Protokół podsumowuje najlepsze praktyki mające na celu zminimalizowanie obciążenia biologicznego mikroorganizmów w środowisku pomieszczeń czystych i zawiera strategie, takie jak monitorowanie środowiska, monitorowanie procesów i testowanie sterylności produktu. Jest to istotne dla zakładów produkcyjnych i badawczych, które są zobowiązane do spełniania aktualnych standardów dobrej praktyki tkankowej i aktualnych standardów dobrej praktyki wytwarzania.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Strategie kontroli i monitorowania mikrobiologicznego w pomieszczeniach czystych i terapiach komórkowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dobrze zweryfikowany i całościowy program, który obejmuje solidne środki w zakresie ubierania, czyszczenia, monitorowania środowiska i monitorowania personelu, jest kluczowy dla zminimalizowania obciążenia mikrobiologicznego w zestawach produkcyjnych terapii komórkowej i odpowiednich laboratoriach testowych, aby zapewnić, że obiekty działają w stanie kontroli. Zapewnienie bezpieczeństwa produktu za pomocą środków kontroli jakości, takich jak testy sterylności, jest wymogiem regulacyjnym zarówno dla minimalnie zmanipulowanych (sekcja 361), jak i więcej niż minimalnie zmanipulowanych (sekcja 351) ludzkich komórek, tkanek oraz produktów komórkowych i tkankowych (HCT/P). W tym filmie przedstawiamy przewodnik krok po kroku, jak opracować i włączyć najlepsze praktyki aseptyczne do pracy w środowisku pomieszczeń czystych, w tym fartuch, czyszczenie, rozmieszczenie materiałów, monitorowanie środowiska, monitorowanie procesów i testowanie sterylności produktu przy użyciu inokulacji bezpośredniej, dostarczone przez Farmakopeę Stanów Zjednoczonych (USP<71>) i Narodową Instytucję Zdrowia (NIH) Alternatywna metoda testowania sterylności. Protokół ten ma służyć jako przewodnik referencyjny dla zakładów, od których oczekuje się, że będą przestrzegać aktualnych dobrych praktyk tkankowych (cGTP) i aktualnych dobrych praktyk wytwarzania (cGMP).
Wprowadzenie
Wdrożenie silnego programu monitorowania mikroorganizmów poprzez monitorowanie środowiska (EM), monitorowanie procesów i testowanie sterylności produktu jest wymogiem regulacyjnym dla obecnych dobrych praktyk tkankowych (cGTP) i obecnych dobrych praktyk produkcyjnych (cGMP) w laboratoriach terapii komórkowej1. Ponadto Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) oczekuje, że laboratorium przeprowadzające testy kontroli jakości (QC) produktu powinno również korzystać z urządzeń i kontroli porównywalnych do tych używanych do operacji aseptycznego napełniania2.
Ten protokół składa się z czterech głównych sekcji: 1) Praktyki aseptyczne, w tym ubieranie personelu, czyszczenie i porządkowanie materiałów; 2) EM, w tym żywotne kultury powietrza i powierzchni oraz monitorowanie powietrza nieżywotnych cząstek; 3) monitorowanie procesu, w tym płytki osadcze i pobieranie próbek opuszków palców w rękawicach; oraz 4) testowanie sterylności produktu za pomocą kompendialnej metody Farmakopei Stanów Zjednoczonych (USP) <71> 3 lub NIH Alternative Sterility Testing Method4. Stosowane razem, środki te mogą być skuteczną metodą zapewniającą, że obiekt pozostaje w stanie kontroli.
Techniki opisane tutaj nie są nowe; jednak obecne standardy organów regulacyjnych i organizacji zawodowych nie są szczegółowe, co doprowadziło do braku monitorowania mikrobiologicznego lub wdrożenia niestandardowych praktyk, szczególnie w ośrodkach akademickich, gdzie produkcja na miejscu i testowanie sterylności produktów pojawiają się w szybkim tempie1,5,6. Protokół ten może być wykorzystany jako przewodnik do stworzenia programu monitorowania i kontroli drobnoustrojów, który spełnia wymagania prawne, gdy jest używany w połączeniu z walidacją użytkownika końcowego i ocenami ryzyka.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Praktyki aseptyczne
- Ubieranie personelu do pomieszczeń czystych
UWAGA: Niniejsza procedura opiera się na wstępnym ubieraniu w pomieszczeniu nieklasyfikowanym, a następnie wejściu do strefy ISO 8, a następnie do strefy ISO7. Procedura ta jest istotna dla laboratoriów próbujących przekształcić istniejącą przestrzeń w pomieszczenie czyste. Idealnie byłoby, gdyby całe wstępne ubieranie odbywało się w pomieszczeniu sklasyfikowanym jako ISO8 (a nie w pomieszczeniu nieklasyfikowanym).- Upiąć luźne włosy. Umyć ręce i przebrać się w odzież medyczną (preferowane są bluzy z długim rękawem i pełnowymiarowe spodnie medyczne). Przygotować i założyć obuwie do pomieszczeń czystych wraz z ochraniaczami na buty.
- Zdezynfekować ręce, używając początkowo środka do dezynfekcji rąk na bazie alkoholu, a następnie powtórzyć tę czynność przed każdym z następujących kroków: założeniem rękawiczek niesterylnych, a następnie osłony na brodę (w przypadku widocznego owłosienia twarzy), jeśli dotyczy. Założyć niesterylną czepkę i zakryć przedramiona niesterylnymi rękawami, jeśli nie użyto bluz z długim rękawem.
