Ultraszybkie sekwencjonowanie nowej generacji oparte na amplikonie w niepłaskonabłonkowym niedrobnokomórkowym raku płuca

W ciągu ostatniej dekady, rozwój terapii celowanych i immunologicznych znacznie zwiększył całkowite przeżycie (OS) niepłaskonabłonkowego niedrobnokomórkowego raka płuca (NS-NSCLC)^1,2. W związku z tym w ciągu ostatnich kilku lat wzrosła liczba obowiązkowych genów i celów molekularnych do analizy podczas leczenia NS-NSCLC^3,4.

Aktualne międzynarodowe wytyczne zalecają testowanie EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET i MET podczas diagnozy zaawansowanego NS-NSCLC⁵. Ponadto, ponieważ nowe leki dały ostatnio bardzo obiecujące wyniki w badaniach klinicznych, dodatkowe zmiany genomowe zostaną wkrótce przebadane w wielu dodatkowych genach, w szczególności KRAS i HER2, wraz z BRAC1/BRAC2, PI3KA, NRG1 i NUT^6,7,8,9. Ponadto status różnych powiązanych genów, takich jak STK11, KEAP1 i TP53, może być bardzo interesujący dla lepszego przewidywania odpowiedzi lub oporności na niektóre terapie celowane i/lub inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych (ICI)^10,11,12.

Co ważne, zmiany molekularne muszą być zgłaszane bez znaczącej zwłoki, aby zapewnić staranne podejmowanie decyzji klinicznych. Brak charakterystyki molekularnej guza może prowadzić do rozpoczęcia terapii niecelowanych, takich jak chemioterapia z lub bez immunoterapii, co prowadzi do nieoptymalnej strategii leczenia, ponieważ odpowiedź na chemioterapię jest ograniczona u pacjentów ze zmianami możliwymi do działania, takimi jak mutacje EGFR lub fuzje genów¹³.

Ponadto, obecny rozwój terapii celowanych/immunoterapii w ustawieniach neoadiuwantowych i/lub adjuwantowych może prowadzić do systematycznego poszukiwania, przynajmniej zmian EGFR i ALK we wczesnym stadium NS-NSCLC, ponieważ ICI powinny być podawane tylko w nowotworach typu dzikiego dla EGFR i ALK¹⁴. Obecnie obowiązkowe jest również badanie na obecność mutacji EGFR we wczesnym stadium NS-NSCLC, ponieważ ozymertynib (inhibitor kinazy tyrozynowej trzeciej generacji EGFR) może być stosowany jako terapia uzupełniająca w NS-NSCLC^{EGFRsup class="xref">15}.

Strategia oceny różnych biomarkerów w przewidywaniu odpowiedzi na różne terapie celowane i/lub immunoterapie u pacjentów z NS-NSCLC postępuje szybko, co utrudnia sekwencyjną identyfikację tych biomarkerów^3,16. W związku z tym sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) jest obecnie optymalnym podejściem do wysokoprzepustowej równoległej oceny zmian genów w NS-NSCLC^5,17.

Jednak przepływ pracy NGS może być trudny do opanowania i może trwać do dłuższego TAT^18,19. W związku z tym wiele ośrodków nadal stosuje podejścia sekwencyjne (immunohistochemia (IHC), fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) i/lub sekwencjonowanie celowane). Strategia ta jest jednak ograniczona w przypadku małej liczebności próby, a przede wszystkim ze względu na zwiększoną liczbę mutacji, które są wymagane do przetestowania w NS-NSCLC²⁰. W związku z tym ultraszybkie i proste metody testowe pozwalające na szybką ocenę zmian w genach stają się coraz ważniejsze dla optymalnego podejmowania decyzji klinicznych. Co więcej, zatwierdzone i akredytowane systemy do badań molekularnych stają się obowiązkowe przy przepisywaniu określonych terapii celowanych.

