Artykuł metodologiczny

Wydajny protokół do analizy CUT&RUN mysich komórek satelitarnych izolowanych od FACS

DOI:

10.3791/65215

⸱

7 lipca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CNRS, Inserm, IGBMC UMR 7104- UMR-S 1258, Université de Strasbourg

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany tutaj jest skuteczny protokół do izolacji komórek satelitarnych mięśni kończyn myszy aktywowanym fluorescencyjnie (FACS), przystosowany do badania regulacji transkrypcji we włóknach mięśniowych poprzez rozszczepienie pod tarczami i uwolnienie za pomocą nukleazy (CUT&RUN).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analizy całego genomu z populacjami małych komórek są głównym ograniczeniem dla badań, szczególnie w dziedzinie komórek macierzystych. Praca ta opisuje skuteczny protokół izolacji komórek satelitarnych z aktywowanego fluorescencją sortowania komórek (FACS) z mięśnia kończyny, tkanki o wysokiej zawartości białek strukturalnych. Wypreparowane mięśnie kończyn u dorosłych myszy zostały mechanicznie przerwane przez mielenie w pożywce uzupełnionej dypazą i kolagenazą typu I. Po roztrawieniu homogenat przefiltrowano przez sitka komórkowe, a komórki zawieszono w buforze FACS. Żywotność określono za pomocą możliwego do naprawienia barwienia żywotności, a wyizolowano immunologicznie wyizolowane komórki satelitarne za pomocą FACS. Komórki poddano lizie za pomocą Triton X-100, a uwolnione jądra zostały związane z kulkami magnetycznymi konkanawaliny A. Kompleksy jądro/kulki inkubowano z przeciwciałami przeciwko czynnikowi transkrypcyjnemu lub modyfikacjom histonów, które były przedmiotem zainteresowania. Po przemyciu kompleksy jądro/kulki inkubowano z nukleazą białkową A-mikrokokową, a rozszczepienie chromatyny zainicjowano za pomocą CaCl2. Po ekstrakcji DNA wygenerowano i zsekwencjonowano biblioteki, a za pomocą analizy bioinformatycznej uzyskano profile wiązania czynników transkrypcyjnych w całym genomie i kowalencyjnych modyfikacji histonów. Piki uzyskane dla różnych znaczników histonowych wykazały, że zdarzenia wiązania były specyficzne dla komórek satelitarnych. Co więcej, analiza znanych motywów ujawniła, że czynnik transkrypcyjny jest związany z chromatyną poprzez pokrewny element odpowiedzi. Protokół ten jest zatem przystosowany do badania regulacji genów w komórkach satelitarnych mięśni kończyn dorosłych myszy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mięśnie poprzecznie prążkowane stanowią średnio 40% masy całego ciała ludzkiego1. Włókna mięśniowe wykazują niezwykłą zdolność do regeneracji po urazie, co opisuje fuzja nowo powstałych miocytów i generowanie nowych miowłókien, które zastępują uszkodzone2. W 1961 roku Alexander Mauro opisał populację komórek jednojądrzastych, które określił jako komórki satelitarne3. Te komórki macierzyste wyrażają sparowaną ramkę 7 czynnika transkrypcyjnego (PAX7) i znajdują się między blaszką podstawną a sarkolemmą włókien mięśniowych4. Doniesiono, że wykazują one ekspresję klastra różnicowania 34 (CD34; marker hematopoetyczny, progenitor śródbłonka i mezenchymalny marker komórek macierzystych), integryny alfa 7 (ITGA7; marker gładki mięśnia sercowego i mięśni szkieletowych), a także receptora chemokiny C-X-C typu 4 (CXCR4; marker limfocytów, komórek krwiotwórczych i satelitarnych)5. W warunkach podstawowych komórki satelitarne znajdują się w określonym mikrośrodowisku, które utrzymuje je w stanie spoczynku6. Po uszkodzeniu mięśni ulegają aktywacji, namnażają się i ulegają miogenezie7. Jednak ich analizy całego genomu, które stanowią tylko niewielki ułamek całkowitej liczby komórek mięśniowych, są szczególnie trudne, zwłaszcza w warunkach fizjologicznych (<1% wszystkich komórek).

