Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pierwotna hodowla komórek macierzystych miazgi zębowej

4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65223

⸱

5 maja 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biophysics, PGIMER, 2Unit of Oral and Maxillofacial Surgery, Department of Oral Health Sciences, PGIMER

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku, jak założyć pierwotną hodowlę komórek macierzystych miazgi zębowej przy użyciu metody hodowli eksplantatów i charakterystykę tych komórek w oparciu o wytyczne ICSCRT. Komórki wyizolowane za pomocą tego protokołu można uznać za mezenchymalne komórki macierzyste do dalszych zastosowań.

Streszczenie

Ludzka miazga zębowa stanowi obiecujący multipotencjalny rezerwuar komórek macierzystych z wybitnymi kompetencjami regeneracyjnymi, które można pobrać z usuniętego zęba. Ekto-mezenchymalne pochodzenie komórek macierzystych miazgi zębowej (DPSC) wywodzące się z grzebienia nerwowego nadaje wysoki stopień plastyczności, który zawdzięcza wieloaspektowym korzyściom w naprawie i regeneracji tkanek. Istnieje wiele praktycznych sposobów pozyskiwania, utrzymywania i namnażania dorosłych komórek macierzystych, które są badane pod kątem ich zastosowania w medycynie regeneracyjnej. W niniejszej pracy wykazano ustanowienie pierwotnej hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki zęba metodą hodowli eksplantatów. Wyizolowane komórki miały kształt wrzeciona i przylegały do plastikowej powierzchni płytki hodowlanej. Charakterystyka fenotypowa tych komórek macierzystych wykazała pozytywną ekspresję zalecanych przez Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowej (ISCT) markerów powierzchni komórek dla MSC, takich jak CD90, CD73 i CD105. Ponadto, znikoma ekspresja markerów krwiotwórczych (CD45) i śródbłonka (CD34) oraz mniejsza niż 2% ekspresja markerów HLA-DR potwierdziły jednorodność i czystość kultur DPSC. Dalej zilustrowaliśmy ich wielomoc w oparciu o różnicowanie do linii adipogennych, osteogennych i chondrogennych. Skłoniliśmy również te komórki do różnicowania się w komórki podobne do wątroby i neuronów, dodając odpowiednie pożywki stymulacyjne. Ten zoptymalizowany protokół pomoże w hodowli wysoce rozszerzalnej populacji mezenchymalnych komórek macierzystych, które zostaną wykorzystane w laboratorium lub do badań przedklinicznych. Podobne protokoły można włączyć do konfiguracji klinicznych w celu praktykowania leczenia opartego na DPSC.

Wprowadzenie

Dorosłe komórki macierzyste stały się potężnym narzędziem terapeutycznym dla terapii ukierunkowanych na komórki ze względu na ich plastyczność, mechanizmy parakrynne i właściwości immunomodulacyjne1,2,3. Zachęcające dane z badań przedklinicznych opartych na komórkach macierzystych zainspirowały naukowców do pracy nad translacją z laboratorium na łóżko. Rodzaj komórek macierzystych stosowanych w terapii komórkami macierzystymi odgrywa znaczącą rolę w pomyślnych wynikach. W badaniach przedklinicznych i klinicznych najczęściej zgłaszanym źródłem mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) pozostaje szpik kostny4,5. Jednak głównymi wadami stosowania komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego (BMSC) są ich rzadka populacja, wysoce inwazyjne procedury izolacji i ich ograniczona zdolność do ekspansji. W związku z tym poszukuje się alternatywnych źródeł MSC. W związku z tym tkanki zębowe, ze względu na ich łatwość dostępu, ogromną plastyczność, wysoki potencjał regeneracyjny i wysoką zdolność proliferacji, zostały obecnie uznane za bogate i potencjalne alternatywne źródło komórek macierzystych6,7,8,9,10.

