Artykuł metodologiczny

In vivo (in vivo) Obrazowanie całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej

7.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65218

⸱

28 kwietnia 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Electrical Engineering, KAIST, 2Department of Biology, Chungnam National University, 3KAIST Institute for Health Science and Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania in vivo całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej. Procedura eksperymentalna obejmuje przygotowanie próbki, akwizycję obrazu i wizualizację.

Streszczenie

Jako model kręgowca, larwy danio pręgowanego są szeroko stosowane w neurobiologii i dają unikalną możliwość monitorowania aktywności całego mózgu w rozdzielczości komórkowej. W tym miejscu zapewniamy zoptymalizowany protokół do wykonywania obrazowania całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej, w tym przygotowanie i unieruchomienie próbki, osadzanie próbki, akwizycję obrazu i wizualizację po obrazowaniu. Obecny protokół umożliwia obrazowanie in vivo struktury i aktywności neuronalnej mózgu larwy danio pręgowanego w rozdzielczości komórkowej przez ponad 1 godzinę przy użyciu mikroskopii konfokalnej i specjalnie zaprojektowanej mikroskopii fluorescencyjnej. Omówiono również krytyczne etapy protokołu, w tym montaż i pozycjonowanie próbki, zapobieganie tworzeniu się pęcherzyków i pyłu w żelu agarozowym oraz unikanie ruchu na obrazach spowodowanego niepełnym zestaleniem żelu agarozowego i paraliżem ryby. Protokół został zweryfikowany i potwierdzony w wielu ustawieniach. Protokół ten można łatwo dostosować do obrazowania innych narządów larwy danio pręgowanego.

Wprowadzenie

Danio rerio) danio pręgowany (Danio rerio) został powszechnie przyjęty jako modelowy kręgowiec w neurobiologii, ze względu na jego przezroczystość optyczną w stadium larwalnym, szybki rozwój, niskie koszty utrzymania i dostępność różnorodnych narzędzi genetycznych1,2,3,4. W szczególności przezroczystość optyczna larw w połączeniu z genetycznie kodowanymi fluorescencyjnymi reporterami zdarzeń biologicznych5,6,7,8,9 zapewnia wyjątkową okazję do zobrazowania zarówno aktywności neuronalnej, jak i struktury na poziomie całego mózgu10,11,12,13,14. Jednak nawet w przypadku mikroskopu, który obsługuje rozdzielczość komórkową, uzyskane obrazy niekoniecznie zachowują informacje na poziomie pojedynczej komórki; Jakość obrazu optycznego może ulec pogorszeniu z powodu aberracji wprowadzanej przez żel agarozowy używany do mocowania próbki, ryby mogą być zamontowane pod kątem, przez co obszary zainteresowania nie są w pełni zawarte w polu widzenia mikroskopu, a ryby mogą poruszać się podczas zapisu, powodując artefakty ruchu na obrazach lub utrudniając dokładne wydobycie sygnału z obrazów.

Dlatego potrzebny jest skuteczny i powtarzalny protokół do pozyskiwania wysokiej jakości danych obrazowych przy minimalnym szumie i ruchu. Niestety, publicznie dostępne protokoły obrazowania całego mózgu larw danio pręgowanego in vivo15,16,17,18,19 tylko pobieżnie opisują procedurę, pozostawiając istotną część szczegółów, takich jak krzepnięcie agarozy, precyzyjne techniki montażu i pozycjonowanie próbki za pomocą kleszczy, każdemu eksperymentatorowi. Ponadto niespójności w metodach koncentracji i unieruchamiania agarozy 10,11,14,15,16,17,18,19 mogą prowadzić do problemów wynikających z ruchu ryb podczas procesu obrazowania.

Tutaj znajduje się szczegółowy protokół obrazowania całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej. Rysunek 1 przedstawia graficzny przegląd protokołu: przygotowanie i unieruchomienie próbki, osadzanie próbki, akwizycja obrazu i wizualizacja po obrazowaniu. Strukturalne i funkcjonalne obrazowanie mózgu larwy danio pręgowanego in vivo zademonstrowano przy użyciu komercyjnego mikroskopu konfokalnego i specjalnie zaprojektowanego mikroskopu fluorescencyjnego. Protokół ten może być dostosowany przez praktyków do obrazowania mózgu z określonymi bodźcami sensorycznymi lub kontekstami zachowania, w zależności od potrzeb i projektu eksperymentu.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z danio pręgowanym zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) KAIST (KA2021-125). Łącznie 12 dorosłych ryb danio pręgowanego z panneuronalną ekspresją wskaźnika wapnia GCaMP7a [Tg(huc:GAL4); Tg(UAS:GCaMP7a)] na kacper [mitfa(w2/w2); MPV17(A9/A9)] wykorzystano do hodowli. Grupa ta składała się z ośmiu samic i czterech samców w wieku od 3 do 12 miesięcy. Eksperymenty obrazowe przeprowadzono na larwach danio pręgowanego w 3-4 dni po zapłodnieniu (d.p.f.), w okresie, w którym nie można określić ich płci.