Opisano różne metody izolacji chromatyny z komórek satelitarnych, które obejmują immunoprecypitację chromatyny, po której następuje masowe sekwencjonowanie równoległe (ChIP-seq) lub dzielenie pod celami i eksperymenty tagmentacji (CUT&Tag). Niemniej jednak te dwie techniki mają pewne istotne ograniczenia, które pozostają niekwestionowane. Rzeczywiście, ChIP-seq wymaga dużej ilości materiału wyjściowego do wytworzenia wystarczającej ilości chromatyny, której duża część jest tracona podczas etapu sonikacji. CUT&Tag jest bardziej odpowiedni dla małej liczby komórek, ale generuje więcej miejsc rozszczepienia poza celem niż ChIP-seq ze względu na aktywność transpozazy Tn5. Ponadto, ponieważ enzym ten ma wysokie powinowactwo do regionów otwartej chromatyny, podejście CUT&Tag może być preferencyjnie stosowane do analizy modyfikacji histonów lub czynników transkrypcyjnych związanych z aktywnie transkrybowanymi regionami genomu, zamiast wyciszonej heterochromatyny8,9.

Prezentowany tutaj jest szczegółowy protokół, który pozwala na izolację komórek satelitarnych mięśni kończyn myszy za pomocą FACS w celu rozszczepienia pod celami i uwolnienia za pomocą nukleazy (CUT&RUN)10,11 analiza. Poszczególne etapy obejmują mechaniczne rozerwanie tkanki, sortowanie komórek i izolację jąder. Skuteczność metody w zakresie przygotowania żywej zawiesiny komórkowej wykazano poprzez przeprowadzenie analizy CUT&RUN pod kątem kowalencyjnych modyfikacji histonów i czynników transkrypcyjnych. Jakość izolowanych komórek sprawia, że opisana metoda jest szczególnie atrakcyjna do otrzymywania chromatyny, która wiernie oddaje natywny stan zajętości genomu i prawdopodobnie będzie odpowiednia do uchwycenia konformacji chromosomów w połączeniu z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości w określonych loci (sekwencja 4C) lub na poziomie całego genomu (Hi-C).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy były trzymane w akredytowanym pomieszczeniu dla zwierząt, zgodnie z Krajowymi Wytycznymi Opieki nad Zwierzętami (dyrektywa Komisji Europejskiej 86/609/CEE; Francuski dekret nr 87-848) w sprawie wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych do badań. Zamierzone manipulacje zostały przedłożone Komitetowi Etyki (Com'Eth, Strasburg, Francja) oraz francuskiemu Ministerstwu Badań Naukowych (MESR) w celu oceny etycznej i autoryzacji zgodnie z dyrektywą 2010/63/UE pod numerem APAFIS #22281.

1. Przygotowanie zawiesiny komórek do izolacji komórek satelitarnych metodą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) (Rysunek 1)

