Artykuł metodologiczny

Ultraszybkie sekwencjonowanie nowej generacji oparte na amplikonie w niepłaskonabłonkowym niedrobnokomórkowym raku płuca

DOI:

10.3791/65190

⸱

8 września 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Clinical and Experimental Pathology, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Université Côte d’Azur, CHU de Nice, 2Hospital-Integrated Biobank (BB-0033-00025), Université Côte d'Azur, Hôpital Pasteur, CHU de Nice, 3Institut Hospitalo-Universitaire (IHU), RespirERA, Université Côte d'Azur, Hôpital Pasteur, CHU de Nice, 4FHU OncoAge, Université Côte d'Azur, 5Team 4, Institute of Research on Cancer and Aging (IRCAN), CNRS INSERM, Centre Antoine-Lacassagne, Université Côte d'Azur, 6Department of Pulmonary Medicine and Thoracic Oncology, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Université Côte d'Azur

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wzrost liczby biomarkerów molekularnych do testowania w leczeniu leczenia niepłaskonabłonkowym niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NS-NSCLC) skłonił do opracowania szybkich i niezawodnych metod wykrywania molekularnego. Opisujemy przebieg pracy do oceny zmian genomowych u pacjentów z NS-NSCLC przy użyciu podejścia ultraszybkiego sekwencjonowania nowej generacji (NGS).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liczba zmian molekularnych do zbadania pod kątem terapii celowanej pacjentów z niepłaskonabłonkowym niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NS-NSCLC) znacznie wzrosła w ciągu ostatnich kilku lat. Wykrywanie nieprawidłowości molekularnych jest niezbędne do optymalnej opieki nad pacjentami z NS-NDRP w stopniu zaawansowanym lub z przerzutami, umożliwiając stosowanie terapii celowanych z poprawą całkowitego przeżycia. Niemniej jednak nowotwory te rozwijają mechanizmy oporności, które są potencjalnie możliwe do zwalczenia za pomocą nowych terapii. Niektóre zmiany molekularne mogą również modulować odpowiedź na leczenie. Charakterystyka molekularna NS-NSCLC musi być wykonana w krótkim czasie realizacji (TAT), w czasie krótszym niż 10 dni roboczych, zgodnie z zaleceniami międzynarodowych wytycznych. Ponadto pochodzenie biopsji tkanek do analizy genomowej jest zróżnicowane, a ich rozmiar stale się zmniejsza wraz z rozwojem mniej inwazyjnych metod i protokołów. W związku z tym patolodzy stają przed wyzwaniem wykonywania skutecznych technik molekularnych przy jednoczesnym zachowaniu skutecznej i szybkiej strategii diagnozowania. W tym miejscu opisujemy ultraszybki przepływ sekwencjonowania nowej generacji (NGS) oparty na amplikonie, stosowany w codziennej rutynowej praktyce podczas diagnozowania pacjentów z NS-NSCLC. Wykazaliśmy, że system ten jest w stanie zidentyfikować obecne cele molekularne stosowane w medycynie precyzyjnej w onkologii klatki piersiowej w odpowiednim TAT.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatniej dekady, rozwój terapii celowanych i immunologicznych znacznie zwiększył całkowite przeżycie (OS) niepłaskonabłonkowego niedrobnokomórkowego raka płuca (NS-NSCLC)1,2. W związku z tym w ciągu ostatnich kilku lat wzrosła liczba obowiązkowych genów i celów molekularnych do analizy podczas leczenia NS-NSCLC3,4.

Aktualne międzynarodowe wytyczne zalecają testowanie EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET i MET podczas diagnozy zaawansowanego NS-NSCLC5. Ponadto, ponieważ nowe leki dały ostatnio bardzo obiecujące wyniki w badaniach klinicznych, dodatkowe zmiany genomowe zostaną wkrótce przebadane w wielu dodatkowych genach, w szczególności KRAS i HER2, wraz z BRAC1/BRAC2, PI3KA, NRG1 i NUT6,7,8,9. Ponadto status różnych powiązanych genów, takich jak STK11, KEAP1 i TP53, może być bardzo interesujący dla lepszego przewidywania odpowiedzi lub oporności na niektóre terapie celowane i/lub inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych (ICI)10,11,12.