Komórki macierzyste miazgi zębowej (DPSC) były pierwszym typem komórek macierzystych zęba, które zostały wyizolowane i scharakteryzowane przez Gronthos w 2000 roku11. DPSC przyciągnęły uwagę w zastosowaniach inżynierii tkankowej ze względu na ich wysoki wskaźnik proliferacji, znaczny potencjał różnicowania, łatwość dostępu przy łatwej hodowli i, co najważniejsze, ich zdolność do uzyskania z odrzuconego zęba bez żadnych obaw etycznych12. Ograniczenia stwarzane przez inne źródła komórek macierzystych, takie jak BMSC i komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ADSC), w ich izolacji i niewystarczających zdolnościach do samoodnawiania są obchodzone przez DPSCs13. Ludzkie DPSC można uzyskać z ludzkich zębów mlecznych, zębów stałych, zębów mądrości, złuszczonych zębów mlecznych (SHED) i brodawek wierzchołkowych. Co więcej, DPSC mogą być również izolowane od zębów nadliczbowych, które są zazwyczaj odrzucane14. DPSC wyrażają markery związane z grzebieniem nerwowym i mają potencjał do różnicowania się w komórki neuronalne zarówno in vitro, jak i in vivo15. Oprócz swojego potencjału neurogennego, DPSC mogą różnicować się w inne linie komórkowe, takie jak osteogenne, chondrogenne, adipogenne, wątrobowe i miogenne, po spełnieniu określonych warunków różnicowania13. Tak więc te multipotencjalne komórki mają ogromny potencjał w terapii komórkowej i mogą być wykorzystywane do regeneracji różnych tkanek. Badania wykazały również potencjalną rolę DPSC w rekonstrukcji rogówki 16, naprawie zawału mięśnia sercowego17 oraz ich potencjalnej roli terapeutycznej w chorobach takich jak niedokrwienie kończyn18, choroba Alzheimera 19, Parkinson's 20 i aging21. Dlatego komórki macierzyste pochodzące z tkanek zębowych mogą być wykorzystywane nie tylko do regeneracji zębów, ale także do naprawy i regeneracji narządów niebędących narządami zębowymi, takich jak oczy16, hearts17, livers22, bones23 itd.

Istnieją dwie szczególne metody izolacji populacji MSC od tkanki miazgi - trawienie enzymatyczne i hodowla eksplantatów24,25. Pomyślne założenie kultur pierwotnych bez znaczącej różnicy w ilości i właściwościach DPSC zostało zgłoszone przez obie te metody26. W tym badaniu skupiliśmy się na izolacji DPSC metodą eksplantatyczną 27, ponieważ ta metoda generuje DPSC bez zanieczyszczenia komórek krwiotwórczych i śródbłonka, w porównaniu z trawieniem enzymatycznym, które może prowadzić do zanieczyszczenia fibroblastami28.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury opisane w badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Instytutu (IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72) w PGIMER, Chandigarh. Wszystkie doświadczenia związane z hodowlami komórkowymi muszą być przeprowadzane w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II (BSC) z zachowaniem techniki aseptycznej. Miazgę zębową uzyskano ze zdrowych zębów trzech (K/14, M/14 i M/20) pacjentów poddawanych ekstrakcji trzecich zębów trzonowych ze względów ortodontycznych. Przed pobraniem próbki uzyskano pisemną świadomą zgodę pacjenta/opiekuna zgodnie z wytycznymi komisji bioetycznej PGIMER w Chandigarh.

1. Założenie podstawowej hodowli komórek macierzystych miazgi zębowej (DPSC) z ludzkiej tkanki zębowej

UWAGA: Nie należy używać żadnych zepsutych zębów.