  1. Izolacja tkanki mięśniowej
    1. Odkazić narzędzia do rozwarstwiania mięśni, w tym kleszcze, skalpele i nożyczki, za pomocą środka czyszczącego (Tabela 1) i dokładnie spłukać wodą destylowaną.
    2. Przygotować dwie probówki o pojemności 2 ml (Tabela 1), z których każda zawiera 1 ml buforu do izolacji mięśni, i umieścić je na lodzie w celu zebrania pobranych mięśni.
    3. Uśmierc dwa 10-tygodniowe samce myszy C57 / Bl6J przez uduszenie CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Rozpyl 70% etanolu na każdą całą mysz. Zdejmij skórę z tylnej kończyny za pomocą kleszczy. Wypreparuj wszystkie mięśnie kończyn otaczające kość udową, piszczelową i strzałkową (około 1 mg mięśni na mysz).
      UWAGA: Liczba komórek satelitarnych zmniejsza się po 15 tygodniu życia.
    4. Pobrane mięśnie kończyn umieścić w probówkach o pojemności 2 ml zawierających 1 ml buforu do izolacji mięśni przygotowanego w kroku 1.1.2. Zbierz mięśnie od drugiej myszy, postępując zgodnie z tą samą procedurą. Zebrane mięśnie rozdrobnić nożyczkami na lodzie, aż uzyskasię mniejsze niż 1 mm 3 fragmenty.
      UWAGA: Mięśnie zostały zebrane i zmielone głównie zgodnie z opisem12. Przeprowadź trawienie tkankowe, postępując zgodnie z krokiem 1.2 lub 1.3.
  2. Trawienie tkanek za pomocą enzymu kolagenazy
    1. Przenieś zawiesinę mięśni mielonych od dwóch myszy, wlewając je do probówki o pojemności 50 ml (Tabela 1) zawierającej 18 ml buforu do izolacji mięśni (uzupełnionego 5 ml [5 U / ml] dypazy i 5 mg kolagenazy typu I) (Tabela 1).
    2. Zamknąć szczelnie probówkę i zamknąć ją folią laboratoryjną (Tabela 1). Umieścić go poziomo w wytrząsającej łaźni wodnej (tabela 1) w temperaturze 37 °C przy 100 obr./min na 30 min.
    3. Po 30 minutach dodać 5 mg kolagenazy typu I. Trzymać probówki przez kolejne 30 minut pod mieszaniem w wytrząsającej łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przy 100 obr./min.
    4. Po strawieniu odpipetuj zawiesinę mięśniową w górę i w dół 10 razy pipetą o pojemności 10 ml, aby poprawić skuteczność dysocjacji. Wirować w temperaturze 4 °C przy 400 x g przez 5 min. Na dnie tuby będzie widoczny przezroczysty granulek. Odrzucić supernatant za pomocą pipety o pojemności 10 ml, pozostawiając 5 ml pożywki w probówce.
      UWAGA: Pozostawienie pożywki pomaga uniknąć stresu komórek. Dodać 10 ml świeżego buforu do izolacji mięśni i ponownie zawiesić osad, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
    5. Umieścić sitka do komórek o pojemności 100 μm, 70 μm i 40 μm (po jednym z każdego rodzaju) (tabela 1) na otwartych probówkach o pojemności 50 ml. Odpipetować zawiesinę na kolejne sitka (100 μm, 70 μm, 40 μm) i zebrać przepływ do probówek o pojemności 50 ml, zawierających komórki poniżej 40 μm.
    6. Odwirować zawiesinę w temperaturze 4 °C przy 400 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant za pomocą pipety o pojemności 10 ml do momentu, aż pozostanie 2 ml, a następnie użyć pipety o pojemności 0,2-1 ml do momentu, aż pozostanie 100-200 μl. Zawiesić osad w 2 ml buforu do lizy krwinek czerwonych (Tabela 2). Inkubować na lodzie przez 3 minuty.
    7. Wirować w temperaturze 4 °C przy 400 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant za pomocą pipety o pojemności 20-200 μl. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl zimnego buforu FACS (Tabela 2). Ułóż na lodzie.
  3. Alternatywna metoda trawienia tkanek za pomocą enzymu o niskiej zawartości termolizyny (TL) liberazy
    1. Postępuj zgodnie z opisami w kroku 1.1. w celu izolacji tkanek.
    2. W przypadku dezagregacji tkanek za pośrednictwem liberazy, należy pobrać mięśnie w 2 ml buforu izolacyjnego Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Tabela 2), zamiast bufora do izolacji mięśni opisanego w kroku 1.1.2.
    3. Przenieś zawiesinę mięśni mielonych od dwóch myszy, wlewając je do probówki o pojemności 50 ml (Tabela 1) zawierającej 18 ml buforu izolacyjnego RPMI uzupełnionego 300 lub 600 μl Liberazy TL w stężeniu 5 mg/ml (Tabela 1) (tj. odpowiednio 0,083 mg/ml i 0,167 mg/ml końcowe)13.
    4. Zamknąć szczelnie probówkę i zamknąć ją folią laboratoryjną (Tabela 1). Umieścić go poziomo w wytrząsającej łaźni wodnej (tabela 1) w temperaturze 37 °C przy 100 obr./min na 30 min.
    5. Po strawieniu odpipetuj zawiesinę mięśniową 10 razy w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml, aby dysocjować i poprawić skuteczność dysocjacji.