1. Przygotowanie próbki danio pręgowanego

  1. Zbieraj zarodki po hodowli dorosłych ryb pożądanej linii transgenicznej, takich jak Tg(huc:GAL4); Tg(UAS:GCaMP7a)20,21,22, na szalce Petriego wypełnionej wodą z jajek (patrz Tabela Materiałów). Umieścić zarodki w inkubatorze w temperaturze 28 °C i wyhodować je do 3-4 d.p.f. larwy23,24,25.
    1. Jeśli tło danio pręgowanego nie jest albinosem, aby zahamować powstawanie pigmentacji, przenieś zarodki po 24 godzinach od zapłodnienia (h.p.f.) na szalkę Petriego wypełnioną wodą jajeczną zawierającą 200 μM 1-fenylo-2-tiomocznika (PTU; patrz Tabela Materiałów)25,26. Co 24 godziny przenosić rybę do nowego naczynia ze świeżą wodą z jaj zawierającą 200 μM PTU.
      UWAGA: Danio pręgowany jest utrzymywany w standardowych warunkach w temperaturze 28 °C i 14:10 h cyklu światło: ciemność. Wiadomo, że leczenie PTU wpływa na zachowanie i funkcję tarczycy larw danio pręgowanego27,28. Dlatego ważne jest, aby używać PTU z ostrożnością i dokładnie kontrolować potencjalne czynniki zakłócające we wszelkich eksperymentach.
  2. Aby znaleźć próbkę wykazującą ekspresję białek fluorescencyjnych będących przedmiotem zainteresowania (np. panneuronalnego GCaMP7a), należy przebadać próbkę pod mikroskopem epi-fluorescencyjnym i wybrać próbkę o jasnym wyrazie.
  3. Przygotuj wybraną próbkę danio pręgowanego o sile 3-4 d.p.f. na szalce Petriego wypełnionej wodą jajeczną (Rysunek 2A).
    UWAGA: Do rejestrowania spontanicznej aktywności neuronalnej zaleca się używanie próbek w wieku od 80 do 100 h.p.f., ponieważ poziom spontanicznej aktywności jest niski przed 80 h.p.f., a rozwój pigmentacji, nawet przy tle casper, może pogorszyć jakość obrazu po 100 h.p.f.
  4. Przygotuj roztwór bromku pankuronium o stężeniu 0,25 mg/ml14,19,29,30,31, dodając 1 ml roztworu podstawowego o stężeniu 2,5 mg/ml (patrz tabela materiałów) do 10 ml wody jajecznej. Podwielokrotność roztworu bromku pankuronium rozlać na 1,5 ml probówek do mikrowirówek.
  5. Przenieść wstępnie przesianą próbkę na płytkę Petriego za pomocą pipety transferowej.
    UWAGA: Spróbuj przenieść minimalną objętość wody jajecznej z próbką.
  6. Przenieść 0,1 ml roztworu bromku pankuronium na szalkę Petriego w celu paraliżu.
    UWAGA: Bromek pankuronium ma potencjalny wpływ tłumiący na aktywność neuronalną u larw danio pręgowanego32. Konieczne jest dokładne rozważenie stężenia i czasu trwania ekspozycji na bromek pankuronium.

2. 2% (wag./obj.) preparat w żelu agarozowym

  1. Włącz blok grzewczy i ustaw temperaturę docelową na 37 °C. Poczekaj, aż urządzenie się nagrzeje i wyrówna w ustawionej temperaturze.
  2. Rozpuścić 0,2 g proszku agarozy o niskiej temperaturze topnienia (patrz tabela materiałów) w 10 ml wody jajecznej.
  3. Podgrzej roztwór agarozy w kuchence mikrofalowej i mieszaj go, potrząsając i wirując, aż agaroza całkowicie się rozpuści.
  4. Porcję żelu agarozowego rozmieścić w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać probówki do mikrowirówek na bloku grzewczym (Rysunek 2B).
    UWAGA: Sprawdź, czy zniknęły pęcherzyki w żelu agarozowym.