  1. Pobieranie próbek miazgi zębowej i transport do laboratorium hodowli tkankowej
    1. Wykonaj zabieg ekstrakcji zęba w warunkach nieurazowych i aseptycznych. Dokładnie wypłucz usunięty ząb sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć resztki krwi.
    2. Przeciąć usunięty ząb wzdłużnie na dwie części za pomocą wiertła szczelinowego z węglików spiekanych ze stałym nawadnianiem sterylną solą fizjologiczną, aby odsłonić miazgę.
    3. Usunięty ząb wraz z nienaruszoną miazgą należy przetransportować w sterylnym α-minimum niezbędnym podłożu (α-MEM) utrzymywanym na lodzie do laboratorium hodowli komórkowych i tkankowych.
      UWAGA: Najlepiej przetworzyć wszystkie otrzymane próbki w ciągu 2 godzin w celu hodowli komórkowej. Jednak niedawny raport sugeruje, że przetwarzanie próbki zębów nawet po 24 godzinach nie wpłynęło na żywotność i proliferację DPSC, jednak zmniejszyło ich funkcjonalność29.

2. Usuwanie tkanki miazgi z zęba i hodowli komórkowej DPSC (czas: 60-120 min)

UWAGA: Wszystkie kroki po transporcie zębów zostały wykonane w laboratorium hodowli komórek i tkanek w komorze bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2.

  1. Umieść próbkę zęba na sterylnych szalkach Petriego i dokładnie spłucz (trzy lub cztery razy) 1x sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).
  2. Ostrożnie usuń tkankę miazgi z jamy miazgi za pomocą ostrej koparki i kleszczy.
  3. Po usunięciu miazgi należy ją dokładnie oczyścić sterylnym PBS, aby usunąć wszelkie resztki krwi.
  4. Pokrój tkankę miazgi na małe kawałki o wielkości około 2-3 mm za pomocą ostrza chirurgicznego na szalce Petriego.
    1. Podziel powierzchnię naczynia na cztery części, umieszczając w każdym obszarze 1-2 ml sterylnego PBS. Umieść próbkę tkanki miazgi w jednym miejscu z PBS i pokrój tkankę na najmniejsze możliwe kawałki za pomocą ostrza chirurgicznego (im mniejszy kawałek, tym łatwiej będzie komórkom macierzystym wydostać się z tkanki). Następnie przenieś każdy kawałek, podnosząc go do innego obszaru z PBS i tak dalej, aż do czwartego obszaru, tak aby kawałki tkanki były odpowiednio umyte i wolne od wszelkich zanieczyszczeń.
  5. W międzyczasie wlej około 0,8-1 ml α-MEM zawierającego aminokwasy endogenne z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i koktajlem antybiotykowym (tj. penicyliną i streptomycyną) do dołków 6-dołkowej płytki. Rozprowadzić pożywkę równomiernie, przesuwając płytkę, tak aby równomiernie rozprowadzić ją na powierzchni studzienki.
  6. Wysiew małe kawałki tkanki miazgi lub eksplantatów za pomocą kleszczy do pojedynczego dołka (od czterech do sześciu kawałków na studzienkę) płytki 6-dołkowej i trzymaj płytkę w spokoju przez 5 minut w kapturze bezpieczeństwa biologicznego.
    UWAGA: Ten krok umożliwia/pomaga w przyleganiu tkanek/eksplantatów do poddanych działaniu środka powierzchni płytek hodowlanych.
  7. Utrzymuj płytkę hodowlaną w wilgotnej atmosferze o temperaturze 37 °C i poziomie CO2 na poziomie 5%.
  8. Następnego dnia ostrożnie odessaj pożywkę ze studzienek, nie naruszając eksplantatów i dodaj do niej świeże podłoże. Na tym etapie zmieniaj podłoże co drugi dzień, aby zapobiec wysuszeniu. Upewnij się, że w inkubatorze jest wystarczająca ilość wody na tacy, aby dodatkowe parowanie nie spowodowało wyschnięcia pożywki w dołkach płytkowych.
    UWAGA: Jest to bardzo ważny krok, a zakłócenia mogą spowodować przemieszczenie eksplantatów z ich pozycji. Jeśli kawałki eksplantatu zostaną przemieszczone z ich pozycji podczas przenoszenia pożywki, spróbuj je ponownie przymocować, całkowicie usuwając podłoże i pozwalając im przylegać do powierzchni studzienki. Pożywkę należy ostrożnie dodawać wzdłuż ściany studni, nie naruszając eksplantatów, w przeciwnym razie mogą się one ponownie oderwać. Obserwuj regularnie płytki do hodowli komórkowych pod odwróconym mikroskopem (powiększenie 4x lub 10x). Identyfikuj DPSC na podstawie ich zdolności do przylegania do powierzchni tworzywa sztucznego i morfologii w kształcie wrzeciona.
  9. Gdy wystarczająca liczba komórek migruje z eksplantatów, usuń tkanki i pozwól komórkom namnażać się i osiągnąć optymalną zbieżność komórek 70%-75% przed subkulturacją. Objętość α-MEM zawierającego 10% FBS można na tym etapie zwiększyć do 2 ml, aby komórki mogły dzielić się szybciej. Na tym etapie zmieniaj nośnik co trzeci dzień.