Co ważne, zmiany molekularne muszą być zgłaszane bez znaczącej zwłoki, aby zapewnić staranne podejmowanie decyzji klinicznych. Brak charakterystyki molekularnej guza może prowadzić do rozpoczęcia terapii niecelowanych, takich jak chemioterapia z lub bez immunoterapii, co prowadzi do nieoptymalnej strategii leczenia, ponieważ odpowiedź na chemioterapię jest ograniczona u pacjentów ze zmianami możliwymi do działania, takimi jak mutacje EGFR lub fuzje genów13.

Ponadto, obecny rozwój terapii celowanych/immunoterapii w ustawieniach neoadiuwantowych i/lub adjuwantowych może prowadzić do systematycznego poszukiwania, przynajmniej zmian EGFR i ALK we wczesnym stadium NS-NSCLC, ponieważ ICI powinny być podawane tylko w nowotworach typu dzikiego dla EGFR i ALK14. Obecnie obowiązkowe jest również badanie na obecność mutacji EGFR we wczesnym stadium NS-NSCLC, ponieważ ozymertynib (inhibitor kinazy tyrozynowej trzeciej generacji EGFR) może być stosowany jako terapia uzupełniająca w NS-NSCLCEGFRsup class="xref">15.

Strategia oceny różnych biomarkerów w przewidywaniu odpowiedzi na różne terapie celowane i/lub immunoterapie u pacjentów z NS-NSCLC postępuje szybko, co utrudnia sekwencyjną identyfikację tych biomarkerów3,16. W związku z tym sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) jest obecnie optymalnym podejściem do wysokoprzepustowej równoległej oceny zmian genów w NS-NSCLC5,17.

Jednak przepływ pracy NGS może być trudny do opanowania i może trwać do dłuższego TAT18,19. W związku z tym wiele ośrodków nadal stosuje podejścia sekwencyjne (immunohistochemia (IHC), fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) i/lub sekwencjonowanie celowane). Strategia ta jest jednak ograniczona w przypadku małej liczebności próby, a przede wszystkim ze względu na zwiększoną liczbę mutacji, które są wymagane do przetestowania w NS-NSCLC20. W związku z tym ultraszybkie i proste metody testowe pozwalające na szybką ocenę zmian w genach stają się coraz ważniejsze dla optymalnego podejmowania decyzji klinicznych. Co więcej, zatwierdzone i akredytowane systemy do badań molekularnych stają się obowiązkowe przy przepisywaniu określonych terapii celowanych.

Tutaj opisujemy ultraszybki i zautomatyzowany test DNA/RNA NGS oparty na amplikonie do testów molekularnych NS-NSCLC, który jest używany w Laboratorium Laboratorium Patologii Klinicznej i Eksperymentalnej (LPCE), Szpitalu Uniwersyteckim w Nicei, Francja i jest akredytowany zgodnie z normą ISO 15189 przez Francuską Komisję Akredytacyjną (COFRAC) (https://www.cofrac.fr/). COFRAC zaświadcza, że laboratorium spełnia wymagania normy ISO 15189 oraz zasady stosowania COFRAC dla czynności testowania/kalibracji w analizie molekularnej w zautomatyzowanym NGS na sekwenatorze z panelem wykonywanym przez laboratorium. Akredytacja zgodnie z uznaną międzynarodową normą ISO 15189 świadczy o kompetencjach technicznych laboratorium w określonym zakresie oraz o prawidłowym działaniu odpowiedniego systemu zarządzania w tym laboratorium. Omówiono korzyści i ograniczenia tego przepływu pracy, począwszy od przygotowania próbek biopsji tkanek do uzyskania raportu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyki (Komisja ds. Etyki Badań Klinicznych, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Tumorothèque BB-0033-00025). Uzyskano świadomą zgodę wszystkich pacjentów na wykorzystanie próbek i wygenerowanych danych. Wszystkie próbki pobrano od pacjentów, u których zdiagnozowano NS-NSCLC w LPCE (Nicea, Francja) w okresie od 20 września do 31 stycznia 2022 r. w ramach opieki medycznej.