3. Przykładowy montaż i pozycjonowanie

  1. Sprawdzić próbkę pod mikroskopem stereoskopowym, aby upewnić się, że ruch larw został zatrzymany i aby ocenić stan zdrowia próbki wizualnie, sprawdzając bicie jej serca (Rysunek 2C). Jeśli bicie serca jest zbyt wolne, wyrzuć próbkę.
    UWAGA: Jeśli bicie serca obrazowanej ryby jest zbyt wolne (np. poniżej 60 uderzeń na minutę), wykonanie długotrwałego obrazowania może nie być możliwe. Aby ocenić dobrostan ryby, tętno można sprawdzić wizualnie, porównując je z innymi rybami na tej samej szalce Petriego. Pomoże to upewnić się, że obrazowana ryba jest wystarczająco zdrowa i stabilna do przeprowadzenia procedury obrazowania.
  2. Za pomocą pipety transferowej umieść pojedynczą larwę danio pręgowanego w żelu agarozowym w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml (Rysunek 2D).
    UWAGA: Upewnij się, że pipeta została wyrzucona po przeniesieniu próbki.
  3. Wlej żel agarozowy na szalkę Petriego, aby uzyskać 1-2 mm warstwę. Przenieść próbkę w probówkach do mikrowirówek na płytkę Petriego za pomocą pipety transferowej, tak aby larwa została umieszczona w środku szalki.
    UWAGA: Jeśli w żelu agarozowym znajduje się kurz i pęcherzyki, usuń je za pomocą pipety transferowej.
  4. Użyj kleszczyków, aby ustawić próbkę w żądanej orientacji, tak aby głowa i ogon były płaskie (Rysunek 2E).
  5. Obróć próbkę za pomocą kleszczy tak, aby oba oczy były wypoziomowane (Rysunek 2F).
    UWAGA: Procedury wyrównywania (pozycja i obrót) powinny zostać zakończone, zanim żel agarozowy zacznie krzepnąć.
  6. Po wyrównaniu poczekaj, aż żel agarozowy zastygnie (Rysunek 2G,H).
    UWAGA: Czas oczekiwania na zastygnięcie żelu agarozowego może wynosić od 5-10 minut, w zależności od objętości i wielkości żelu.
  7. Po zestaleniu żelu agarozowego napełnij szalkę Petriego wodą jajeczną i umieść szalkę Petriego z osadzoną próbką na stoliku mikroskopowym (Rysunek 2I).

4. Akwizycja obrazu

  1. Włącz system mikroskopu (np. lasery, kontrolery konfokalne, mikroskop i komputer; patrz Tabela materiałów) i sprawdź, czy cały system działa.
  2. Wybierz soczewkę obiektywową o małym powiększeniu i umieść próbkę w środku pola widzenia.
  3. Wybierz soczewkę obiektywową zanurzoną w wodzie lub zanurzającą się w wodzie o odpowiednim powiększeniu (np. soczewka do zanurzania w wodzie 16x 0.8 z aperturą numeryczną (NA); patrz tabela materiałów). Dokonaj precyzyjnych korekt pola widzenia.
  4. Ustaw parametry obrazowania (np. rozmiar obrazu, moc lasera, czas naświetlania, liczbę klatek) za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu.
    UWAGA: Ustaw parametry obrazowania, aby osiągnąć najlepsze możliwe wyniki dla określonych potrzeb (patrz konfiguracja akwizycji obrazu w sekcji dotyczącej reprezentatywnych wyników). Jeśli obraz jest nasycony, zmniejsz moc lasera.
  5. Znajdź mózg próbki, przesuwając stolik i określ jego grubość w trybie podglądu na żywo w oprogramowaniu, ręcznie zmieniając płaszczyzny ogniskowych w górę iw dół. Ustaw dolną i górną granicę głośności.
    UWAGA: Upewnij się, że cały mózg znajduje się w polu widzenia zarówno w kierunku bocznym, jak i osiowym.
  6. Ustaw rozmiar kroku Z, biorąc pod uwagę rozdzielczość osiową mikroskopu.
    UWAGA: Optymalna wielkość kroku Z do obrazowania mózgu larwy danio pręgowanego zależy od metody obrazowania i rozdzielczości mikroskopu. Jako przykład użyto kroku z o rozmiarze 5 μm, biorąc pod uwagę grubość arkusza świetlnego i średnią średnicę ciał komórek10.
  7. Kontynuuj akwizycję obrazu dla ustawionego pola view.
    1. W przypadku wolumetrycznego obrazowania strukturalnego uzyskaj obraz 3D (x,y,z) całego mózgu, zmieniając płaszczyzny ogniskowe i uzyskując sekwencyjne obrazy 2D każdej płaszczyzny z.
    2. Aby obrazować funkcjonalnie pojedynczą płaszczyznę z, uzyskaj obrazy szeregów czasowych (x,y,t) aktywności neuronalnej mózgu na określonej głębokości.
    3. W przypadku wolumetrycznego obrazowania funkcjonalnego uzyskaj obraz 4D (x,y,z,t) aktywności neuronalnej w całym mózgu, uzyskując sekwencyjne obrazy 3D.
      UWAGA: Ustawia liczbę ramek, biorąc pod uwagę dostępny rozmiar pamięci komputera. Zalecany jest czas akwizycji krótszy niż 1 godzina ze względu na czas trwania działania bromku pankuronium.
  8. Po uzyskaniu obrazów zapisz wyniki i zapisz parametry obrazowania (np. rozmiar piksela, rozmiar kroku z, liczba klatek na sekundę, moc lasera) w celu analizy obrazu.
  9. Eksportuj obrazy w odpowiednim formacie do renderowania danych i analizy obrazu.
    UWAGA: Zaleca się eksportowanie obrazów w formacie TIF (tagged image file). TIF obsługuje bezstratną kompresję obrazu i jest kompatybilny z większością programów do przetwarzania obrazu i języków programowania. Ponadto format TIF obsługuje dołączanie metadanych, takich jak parametry akwizycji, rozdzielczość obrazu i inne istotne informacje, które mogą pomóc w interpretacji i odtwarzalności danych.