    6. Wirować w temperaturze 4 °C przy 400 x g przez 5 min. Na dnie tuby będzie widoczny przezroczysty granulek. Odrzucić supernatant za pomocą pipety o pojemności 10 ml, pozostawiając 5 ml pożywki w probówce. Pozostawienie pożywki pomaga uniknąć stresu komórek. Dodać 10 ml świeżego buforu izolacyjnego RPMI i ponownie zawiesić osad, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
    7. Umieścić sitka do komórek o pojemności 100 μm, 70 μm i 40 μm (po jednym z każdego rodzaju) (tabela 1) na otwartych probówkach o pojemności 50 ml.
    8. Odpipetować zawiesinę na kolejne sitka (100 μm, 70 μm, 40 μm) i zebrać przepływ do probówek o pojemności 50 ml, zawierających komórki poniżej 40 μm.
    9. Odwirować zawiesinę w temperaturze 4 °C przy 400 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant za pomocą pipety o pojemności 10 ml do momentu, aż pozostanie 2 ml, a następnie użyć pipety o pojemności 0,2-1 ml do momentu, aż pozostanie 100-200 μl.
    10. Zawiesić osad w 2 ml buforu do lizy krwinek czerwonych (Tabela 2). Inkubować na lodzie przez 3 minuty.
    11. Wirować w temperaturze 4 °C przy 400 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant za pomocą pipety o pojemności 20-200 μl.
    12. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl zimnego buforu FACS (Tabela 2). Ułóż na lodzie.
  4. Przygotowanie zawiesiny komórek do izolacji FACS
    1. Przenieść 10 μl zawiesiny komórek otrzymanej w kroku 1.2.12 do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml. Próbka ta będzie stanowić niebarwioną kontrolę lub kontrolę ujemną (Rysunek 2). Dodać 190 μl buforu FACS, przenieść do probówki o pojemności 5 ml (Tabela 1) i przechowywać na lodzie.
    2. Odwirować pozostałe 90 μl zawiesiny komórek otrzymanej w kroku 1.2.12 w temperaturze 4 °C przy 400 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant za pomocą pipety (objętość końcówki 20-200 μl). Inkubować komórki z 400 μl możliwej do utrwalenia barwie żywotności (Tabela 3) rozcieńczonej w niezawierającej surowicy zmodyfikowanej pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    3. Przemyć komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 °C przy 400 x g przez 5 minut i dodać 100 μl buforu FACS. Delikatnie odwrócić probówki trzy razy i ponownie odwirować w temperaturze 4 °C przy 400 x g przez 5 minut.
    4. W czasie wirowania przygotować 100 μl głównej mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych sprzężonych z fluoroforami i skierowanych przeciwko CD11b, CD31, CD45, TER119, CD34, ITGA7 i CXCR4 (Tabela 3), rozcieńczonej w buforze FACS.
    5. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant komórek za pomocą pipety (objętość końcówki 20-200 μl) i dodać 100 μl mieszaniny przeciwciał. Delikatnie odwróć rurkę trzy razy. Nie wirować. Inkubować w ciemności na lodzie przez 30 minut.
    6. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant za pomocą pipety o pojemności 20-200 μl i dodać 500 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w celu przepłukania komórek. Delikatnie odwróć rurkę trzy razy. Ponownie odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant za pomocą pipety o pojemności 20-200 μl.
    7. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforu FACS i przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 5 ml.
      UWAGA: zawiesina komórkowa uzyskana z trawienia liberazy jest przetwarzana w ten sam sposób.
  5. Wybór komórek satelitarnych przez FACS
    1. Krótko zawirować zawiesinę komórek (2-5 sekund) i przetworzyć komórki na cytometrze przepływowym wyposażonym w dyszę 100 μm (Tabela 1).
    2. Określ różne rozmiary bramek na podstawie niebarwionej próbki przechowywanej w kroku 1.4.1 (Rysunek 2).
    3. Pokryj probówkę o pojemności 5 ml 1 ml czystej płodowej surowicy cielęcej (FCS), aby poprawić pobieranie komórek i dodaj 500 μl buforu FACS.
    4. Zamień niebarwioną próbkę na próbkę znakowaną przeciwciałami.
    5. Wybierz interesującą populację zgodnie z obszarem rozproszenia do przodu (FSC-A) i obszarem rozproszenia bocznego (SSC-A) (Rysunek 3A) i usuń komórki dubletowe z FSC-A i wysokością rozproszenia do przodu (FSC-H) (Rysunek 3B)14.
    6. Zidentyfikuj żywe komórki z możliwym do naprawienia barwieniem ujemnym pod względem żywotności (Rysunek 3C).
    7. Wybierz ujemne komórki dla CD31, CD45, TER119 i CD11b (Rysunek 3D).
    8. Aby zidentyfikować komórki satelitarne, wybierz najpierw komórki, które są dodatnie dla CD34 i ITGA7 (Rysunek 3E), a następnie wybierz komórki CXCR4-dodatnie w populacji wybranej przez CD34 i ITGA7 (Rysunek 3F).
    9. Wybrane komórki (od 40 000 do 80 000 komórek, w zależności od jakości preparatu) należy zebrać do powlekanej probówki o pojemności 5 ml zawierającej 500 μl buforu FACS.