1. Przygotowanie próbek DNA i RNA FFPE za pomocą automatycznego urządzenia do oczyszczania (API) (Czas przetwarzania: 5 h 15 min)

  1. Uruchom planowanie na instrumencie.
    1. Włącz instrument i zaloguj się za pomocą nazwy użytkownika i hasła (Tabela materiałów). Utwórz plan przebiegu oczyszczania, klikając pozycję Uruchom, a następnie Dodaj plan i nadając nazwę planowi uruchamiania.
    2. Następnie wybierz odpowiedni zestaw do oczyszczania i protokół sekwencyjnego oczyszczania DNA i RNA z próbek zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie. Włączyć oznaczanie ilościowe po oczyszczeniu.
    3. Wybierz żądaną objętość elucji (50 μl) z listy rozwijanej, a następnie kliknij przycisk Dalej. Wybierz liczbę próbek, które zostaną wyekstrahowane.
    4. Następnie zaznacz każdy przykład, kliknij przycisk Edytuj, wprowadź identyfikator próbki, a następnie kliknij przycisk Zapisz.
  2. Przygotowanie próbek FFPE DNA i RNA za pomocą GPI
    1. Przygotować próbki tkanek FFPE (4 sekcje cięcia po 10 μm za pomocą mikrotomu) lub wykonać makrodysekcję bezpośrednio na blokach FFPE. Umieść każdą próbkę tkanki FFPE w oddzielnych i zidentyfikowanych probówkach do przetwarzania próbek FFPE (tabela materiałów).
    2. Wirować przy 2000 x g przez 1 minutę, aby zebrać tkankę z dna probówek.
    3. Do każdej probówki do przetwarzania próbek FFPE dodać główną mieszankę do trawienia proteazy przygotowaną z zestawu do oczyszczania kwasów nukleinowych i inkubować w temperaturze 60 °C przez co najmniej 60 minut (tabela materiałów). Próbki inkubować w temperaturze 90 °C przez 60 minut.
    4. Po inkubacji pozostawić próbki do ostygnięcia przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    5. Dla każdej probówki do przetwarzania próbek FFPE podnieś rurkę wewnętrzną, zablokuj ją, skręcając w lewo, a następnie odwiruj próbki o masie 2000 x g przez 10 minut.
    6. Odblokuj dętki, skręcając w prawo, oddziel je od dętek zewnętrznych i wyrzuć. Próbki należy przechowywać w zewnętrznych probówkach na lodzie do momentu załadowania do API.
    7. Przygotuj główną mieszankę do mineralizacji DNazy i załaduj ją do wstępnie napełnionej płytki do oczyszczania DNA i RNA FFPE 2. Następnie załaduj przygotowane próbki na płytkę oczyszczającą FFPE DNA i RNA 1 (tabela materiałów).
  3. Uruchom przebieg oczyszczania w interfejsie API.
    1. Na ekranie API kliknij przycisk Uruchom, wybierz plan uruchamiania, a następnie kliknij przycisk Dalej.
    2. Postępuj zgodnie ze wskazówkami wyświetlanymi na ekranie, aby załadować do API wymagane materiały eksploatacyjne i odczynniki potrzebne do przebiegu oczyszczania (tabela materiałów).
    3. Po załadowaniu wszystkich odczynników kliknij przycisk Dalej. Zamknij okno interfejsu API i kliknij przycisk Start.
    4. Pod koniec cyklu kliknij « rozładuj » na ekranie dotykowym i natychmiast wyjmij 48-dołkową płytkę archiwum kwasu nukleinowego zawierającą oczyszczoną próbkę DNA i RNA.
    5. Eksportuj wyniki oceny ilościowej. Uszczelnić płytkę i przechowywać oczyszczone próbki w temperaturze -80 °C. Przenieść 96-dołkową płytkę do sekwenatora, który ma być poddany analizie.
  4. Utwórz przykład i utwórz przebieg.
    1. Otwórz oprogramowanie i zaloguj się do niego, a następnie wybierz na pasku menu Próbki i kliknij Utwórz próbkę.
    2. Wprowadź nazwę próbki, płeć i procent komórek nowotworowych, a w razie potrzeby wypełnij wymagane pola i pola opcjonalne.
    3. Zapisz szczegóły (płeć i procent komórek nowotworowych są ważne dla analizy wariantów liczby kopii [CNV]).
    4. Wybierz Przebiegi i Kwas nukleinowy do wyniku na pasku menu.
    5. Wprowadź nazwę uruchomienia w kroku Setup. Kliknij Dalej.
    6. Wybierz test w kroku Testy. Kliknij Dalej.
    7. Wybierz próbki w kroku Próbki, aby uruchomić test.
    8. Następnie w okienku Wybrane testy kliknij przycisk Przypisz. Kliknij Dalej.
    9. Przejrzyj przykładowe pozycje na przykładowej płytce wejściowej. Kliknij Dalej.
    10. Przejrzyj podsumowanie planu uruchamiania, a następnie Zapisz i wydrukuj lub Zapisz.