5. Konfiguracja wizualizacji za pomocą napari

UWAGA: napari to wielowymiarowa przeglądarka obrazów o otwartym kodzie źródłowym w środowisku Pythona z renderingiem opartym na procesorze graficznym (GPU)33. Wtyczka napari-animation zapewnia programowe tworzenie filmów. Korzystanie z Fiji, programu do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym, jest zalecane do ogólnego przetwarzania obrazu, takiego jak filtrowanie i transformacja geometryczna (patrz Tabela materiałów). Kod źródłowy użyty do wizualizacji przy użyciu napari jest dostępny w serwisie GitHub (https://github.com/NICALab/Zebrafish-brain-visualization).

  1. Zainstaluj napari i napari-animation za pomocą lub conda. Po instalacji utwórz nowy plik Jupyter Notebook.
    UWAGA: Uruchamianie za pomocą jupyter notebook, który jest interaktywnym narzędziem dla języka Python, jest zalecane zamiast skryptu języka Python.
  2. Importuj animacje napari i napari.

6. Wizualizacja struktur za pomocą napari

  1. Aby wizualizować obrazy i tworzyć filmy z renderowanym mózgiem danio pręgowanego, załaduj obraz 3D (x,y,z) i otwórz okno napari. Podłącz wtyczkę napari-animation (Rysunek 3A).
  2. Ustaw parametry, takie jak rozmiar woksela, mapa kolorów i limity kontrastu w kontrolkach warstwy.
  3. Dostosuj ustawienia przeglądarki (np. perspektywę, kąty) w obszarze roboczym.
  4. Aby przechwycić renderowany obraz, naciśnij przycisk przechwytywania w kreatorze animacji.
  5. Aby wygenerować filmy z renderowanej objętości, zmodyfikuj ustawienia przeglądarki i dodaj klatki kluczowe (Rysunek 3B).
  6. Po dodaniu klatek kluczowych ustaw liczbę klatek (kroków) między klatkami kluczowymi w kreatorze animacji. Zapisz wyrenderowaną animację.

7. Przetwarzanie obrazów i wizualizacja aktywności neuronalnej za pomocą napari

UWAGA : Aby zobrazować obrazy aktywności neuronalnej w szeregach czasowych jako nałożone obrazy statycznego tła i aktywności, algorytm dekompozycji musi zostać zastosowany do surowych obrazów. Użyj implementacji algorytmu dekompozycji w programie MATLAB o nazwie BEAR24. Wersja MATLAB BEAR jest dostępna na GitHub (https://github.com/NICALab/BEAR).

  1. Aby zdekomponować statyczne tło i aktywność neuronalną, zastosuj BEAR do surowych obrazów szeregów czasowych (x,y,t lub x,y,z,t). Po dekompozycji zapisz obrazy tła i aktywności neuronalnej jako pliki TIF (Rysunek 3C).
  2. Załaduj obrazy tła i aktywności neuronalnej i otwórz okno napari. Podłącz wtyczkę napari-animation.
  3. Użyj szarej mapy kolorów dla obrazów tła i gorącej mapy kolorów dla obrazów aktywności neuronalnej (Rysunek 3C).
  4. Ustaw parametry, takie jak limity krycia i kontrastu, w kontrolkach warstwy.
  5. Aby wygenerować filmy przedstawiające aktywność neuronalną, zmodyfikuj ustawienia przeglądarki i dodaj klatki kluczowe w celu renderowania animacji.
  6. Po dodaniu klatek kluczowych ustaw liczbę klatek (kroków) między klatkami kluczowymi w kreatorze animacji. Zapisz wyrenderowaną animację.