- Zdjąć ochraniacze na buty, stając każdą stopą na maty lepkiej przed drzwiami śluzy ISO8 po zdjęciu ochraniacza. Przed wejściem upewnić się, że cała stopa styka się z matą lepką. Wyrzucić ochraniacze na buty, a rękawiczki oraz klamkę drzwi zdezynfekować 70% sterylnym alkoholem izopropylowym (sIPA). Wejść do śluzy ISO8.
- Przygotować sterylny kaptur, sterylną maseczkę, sterylny kombinezon, sterylne ochraniacze na buty oraz okulary ochronne. Zdezynfekować rękawiczki 70% sIPA. Założyć okulary ochronne i przygotować materiały na czystej powierzchni, zgodnie z krokiem 1.5.
- Założyć nową parę niesterylnych ochraniaczy na buty na dedykowane obuwie do pomieszczeń czystych i stanąć na maty lepkiej przed wtórną śluzą. Upewnić się, że cała powierzchnia każdej stopy styka się z matą lepką. Zdezynfekować rękawiczki 70% sIPA. Pobrać przygotowane akcesoria do ubioru i wejść do wtórnej śluzy ISO7, pozostając po „brudnej” stronie linii demarkacyjnej.
- Założyć sterylny kaptur i sterylny kombinezon, dotykając wyłącznie wewnętrznej strony materiału i upewniając się, że szyja kaptura jest wsunięta do wnętrza kombinezonu w celu stworzenia pełnej szczelności. Założyć wtórne sterylne ochraniacze na buty. Między każdym etapem ubierania zdezynfekować rękawiczki 70% sIPA.
- Zweryfikować, czy ubiór został założony prawidłowo, zdezynfekować rękawiczki 70% sIPA i wejść do strefy ISO7.
UWAGA: Okresowo kontrolować integralność materiału ochronnego. W przypadku uszkodzenia natychmiast opuścić pomieszczenie czyste i ubrać się ponownie.
- Ubieranie do pracy z komorą z laminarnym przepływem powietrza (BSC)
- Ubrać się zgodnie z krokiem 1.1 powyżej, stosując dodatkowo następujące zasady.
- Przygotować sterylne rękawiczki i sterylne rękawy. Oczyścić BSC zgodnie z krokiem 1.4 i przygotować materiały zgodnie z krokiem 1.5. Zdezynfekować rękawiczki 70% sIPA.
- Aseptycznie założyć sterylne rękawy na kombinezon, używając pętli na kciuki, jeśli są dostępne. Założyć sterylne rękawiczki na istniejące rękawiczki, upewniając się, że mankiet rękawiczki zakrywa sterylny rękaw. Zdezynfekować rękawiczki 70% sIPA między każdym krokiem. Wejść do BSC.
UWAGA: Okresowo kontrolować integralność materiału ochronnego. W przypadku uszkodzenia natychmiast opuścić pomieszczenie czyste i ubrać się ponownie.
- Zdejmowanie odzieży i akcesoriów ochronnych
- Wyjść z BSC i ostrożnie zdjąć górną parę rękawiczek oraz sterylne rękawy. Zdezynfekować wewnętrzne rękawiczki 70% sIPA.
- Wejść do wtórnej, a następnie do głównej śluzy, czekając na pełne zamknięcie drzwi między każdym krokiem. Zdjąć elementy w następującej kolejności: zewnętrzne sterylne ochraniacze na buty, kombinezon, kaptur i maseczkę.
- Wyjść z głównej śluzy i zdjąć niesterylny ubiór ochronny.
UWAGA: Kolejność zdejmowania w pomieszczeniu nieklasyfikowanym nie jest istotna; jednak wewnętrzne niesterylne ochraniacze na buty powinny pozostać na obuwiu do pomieszczeń czystych podczas przechowywania w strefach nieklasyfikowanych. - Zdezynfekować ręce, używając środka do dezynfekcji rąk na bazie alkoholu, i przebrać się w ubrania cywilne.
- Czyszczenie powierzchni pomieszczenia czystego i BSC
- Przygotować ręczny mop do czyszczenia lub pobrać czystą ściereczkę niepozostawiającą włókien. W przypadku użycia ściereczki niepozostawiającej włókien, złożyć ją na cztery części i obracać między kolejnymi powierzchniami. Nasączyć głowicę mopa lub ściereczkę zatwierdzonym środkiem dezynfekcyjnym.
- Pracując od tyłu do przodu (lub od góry do dołu), oczyścić BSC, stosując nakładające się ruchy przecierania w następującej kolejności: kratka dyfuzora HEPA (górna część BSC), tylna ściana BSC, obie ściany boczne BSC, szyba osłonowa i powierzchnia robocza. Na koniec przetrzeć szybę osłonową BSC 70% sIPA, aby usunąć resztki środka dezynfekcyjnego. Typowy wzór czyszczenia BSC przedstawiono na Rysunku 1.
- Przygotowanie materiałów i sprzętu do wprowadzania do środowisk sklasyfikowanych
- Zdezynfekować (tj. przygotować) wszystkie materiały wymagające przeniesienia z obszaru nieklasyfikowanego lub o niższej klasyfikacji do obszaru o wyższej klasyfikacji (np. z obszaru ISO8 do ISO7), aby zminimalizować przeniesienie drobnoustrojów. Przenoszenie materiałów między obszarami o tym samym poziomie klasyfikacji ISO nie wymaga takiego przygotowania.
UWAGA: Jeśli materiały zostały poddane sterylizacji końcowej i znajdują się w wielu workach, należy zdjąć zewnętrzny worek/etui i przenieść materiał do strefy sklasyfikowanej; przecieranie wewnętrznego worka/etui nie jest wymagane. - Pobrać ściereczkę niepozostawiającą włókien i złożyć ją na cztery części, aby obracać na czystą stronę w miarę zanieczyszczania ściereczki. Nasączyć ściereczkę 70% sIPA lub zatwierdzonym środkiem dezynfekcyjnym.