2. Zautomatyzowany NGS na sekwencerze (Czas przetwarzania: 30 min)

  1. Załaduj płytkę próbki.
    UWAGA: Optymalne stężenie kwasu nukleinowego wynosi 0,5 ng/μL. Zwalidowany zakres stężeń kwasów nukleinowych wynosi 0,33-1 ng/μL. W przypadku DNA i RNA stężenie 1 ng/μl zostało zweryfikowane w laboratorium.
    1. Sekwencer wymaga całkowitej objętości 20 μl. Upewnij się, że objętość jest wystarczająca do załadowania próbki.
    2. Dodać kontrole pozytywne (DNA i RNA) i NTC (DNA i RNA) do 1. etapu instrumentu oczyszczającego bez ekstrakcji. Użyj kontroli DNA i RNA dla każdego przebiegu, aby zweryfikować przebieg i zweryfikować użyte partie. Dodaj kontrole DNA i RNA do płytki na końcu przebiegu API.
  2. Załaduj sekwencer i rozpocznij przebieg.
    1. Wyjmij wszystkie odczynniki z pudełek w lodówce lub zamrażarce i rozmrażaj w temperaturze pokojowej przez minimalny okres 30 minut (tabela materiałów) i maksymalnie 12 godzin.
    2. W laboratorium sekwencer powinien być zawsze włączony, postępując zgodnie z zaleceniami udzielonymi przez dostawcę podczas szkolenia na miejscu. Zaloguj się do systemu.
    3. Załadować płytkę z przyrządu do oczyszczania, która zawiera próbki, po uszczelnieniu płytki arkuszem samoprzylepnej folii do płytek PCR (tabela materiałów).
    4. Zainstaluj wszystkie materiały eksploatacyjne w pokładzie. Sekwencer zawiera instrukcje krok po kroku, jak załadować każdy wymagany materiał eksploatacyjny w podświetlonej pozycji (Tabela materiałów).
    5. Sprawdź, czy na probówce 3 paska 2-HD nie ma osadów. Przesuń rurkę lub delikatnie przekręć pasek, aby w razie potrzeby rozpuścić osad.
    6. Pasek 1 i Pasek 3 zawierają koraliki magnetyczne. Ten krok jest bardzo ważny: upewnij się, że koraliki są ponownie zawieszone. W górnej części rurki nie powinny pozostać żadne koraliki.
    7. Odwróć pasek do góry nogami i do tyłu 3-4 razy, aby usunąć koraliki. Przytrzymaj pasek na jednym końcu z uszczelką paska skierowaną do góry. Następnie szybko przesuń pasek w dół, wykonując szybki, odśrodkowy ruch ramienia, i zakończ, wykonując ostry ruch nadgarstka.
    8. Wirować przy 300 x g przez 15 s. W razie potrzeby powtórzyć. Odwirować paski za pomocą adapterów i uchwytów pasków, aby zminimalizować awarie obserwowane losowo w związku z pozostałościami kulek w górnej części pasków.
    9. Zamknij system i kliknij przycisk Dalej. Zamontuj drzwi wnęki odczynników do sekwencjonowania (tabela materiałów). Zamknij drzwi. Sekwencer automatycznie rozpoczyna przebieg.
  3. czyszczenie
    1. W przypadku czyszczenia po przebiegu, po jego zakończeniu, kliknij przycisk Dalej.
    2. Drzwi otwierają się sukcesywnie. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby opróżnić odpady i usunąć wszystkie materiały eksploatacyjne. Kliknij Dalej.
    3. Zamknij pokład po zakończeniu, kliknij przycisk Dalej. Rozpoczyna się 2-minutowe czyszczenie UV. Sekwencer jest gotowy do rozpoczęcia nowego przebiegu.