Wyniki

Strukturę i aktywność neuronalną mózgów larw zebrafish wykazujących pan-neuronalny wskaźnik wapnia GCaMP7a (Tg(huc:GAL4);Tg(UAS:GCaMP7a))20,21,22 w linii casper (mitfa(w2/w2);mpv17(a9/a9))34 obrazowano w 3-4 d.p.f. zgodnie z opisanym protokołem.

Do obrazowania strukturalnego w objętości wykorzystano komercyjny system skaningowej mikroskopii konfokalnej wyposażony w obiektyw imersyjny wodny 16x 0.8 NA. Do obrazowania strukturalnego i funkcjonalnego zastosowano laser wzbudzający o długości fali 488 nm. Częstotliwość klatek, rozdzielczość obrazu, rozmiar piksela oraz krok osiowy wynosiły odpowiednio 0.25 Hz, 2048 x 2048, 0.34 µm i 1.225 µm. Akwizycja obrazów trwała około 1 h i 20 min. Objętościowe pole widzenia pozyskanego obrazu obejmowało obszary mózgowia przedniego, średniego i tylnego (Rycina 4A). Na obrazach z mikroskopii konfokalnej wyraźnie widoczne były ciała komórek neuronalnych rdzenia przedłużonego, płytki móżdżku, dachu wzrokowego, habenuli oraz grzbietowego telencefalonu w całym mózgu larw zebrafish w 4 d.p.f. (Rycina 4B). Renderowanie 3D obrazów z mikroskopii konfokalnej wykonano za pomocą oprogramowania napari27, postępując zgodnie z wyżej wymienionym protokołem (Rycina 4C oraz Wideo 1).

W celu obrazowania funkcjonalnego w 2D próbkę obrazowano przy użyciu tego samego systemu mikroskopii konfokalnej, wyposażonego w obiektyw imersyjny wodny 16x 0,8 NA. Częstotliwość odświeżania klatek, rozdzielczość obrazu i rozmiar piksela wynosiły odpowiednio 2 Hz, 512 x 256 oraz 1,5 µm. Ciała komórek neuronalnych były wyraźnie widoczne zarówno w tle, jak i w nałożonej aktywności neuronalnej (Rysunek 5A,B).

Do obrazowania funkcjonalnego w 3D zastosowano specjalnie zaprojektowany system mikroskopii 3D18 zastosowano, co umożliwiło in vivo obrazowanie aktywności neuronalnej całego mózgu larwy danio pręgowanego z polem widzenia wynoszącym 1,040 µm × 400 µm × 235 µm oraz rozdzielczość boczna i osiowa 1.7 µm i 5.4 µmodpowiednio. Szybkość obrazowania wynosiła do 4,2 wolumenu na sekundę. Podobnie jak w przypadku wizualizacji danych obrazowania strukturalnego, do renderowania 3D danych obrazowania wapniowego całego mózgu wykorzystano program napari (Rysunek 5C i Film 2).