2. Walidacja izolowanej populacji w hodowli tkankowej

  1. Powłoka ślizgowa z hydrożelem
    1. Rozcieńczyć 280 μl czystej hydrożelowej matrycy kwalifikowanej do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) (Tabela 1) w 12 ml pożywki DMEM/F12 bez surowicy.
    2. Pokryć szkiełko podstawowe (tabela 1) roztworem hydrożelu i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    3. Następnego dnia inkubować szkiełko komorowe w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1 godzinę przed wysiewem komórek.
  2. Wzrost i różnicowanie komórek
    1. Umieść około 20 000 komórek, uzyskanych z kroku 1.5.9, na dołek i hoduj je w pożywce wzrostowej (Tabela 2) przez 5 dni. Wykonaj obrazy z kontrastem fazowym za pomocą mikroskopu jasnego pola (Rysunek 4A), przed przetworzeniem ich do analizy immunofluorescencyjnej, aby zapewnić jakość preparatu ( Rysunek 4B).
    2. Aby wywołać miogenezę, hoduj amplifikowane komórki satelitarne z kroku 2.2.1 w pożywce miogennej (Tabela 2) przez dodatkowe 7 dni. Wykonaj obrazy z kontrastem fazowym za pomocą mikroskopu jasnego pola ( Rysunek 4C) przed przetworzeniem ich do analizy immunofluorescencyjnej, aby zapewnić jakość preparatu (Rysunek 4D).
  3. Analiza immunocytofluorescencyjna
    1. Delikatnie usunąć pożywkę, umyć komórki, które były hodowane na szkiełku komorowym 100 μl 1x PBS dwukrotnie, i utrwalić je 100 μl 4% paraformaldehydu (PFA) w temperaturze pokojowej przez 1 h,
      UWAGA: Ten krok należy wykonywać ostrożnie. W komorze należy zawsze przechowywać niewielką objętość pożywki, aby zapobiec naprężeniu komórek, a PBS należy przelać przez ścianki komory.
    2. Umyj komórki trzykrotnie 100 μl 1x PBS, uzupełnionym 0,1% Tween 20 (PBST) w celu przepuszczalności błon komórkowych.
    3. Blokuj sygnały niespecyficzne przez inkubację w 100 μL 1x PBST uzupełnionego 5% FCS (PBST-FCS) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    4. Inkubować komórki ze 100 μl głównej mieszanki przeciwciał anty-PAX7 i anty-dystrofiny (DMD) (rozcieńczonych w 1x PBST-FCS) w temperaturze 4 °C przez noc, w celu wykrycia odpowiednio komórek satelitarnych i włókien mięśniowych.
    5. Umyj komórki trzykrotnie 100 μl 1x PBST i inkubuj je ze 100 μl kozich przeciwciał anty-mysich Cy3 lub kozich anty-króliczych Alexa 488 (Tabela 3) rozcieńczonych w 1x PBST-FCS w RT przez 1 godzinę.
    6. Oddzielić studzienki komory od szkiełka za pomocą sprzętu dostarczonego przez dostawcę, dodać 20 μl wodnego podłoża montażowego z 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) i przykryć szkiełko nakrywkowym szkiełkiem nakrywkowym (tabela 1).
    7. Obserwuj i uchwyć obraz barwionych komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego.
    8. Przetwarzaj obrazy za pomocą oprogramowania do analizy obrazu (Rysunki 4B, D).