3. Analiza wyników za pomocą zintegrowanego oprogramowania (Czas analizy według pacjenta [próbki ADN i ARN]: 15 min)

UWAGA: Technika jest akredytowana przez Francuską Komisję Akredytacyjną (COFRAC) ISO 15189 (https://www.cofrac.fr/)

  1. Dane i wyniki
    1. Wybierz wynik przebiegu lub przykładowy wynik w menu Wyniki. Na ekranie Wyniki/Wyniki uruchomienia wyświetlane są wszystkie przebiegi.
    2. Przeszukaj listę wyników, filtrując je w nagłówku kolumny.
    3. Kliknij pozycję Wyniki, a następnie kliknij pozycję Przykładowe wyniki. Następnie kliknij nazwę interesującej Cię próbki w kolumnie nazwy próbki, aby wyświetlić wyniki sekwencjonowania dla unikatowej próbki.
    4. Kliknij opcję Kolumny w lewym górnym rogu ekranu lub usuń zaznaczenie kolumn w tabeli.
  2. Wyświetl wyniki kontroli jakości i wyświetl pokrycie amplikonem.
    1. Kliknij kartę QC (Kontrola jakości) na ekranie Results (Wyniki).
    2. W przypadku DNA upewnij się, że mediana bezwzględnych różnic parami (MAPT) wynosi od 0 do 0,5, aby zweryfikować analizę wariantów liczby kopii (CNV). Zamapowane odczyty muszą być większe niż 1,5 miliona.
    3. W przypadku RNA sprawdź, czy zmapowane odczyty mieszczą się w zakresie od 150 000 do 400 000. Poniżej tego poziomu istnieje ryzyko wyników fałszywie ujemnych, a poza tym istnieje ryzyko wyników fałszywie dodatnich.
    4. Kliknij nazwę próbki, aby otworzyć kartę Kluczowe wyniki.
    5. Przewiń do wykresów pokrycia amplikonem.
    6. Zapoznaj się z wykresami zasięgu. Określ minimalny próg pokrycia amplikonem, ponieważ dostawca go nie zapewnia. Aby zdefiniować zakres i próg, należy zmieszać próbkę kontrolną i próbkę typu dzikiego (WT). Następnie obserwuj najmniejszą wartość pokrycia amplikonem dla jednej lub więcej wybranych mutacji.
  3. Wyświetlanie wyników wariantów.
    1. Aby wyeksportować dane w formacie tabelarycznym, kliknij przycisk Eksportuj w prawym górnym rogu ekranu.
    2. Aby wyświetlić wynik pojedynczego wariantu nukleotydu/wariantu insercji-delecji (SNV/INDEL), kliknij kartę Warianty, a następnie kliknij opcję SNV/Indels. Kliknij przycisk Edytuj filtry i wybierz opcję Brak filtra.
      UWAGA: Próg czułości został określony na poziomie 5% zgodnie z zaleceniami grupy INCA (Francuski Narodowy Instytut Raka) (https://www.e-cancer.fr/Professionnels-de-sante/Les-therapies-ciblees/Les-plateformes-de-genetique-moleculaire-des-cancers/Le-programme-d-assurance-qualite-des-plateformes).
    3. Wyświetlanie wyników fuzji i wyświetlanie wariantów eksonów RNA: Kliknij w kartę Warianty, a następnie kliknij w Fuzje.
    4. W prawym górnym rogu kliknij pozycję Wizualizacja i wariant eksonu RNA, a następnie przejrzyj wykres Warianty eksonu RNA.
    5. Dzięki temu zestawowi można wykryć przeskakiwanie eksonów genów EGFR, MET i AR. Kliknij opcję Wizualizacja; Jest to łatwiejsze do analizy.
    6. Wyświetlanie nierównowagi fuzji kafelków eksonów RNA: Kliknij w kartę Warianty, a następnie kliknij w Fuzje.
    7. W prawym górnym rogu kliknij pozycję Wizualizacja i nierównowaga fuzji kafelków eksonów RNA, a następnie przejrzyj wykresy nierównowagi fuzji kafelków eksonów RNA. Fuzja nierównowagi to fuzja między znanym partnerem a partnerem, który nie jest objęty panelem.
    8. Wyświetl wyniki CNV: Kliknij pozycję CNV na karcie Warianty, aby wyświetlić dane.
      UWAGA: Konieczne jest zachowanie czujności w stosunku do wyników CNV poprzez informowanie podczas przygotowywania próbek o płci i procentowej zawartości komórek nowotworowych w próbce. Gen AR jest przenoszony tylko przez chromosom X. Jeśli płeć nie zostanie określona, płeć męska może ponieść straty, co prowadzi do fałszywie dodatnich wyników u pacjentów płci męskiej.
  4. Przejrzyj wyniki wtyczki.
    1. Przejrzyj wyniki wtyczki Analiza pokrycia: W prawym górnym rogu kliknij i wybierz pobierz pliki.
    2. Wtyczka Analiza pokrycia generuje raport z analizy pokrycia.
    3. Przejrzyj wyniki wtyczki Molecular Coverage Analysis: W prawym górnym rogu kliknij i wybierz pobierz pliki. Analiza ta sprawdza, czy wszystkie amplikony są objęte i potwierdza wyniki wariantów numerów kopii (CNV) dostarczone przez oprogramowanie.
  5. Wyświetlanie metryk testu i raportu z przebiegu