Schemat procesu obrazowania danio pręgowanego z przygotowaniem próbki, pozycjonowaniem, akwizycją obrazu i przetwarzaniem.
Rysunek 1: Przegląd procedury eksperymentalnej. Przygotowanie i paraliż próbki danio pręgowanego (krok 1). Przygotowanie 2% (wt/vol) żelu agarozy (krok 2). Montaż i pozycjonowanie próbki (krok 3). Akwizycja obrazu (krok 4). Przetwarzanie obrazu oraz wizualizacja struktury i aktywności neuronalnej (kroki 5-7). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Badanie zarodków rybki zebrafish: ustawienie PCR (B), obserwacje mikroskopowe (C, F), analiza dopasowania (G, H).
Rycina 2: Procedura eksperymentalna przygotowania do obrazowania całego mózgu. (A) Przesiewany obiekt rybki zebrafish wykazujący ekspresję pan-neuronalnego GCaMP7a w szalce Petriego wypełnionej wodą do jaj. (B) Sprzęt i materiały niezbędne do montażu i pozycjonowania obiektu. (1) Blok grzejny o temperaturze 37 °C; (2) żel agarozowy 2% (m/v); (3) probówka do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL; (4) woda do jaj; (5) roztwór bromku pankuroniowego o stężeniu 0,25 mg/mL; (6) szalka Petriego; (7) pęseta; (8) pipeta transferowa. (C) Obraz z mikroskobu stereoskopowego przedstawiający sparaliżowany obiekt. Czarna strzałka wskazuje serce obiektu. (D) Obiekt w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL zostaje przeniesiony za pomocą pipety. Wstawka przedstawia powiększony widok zaznaczonego obszaru. (E) Obiekt (czarna strzałka) zostaje umieszczony w centrum szalki Petriego za pomocą pęsety. (F) Obiekt zostaje ustawiony za pomocą pęsety. (G) Przykład nieprawidłowo ustawionego obiektu w żelu. (H) Przykład prawidłowo ustawionego obiektu w żelu. (I) Obiekt zostaje umieszczony na stoliku mikroskopu pod obiektywem w celu akwizycji obrazu. Pasek skali: 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rendering 3D aktywności neuronalnej; klatki kluczowe; analiza danych mikroskopowych; konfiguracja animacji; wizualizacja naukowa.
Rycina 3: Wizualizacja obrazów mózgu larwy zebrafish. (A) Rendering 3-D obrazu z mikroskopii konfokalnej mózgu larwy zebrafish (4 d.p.f) wykazującego pan-neuronalną ekspresję GCaMP7a. Do renderowania użyto napari, otwartoźródłowej przeglądarki obrazów wielowymiarowych w środowisku Python. Okno napari obejmuje sterowniki warstw (czerwona ramka), listę warstw (żółta ramka), obszar roboczy (niebieska ramka) oraz kreator animacji (zielona ramka). (B) Klatki kluczowe z wieloma ustawieniami przeglądarki dodane w celu wyrenderowania animacji. (C) Obraz z mikroskopii konfokalnej z obrazowania time-lapse w 2-D aktywności neuronalnej w mózgu larwy zebrafish. Obraz został rozdzielony na tło (lewo) i aktywność neuronalną (środek), a następnie nałożony (prawo). Pasek skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia regionów mózgu, przekroje przedniego, środkowego i tylnego mózgu, obrazowanie 3D, analiza neuroanatomiczna.
Rycina 4: Obrazowanie struktury mózgu larwy danio pręgowanego. (A) Projekcja maksymalnej intensywności (MIP) obrazu z mikroskopii konfokalnej mózgu larwy danio pręgowanego (4 d.p.f.) wykazującego ekspresję panneuronalnego GCaMP7a. Góra: MIP boczna. Dół: MIP osiowa. Każda granica obejmuje przedni mózg (czerwony), środkowy mózg (żółty) i tylny mózg (niebieski). (B) Łącznie 10 przekrojów osiowych na różnych głębokościach z obrazu wolumetrycznego mózgu (przy z = 25 µm, 50 µm, 75 µm, 100 µm, 125 µm, 150 µm, 175 µm, 200 µm, 225 µm, 250 µm, licząc od góry do dołu; z = 0 µm oznacza górną powierzchnię mózgu). Każde białe pole reprezentuje region mózgu (rdzeń przedłużony, płytka móżdżkowa, dach wzrokowy, habenula i grzbietowe telencefalon). (C) Cały mózg wyrenderowany przy użyciu programu napari. Pasek skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Aktywność mózgu danio pręgowanego; obrazowanie optyczne; schemat; dynamika sieci neuronalnych; analiza czasowo-przestrzenna.
Rycina 5: Obrazowanie aktywności neuronalnej w mózgu larwy danio pręgowanego. (A) Obraz z mikroskopii konfokalnej przedstawiający aktywność neuronalną w mózgu larwy danio pręgowanego (4 d.p.f.) wykazującego pan-neuronalną ekspresję GCaMP7a. Pasek skali: 100 µm. (B) Powiększony widok obszaru zaznaczonego ramką w A, pokazujący aktywność neuronalną w tekcie optycznym w wielu punktach czasowych. Pasek skali: 20 µm. (C) Rendering 3-D aktywności neuronalnej całego mózgu larwy danio pręgowanego, uzyskany przy użyciu specjalnie zaprojektowanego mikroskopu (lewo: t = 133 s; prawo: t = 901 s). Aktywność neuronalna jest nałożona na statyczne tło. Pasek skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Eksperyment obrazowania czasowego mózgu; wizualizacja aktywności kory w czasie; wyniki akwizycji danych.
Rysunek 6: Obrazowanie time-lapse z dryftem i bez dryftu próbki. (A) Obrazowanie time-lapse mózgu larwy zebrafish wykazującej pan-neuronalną ekspresję GCaMP7a z dryftem próbki. Wodę z jaj (egg water) dodano do próbki przed zestaleniem żelu agarozowego (krok 3.6-3.7). Ryba poruszała się w kierunkach bocznych i osiowych. (B) Obrazowanie time-lapse mózgu larwy zebrafish bez dryftu próbki. Wodę z jaj (egg water) dodano do próbki po zestaleniu żelu agarozowego (krok 3.6-3.7). Pasek skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wideo 1: Rendering 3D struktury całego mózgu larwy zebrafish (4 d.p.f.) wykazującej ekspresję pan-neuronalnego GCaMP7a. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać to wideo.

Wideo 2: Rendering 3D aktywności neuronalnej całego mózgu larwy danio przebrzmiałego (4 d.p.f.) z ekspresją pan-neuronalnego GCaMP7a. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać to wideo.