- Przetrzeć zewnętrzną stronę materiału/sprzętu, stosując nakładające się ruchy. Upewnić się, że przetarto wszystkie obszary przedmiotu, w tym wnętrza zgrzewów opakowań oraz wnęki/zagłębienia w sprzęcie i innych akcesoriach o nieregularnych kształtach. W przypadku sprzętu na kółkach upewnić się, że całe koło zostało przetarte podczas procesu przygotowania (może być konieczne delikatne przechylenie sprzętu, aby umożliwić obrót kół).
- Zdezynfekować (tj. przygotować) wszystkie materiały wymagające przeniesienia z obszaru nieklasyfikowanego lub o niższej klasyfikacji do obszaru o wyższej klasyfikacji (np. z obszaru ISO8 do ISO7), aby zminimalizować przeniesienie drobnoustrojów. Przenoszenie materiałów między obszarami o tym samym poziomie klasyfikacji ISO nie wymaga takiego przygotowania.
Rycina 1: Przykład schematu czyszczenia BSC. Pracując od tyłu do przodu (lub od góry do dołu), należy wyczyścić BSC, przecierając powierzchnie nakładającymi się ruchami w następującej kolejności: kratkę dyfuzora HEPA (górna część BSC), tylną ścianę BSC, obie ściany boczne BSC, szybę przednią oraz powierzchnię roboczą. Na koniec przemyć szybę przednią BSC za pomocą 70% sIPA, aby usunąć pozostałości środka dezynfekującego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
2. Monitorowanie środowiska (EM)
- Próbkowanie powierzchniowe mikroorganizmów żywych
- Przygotować materiały niezbędne do sesji próbkowania zgodnie z krokiem 1.5 i ubrać się w odzież ochronną do wejścia do pomieszczenia zaklasyfikowanego zgodnie z sekcją 1.
UWAGA: Próbkowanie powierzchniowe powinno być wykonane przed próbkowaniem powietrza w każdym określonym punkcie. W przypadku użycia wielu szalek do próbkowania powierzchniowego danego obszaru, nie należy pobierać próbek z tego samego miejsca. Do pobierania próbek z powierzchni płaskich należy używać szalek kontaktowych, aby zapewnić pełny kontakt i uniknąć potencjalnego uszkodzenia agaru. - Przygotować i opisać jedną szalkę z agarem sojowo-kaseinowym z lecytyną i Tweenem (TSALT) oraz jedną szalkę z agarem Sabourauda z lecytyną i Tweenem (SABLT) dla każdego punktu próbkowania. Trzymając dno szalki jedną ręką, aseptycznie zdjąć pokrywkę, uważając, aby nie dotknąć wypukłej powierzchni agaru.
- Przyłożyć wypukły agar do pobieranej powierzchni, upewniając się, że cała powierzchnia styka się z agarem, i mocno docisnąć szalkę. Pozostawić szalkę w kontakcie z powierzchnią przez co najmniej 5 s.
- KRYTYCZNE: Nie przesuwać szalki bocznie po pobieranej powierzchni, ponieważ może to spowodować rozprzestrzenienie potencjalnego wzrostu na obszarze powierzchni, co utrudni rozróżnienie poszczególnych kolonii. Nie wywierać nadmiernej siły na szalkę kontaktową podczas próbkowania, ponieważ powierzchnia agaru może pęknąć.
- Aseptycznie założyć pokrywkę, uważając, aby nie dotknąć wypukłej powierzchni agaru. Zablokować pokrywkę, jeśli szalka kontaktowa posiada system blokujący. Oczyścić obszar próbkowania 70% sIPA, aby usunąć z powierzchni wszelkie pozostałości pożywki. Umieścić szalki w woreczkach i inkubować kultury zgodnie z opisem w Tabeli 1. Reprezentatywny obraz przedstawiający wzrost trzech jednostek tworzących kolonie (CFU) o dwóch odmiennych morfologiach kolonii na szalce do próbkowania powierzchniowego TSALT zilustrowano na Rysunku 2. Rysunek 3 pokazuje kontaminację szalki TSALT z wzrostem na krawędzi szalki, co jest wynikiem błędnej techniki aseptycznej podczas pobierania próbki.
- Przygotować materiały niezbędne do sesji próbkowania zgodnie z krokiem 1.5 i ubrać się w odzież ochronną do wejścia do pomieszczenia zaklasyfikowanego zgodnie z sekcją 1.
- Próbkowanie powietrza pod kątem mikroorganizmów żywych
- Przygotować materiały niezbędne do sesji próbkowania zgodnie z krokiem 1.5 i ubrać się w odzież ochronną do wejścia do pomieszczenia zaklasyfikowanego zgodnie z sekcją 1.
- Przygotować i opisać jedną szalkę z agarem sojowo-kaseinowym (TSA) oraz jedną szalkę z agarem Sabourauda (SAB) dla każdego punktu próbkowania. Przygotować próbnik powietrza, aseptycznie zdejmując głowicę pobierającą, chwytając ją wyłącznie za zewnętrzną krawędź, aby uniknąć kontaminacji głowicy.
- Trzymając głowicę pobierającą w jednej ręce, aseptycznie umieścić pożywkę w uchwycie na szalki w próbniku. Jeśli jeden z wypustów jest dłuższy od pozostałych, najpierw wsunąć pożywkę w stronę dłuższego wypustu, a następnie docisnąć szalkę do pozostałych wypustów, aby ją zabezpieczyć.