    1. Kliknij kartę Uruchom raport w oknie Podsumowanie przebiegu.
    2. Aby wyświetlić raport uruchamiany, wybierz opcję Wybierz próbkę z menu rozwijanego.
    3. Metryki testu i raport przebiegu: znajdź metryki sekwencjonowania w górnej części ekranu, a następnie metryki specyficzne dla próbki w tabeli Przykłady uruchamiania.
      UWAGA: Informacje zawarte w pliku archiwum obsługi klienta (CSA) mogą pomóc w rozwiązywaniu problemów z wynikami, ale nie można ich bezpośrednio analizować. Pliki CSA podsumowują dane całego przebiegu i wskazują przyczyny problemu w przypadku nieudanego uruchomienia.
    4. Pobieranie raportu o uruchamianiu: Kliknij w kartę Raporty.
    5. Kliknij przycisk Pobierz raport, aby pobrać podsumowanie raportu uruchamiania w formacie PDF.
  6. Wygeneruj raport wariantów.
    1. Włącz opcję Generuj raport w kroku Ustawienia, aby automatycznie generować raport wariantów dla każdej próbki podczas analizy danych przebiegu.
    2. Po wygenerowaniu raportu wariantów dla próby, system udostępnia raport w dwóch miejscach: Po pierwsze, na ekranie Wyniki/Wyniki próby udostępniany jest link. Kliknij łącze, aby pobrać plik PDF.
    3. Po drugie, przejdź do okienka Raport wariantów w zakładce Raporty i kliknij przycisk Pobierz raport. Raporty wariantów należy podpisywać elektronicznie lub ręcznie.
      UWAGA: Raporty podpisane elektronicznie mają (Podpisz) po nazwie próbki na ekranie Przykładowe wyniki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z przedstawionej tutaj procedury, szczegółowo opisanej w naszych ostatnich publikacjach21, opracowaliśmy optymalny przepływ pracy do oceny zmian molekularnych jako testu odruchowego w rutynowo przeprowadzanej praktyce klinicznej do diagnozy u pacjentów z NS-NSCLC przy użyciu ultraszybkiego sekwencjonowania nowej generacji opartego na amplikonach. Molekularny przebieg pracy metody jest pokazany na Rysunek 1. Lista genów uwzględnionych w panelu znajduje się ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowanie ultraszybkiego podejścia NGS opartego na amplikonie jako testu odruchowego do oceny zmian molekularnych w rozpoznaniu dowolnego stadium NS-NSLC jest optymalną opcją do wykrywania wszystkich zalecanych przez wytyczne i pojawiających się biomarkerów w NS-NSCLC 5,22,23. Podczas gdy metody sekwencyjne (IHC, PCR, FISH) koncentrują się tylko na określonych genach i mogą prowadzić do wyczerpania materiału tkankowego, ten pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Christophe Bontoux uczestniczy w płatnych zajęciach prelegentów i otrzymuje korzyści od Thermo Fisher Scientific. Paul Hofman uczestniczy w płatnych działaniach prelegentów i otrzymuje świadczenia oraz fundusze od Thermo Fisher Scientific.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy firmie Thermo Fisher Scientific za umożliwienie nam korzystania z ich urządzenia i materiałów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-dołkowa przezroczysta płyta z twardą skorupąThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)4483354
Samoprzylepna folia PCRThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)AB0626
AutoLys M tube Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A38738Probówki do przetwarzania próbek FFPE
Genexus Kody kreskowe 1-32 HDThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40261
Chip Genexus GX5 i łącznik GenexusThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40269
Końcówki do pipet GenexusThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone)A40266
Przyrząd do oczyszczania GenexusThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A48148Automatyczny przyrząd do oczyszczania (API)
Zestaw do sekwencjonowania GenexusThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40271
Paski szablonowe Genexus 3-GX5 i 4Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40263
Genexus Zintegrowany sekwencerThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A45727
Ion Torrent  Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo KitThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A45539
Oncomine  Panel do precyzyjnego testu GX (OPA) (w zestawie paski 1 i 2-HD)Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A46291