Dyskusja

Obecny protokół umożliwia obrazowanie in vivo całego mózgu larw danio pręgowanego przez dłuższy czas (np. dłużej niż 1 godzinę) oraz wizualizację uzyskanych danych obrazowania strukturalnego i funkcjonalnego.

Najbardziej krytycznymi etapami są montaż i pozycjonowanie próbki. Podczas zatapiania próbki ważne jest, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków i uniknąć pyłu w żelu agarozowym. Jeśli żel zawiera pęcherzyki powietrza i kurz, jakość obrazu może ulec znacznemu pogorszeniu. Podczas ustawiania próbki za pomocą kleszczy ważne jest, aby upewnić się, że próbka jest wypoziomowana zarówno w poziomie, jak i w pionie. W przeciwnym razie obszary zainteresowania mogą nie znajdować się w polu widzenia mikroskopu. Ponadto takie pozycjonowanie powinno być wykonane w krótkim czasie przed zestaleniem się żelu agarozowego, aby uniknąć uszkodzenia jego powierzchni, ponieważ takie uszkodzenie pogarsza jakość obrazu.

Innym poważnym wyzwaniem jest uniknięcie ruchu na obrazach, które pochodzą z niepełnego zestalenia żelu agarozowego (ryc. 6) i paraliżu danio pręgowanego. Gdy woda z jaj jest dodawana do próbki przed całkowitym zestaleniem żelu agorse, ryby poruszają się powoli zarówno na boki, jak i osiowo, co objawia się dryfowaniem próbki na obrazach szeregów czasowych (ryc. 6A). Jeśli dawka paralityków jest niewystarczająca lub czas trwania efektu dobiega końca, próbka może próbować się poruszać, co na obrazach poklatkowych objawia się szybkim drganiem.

Pomimo znaczenia wyżej wymienionych kroków dla uzyskania wysokiej jakości obrazów bez artefaktów ruchu, publicznie dostępne protokoły 15,16,17,18,19 zawierają tylko krótki przegląd procedury eksperymentalnej, brakuje tych szczegółów. Na przykład uzyskane obrazy bez protokołów unieruchomienia11 cierpią z powodu znacznych artefaktów ruchowych, które sprawiają, że dalsza analiza obrazu jest trudna. Dzięki integracji niezbędnych komponentów, takich jak krzepnięcie żelu agarozowego i paraliż próbki, nasz protokół znacznie poprawia spójność jakości pozyskiwanych obrazów, jednocześnie minimalizując artefakty ruchu.

Podsumowując, opisano zoptymalizowaną i powtarzalną procedurę eksperymentalną obrazowania in vivo mózgu larw danio pręgowanego. Ważność i odtwarzalność tego protokołu do obrazowania in vivo aktywności i struktury mózgu została potwierdzona w wielu warunkach 14,18,29,30,31. Obecny przebieg prac koncentrował się na obrazowaniu całego mózgu larw danio pręgowanego, ale można go łatwo zastosować do obrazowania innych narządów larw danio pręgowanego35,36.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Linie danio pręgowanego używane do obrazowania wapnia zostały dostarczone przez Zebrafish Center for Disease Modeling (ZCDM), Korea. Badania te były wspierane przez National Research Foundation of Korea (2020R1C1C1009869, NRF2021R1A4A102159411, RS-2023-00209473).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka do mikrowirówek 1,5 mlSciLabSL. Tub3513Do podwielokrotności żelu agarozowego i roztworu bromku pankuronium
15 ml probówek FalconFalcon352096Do przygotowania żelu agarozowego i roztworu bromku pankuronium
16 i razy; 0,8 NA soczewka obiektywowa do zanurzania w wodzieNikonCFI75 LWD 16 razy; WSoczewka obiektywowa do obrazowania całego mózgu
1-fenylo 2-tiomocznik (PTU)Sigma-AldrichP7629-10G200 μ M z 1-fenylo 2-tiomocznika (PTU)
50 ml Probówki FalconFalcon352070Do przygotowania wody jajecznej
Jednorazowa pipeta transferowaSciLabSL. Pip3032Do przenoszenia larw danio pręgowanego
Woda jajecznaN/AN/D0,6 g soli morskiej w 10 l wody dejonizowanej
KleszczeKarl Hammacher GmbHHSO 010-10Kleszcze używane do pozycjonowania próbek
Agaroza o niskiej temperaturze topnieniaThermo ScientificR08012% (wt/vol) żel agarozowy
NapariNapari N/ADo wizualizacji obrazów mikroskopowych w 3D
NIS-Elements CNikonN/AOprogramowanie do obrazowania do mikroskopu konfokalnego
Bromek pankuroniumSigma-AldrichP1918-10MG0,25 mg/ml roztworu bromku pankuronium
szalka Petriego, 35 mmSPL Nauki Biologiczne11035Szalka Petriego używana do zatapiania próbki Szalka
Petriego, 55 mmSPL Nauki Biologiczne11050Przygotowanie larw danio pręgowanego po badaniu przesiewowym
System punktowej skaningowej mikroskopii konfokalnej (C2 Plus)NikonN/A Mikroskopkonfokalny do obrazowania całego mózgu
Sól morska Sigma-AldrichS9883-500GSól morska używana do przygotowania wody jajecznej