- Aseptycznie zdjąć pokrywkę szalki i położyć ją na czystej powierzchni w miejscu, gdzie nie będzie przeszkadzać, aż do zakończenia próbkowania. Aseptycznie założyć i zabezpieczyć głowicę pobierającą, chwytając ją wyłącznie za zewnętrzną krawędź, aby uniknąć kontaminacji głowicy. Powtórzyć kroki 2.2.2-2.2.4 dla pozostałych pożywek w przypadku korzystania z próbnika powietrza z wieloma głowicami.
- Umieścić próbnik powietrza w punkcie próbkowania tak, aby głowice pobierające były skierowane w dominującym kierunku przepływu powietrza. Upewnić się, że wylot z próbnika powietrza do cząstek nieżyjących (jeśli próbkowanie odbywa się jednocześnie) nie zakłóca pracy próbnika mikroorganizmów żywych. Upewnić się, że próbnik powietrza jest ustawiony zgodnie z zwalidowanymi parametrami, i rozpocząć cykl próbkowania.
- Po zakończeniu cyklu próbkowania aseptycznie zdjąć głowicę pobierającą z próbnika, chwytając ją wyłącznie za zewnętrzną krawędź, aby uniknąć kontaminacji głowicy. Trzymając głowicę pobierającą w jednej ręce, aseptycznie założyć pokrywkę szalki z agarem. Wyjąć szalkę z uchwytu. Umieścić szalki w woreczkach i inkubować kultury zgodnie z opisem w Tabeli 1.
- Zdezynfekować głowicę pobierającą oraz obszar wokół uchwytu na szalki 70% sIPA. Aseptycznie zabezpieczyć głowicę pobierającą, chwytając ją wyłącznie za zewnętrzną krawędź. Powtórzyć krok 2.2.6 i krok 2.2.7 dla pozostałych pożywek w przypadku korzystania z próbnika powietrza z wieloma głowicami.
UWAGA: Rysunek 4 przedstawia kulturę z aktywnego próbkowania powietrza na TSA z wzrostem spowodowanym kontaminacją głowicy pobierającej. Z kolei Rysunek 5 przedstawia kulturę z aktywnego próbkowania powietrza na TSA bez wzrostu. Na obrazie widoczne są wgłębienia powstałe w wyniku uderzeń powietrza z głowicy pobierającej.
- Próbkowanie cząstek nieżyjących
- Przed rozpoczęciem czynności próbkowania każdego dnia przeprowadzić kontrolę zera w laserowym liczniku cząstek. Podłączyć głowicę izokinetyczną do portu pobierającego licznika cząstek bezpośrednio lub za pomocą odcinka rurki, zależnie od wymogów miejsca próbkowania.
- W przypadku zastosowania rurki należy użyć krótkiego odcinka, ponieważ rurki o długości >1 m mogą powodować problemy z enumeracją cząstek o rozmiarze ≥1 µm oraz mogą prowadzić do niepotrzebnych zagięć rurki. Upewnić się, że licznik cząstek jest ustawiony zgodnie z zwalidowanymi parametrami. Zaleca się ustawienie opóźnienia wynoszącego około 30 s, aby umożliwić opuszczenie obszaru próbkowania i uniknąć zakłócenia przepływu powietrza podczas próbkowania.
- Ustawić głowicę izokinetyczną laserowego licznika cząstek w punkcie próbkowania tak, aby była skierowana w dominującym kierunku przepłycia powietrza. Upewnić się, że wylot z próbnika mikroorganizmów żywych (jeśli próbkowanie odbywa się jednocześnie) nie zakłóca pracy próbnika cząstek nieżyjących. W obszarach, w których przepływ powietrza nie jest jednokierunkowy lub wzór przepływu jest nieznany, należy upewnić się, że głowica izokinetyczna jest skierowana pionowo w górę.
UWAGA: Jeśli w pobliżu próbnika powietrza rozpylono środek dezynfekcyjny w formie rotacyjnej lub 70% sIPA, należy odczekać co najmniej 5 min przed rozpoczęciem cyklu próbkowania. - Rozpocząć cykl próbkowania i powoli opuścić obszar próbkowania, aby nie zakłócać przepływu powietrza.
KRYTYCZNE: Nie rozpylać cieczy w pobliżu próbnika powietrza podczas cyklu próbkowania, ponieważ spowoduje to wysokie wartości zliczeń cząstek nieżyjących. - Po zakończeniu próbkowania odebrać laserowy licznik cząstek. Zarejestrować średnią liczbę cząstek dla 0.5 µm. Niektóre placówki mogą również monitorować i analizować trendy dla 5.0 µm.
- Powtórzyć kroki 2.3.3-2.3.6 dla kolejnego punktu próbkowania. Podczas przemieszczania się między pomieszczeniami lub komorami BSC, przetrzeć zewnętrzną stronę próbnika cząstek nieżyjących 70% sIPA lub zatwierdzonym środkiem dezynfekcyjnym. Unikać przedostania się środka dezynfekcyjnego do wnętrza głowicy izokinetycznej, ponieważ może to prowadzić do niedokładnych zliczeń cząstek.