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Howlader, N., et al. The effect of advances in lung-cancer treatment on population mortality. New England Journal of Medicine. 383 (7), 640-649 (2020).
  2. Melosky, B., et al. The rapidly evolving landscape of novel targeted therapies in advanced non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 160, 136-151 (2021).
  3. Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer with driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. Journal of Clinical Oncology. 39 (9), 1040-1091 (2021).
  4. Kerr, K. M., et al. The evolving landscape of biomarker testing for non-small cell lung cancer in Europe. Lung Cancer. 154, 161-175 (2021).
  5. Mosele, F., et al. Recommendations for the use of next-generation sequencing (NGS) for patients with metastatic cancers: a report from the ESMO precision medicine working group. Annals of Oncology. 31 (11), 1491-1505 (2020).
  6. Kazdal, D., Hofman, V., Christopoulos, P., Ilié, M., Stenzinger, A., Hofman, P. Fusion-positive non-small cell lung carcinoma: Biological principles, clinical practice, and diagnostic implications. Genes Chromosomes and Cancer. 61 (5), 244-260 (2022).
  7. Li, B. T., et al. Trastuzumab deruxtecan in HER2 -mutant non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 386 (3), 241-251 (2022).
  8. Bontoux, C., Hofman, V., Brest, P., Ilié, M., Mograbi, B., Hofman, P. Daily practice assessment of KRAS status in NSCLC patients: A new challenge for the thoracic pathologist is right around the corner. Cancers. 14 (7), 1628(2022).
  9. Skoulidis, F., et al. Sotorasib for lung cancers with KRAS p.G12C mutation. New England Journal of Medicine. 384 (25), 2371-2381 (2021).
  10. Hellyer, J. A., et al. Impact of tumor suppressor gene co-mutations on differential response to EGFR TKI therapy in EGFR L858R and Exon 19 deletion lung cancer. Clinical Lung Cancer. 23 (3), 264-272 (2022).
  11. Mograbi, B., Heeke, S., Hofman, P. The importance of stk11/lkb1 assessment in non-small cell lung carcinomas. Diagnostics. 11 (2), 196(2021).
  12. Nadal, E., et al. Two patients with advanced-stage lung adenocarcinoma with radiologic complete response to nivolumab treatment harboring an STK11/LKB1 mutation. JCO Precision Oncology. 4, 1239-1245 (2022).
  13. Smeltzer, M. P., et al. The international association for the study of lung cancer global survey on molecular testing in lung cancer. Journal of Thoracic Oncology. 15 (9), 1434-1448 (2020).
  14. Ahern, E., Solomon, B. J., Hui, R., Pavlakis, N., O'Byrne, K., Hughes, B. G. M. Neoadjuvant immunotherapy for non-small cell lung cancer: Right drugs, right patient, right time. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 9 (6), e002248(2021).
  15. Wu, Y. -L., et al. Osimertinib in resected EGFR-mutated non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 383 (18), 1711-1723 (2020).
  16. Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer without driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. J Clin Oncol. 38 (14), 1608-1632 (2020).
  17. de Maglio, G., et al. The storm of NGS in NSCLC diagnostic-therapeutic pathway: How to sun the real clinical practice. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 169, 103561(2022).
  18. DiStasio, M., Chen, Y., Rangachari, D., Costa, D. B., Heher, Y. K., VanderLaan, P. A. Molecular testing turnaround time for non-small cell lung cancer in routine clinical practice confirms feasibility of CAP/IASLC/AMP guideline recommendations: A single-center analysis. Clinical Lung Cancer. 18 (5), e349-e356 (2017).
  19. Heeke, S., et al. Use of the ion PGM and the genereader NGS systems in daily routine practice for advanced lung adenocarcinoma patients: A practical point of view reporting a comparative study and assessment of 90 patients. Cancers. 10 (4), 88(2018).
  20. Hofman, P. The challenges of evaluating predictive biomarkers using small biopsy tissue samples and liquid biopsies from non-small cell lung cancer patients. Journal of Thoracic Disease. 11, S57-S64 (2019).