3. Analiza CUT&RUN

  1. Przygotowanie próbki do analizy CUT&RUN na izolowanych komórkach satelitarnych FACS
    Uwaga: CUT&RUN został wykonany zasadniczo zgodnie z opisem10,15. Skład bufora przedstawiono w tabeli 2.
    1. Do testu CUT&RUN należy użyć około 40 000 komórek uzyskanych w kroku 1, krok 1.5.9, na próbkę/przeciwciało, które należy przebadać.
    2. Odwirować izolowane przez FACS komórki satelitarne w temperaturze pokojowej przy 500 x g przez 10 minut, a następnie wyrzucić supernatant za pomocą pipety (objętość końcówki 20-200 μl).
    3. Przemyć komórki 1 ml 1x PBS, odwirować w temperaturze pokojowej przy 500 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant za pomocą pipety (objętość końcówki 0,2-1 ml) i ponownie zawiesić je w 1 ml zimnego buforu do ekstrakcji jądrowej (Tabela 2). Inkubować na lodzie przez 20 minut.
    4. Podczas inkubacji przygotować jedną probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą 850 μl buforu wiążącego na zimno (tabela 2) i dodać 20 μl kulek magnetycznych pokrytych konkanawaliną A na próbkę (tabela 1).
    5. Umyj kulki dwukrotnie 1 ml zimnego buforu wiążącego za pomocą stojaka magnetycznego (Tabela 1). Przy każdej zmianie płukania lub buforu w trakcie zabiegu, należy pozwolić, aby kulki gromadziły się z boku probówki na stojaku magnetycznym przez 5 minut, a następnie usunąć oczyszczony supernatant za pomocą pipety (objętość końcówki 0,2-1 ml). Następnie delikatnie zawiesić w 300 μl buforu wiążącego na zimno.
    6. Odwirować jądra w temperaturze 4 °C przy 600 x g przez 5 minut i delikatnie zawiesić je ponownie w 600 μl buforu do ekstrakcji jądrowej. Delikatnie wymieszać 600 μl wyekstrahowanych jąder z 300 μl zawiesiny kulki konkanawaliny A i inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
    7. Usunąć supernatant za pomocą stojaka magnetycznego, jak opisano w kroku 3.1.4, i delikatnie zawiesić jądra związane z kulkami za pomocą 1 ml zimnego buforu blokującego (Tabela 2). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    8. Usunąć supernatant za pomocą stojaka magnetycznego i dwukrotnie przemyć jądra związane z kulkami 1 ml buforu do przemywania na zimno (Tabela 2). Podczas drugiego płukania równo podziel jądra związane z kulkami na probówki o pojemności 1,5 ml. W następnym kroku każda probówka zostanie potraktowana specyficznym przeciwciałem.
      UWAGA: W tym przykładzie 250 μl jąder związanych z kulkami podzielono na cztery probówki o pojemności 1,5 ml.
    9. Oddzielić supernatant za pomocą stojaka magnetycznego, jak opisano w kroku 3.1.4, i odessać pipetą. Delikatnie zawiesić kompleksy jądro/kulki specyficznym przeciwciałem pierwszorzędowym (Tabela 3) lub IgG innego gatunku (w tym przypadku królika) rozcieńczonymi w 250 μl buforu do płukania na zimno. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc, delikatnie mieszając.
      UWAGA: Zastosowane tutaj przeciwciała są skierowane przeciwko AR, H3K4me2 i H3K27ac.
    10. Usunąć supernatant za pomocą stojaka magnetycznego, jak opisano w kroku 3.1.4, przemyć jądra związane z kulkami dwukrotnie 1 ml buforu do przemywania na zimno i ponownie zawiesić w 100 μl buforu do przemywania na zimno.
    11. Rozcieńczyć białko A-mikrokokowa nukleazą w stężeniu 1,4 ng/μl w 100 μl na próbkę buforu do płukania na zimno.
    12. Dodać 100 μl białkowej nukleazy A-mikrokokowej do 100 μl próbki otrzymanej w 3.1.11 i inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę z mieszaniem.
    13. Usunąć supernatant za pomocą stojaka magnetycznego, jak opisano w kroku 3.1.4, przemyć dwukrotnie 1 ml buforu do przemywania na zimno i ponownie zawiesić jądra związane z kulkami w 150 μl buforu do przemywania na zimno.
    14. Aby zainicjować rozszczepianie DNA, dodać 3 μl ze 100 mM CaCl2 do 150 μl próbki, szybko wymieszać przez strzepywanie i inkubować na lodzie przez 30 minut. Zatrzymać reakcję, dodając 150 μl buforu zatrzymującego i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut w celu wytrawienia RNA i uwolnienia fragmentów DNA.
    15. W celu ekstrakcji DNA próbki należy odwirować w temperaturze 16 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