Tutaj opisujemy ultraszybki i zautomatyzowany test DNA/RNA NGS oparty na amplikonie do testów molekularnych NS-NSCLC, który jest używany w Laboratorium Laboratorium Patologii Klinicznej i Eksperymentalnej (LPCE), Szpitalu Uniwersyteckim w Nicei, Francja i jest akredytowany zgodnie z normą ISO 15189 przez Francuską Komisję Akredytacyjną (COFRAC) (https://www.cofrac.fr/). COFRAC zaświadcza, że laboratorium spełnia wymagania normy ISO 15189 oraz zasady stosowania COFRAC dla czynności testowania/kalibracji w analizie molekularnej w zautomatyzowanym NGS na sekwenatorze z panelem wykonywanym przez laboratorium. Akredytacja zgodnie z uznaną międzynarodową normą ISO 15189 świadczy o kompetencjach technicznych laboratorium w określonym zakresie oraz o prawidłowym działaniu odpowiedniego systemu zarządzania w tym laboratorium. Omówiono korzyści i ograniczenia tego przepływu pracy, począwszy od przygotowania próbek biopsji tkanek do uzyskania raportu.

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyki (Komisja ds. Etyki Badań Klinicznych, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Tumorothèque BB-0033-00025). Uzyskano świadomą zgodę wszystkich pacjentów na wykorzystanie próbek i wygenerowanych danych. Wszystkie próbki pobrano od pacjentów, u których zdiagnozowano NS-NSCLC w LPCE (Nicea, Francja) w okresie od 20 września do 31 stycznia 2022 r. w ramach opieki medycznej.

1. Przygotowanie próbek DNA i RNA FFPE za pomocą automatycznego urządzenia do oczyszczania (API) (Czas przetwarzania: 5 h 15 min)