  21. Ilié, M., et al. Setting up an ultra-fast next-generation sequencing approach as reflex testing at diagnosis of non-squamous non-small cell lung cancer; experience of a single center (LPCE, Nice, France). Cancers. 14 (9), 2258(2022).
  22. Zacharias, M., et al. Reflex testing in non-small cell lung carcinoma using DNA-and RNA-based next-generation sequencing-a single-center experience. Translational Lung Cancer Research. 10 (11), 4221-4234 (2021).
  23. Miller, T. E., et al. Clinical utility of reflex testing using focused nextgeneration sequencing for management of patients with advanced lung adenocarcinoma. Journal of Clinical Pathology. 71 (12), 1108-1115 (2018).
  24. Al-Ahmadi, A., et al. Next generation sequencing of advanced non-small cell lung cancer: utilization based on race and impact on survival. Clinical Lung Cancer. 22 (1), 16.e1-22.e1 (2021).
  25. Kim, J. H., Yoon, S., Lee, D. H., Jang, S. J., Chun, S. M., Kim, S. W. Real-world utility of next-generation sequencing for targeted gene analysis and its application to treatment in lung adenocarcinoma. Cancer Medicine. 10 (10), 3197-3204 (2021).
  26. Sheffield, B. S., et al. Point of care molecular testing: Community-based rapid next-generation sequencing to support cancer care. Current Oncology. 29 (3), 1326-1334 (2022).
  27. Camidge, D. R., Doebele, R. C., Kerr, K. M. Comparing and contrasting predictive biomarkers for immunotherapy and targeted therapy of NSCLC. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (6), 341-355 (2019).
  28. Rosas, D., Raez, L. E., Russo, A., Rolfo, C. Neuregulin 1 gene (Nrg1). A potentially new targetable alteration for the treatment of lung cancer. Cancers. 13 (20), 5038(2021).
  29. Shapiro, G. I., et al. A Phase 1 study of RO6870810, a novel bromodomain and extra-terminal protein inhibitor, in patients with NUT carcinoma, other solid tumours, or diffuse large B-cell lymphoma. British Journal of Cancer. 124 (4), 744-753 (2021).
  30. Schoenfeld, A. J., et al. The genomic landscape of SMARCA4 alterations and associations with outcomes in patients with lung cancer. Clinical Cancer Research. 26 (21), 5701-5708 (2021).
  31. Zhang, K., et al. Identification of deleterious NOTCH mutation as novel predictor to efficacious immunotherapy in NSCLC. Clinical Cancer Research. 26 (14), 3649-3661 (2020).
  32. Shen, C. I., et al. Real-world evidence of the intrinsic limitations of PCR-based EGFR mutation assay in non-small cell lung cancer. Scientific Reports. 12 (1), 13566(2022).
  33. Zou, D., et al. Diagnostic value and cost-effectiveness of next-generation sequencing-based testing for treatment of patients with advanced/metastatic non-squamous non-small-cell lung cancer in the United States. Journal of Molecular Diagnostics. 24 (8), 901-914 (2022).
  34. Zhong, Y., Xu, F., Wu, J., Schubert, J., Li, M. M. Application of next generation sequencing in laboratory medicine. Annals of Laboratory Medicine. 41 (1), 25-43 (2020).
  35. Bruno, R., Fontanini, G. Next generation sequencing for gene fusion analysis in lung cancer: A literature review. Diagnostics. 10 (8), 521(2020).
  36. Hofman, V., et al. Ultra-fast gene fusion assessment for non-squamous non-small cell lung cancer. JTO Clinical and Research Reports. 4 (2), 100457(2022).
  37. Horgan, D., et al. Personalized medicine perspective identifying the steps required to effectively implement next-generation sequencing in oncology at a national level in Europe. Journal of Personalized Medicine. 12 (1), 72(2022).
  38. Cohen, D., et al. Optimizing mutation and fusion detection in NSCLC by sequential DNA and RNA sequencing. Journal of Thoracic Oncology. 15 (6), 1000-1014 (2020).
  39. Goswami, R. S., et al. Identification of factors affecting the success of next-generation sequencing testing in solid tumors. American Journal of Clinical Pathology. 145 (2), 222-237 (2016).
  40. Ilie, M., Hofman, P. Pitfalls in Lung Cancer Molecular Pathology: How to Limit them in Routine Practice. Current Medicinal Chemistry. 19 (16), 2638-2651 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sekwencjonowanie oparte na amplikonachzmiany molekularneprofilowanie genomiczneterapia celowanatkanka FFPEoczyszczanie DNA i RNAwykrywanie wariant wonkologia torakalna

Powiązane artykuły