| Kategoria | Pożywki | Warunki hodowli | Obserwacja hodowli | Wyniki | ||||||
| Monitorowanie środowiska | TSA (powietrze biologicznie czynne) | 30 °C-35 °C, powietrze, przez co najmniej 3 dni | Zakończenie inkubacji | Grupa zapewnienia jakości (QA) w każdym zakładzie powinna ustanowić limity ostrzegawcze i limity działań dla każdego rodzaju i miejsca pobierania próbek. W przypadku próbek żywych, limity działań oparte na klasyfikacji ISO mogą być określane w oparciu o wytyczne PIC/S 009-16 (Aneksy). 18 or ISO-14644-1 7Limity interwencyjne dla nieżywych próbek powietrza są zazwyczaj ustalane jako procent limitu ISO (np. 99%). Limity ostrzegawcze dla próbek żywych są zazwyczaj ustalane jako procent limitu interwencyjnego lub limitu ISO (np. 95%). Należy odnieść się do PDA TR-13 oraz USP.<1116> po więcej szczegółów dotyczących ustalania poziomów ostrzegawczych i alarmowych oraz walidacji wybranych warunków hodowli 8,9. | ||||||
| SAB (powietrze żywe) | 20 °C-25 °C, powietrze, przez co najmniej 7 dni | |||||||||
| TSALT (powierzchnia żywa) | 30 °C-35 °C, powietrze, przez co najmniej 3 dni | Reprezentatywne obrazy płytek EM przedstawiono w Rysunek 2, Rysunek 3, Rycina 4i Rycina 5. | ||||||||
| SABLT (powierzchnia żywa) | 20 °C-25 °C, powietrze, przez co najmniej 7 dni | |||||||||
| Monitorowanie procesu | TSA (płytka sedymentacyjna) | 30 °C-35 °C, powietrze, przez co najmniej 3 dni | Wyłącznie do celów informacyjnych. Zawiera przydatne informacje w przypadku prowadzenia dochodzenia OOS (wynik poza specyfikacją) w odpowiedzi na negatywny wynik testu sterylności produktu. | |||||||
| SAB (płytka sedymentacyjna) | 20 °C-25 °C, w powietrzu, przez co najmniej 7 dni | Zobacz Rycina 6 jako przykład dodatniej płytki sedymentacyjnej. | ||||||||
| Pobieranie próbek metodą dotykową przy użyciu rękawiczek | TSALT | 30 °C-35 °C, powietrzem przez co najmniej 48 godzin, a następnie 20 °C-25 °C przez co najmniej 5 dni 19. | Kryteria akceptacji dla GFS to <1 JCF/płytkę (tzn. brak wzrostu) zgodnie z PIC/S 009-16 (Aneksy) 18Kryteria akceptacji mogą zostać zmodyfikowane według uznania działu QA placówki. | |||||||
| Badanie sterylności produktu | TSB (USP)<71>) | 20 °C-25 °C, powietrze, przez co najmniej 14 dni | Okresowo w trakcie inkubacji (dni 3, 5, 7 i 14) | Brak wzrostu. | ||||||
| FTM (USP)<71>) | 30 °C-35 °C, powietrze, przez co najmniej 14 dni | |||||||||
| iFA+ (metoda NIH) | 30 °C-35 °C, powietrze, przez co najmniej 14 dni | Monitorowanie odbywa się automatycznie za pomocą urządzenia BacT/ALERT Dual-T. Zdecydowanie zaleca się wizualną kontrolę każdej butelki pod kątem obecności grudek pleśni po zakończeniu inkubacji. | Zobacz Rysunek 8 jako przykład widocznych grudek pleśni, których system BacT/ALERT nie wykrył automatycznie. | |||||||
| iFN+ (metoda NIH) | ||||||||||
| SAB (metoda NIH) | 20 °C-25 °C przez co najmniej 14 dni | Okresowo w trakcie inkubacji (dni 3, 5, 7 i 14) | ||||||||
Tabela 1: Podsumowanie zalecanych warunków hodowli i oczekiwanych wyników. Opisane tutaj warunki hodowli są rekomendacjami opartymi na zwalidowanym programie stosowanym w NIH. Każdy użytkownik końcowy jest zobowiązany do zwalidowania własnego programu badań mikrobiologicznych. Strategie kontroli i testowania mikrobiologicznego mogą różnić się między instytutami w zależności od zmiennych, takich jak projekt obiektu, flora obiektu oraz klasyfikacja ryzyka produktu.
Rycina 2: Wzrost na płytce TSALT. Płytka do pobierania próbek powierzchniowych TSALT wykazująca trzy CFU o dwóch różnych morfologiach kolonii. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Kontaminacja płytki TSALT podczas pobierania próbek. Kultura powierzchniowa na podłożu TSALT wykazująca pojedynczą kolonię na krawędzi płytki, co wskazuje na niewłaściwe przestrzeganie zasad aseptyki podczas procesu pobierania próbek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Kultura uzyskana przy użyciu zanieczyszczonej głowicy do pobierania próbek powietrza. Przykład kultury z aktywnego poboru powietrza na podłożu TSA wykazującej >100 jednostek tworzących kolonie (CFU) o mieszanej morfologii. Wzór wzrostu wskazuje na zanieczyszczenie głowicy pobierającej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 5: Brak wzrostu na aktywnej płytce do badania żywotności mikroorganizmów w powietrzu z pożywką TSA. Aktywna płytka do badania żywotności mikroorganizmów w powietrzu z pożywką TSA obrazująca brak wzrostu po inkubacji. Na zdjęciu widoczne są odciski głowicy aktywnego próbnika powietrza. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
3. Monitorowanie procesu
- Płytki sedymentacyjne (pasywny monitoring powietrza)
- Umieść oznakowane płytki TSA i SAB w pobliżu obszaru roboczego, ale w miejscu, które nie będzie utrudniać przeprowadzania testów. Odnotuj czas rozpoczęcia pobierania próbek, a następnie aseptycznie otwórz obie płytki, kładąc pokrywki na czystej powierzchni w BSC z dala od obszaru roboczego.
- Płytki sedymentacyjne mogą pozostać otwarte maksymalnie przez 4 h, aby zapobiec wysychaniu agaru. Po zakończeniu procesu zamknij pokrywy płytek. Umieść płytki luźno w workach i inkubuj kultury zgodnie z opisem w Tabeli 1. Rysunek 6 przedstawia pojedynczą kolonię zanieczyszczenia na płytce sedymentacyjnej TSA.
