanemu locus (patrz tabela materiałów).
    4. Porównaj dane uzyskane w kroku 4.3.3 z bazą danych profilu jądrowego DNA (Tabela 1), aby sprawdzić, czy profil jądrowego DNA pasuje do profilu linii komórkowej receptora mitochondriów (Rysunek 4).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po zastosowaniu wyżej przedstawionego protokołu, należy uzyskać homoplazmatyczną linię komórek cybrydowych z zachowanym tłem jądrowym, ale z nowym genotypem mitochondriów, jak pokazano na schemacie w Rysunek 1 i Rysunek 2. Czystość mitochondrialnego i jądrowego DNA obecnego w cybrydach można potwierdzić za pomocą RFLP, jak pokazano na Rysunek 3, oraz przez analizę genotypowania jądrowego DNA, jak pokazano na Rysunek 4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odkąd Otto Warburg poinformował, że komórki rakowe zmieniają swój metabolizm i nasilają "glikolizę tlenową"3,4, jednocześnie zmniejszając oddychanie mitochondrialne, zainteresowanie rolą mitochondriów w transformacji i progresji raka wzrosło wykładniczo. W ostatnich latach mutacje w mtDNA i dysfunkcja mitochondriów zostały postulowane jako cechy charakterystyczne wielu typów nowotworów25. Do tej pory w licznych badaniach analizowano zmienn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane z grantu numer PID2019-105128RB-I00 dla RSA, JMB i AA oraz PGC2018-095795-B-I00 dla PFS i RML, oba finansowane przez MCIN/AEI/10.13039/501100011033 i granty o numerach B31_20R (RSA, JMA i AA) oraz E35_17R (PFS i RML) i finansowane przez Gobierno de Aragón. Prace RSA były wspierane przez grant z Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. Autorzy pragną potwierdzić wykorzystanie Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Analizator genetyczny 3500XL ThermoFisher Scientific 4406016
6-dołkowapłytka Corning08-772-1B
Nadsiarczan amonuSigma-AldrichA3678
AmpFlSTR Identifiler Plus Zestaw do amplifikacji PCRThermoFisher Scientific4427368
Anoda buforowa Seria 3500Applied Biosystems4393927
Kwas borowyTest PanReac131015
BradfordBiorad5000002
Pojemnik buforowy katody Seria 3500Stosowane biosystemy4408256
Kolby do hodowli komórkowychTPP90076
DMEM o wysokiej stężeniu glukozyGibco11965092
EDTAPanReac131026
Bromek etydynySigma-AldrichE8751
GeneticinGibco10131027
Homogenizator Tłuczek teflonowyDeltalab196102
linia komórkowa L929ATCCCCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel SystemBioRad1658004
MOPSStartery
Sigma-AldrichProdukty niestandardowe
Roztwór poliakryloamidu 30%PanReacA3626
Glikol polietylenowySigma-AldrichP7181
POP-7Applied Biosystems4393714
PirogronianSigma-AldrichP5280
QIAmp DNA Mini KitQiagen51306
Rodamina-6GSigma-AldrichR4127
Surowica płodowa bydlęcaSigma-AldrichF7524
SspINew England BiolabsR3132
Streptomycyna/penicylinaPAN biotechP06-07100
SacharozaSigma-AldrichS3089
TEMEDSigma-AldrichT9281
TrisPanReacP14030b
UridineSigma-AldrichU3750
PCR Sigma-Aldrich M1254

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D. Hallmarks of cancer: new dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
  2. Wind, F., Warburg, O. H. The Metabolism of Tumors: Investigation from the Kaiser Wilhelm Institute for Biology. , Constable. Berlin-Dahlem. (1930).
  3. Warburg, O. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 269-270 (1956).
  4. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
  5. Weinhouse, S. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 267-269 (1956).
  6. Brandon, M., Baldi, P., Wallace, D. C. Mitochondrial mutations in cancer. Oncogene. 25 (34), 4647-4662 (2006).
  7. Ju, Y. S., et al. Origins and functional consequences of somatic mitochondrial DNA mutations in human cancer. eLife. 3, 02935(2014).