1. Uruchom planowanie na instrumencie.
   1. Włącz instrument i zaloguj się za pomocą nazwy użytkownika i hasła (Tabela materiałów). Utwórz plan przebiegu oczyszczania, klikając pozycję Uruchom, a następnie Dodaj plan i nadając nazwę planowi uruchamiania.
   2. Następnie wybierz odpowiedni zestaw do oczyszczania i protokół sekwencyjnego oczyszczania DNA i RNA z próbek zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie. Włączyć oznaczanie ilościowe po oczyszczeniu.
   3. Wybierz żądaną objętość elucji (50 μl) z listy rozwijanej, a następnie kliknij przycisk Dalej. Wybierz liczbę próbek, które zostaną wyekstrahowane.
   4. Następnie zaznacz każdy przykład, kliknij przycisk Edytuj, wprowadź identyfikator próbki, a następnie kliknij przycisk Zapisz.
2. Przygotowanie próbek FFPE DNA i RNA za pomocą GPI
   1. Przygotować próbki tkanek FFPE (4 sekcje cięcia po 10 μm za pomocą mikrotomu) lub wykonać makrodysekcję bezpośrednio na blokach FFPE. Umieść każdą próbkę tkanki FFPE w oddzielnych i zidentyfikowanych probówkach do przetwarzania próbek FFPE (tabela materiałów).
   2. Wirować przy 2000 x g przez 1 minutę, aby zebrać tkankę z dna probówek.
   3. Do każdej probówki do przetwarzania próbek FFPE dodać główną mieszankę do trawienia proteazy przygotowaną z zestawu do oczyszczania kwasów nukleinowych i inkubować w temperaturze 60 °C przez co najmniej 60 minut (tabela materiałów). Próbki inkubować w temperaturze 90 °C przez 60 minut.
   4. Po inkubacji pozostawić próbki do ostygnięcia przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
   5. Dla każdej probówki do przetwarzania próbek FFPE podnieś rurkę wewnętrzną, zablokuj ją, skręcając w lewo, a następnie odwiruj próbki o masie 2000 x g przez 10 minut.
   6. Odblokuj dętki, skręcając w prawo, oddziel je od dętek zewnętrznych i wyrzuć. Próbki należy przechowywać w zewnętrznych probówkach na lodzie do momentu załadowania do API.
   7. Przygotuj główną mieszankę do mineralizacji DNazy i załaduj ją do wstępnie napełnionej płytki do oczyszczania DNA i RNA FFPE 2. Następnie załaduj przygotowane próbki na płytkę oczyszczającą FFPE DNA i RNA 1 (tabela materiałów).
3. Uruchom przebieg oczyszczania w interfejsie API.
   1. Na ekranie API kliknij przycisk Uruchom, wybierz plan uruchamiania, a następnie kliknij przycisk Dalej.
   2. Postępuj zgodnie ze wskazówkami wyświetlanymi na ekranie, aby załadować do API wymagane materiały eksploatacyjne i odczynniki potrzebne do przebiegu oczyszczania (tabela materiałów).
   3. Po załadowaniu wszystkich odczynników kliknij przycisk Dalej. Zamknij okno interfejsu API i kliknij przycisk Start.
   4. Pod koniec cyklu kliknij « rozładuj » na ekranie dotykowym i natychmiast wyjmij 48-dołkową płytkę archiwum kwasu nukleinowego zawierającą oczyszczoną próbkę DNA i RNA.
   5. Eksportuj wyniki oceny ilościowej. Uszczelnić płytkę i przechowywać oczyszczone próbki w temperaturze -80 °C. Przenieść 96-dołkową płytkę do sekwenatora, który ma być poddany analizie.
4. Utwórz przykład i utwórz przebieg.
   1. Otwórz oprogramowanie i zaloguj się do niego, a następnie wybierz na pasku menu Próbki i kliknij Utwórz próbkę.
   2. Wprowadź nazwę próbki, płeć i procent komórek nowotworowych, a w razie potrzeby wypełnij wymagane pola i pola opcjonalne.
   3. Zapisz szczegóły (płeć i procent komórek nowotworowych są ważne dla analizy wariantów liczby kopii [CNV]).
   4. Wybierz Przebiegi i Kwas nukleinowy do wyniku na pasku menu.
   5. Wprowadź nazwę uruchomienia w kroku Setup. Kliknij Dalej.
   6. Wybierz test w kroku Testy. Kliknij Dalej.
   7. Wybierz próbki w kroku Próbki, aby uruchomić test.
   8. Następnie w okienku Wybrane testy kliknij przycisk Przypisz. Kliknij Dalej.
   9. Przejrzyj przykładowe pozycje na przykładowej płytce wejściowej. Kliknij Dalej.
   10. Przejrzyj podsumowanie planu uruchamiania, a następnie Zapisz i wydrukuj lub Zapisz.