- Pobieranie próbek z opuszków palców w rękawiczkach (GFS)
- Przygotuj dwie oznakowane płytki TSALT. Aseptycznie zdejmij pokrywkę z jednej płytki i połóż ją na czystej powierzchni roboczej z dala od miejsca pobierania próbek.
- Delikatnie przetocz opuszkę każdego palca oraz kciuka jednej ręki po powierzchni płytki (Rysunek 7). Pobieraj próbki z jak największej powierzchni każdego palca/kciuka, a nie tylko z samego czubka. Użyj siły wystarczającej do powstania lekkich wgłębień w agarze, nie powodując pęknięć jego powierzchni.
- Aseptycznie nałóż pokrywkę z powrotem na płytkę i powtórz krok 3.2.2 dla drugiej ręki. Po zakończeniu pobierania próbek zdezynfekuj dłonie 70% sIPA. Umieść płytki luźno w workach i inkubuj kultury zgodnie z opisem w Tabeli 1.
Rycina 6: Wzrost na płytce TSA do osiadania powietrza. Płytka TSA do osiadania powietrza obrazująca pojedynczą kolonię zanieczyszczenia wyhodowaną podczas pasywnego monitorowania powietrza w BSC. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 7: Pobieranie próbek z opuszków palców w rękawiczkach. Po lewej stronie przedstawiono prawidłową metodę pobierania próbek z opuszków palców w rękawiczkach, z wykorzystaniem największej powierzchni (opuszki) każdego palca/kciuka. Po prawej stronie przedstawiono nieprawidłowy proces, w którym próbka jest pobierana tylko z samego czubka palca. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
4. Badanie sterylności poprzez bezpośrednią inokulację produktu
- Inokulacja bezpośrednia zgodnie z USP<71>
- Przygotować jedną opisaną butelkę z bulionem sojowo-kazeinowym (TSB) oraz jedną opisaną butelkę z medium z tioglikolanem (FTM) dla każdego przedłożonego artykułu testowego. Na sesję badawczą przygotować jedną płytkę TSALT i jedną SABLT do pobierania próbek powierzchniowych na obecność drobnoustrojów, jedną płytkę TSA i jedną SAB jako płytki osiadania oraz dwie płytki TSALT do GFS.
- Ubrać odzież ochronną do pracy w komorze BSC zgodnie z krokiem 1.2. Oczyścić BSC zgodnie z krokiem 1.4. Rozmieścić materiały w BSC zgodnie z krokiem 1.5. Przeprowadzić pobieranie próbek kontaktowych z krytycznego obszaru roboczego zgodnie z krokiem 2.1, przecierając powierzchnię 70% sIPA po pobraniu próbek. Przygotować płytki osiadania TSA i SAB w pobliżu obszaru roboczego zgodnie z krokiem 3.1.
- Pobrać artykuł testowy oraz przypisane butelki TSB i FTM. Jeśli butelki TSB i FTM posiadają septum, zdjąć nakładki ochronne z każdej butelki i przetrzeć septum sterylną chusteczką nasączoną alkoholem. Jeśli butelki TSB i FTM mają nakrętki zakręcane, poluzować nakrętkę w butelkach (ale jej nie zdejmować).
- Wymieszać artykuł testowy w wirówce typu vortex, aby zapewnić jednorodność zawiesiny. Zainokulować butelki zwalidowaną objętością artykułu testowego (do 10 mL/butelkę) za pomocą sterylnej strzykawki i igły hipodermicznej (dla nakrętek z septum) lub pipetora (dla nakrętek zakręcanych).
- Po inokulacji przetrzeć septum sterylną chusteczką nasączoną alkoholem i włożyć sterylny element wentylacyjny, aby umożliwić wymianę powietrza podczas inkubacji. W przypadku butelek z nakrętkami zakręcanymi zamknąć butelkę, pozostawiając nakrętkę poluzowaną o 1/4 do 1/2 obrotu, aby umożliwić wymianę powietrza podczas inkubacji. Powtórzyć kroki 4.1.3–4.1.5 dla każdego artykułu testowego badanego w ramach tej sesji.
- Aseptycznie zamknąć płytki osiadania TSA i SAB oraz odnotować czas zakończenia pobierania próbek. Przeprowadzić GFS zgodnie z krokiem 3.2, przecierając rękawice 70% sIPA po pobraniu próbek. Umieścić płytki w workach (nie zaciskając ich mocno) i inkubować kultury zgodnie z opisem w Tabeli 1.
- Przenieść wszystkie materiały testowe z BSC i oczyścić BSC zgodnie z krokiem 1.4.
- Inokulacja bezpośrednia zgodnie z alternatywną metodą badania sterylności NIH
- Przygotować jedną opisaną płytkę iFA+, jedną opisaną płytkę iFN+ oraz jedną płytkę SAB dla każdego artykułu testowego. Na sesję badawczą przygotować jedną płytkę TSALT i jedną SABLT do pobierania próbek powierzchniowych na obecność drobnoustrojów, jedną płytkę TSA i jedną SAB jako płytki osiadania oraz dwie płytki TSALT do GFS.
- Ubrać odzież ochronną do pracy w komorze BSC zgodnie z krokiem 1.2. Oczyścić BSC zgodnie z krokiem 1.4. Rozmieścić materiały w BSC zgodnie z krokiem 1.5. Przeprowadzić pobieranie próbek kontaktowych z krytycznego obszaru roboczego zgodnie z krokiem 2.1, przecierając powierzchnię 70% sIPA po pobraniu próbek. Przygotować płytki osiadania TSA i SAB w pobliżu obszaru roboczego zgodnie z krokiem 3.1.
- Pobrać artykuł testowy oraz przypisane płytki iFA+, iFN+ i SAB. Zdjąć nakładki ochronne z butelek iFA+ i iFN+ i przetrzeć septum sterylną chusteczką nasączoną alkoholem.