Bibliografia

  1. Choi, T. -Y., Choi, T. -I., Lee, Y. -R., Choe, S. -K., Kim, C. -H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Experimental & Molecular Medicine. 53 (3), 310-317 (2021).
  2. Ahrens, M. B., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).
  3. Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using selective plane illumination microscopy. Frontiers in Neural Circuits. 7, 65(2013).
  4. Bianco, I. H., Kampff, A. R., Engert, F. Prey capture behavior evoked by simple visual stimuli in larval zebrafish. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 101(2011).
  5. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  6. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  7. Piatkevich, K. D., et al. A robotic multidimensional directed evolution approach applied to fluorescent voltage reporters. Nature Chemical Biology. 14 (4), 352-360 (2018).
  8. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  9. Looger, L., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. Biorxiv. , (2021).
  10. Ahrens, M. B., Orger, M. B., Robson, D. N., Li, J. M., Keller, P. J. Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy. Nature Methods. 10 (5), 413-420 (2013).
  11. Prevedel, R., et al. Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy. Nature Methods. 11 (7), 727-730 (2014).
  12. Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nature Methods. 12 (12), 1171-1178 (2015).
  13. Ahrens, M. B., Engert, F. Large-scale imaging in small brains. Current Opinion in Neurobiology. 32, 78-86 (2015).
  14. Yoon, Y. -G., et al. Sparse decomposition light-field microscopy for high speed imaging of neuronal activity. Optica. 7 (10), 1457-1468 (2020).
  15. Randlett, O., et al. Whole-brain activity mapping onto a zebrafish brain atlas. Nature Methods. 12 (11), 1039-1046 (2015).
  16. Cong, L., et al. Rapid whole brain imaging of neural activity in freely behaving larval zebrafish (Danio rerio). eLife. 6, e28158(2017).
  17. Bruzzone, M., et al. Whole brain functional recordings at cellular resolution in zebrafish larvae with 3D scanning multiphoton microscopy. Scientific Reports. 11 (1), 11048(2021).
  18. Cho, E. -S., Han, S., Lee, K. -H., Kim, C. -H., Yoon, Y. -G. 3DM: deep decomposition and deconvolution microscopy for rapid neural activity imaging. Optics Express. 29 (20), 32700-32711 (2021).
  19. Zhang, Z., et al. Imaging volumetric dynamics at high speed in mouse and zebrafish brain with confocal light field microscopy. NatureBiotechnology. 39 (1), 74-83 (2021).
  20. Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-time visualization of neuronal activity during perception. Current Biology. 23 (4), 307-311 (2013).
  21. Köster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Developmental Biology. 233 (2), 329-346 (2001).
  22. Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons. Developmental Biology. 227 (2), 279-293 (2000).
  23. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196(2012).
  24. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edition. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
  25. Morsch, M., et al. Triggering cell stress and death using conventional UV laser confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (120), e54983(2017).
  26. Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490(2016).
  27. Parker, M. O., Brock, A. J., Millington, M. E., Brennan, C. H. Behavioral phenotyping of casper mutant and 1-pheny-2-thiourea treated adult zebrafish. Zebrafish. 10 (4), 466-471 (2013).
  28. Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
  29. Han, S., Cho, E. -S., Park, I., Shin, K., Yoon, Y. -G. Efficient neural network approximation of robust PCA for automated analysis of calcium imaging data. Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention. , Springer International Publishing. 595-604 (2021).
  30. Shin, C., et al. Three-dimensional fluorescence microscopy through virtual refocusing using a recursive light propagation network. Medical Image Analysis. 82, 102600(2022).
  31. Eom, M., et al. Statistically unbiased prediction enables accurate denoising of voltage imaging data. bioRxiv. , (2022).
  32. Johnston, L., et al. Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (81), e51065(2013).
  33. Sofroniew, N., et al. napari: a multi-dimensional image viewer for Python. Zenodo. , 3555620(2022).
  34. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  35. Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
  36. Voleti, V., et al. Real-time volumetric microscopy of in vivo dynamics and large-scale samples with SCAPE 2.0. Nature Methods. 16 (10), 1054-1062 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia trójwymiarowaobrazowanie in vivoaktywność neuronalnamontaż próbekzatapianie w agaroziemikroskopia konfokalnaobrazowanie wolumetryczne
In vivo (in vivo) Obrazowanie całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.