2. Zautomatyzowany NGS na sekwencerze (Czas przetwarzania: 30 min)

1. Załaduj płytkę próbki.
   UWAGA: Optymalne stężenie kwasu nukleinowego wynosi 0,5 ng/μL. Zwalidowany zakres stężeń kwasów nukleinowych wynosi 0,33-1 ng/μL. W przypadku DNA i RNA stężenie 1 ng/μl zostało zweryfikowane w laboratorium.
   1. Sekwencer wymaga całkowitej objętości 20 μl. Upewnij się, że objętość jest wystarczająca do załadowania próbki.
   2. Dodać kontrole pozytywne (DNA i RNA) i NTC (DNA i RNA) do 1. etapu instrumentu oczyszczającego bez ekstrakcji. Użyj kontroli DNA i RNA dla każdego przebiegu, aby zweryfikować przebieg i zweryfikować użyte partie. Dodaj kontrole DNA i RNA do płytki na końcu przebiegu API.
2. Załaduj sekwencer i rozpocznij przebieg.
   1. Wyjmij wszystkie odczynniki z pudełek w lodówce lub zamrażarce i rozmrażaj w temperaturze pokojowej przez minimalny okres 30 minut (tabela materiałów) i maksymalnie 12 godzin.
   2. W laboratorium sekwencer powinien być zawsze włączony, postępując zgodnie z zaleceniami udzielonymi przez dostawcę podczas szkolenia na miejscu. Zaloguj się do systemu.
   3. Załadować płytkę z przyrządu do oczyszczania, która zawiera próbki, po uszczelnieniu płytki arkuszem samoprzylepnej folii do płytek PCR (tabela materiałów).
   4. Zainstaluj wszystkie materiały eksploatacyjne w pokładzie. Sekwencer zawiera instrukcje krok po kroku, jak załadować każdy wymagany materiał eksploatacyjny w podświetlonej pozycji (Tabela materiałów).
   5. Sprawdź, czy na probówce 3 paska 2-HD nie ma osadów. Przesuń rurkę lub delikatnie przekręć pasek, aby w razie potrzeby rozpuścić osad.
   6. Pasek 1 i Pasek 3 zawierają koraliki magnetyczne. Ten krok jest bardzo ważny: upewnij się, że koraliki są ponownie zawieszone. W górnej części rurki nie powinny pozostać żadne koraliki.
   7. Odwróć pasek do góry nogami i do tyłu 3-4 razy, aby usunąć koraliki. Przytrzymaj pasek na jednym końcu z uszczelką paska skierowaną do góry. Następnie szybko przesuń pasek w dół, wykonując szybki, odśrodkowy ruch ramienia, i zakończ, wykonując ostry ruch nadgarstka.
   8. Wirować przy 300 x g przez 15 s. W razie potrzeby powtórzyć. Odwirować paski za pomocą adapterów i uchwytów pasków, aby zminimalizować awarie obserwowane losowo w związku z pozostałościami kulek w górnej części pasków.
   9. Zamknij system i kliknij przycisk Dalej. Zamontuj drzwi wnęki odczynników do sekwencjonowania (tabela materiałów). Zamknij drzwi. Sekwencer automatycznie rozpoczyna przebieg.
3. czyszczenie
   1. W przypadku czyszczenia po przebiegu, po jego zakończeniu, kliknij przycisk Dalej.
   2. Drzwi otwierają się sukcesywnie. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby opróżnić odpady i usunąć wszystkie materiały eksploatacyjne. Kliknij Dalej.
   3. Zamknij pokład po zakończeniu, kliknij przycisk Dalej. Rozpoczyna się 2-minutowe czyszczenie UV. Sekwencer jest gotowy do rozpoczęcia nowego przebiegu.

3. Analiza wyników za pomocą zintegrowanego oprogramowania (Czas analizy według pacjenta [próbki ADN i ARN]: 15 min)

UWAGA: Technika jest akredytowana przez Francuską Komisję Akredytacyjną (COFRAC) ISO 15189 (https://www.cofrac.fr/)