    16. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrofuge i wyrzucić granulki i kulki.
    17. Dodać 3 μl 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 2,5 μl 20 mg/ml proteinazy K. Wymieszać przez inwersję. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 70 °C (bez wstrząsania).
    18. Dodać 300 μl fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego, odwirować, przenieść do 2 ml probówek z synchronizacją fazową (wstępnie odwirowywanych przez 5 minut przy 16 000 x g) i wirować przez 5 minut przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C.
    19. Dodać 300 μl chloroformu do tej samej probówki i wirować przez 5 minut przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant (~300 μl) za pomocą pipety (objętość końcówki 0,2-1 ml) i przenieść do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
    20. Dodać 1 μl glikogenu (stężenie 20 mg/ml).
    21. Dodać 750 μl 100% etanolu i wytrącać przez noc w temperaturze -20 °C.
    22. Osadzać DNA przez wirowanie przez 15 minut w temperaturze 16 000 x g w temperaturze 4 °C. Przemyć osad 1 ml 100% etanolu, wirować przez 5 minut przy 16 000 x g, wyrzucić supernatant, wirować przez 30 s przy 16 000 x g i usunąć płyn pipetą (objętość końcówki 20-200 μl).
    23. Suszyć granulki na powietrzu przez ~5 min. Zawiesić w 25 μL 1 mM Tris-HCl (pH 8) i 0,1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA; pH 8).
  2. Analiza bioinformatyczna
    1. Przygotuj biblioteki z immunologicznie rozszczepionego DNA i zsekwencjonuj je jako odczyty 100 bp z parowanym końcem za pomocą platformy genomicznej, jak opisano16.
    2. Usuń odczyty nakładające się na region czarnej listy ENCODE (V2) i podziel pozostałe odczyty na dwie grupy: rozmiar fragmentu <120 pz (bez nukleosomu, ogólnie dla czynników transkrypcyjnych) i rozmiar fragmentu >150 pz (z nukleosomami, zwykle dla znaczników histonów). Mapuj do genomu referencyjnego mm10 za pomocą Bowtie 2 (v2.3.4.3)17.
    3. Generuj duże pliki za pomocą bamCoverage (deeptools 3.3.0: bamCoverage --normalizeUsing RPKM --binSize 20).
    4. Zachowaj unikatowo zmapowane odczyty do dalszej analizy.
    5. Generuj surowe pliki wykresu łóżka za pomocą genomeCoverageBed (bedtools v2.26.0).
    6. Użyj algorytmu SEACR 1.3 (opcja rygorystyczna) dla wywołania szczytowego. Załaduj docelowy plik bed graph w formacie UCSC bedgraph, który pomija regiony zawierające sygnał zerowy, i kontroluj plik datagraph (IgG), aby wygenerować empiryczny próg dla wywołania szczytu18.
    7. Wykonaj analizę korelacji Pearsona za pomocą narzędzi głębokich, aby określić podobieństwo między próbkami19. Użyj wiersza poleceń multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz, a następnie plotKorelacja -in wyniki.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle "Korelacja liczby odczytów Pearsona" --whatToPlot mapa cieplna --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab.
    8. Wizualizacja profili intensywności całego genomu za pomocą IGV20 przy użyciu plików bedgraph i pików pliku bed uzyskanych z SEACR.
    9. Użyj HOMER do adnotacji szczytów i wyszukiwania motywów21.
    10. Na koniec porównaj zestawy danych z poprzednio opublikowanymi zestawami danych za pomocą przeglądarki ChIP-Atlas Peak, aby zwizualizować je na IGV i/lub analizie wzbogacenia przy użyciu plików łóżka wygenerowanych przez SEACR jako wejściowego zestawu danych22.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki satelitarne z mięśni szkieletowych myszy zostały wyizolowane przez połączenie protokołów Gunthera i in. (dalej Protokół 1)12 i Liu et al.23 (dalej Protokół 2). Ponieważ niestrawione włókna mięśniowe obserwowano po trawieniu przy użyciu stężenia kolagenazy i dypazy zaproponowanego w Protokole 1, ilość enzymów została zwiększona w celu poprawy dysocjacji włókien mięśniowych, jak opisano w krokach 1.2.1 i 1.2.3. Jak wskazano w Protokole 2, próbki poddano delikatnemu mi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym badaniu przedstawiono znormalizowaną, wiarygodną i łatwą do wykonania metodę izolacji i hodowli mysich komórek satelitarnych, a także ocenę regulacji transkrypcji metodą CUT&RUN.