  8. Yuan, Y., et al. Comprehensive molecular characterization of mitochondrial genomes in human cancers. Nature Genetics. 52 (3), 342-352 (2020).
  9. Arnold, R. S., et al. metastasis in prostate cancer: Recurring mitochondrial DNA mutation reveals selective pressure exerted by the bone microenvironment. Bone. 78, 81-86 (2015).
  10. Imanishi, H., et al. Mitochondrial DNA mutations regulate metastasis of human breast cancer cells. PLoS One. 6 (8), 23401(2011).
  11. Lu, J., Sharma, L. K., Bai, Y. Implications of mitochondrial DNA mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis. Cell Research. 19 (7), 802-815 (2009).
  12. Luo, Y., Ma, J., Lu, W. The significance of mitochondrial dysfunction in cancer. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5598(2020).
  13. Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers. 11 (7), 1027(2019).
  14. Schopf, B., et al. OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation. Nature Communications. 11 (1), 1487(2020).
  15. Yuan, Y., et al. Nonsense and missense mutation of mitochondrial ND6 gene promotes cell migration and invasion in human lung adenocarcinoma. BMC Cancer. 15, 346(2015).
  16. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. 34;ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis"--a critical commentary. Free Radicals Biology and Medicine. 45 (9), 1217-1219 (2008).
  17. Welch, D. R., Foster, C., Rigoutsos, I. Roles of mitochondrial genetics in cancer metastasis. Trends in Cancer. 8 (12), 1002-1018 (2022).
  18. Cavaliere, A., Marchet, S., Di Meo, I., Tiranti, V. An in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: A cybrid model. Journal of Visualized Experiments. (181), e63452(2022).
  19. King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
  20. Bacman, S. R., Moraes, C. T. Transmitochondrial technology in animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 503-524 (2007).
  21. Moraes, C. T., Dey, R., Barrientos, A. Transmitochondrial technology in animal cells. Methods in Cell Biology. 65, 397-412 (2001).
  22. Acin-Perez, R., et al. Respiratory complex III is required to maintain complex I in mammalian mitochondria. Molecular Cell. 13 (6), 805-815 (2004).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  24. Bayona-Bafaluy, M. P., et al. Revisiting the mouse mitochondrial DNA sequence. Nucleic Acids Research. 31 (18), 5349-5355 (2003).
  25. Srinivasan, S., Guha, M., Kashina, A., Avadhani, N. G. Mitochondrial dysfunction and mitochondrial dynamics-The cancer connection. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1858 (8), 602-614 (2017).
  26. Bartoletti-Stella, A., et al. Mitochondrial DNA mutations in oncocytic adnexal lacrimal glands of the conjunctiva. Archives of Ophthalmology. 129 (5), 664-666 (2011).
  27. Chinnery, P. F., Samuels, D. C., Elson, J., Turnbull, D. M. Accumulation of mitochondrial DNA mutations in ageing, cancer, and mitochondrial disease: is there a common mechanism. The Lancet. 360 (9342), 1323-1325 (2002).
  28. Copeland, W. C., Wachsman, J. T., Johnson, F. M., Penta, J. S. Mitochondrial DNA alterations in cancer. Cancer Investigation. 20 (4), 557-569 (2002).
  29. Gasparre, G., et al. Clonal expansion of mutated mitochondrial DNA is associated with tumor formation and complex I deficiency in the benign renal oncocytoma. Human Molecular Genetics. 17 (7), 986-995 (2008).
  30. Kopinski, P. K., Singh, L. N., Zhang, S., Lott, M. T., Wallace, D. C. Mitochondrial DNA variation and cancer. Nature Review Cancer. 21 (7), 431-445 (2021).