1. Dane i wyniki
   1. Wybierz wynik przebiegu lub przykładowy wynik w menu Wyniki. Na ekranie Wyniki/Wyniki uruchomienia wyświetlane są wszystkie przebiegi.
   2. Przeszukaj listę wyników, filtrując je w nagłówku kolumny.
   3. Kliknij pozycję Wyniki, a następnie kliknij pozycję Przykładowe wyniki. Następnie kliknij nazwę interesującej Cię próbki w kolumnie nazwy próbki, aby wyświetlić wyniki sekwencjonowania dla unikatowej próbki.
   4. Kliknij opcję Kolumny w lewym górnym rogu ekranu lub usuń zaznaczenie kolumn w tabeli.
2. Wyświetl wyniki kontroli jakości i wyświetl pokrycie amplikonem.
   1. Kliknij kartę QC (Kontrola jakości) na ekranie Results (Wyniki).
   2. W przypadku DNA upewnij się, że mediana bezwzględnych różnic parami (MAPT) wynosi od 0 do 0,5, aby zweryfikować analizę wariantów liczby kopii (CNV). Zamapowane odczyty muszą być większe niż 1,5 miliona.
   3. W przypadku RNA sprawdź, czy zmapowane odczyty mieszczą się w zakresie od 150 000 do 400 000. Poniżej tego poziomu istnieje ryzyko wyników fałszywie ujemnych, a poza tym istnieje ryzyko wyników fałszywie dodatnich.
   4. Kliknij nazwę próbki, aby otworzyć kartę Kluczowe wyniki.
   5. Przewiń do wykresów pokrycia amplikonem.
   6. Zapoznaj się z wykresami zasięgu. Określ minimalny próg pokrycia amplikonem, ponieważ dostawca go nie zapewnia. Aby zdefiniować zakres i próg, należy zmieszać próbkę kontrolną i próbkę typu dzikiego (WT). Następnie obserwuj najmniejszą wartość pokrycia amplikonem dla jednej lub więcej wybranych mutacji.
3. Wyświetlanie wyników wariantów.
   1. Aby wyeksportować dane w formacie tabelarycznym, kliknij przycisk Eksportuj w prawym górnym rogu ekranu.
   2. Aby wyświetlić wynik pojedynczego wariantu nukleotydu/wariantu insercji-delecji (SNV/INDEL), kliknij kartę Warianty, a następnie kliknij opcję SNV/Indels. Kliknij przycisk Edytuj filtry i wybierz opcję Brak filtra.
      UWAGA: Próg czułości został określony na poziomie 5% zgodnie z zaleceniami grupy INCA (Francuski Narodowy Instytut Raka) (https://www.e-cancer.fr/Professionnels-de-sante/Les-therapies-ciblees/Les-plateformes-de-genetique-moleculaire-des-cancers/Le-programme-d-assurance-qualite-des-plateformes).
   3. Wyświetlanie wyników fuzji i wyświetlanie wariantów eksonów RNA: Kliknij w kartę Warianty, a następnie kliknij w Fuzje.
   4. W prawym górnym rogu kliknij pozycję Wizualizacja i wariant eksonu RNA, a następnie przejrzyj wykres Warianty eksonu RNA.
   5. Dzięki temu zestawowi można wykryć przeskakiwanie eksonów genów EGFR, MET i AR. Kliknij opcję Wizualizacja; Jest to łatwiejsze do analizy.
   6. Wyświetlanie nierównowagi fuzji kafelków eksonów RNA: Kliknij w kartę Warianty, a następnie kliknij w Fuzje.
   7. W prawym górnym rogu kliknij pozycję Wizualizacja i nierównowaga fuzji kafelków eksonów RNA, a następnie przejrzyj wykresy nierównowagi fuzji kafelków eksonów RNA. Fuzja nierównowagi to fuzja między znanym partnerem a partnerem, który nie jest objęty panelem.
   8. Wyświetl wyniki CNV: Kliknij pozycję CNV na karcie Warianty, aby wyświetlić dane.
      UWAGA: Konieczne jest zachowanie czujności w stosunku do wyników CNV poprzez informowanie podczas przygotowywania próbek o płci i procentowej zawartości komórek nowotworowych w próbce. Gen AR jest przenoszony tylko przez chromosom X. Jeśli płeć nie zostanie określona, płeć męska może ponieść straty, co prowadzi do fałszywie dodatnich wyników u pacjentów płci męskiej.
4. Przejrzyj wyniki wtyczki.
   1. Przejrzyj wyniki wtyczki Analiza pokrycia: W prawym górnym rogu kliknij i wybierz pobierz pliki.
   2. Wtyczka Analiza pokrycia generuje raport z analizy pokrycia.
   3. Przejrzyj wyniki wtyczki Molecular Coverage Analysis: W prawym górnym rogu kliknij i wybierz pobierz pliki. Analiza ta sprawdza, czy wszystkie amplikony są objęte i potwierdza wyniki wariantów numerów kopii (CNV) dostarczone przez oprogramowanie.
5. Wyświetlanie metryk testu i raportu z przebiegu
   1. Kliknij kartę Uruchom raport w oknie Podsumowanie przebiegu.
   2. Aby wyświetlić raport uruchamiany, wybierz opcję Wybierz próbkę z menu rozwijanego.
   3. Metryki testu i raport przebiegu: znajdź metryki sekwencjonowania w górnej części ekranu, a następnie metryki specyficzne dla próbki w tabeli Przykłady uruchamiania.
      UWAGA: Informacje zawarte w pliku archiwum obsługi klienta (CSA) mogą pomóc w rozwiązywaniu problemów z wynikami, ale nie można ich bezpośrednio analizować. Pliki CSA podsumowują dane całego przebiegu i wskazują przyczyny problemu w przypadku nieudanego uruchomienia.
   4. Pobieranie raportu o uruchamianiu: Kliknij w kartę Raporty.
   5. Kliknij przycisk Pobierz raport, aby pobrać podsumowanie raportu uruchamiania w formacie PDF.
6. Wygeneruj raport wariantów.
   1. Włącz opcję Generuj raport w kroku Ustawienia, aby automatycznie generować raport wariantów dla każdej próbki podczas analizy danych przebiegu.
   2. Po wygenerowaniu raportu wariantów dla próby, system udostępnia raport w dwóch miejscach: Po pierwsze, na ekranie Wyniki/Wyniki próby udostępniany jest link. Kliknij łącze, aby pobrać plik PDF.
   3. Po drugie, przejdź do okienka Raport wariantów w zakładce Raporty i kliknij przycisk Pobierz raport. Raporty wariantów należy podpisywać elektronicznie lub ręcznie.
      UWAGA: Raporty podpisane elektronicznie mają (Podpisz) po nazwie próbki na ekranie Przykładowe wyniki.