- Wymieszać artykuł testowy w wirówce typu vortex, aby zapewnić jednorodność zawiesiny. Zainokulować butelki zwalidowaną objętością artykułu testowego (do 10 mL/butelkę) za pomocą sterylnej strzykawki i igły hipodermicznej. Przetrzeć septum sterylną chusteczką nasączoną alkoholem po inokulacji. Inkubować butelki w urządzeniu BacT/ALERT Dual-T zgodnie z opisem w Tabeli 1.
- Za pomocą pipetora zainokulować płytkę SAB zwalidowaną ilością artykułu testowego (nie więcej niż 500 µL/płytkę) i wykonać posiew izolicyjny za pomocą sterylnej pętlki. Odstawić na 10 min, aby upewnić się, że próbka nie spłynie na pokrywkę płytki po jej odwróceniu do inkubacji. Umieścić każdą płytkę SAB zainokulowaną artykułem testowym w plastikowym worku, zawiązać go luźno i inkubować zgodnie z opisem w Tabeli 1.
- Aseptycznie zamknąć płytki osiadania TSA i SAB oraz odnotować czas zakończenia pobierania próbek. Przeprowadzić GFS zgodnie z opisem w kroku 3.2, przecierając rękawice 70% sIPA po pobraniu próbek. Umieścić płytki w workach (nie zaciskając ich mocno) i inkubować kultury zgodnie z opisem w Tabeli 1. Inspekcja wizualna butelek BacT/ALERT pod koniec okresu inkubacji jest niezbędna do wykrycia kolonii pleśni, które mogły zostać pominięte przez urządzenie (Rysunek 8).
- Przenieść wszystkie materiały testowe z BSC i oczyścić BSC zgodnie z krokiem 1.4.
Rycina 8: Wzrost pleśni, którego nie wykryto za pomocą systemu BacT/ALERT. Przykład grudek pleśni, widocznych gołym okiem, które nie zostały automatycznie wykryte przez system BacT/ALERT. W oparciu o te wyniki zalecamy końcową inspekcję wizualną wszystkich butelek BacT/ALERT oraz dodanie płytki SAB do hodowli grzybów zgodnie z alternatywną metodą badania sterylności NIH. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Oczekiwane wyniki są opisane w Tabeli 1. Dane EM powinny zostać poddane przeglądowi, a następnie podjęte zostaną odpowiednie badania i zostaną podjęte odpowiednie działania oraz reagowanie na działania, alerty lub odchylenia limitów ISO. Jeśli dla cząstek nieżywotnych występuje odchylenie, należy postępować zgodnie z ISO 14644-Załącznik A, sekcja A.5.57. Jeżeli odchylenie można przypisać bezpośrednio możliwemu do zidentyfikowania zjawisku nienormalnemu, należy udokumentować pierwo...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym protokole znajduje się kilka krytycznych obszarów, w tym utrzymanie techniki aseptycznej i jednokierunkowego przepływu powietrza w pomieszczeniach czystych i BSC. Najlepsze praktyki obejmują powolne i celowe poruszanie się w celu zminimalizowania turbulencji. Manipulacje aseptyczne należy wykonywać od strony produktu, a nie od góry. Zaleca się przetwarzanie w systemie zamkniętym i stosowanie surowców sterylizowanych finalnie. Należy unikać mówienia w krytycznych miejscach i opierania się o ściany lub sprzęt. Podobn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Program Badań Wewnętrznych Centrum Klinicznego National Institutes of Health. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie reprezentują one oficjalnych poglądów National Institutes of Health.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 20-25&stopnie; C Preferencja laboratoryjna inkubatora | |||
| 30-35° C Inkubator | Preferencje laboratoryjne | ||
| do dezynfekcji rąk na bazie alkoholu | Preferencje laboratoryjne | ||
| BacT/ALERT Instrument Dual-T | BioMerieux Industry | ||
| Pokrowiec | Preferencja laboratoryjna | ||
| Szafka bezpieczeństwa biologicznego (BSC) | Preferencja laboratoryjna | ||
| do pomieszczeń czystych | Preferencja laboratoryjna | ||
| Płynne podłoże tioglikolanowe (FTM) | Odporna diagnostyka | U84 | USP |
| Ręczny mop do czyszczenia | Contec | 2665LF | |
| Igła | Preferencje laboratoryjne | ||
| iFA+ Butelka BacT/ALERT | Biomerieux | 412990 | |
| iFN+ Butelka BacT/ALERT | Biomerieux | 412991 | |
| Głowica | Preferencje laboratoryjne | ||
| Laserowy licznik | cząstekTSI Incorporated | 9500-01 | |
| LpH III | Steris | 1S16CX | |
| Lustro | Preferencja laboratoryjna | ||
| Niesterylny bouffant | Preferencja laboratoryjna | ||
| Rękawice | Preferencja laboratoryjna | ||
| Niesterylne ochraniacze | Preferencja laboratoryjna | ||
| Niesterylne pokrowce | na rękawy | Preferencja laboratoryjna | |
| Parafilm | Preferencja laboratoryjna | ||
| Peridox RTU | Contec | CR85335IR | |
| Plastikowa torba | Preferencja laboratoryjna | ||
| Agar dekstrozowy Sabouraud z lecytynazą i animacją (SABLT) | Hardy Diagnostics | P595 | USP, napromieniowany |
| agar z dekstrozą Sabouraurd (SAB) | Hardy Diagnostics | W565 | USP, napromieniowane |
| Okulary | Preferencje | ||
| laboratoryjne Peelingi (górne i dolne) | Preferencje laboratoryjne | ||
| Spor-Klenx RTU | Steris | 6525M2 | |
| Sterylne 70% alkohol izopropylowy (IPA) | Decon CiDehol | 8316 | |
| Sterylna chusteczka | Preferencje laboratoryjne | ||
| Sterylny but Pokrowce | Kimberly Clark | Cat# różnią się w zależności od rozmiaru | |
| Sterylne kombinezony | Kimberly Clark | Cat# różnią się w zależności od rozmiaru | |
| Sterylna maska | Preferencje laboratoryjne | ||