  31. Pereira, L., Soares, P., Maximo, V., Samuels, D. C. Somatic mitochondrial DNA mutations in cancer escape purifying selection and high pathogenicity mutations lead to the oncocytic phenotype: pathogenicity analysis of reported somatic mtDNA mutations in tumors. BMC Cancer. 12, 53(2012).
  32. Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
  33. Hopkins, J. F., et al. Mitochondrial mutations drive prostate cancer aggression. Nature Communications. 8 (1), 656(2017).
  34. Weerts, M. J. A., Smid, M., Foekens, J. A., Sleijfer, S., Martens, J. W. M. Mitochondrial RNA expression and single nucleotide variants in association with clinical parameters in primary breast cancers. Cancers. 10 (12), 500(2018).
  35. Jimenez-Morales, S., Perez-Amado, C. J., Langley, E., Hidalgo-Miranda, A. Overview of mitochondrial germline variants and mutations in human disease: Focus on breast cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (3), 923-936 (2018).
  36. Hardie, D. G. AMP-activated/SNF1 protein kinases: conserved guardians of cellular energy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 774-785 (2007).
  37. Perrone, A. M., et al. Potential for mitochondrial DNA sequencing in the differential diagnosis of gynaecological malignancies. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2048(2018).
  38. Musicco, C., et al. Mitochondrial dysfunctions in type I endometrial carcinoma: Exploring their role in oncogenesis and tumor progression. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2076(2018).
  39. Li, N., et al. Dissecting the expression landscape of mitochondrial genes in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma. Oncology Letters. 16 (3), 3992-4000 (2018).
  40. Kim, H. R., et al. Spectrum of mitochondrial genome instability and implication of mitochondrial haplogroups in Korean patients with acute myeloid leukemia. Blood Research. 53 (3), 240-249 (2018).
  41. Tyagi, A., et al. Pattern of mitochondrial D-loop variations and their relation with mitochondrial encoded genes in pediatric acute myeloid leukemia. Mutation Research. 810, 13-18 (2018).
  42. Vidone, M., et al. A comprehensive characterization of mitochondrial DNA mutations in glioblastoma multiforme. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 63, 46-54 (2015).
  43. Chatterjee, A., Mambo, E., Sidransky, D. Mitochondrial DNA mutations in human cancer. Oncogene. 25 (34), 4663-4674 (2006).
  44. Arnold, R. S., et al. An inherited heteroplasmic mutation in mitochondrial gene COI in a patient with prostate cancer alters reactive oxygen, reactive nitrogen and proliferation. BioMed Research International. 2013, 239257(2013).
  45. Petros, J. A., et al. mtDNA mutations increase tumorigenicity in prostate cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (3), 719-724 (2005).
  46. Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V. Mitochondrial energetics and therapeutics. Annual Review of Pathology. 5, 297-348 (2010).
  47. Reznik, E., et al. Mitochondrial DNA copy number variation across human cancers. eLife. 5, 10769(2016).
  48. Soler-Agesta, R., et al. PT-112 induces mitochondrial stress and immunogenic cell death, targeting tumor cells with mitochondrial deficiencies. Cancers. 14 (16), 3851(2022).
  49. Trounce, I., Wallace, D. C. Production of transmitochondrial mouse cell lines by cybrid rescue of rhodamine-6G pre-treated L-cells. Somatic Cell and Molecular Genetics. 22 (1), 81-85 (1996).
  50. Pastushenko, I., Blanpain, C. EMT transition states during tumor progression and metastasis. Trends in Cell Biology. 29 (3), 212-226 (2019).
  51. Pastushenko, I., et al. Identification of the tumour transition states occurring during EMT. Nature. 556 (7702), 463-468 (2018).
  52. Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 131-142 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cybrydy transmitochondrialnewymiana mitochondri wdeplekcja mitochondri wtraktowanie rodamin 6Gizolacja mitochondri wmutacje mitochondrialnego DNAanaliza RFLPtesty funkcji mitochondrialnych

Powiązane artykuły