Korzystając z przedstawionej tutaj procedury, szczegółowo opisanej w naszych ostatnich publikacjach21, opracowaliśmy optymalny przepływ pracy do oceny zmian molekularnych jako testu odruchowego w rutynowo przeprowadzanej praktyce klinicznej do diagnozy u pacjentów z NS-NSCLC przy użyciu ultraszybkiego sekwencjonowania nowej generacji opartego na amplikonach. Molekularny przebieg pracy metody jest pokazany na Rysunek 1. Lista genów uwzględnionych w panelu znajduje się na rysunku uzupełniającym 1.

Analiza molekularna została przeprowadzona u 259 pacjentów z NS-NSCLC. Obejmował on 153 biopsje oskrzeli, 47 biopsji przezklatkowych, 39 próbek chirurgicznych i 25 bloków komórkowych z 13 wysięków opłucnowych i 7 EBUS (Tabela 1). W 242 ważnych lub dostępnych analizach NGS DNA/RNA zaobserwowano następujące zmutowane geny napędowe: KRAS (25,4%), EGFR (18,2%), BRAF (6,3%), ERBB2 (1,7%) i MET (1,7%). Odnotowano następujące fuzje genów: ALK (4,3%), ROS1 (2,3%), RET (1,9%) i NTRK (0,8%). Następujące zmiany wykryto z częstością poniżej 1% (np. IDH1, CDKN2A, FGFR3, KIT, MTOR, FGFR4. NTRK3, NRAS, PIK3CA, IDH2, ERBB3, ERBB4, AR, CHECK2, SMO, PTEN). W przypadku DNA 10 przypadków (4%) nie powiodło się, podczas gdy w 5 przypadkach (2%) nie powiodło się w przypadku RNA. Niepowodzenie było spowodowane niską jakością DNA/RNA i/lub małą ilością DNA/RNA. Nieudana analiza wystąpiła tylko w przypadku próbek mających mniej niż 10% komórkowości guza. W ten sposób zdefiniowaliśmy granicę komórkowości guza na poziomie 10%. W przypadku wyników DNA NGS 10 przypadków (4%) nie przeszło z powodu niskiej jakości kwasów nukleinowych (6 przypadków) lub niewystarczającej ilości kwasów nukleinowych (4 przypadki z <13 ng DNA). Podobnie, w pięciu przypadkach (2%) wyniki sekwencjonowania RNA nie powiodły się zarówno z powodu nieodpowiedniej jakości RNA, jak i małej ilości RNA (<13 ng RNA). Średni odsetek komórek nowotworowych w nieudanych przypadkach był ograniczony (15%, wahał się od 10% do 20%), w przeciwieństwie do udanych przypadków, w których odsetek komórek nowotworowych wahał się od 30% do 90%. Spośród 15 nieudanych próbek, 11 pochodziło z małych biopsji tkanek (o średniej powierzchni 2 mm2), a 4 były próbkami cytologicznymi (takimi jak USG wewnątrzoskrzelowe [EBUS]).