| Sterylne rękawiczki | Preferencje laboratoryjne | ||
| Sterylny kaptur | Kimberly Clark | Cat# różni się w zależności od rozmiaru | |
| Sterylne chusteczki o niskiej zawartości kłaczków | Texwipe | TX3210 | |
| Sterylne nakładki do czyszczenia mopa | Contec | MEQT0002SZ | |
| Sterylne pokrowce na rękawy | Kimberly Clark | 36077 | |
| Sterylny pręt do rozpierania | Fisher Scientific | 14665231 | |
| Sterylna strzykawka | Preferencja laboratoryjna | ||
| Lepkie maty Preferencja laboratoryjna | |||
| Tryptyczny agar sojowy ( TSA) | Hardy Diagnostyka | W570R | USP, napromieniowany |
| tryptyczny agar sojowy z lecytynazą i Tween (TSALT) | Odporna diagnostyka | P520R | USP, napromieniowany |
| tryptyczny bulion sojowy (TSB) | Odporna diagnostyka | U46 | USP |
| Vesphene | |||
| III | Steris | 1S15CX | |
| Żywotny próbnik powietrza | Hardy Diagnostics | Preferencja BAS22K | |
| Vortex | Lab |
Bibliografia
- Cundell, T., Atkins, J. W., Lau, A. F. Sterility testing for hematopoietic stem cells. Journal of Clinical Microbiology. , 10.1128/jcm.01654-22 (2023).
- United States Food and Drug Administration. Guidance for Industry. Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing - Current Good Manufacturing Practice. United States Food and Drug Administration. , (2004).
- United States Pharmacopeia - National Formulary. USP<71> Sterility Tests in USP43-NF38. United States Pharmacopeia - National Formulary. , (2022).
- England, M. R., Stock, F., Gebo, J. E. T., Frank, K. M., Lau, A. F. Comprehensive evaluation of compendial USP<71>, BacT/Alert Dual-T, and Bactec FX for detection of product sterility testing contaminants. Journal of Clinical Microbiology. 57 (2), 01548(2019).
- Gebo, J. E. T., East, A. D., Lau, A. F. A side-by-side comparison of clinical versus current good manufacturing practices (cGMP) microbiology laboratory requirements for sterility testing of cellular and gene therapy products. Clinical Microbiology Newsletter. 43 (21), 181-191 (2021).
- Gebo, J. E. T., Lau, A. F. Sterility testing for cellular therapies: What is the role of the clinical microbiology laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 58 (7), 01492(2020).
- International Organization for Standardization. ISO 14644-1:2015 Cleanrooms and associated controlled environments - Part 1: Classification of air cleanliness by particle concentration. International Organization for Standardization. , (2015).
- Parenteral Drug Association. PDA Technical Report No. 13 Revised 2022 (TR 13) Fundamentals of an Environmental Monitoring Program. Parenteral Drug Association, Inc. , (2022).
- United States Pharmacopeia - National Formulary. USP<1116> Microbiological Evaluation of Cleanrooms and Other Controlled Environments in USP43-NF38 2S. United States Pharmacopeia - National Formulary. , (2020).
- Guinet, R., et al. Multicenter study on incubation conditions for environmental monitoring and aseptic process simulation. PDA journal of pharmaceutical science and technology. 71 (1), 43-49 (2017).
- Gordon, O., Berchtold, M., Staerk, A., Roesti, D. Comparison of different incubation conditions for microbiological environmental monitoring. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 68 (5), 394-406 (2014).
- Anders, H. J., et al. Multisite qualification of an automated incubator and colony counter for environmental and bioburden applications in pharmaceutical microbiology. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. , (2022).
- United States Pharmacopeia - National Formulary. USP<1072> Disinfectants and Antiseptics. United States Pharmacopeia - National Formulary. , (2020).
- United States Pharmacopeia - National Formulary. USP<1071> Rapid Microbial Tests for Release of Sterile Short-Life Products: A Risk-Based Approach in USP43-NF38 2S. United States Pharmacopeia - National Formulary. , (2020).
- United States Pharmacopeia - National Formulary. PUSP<1223> Validation of Alternative Microbiological Methods in USP43-NF38 2S. United States Pharmacopeia - National Formulary. , (2020).
- Parenteral Drug Association. PDA Technical Report No. 33, Revised 2013 (TR 33) Evaluation, Validation and Implementation of Alternative and Rapid Microbiological Methods. Parenteral Drug Association, Inc. , (2013).
- Putnam, N. E., Lau, A. F. Comprehensive study identifies a sensitive, low-risk, closed-system model for detection of fungal contaminants in cell and gene therapy products. Journal of Clinical Microbiology. 59 (11), 0135721(2021).
- Pharmaceutical Inspection Convention & Pharmaceutical Inspection Co-operation. Guide to Good Manufacturing Practice for Medicinal Products Annexes (PE 009-16 (Annexes)). Pharmaceutical Inspection Convention & Pharmaceutical Inspection Co-operation Scheme. , (2022).
- United States Pharmacopeia - National Formulary. USP<825> Radiopharmaceuticals - Preparation, Compounding, Dispensing, and Repackaging in USP43-NF38 2S. United States Pharmacopeia - National Formulary. , (2020).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