Protokół ten obejmuje kilka krytycznych kroków. Pierwszym z nich jest rozerwanie mięśni i trawienie błonnika w celu zapewnienia dużej liczby pobranych komórek. Pomimo zwiększonego stężenia enzymu uzyskano więcej żywych komórek niż przy użyciu Protokołu 1. Komórki satelitarne wyrażają specyficzny wzór różn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Anastasii Bannwarth za doskonałą pomoc techniczną. Dziękujemy obiektowi IGBMC w pomieszczeniach dla zwierząt, hodowli komórkowej, Instytutowi Klinicznemu Myszy (ICS, Illkirch, Francja), obrazowaniu, mikroskopii elektronowej, cytometrii przepływowej oraz platformie GenomEast, członkowi konsorcjum "France Génomique" (ANR-10-INBS-0009).

Ta praca Interdyscyplinarnego Instytutu Tematycznego IMCBio, w ramach programu ITI 2021-2028 Uniwersytetu w Strasburgu, CNRS i Inserm, była wspierana przez IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) oraz przez projekt SFRI-STRAT'US (ANR 20-SFRI-0012) i EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) w ramach Francuskiego Programu Inwestycje dla Przyszłości. Dodatkowe finansowanie zostało zapewnione przez INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), program strategiczny AFM-Téléthon 24376 (dla D.D.), INSERM grant dla młodych naukowców (dla D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT oraz francuski fundusz państwowy zarządzany przez ANR w ramach programu ramowego Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). J.R. był wspierany przez Program CDFA-07-22 z Université franco-allemande i Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation, a K.G. przez Association pour la Recherche à l'IGBMC (ARI).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroprobówka 1,5 mlEppendorf2080422
Mikroprobówka 2 mlStar LabS1620-2700
Probówki 5 mlCORNING-FALCON352063
anty-ARabcamab108341
anty-CD11beBioscience25-0112-82
anty-CD31eBioscience12-0311-82
anty-CD34eBioscience48-0341-82
anty-CD45eBioscience12-0451-83
anty-CXCR4eBioscience17-9991-82
anty-DMDabcamab15277
anty-H3K27acAktywny motyw39133
anty-H3K4me2Active Motif39141
anty-ITGA7MBLk0046-4
anty-PAX7DSHBAB_528428
anty-TER119BD Pharmingen TM553673
KoralikiPolysciences86057-3BioMag® Plus Concanavalin A
Sitko do komórek 100 &mikro; mCorning®  
431752 Sitko komórkowe 40 & mikro; mCorning®  431750
Sitko do komórek 70 & mikro; mCorning®  Wirówka 431751
1Eppendorf521-0011Wirówka 5415 R
Wirówka 2Wirówka 5805000010 Eppendorf5804 R
System suwaków komorowych ThermoFischer171080Systè me Nunc™ Lab-Tek&handel; Środek do czyszczenia zjeżdżalni komorowych
Sigma   SLBQ7780VKolagenaza RNaseZAPTM
, typ I Thermo Fisher1710001710 mg/ml
Rozpuszczalność STEMCELL technologies79135 U/mL
DynaMag™-2 AimantInvitrogen12321D
Fixable Viability StainBD Biosciences565388
Cytometr przepływowyBD FACSAria™ Cytometr Fusion Flow23-14816-01
Fluoromount G z DAPIInvitrogen00-4959-52
Przeglądarka genomu IGVhttp://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glicerol Sigma-AldrichG9012
HydrożelCorning®  354277Matrigel matryca z kwalifikacją hESC
Oprogramowanie do przetwarzania obrazuObraz J®V 1.8.0
Film laboratoryjnySigma-AldrichP7793-1EAPARAFILM® M
Liberase LTRoche5401020001
Galusan propyluSigma-Aldrich2370
Sekwencer Illumina Hiseq 4000SY-401-4001
Kąpiel wodna z potrząsaniemBioblock Scientific polytest 2018724
50 ml Falcon 352098

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
  3. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes. Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).
  5. Tosic, M., et al. Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells. Nature Communications. 9 (1), 366(2018).
  6. Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).
  7. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
  8. Robinson, D. C. L., et al. Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation. Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).
  9. Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
  10. Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85(2019).
  11. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, (2019).
  12. Gunther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
  13. Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139(2018).
  14. Rico, L. G., et al. Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques. Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).
  15. Schreiber, V., et al. Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network. Molecular Metabolism. 53, 101313(2021).
  16. Rovito, D., et al. Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).
  17. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  18. Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42(2019).
  19. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).
  20. Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
  21. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  22. Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).
  23. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  24. Brandhorst, H., et al. Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).
  25. Nikolic, D. M., et al. Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets. Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).
  26. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  27. Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression. Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).
  28. Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).
  29. Billas, I., Moras, D. Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription. Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).
  30. Garcia-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
  31. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 6, 35(2016).
  32. Schultz, E. A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle. The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).
  33. Hyder, A. Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets. Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).
  34. Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).
  35. Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa. Frontiers in Immunology. 8, 250(2017).
  36. Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

CUT And RUNizolacja FACSmi nie ko czyn myszyci cie chromatynyanaliza w skali ca ego genomuwi zanie czynnik w transkrypcyjnychmodyfikacje histon wkom rki macierzyste mi nianaliza cistromu

Powiązane artykuły