Czułość metody wykrywania SNV i INDEL wynosiła 93,44%, dla CNV wynosiła 100%, a dla fuzji wynosiła 91,67% przy minimalnej zawartości komórek nowotworowych wynoszącej 10% (Tabela 1).

Średni TAT z endoskopowego pobierania próbek z raportu molekularnego wynosił 72 godziny (zakres: 48-96 godzin), a średni TAT od ekstrakcji do raportu wynosił 24 godziny.

Analityczna walidacja wyżej opisanego przepływu pracy NGS została przeprowadzona na 30 przypadkach NS-NSCLC. Walidacja wykazała 100% zgodność z metodami złotego standardu stosowanymi wcześniej w naszym centrum i szczegółowo wymienionymi w oryginalnej publikacji21: Test mutacji RT-PCR EGFR; Test mutacji RT-PCR KRAS; ALK IHC, ALK RYBA; ROS1 IHC; ROS1 powiedział: RYBA; BRAFV600E; i metody DNA/RNA NGS.

Wieloetapowa procedura od pobrania próbki do raportu molekularnego gruczolakoraka płuc z mutacją EGFR/TP53 jest przedstawiona w Rysunek 2. Reprezentacja mutacji znalezionej w próbce biopsji przy użyciu oprogramowania do analizy genomu (IGV) pokazano na rysunku uzupełniającym 2. Przykład raportu wygenerowanego z oprogramowania do raportowania przedstawiono na rysunku uzupełniającym 3.

Rysunek 1: Diagram przepływu pracy panelu użytego w tym badaniu. Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą Ilié et al.21. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Wiele kroków od pobrania próbki do raportu z biologii molekularnej. (A) Trzy próbki biopsji oskrzeli pobrane w laboratorium z pracowni endoskopowej. (B) Szkiełko barwione hematokliną/eozyną/Safranem próbki biopsji oskrzeli przedstawiające gruczolakoraka płuc z około 40%-50% komórek nowotworowych (powiększenie 100x). (C) Raport z oprogramowania sprawozdawczego wykazujący mutację EGFR związaną z mutacją TP53 w próbce guza. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Wyniki analizy molekularnej. Analizę molekularną przeprowadzono u 259 pacjentów z NS-NSCLC, w tym 153 biopsje oskrzeli, 47 biopsji przezklatkowych, 39 próbek chirurgicznych i 25 bloków komórkowych z 13 wysięków opłucnowych i 7 EBUS.

Rysunek uzupełniający 1: Geny zawarte w panelu GX do precyzyjnego testu NGS. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Reprezentacja wygenerowanych odczytów i mutacji znalezionych w próbce biopsji za pomocą oprogramowania IGV. (A) gen EGFR i (B) gen TP53. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Raport molekularny wygenerowany przez oprogramowanie do raportowania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Christophe Bontoux uczestniczy w płatnych zajęciach prelegentów i otrzymuje korzyści od Thermo Fisher Scientific. Paul Hofman uczestniczy w płatnych działaniach prelegentów i otrzymuje świadczenia oraz fundusze od Thermo Fisher Scientific.