3. Rozszerzenie DPSC

  1. Przemyć zlewającą się kolbę hodowlaną T75 (zbieg: 70%-80%) DPSC dwukrotnie PBS (10 ml).
  2. Dodać 2,5 ml 0,25% kwasu trypsyna-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) z boku kolby T75 i delikatnie ją zakręcić, aby upewnić się, że trypsyna-EDTA pokrywa cały arkusz komórek lub monowarstwę DPSC.
  3. Przechowywać kolbę w pokrywie w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut. Po 3 minutach delikatnie postukać w kolbę, aby zapewnić dysocjację komórek.
  4. Dodaj 5 ml kompletnej pożywki (α-MEM z 10% FBS) lub 250 μl FBS (10% użytej objętości trypsyny) jako środek neutralizujący, aby dezaktywować aktywność trypsyny. Przenieść zawiesinę całych komórek zdysocjowanych DPSC do świeżej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
  5. Odwirować zdysocjowane komórki przy 500 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad komórkowy.
  6. Odessać cały supernatant za pomocą pipety, dodać 5-10 ml PBS do kolby w celu zebrania resztek komórek, przepłukać komórkę w PBS delikatnym pipetowaniem i ponownie odwirować komórki przy 500 x g przez 2 min. W razie potrzeby powtórzyć.
  7. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml kompletnej pożywki (α-MEM z 10% FBS) po ostrożnym usunięciu supernatantu i wykonaniu delikatnego pipetowania w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej.
  8. Podzielić komórki i wysiać je (równą objętość) do dwóch kolb hodowlanych T75, z których każda zawiera 10 ml pełnej, kompletnej pożywki. Przechowywać kolbę wewnątrz okapu w temperaturze 37 °C.
  9. Następnego dnia odessać pożywkę i zastąpić ją świeżą, kompletną pożywką.
    UWAGA: Przedłużone leczenie trypsyną może zagrozić integralności komórek, żywotności i funkcji komórek poprzez rozszczepienie białka powierzchniowego komórki i białka macierzy zewnątrzkomórkowej.

4. Identyfikacja markerów fenotypowych komórek macierzystych (czas: 90 - 120 min)

UWAGA: Do scharakteryzowania komórek pobranych z tkanki miazgi, użyj komórek między trzecim a piątym przejściem.

  1. Użyj dwóch 70%-80% (~3-4 x 106 komórek; policz komórki za pomocą cytometru lub hemocytometru opartego na obrazie) zlewających się kolb hodowlanych T75 DPSC i przemyj komórki dwukrotnie 10 ml PBS.
  2. Dodać 2,5 ml 0,25% trypsyny-EDTA i utrzymywać kolbę w kapturze w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut. Dodać 5 ml kompletnej pożywki lub 250 μl FBS (10% użytej objętości trypsyny) jako środek neutralizujący w celu dezaktywacji aktywności trypsyny.
  3. Zebrać komórki za pomocą pipety w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować zdysocjowane komórki przy 500 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad komórkowy.
  4. Odessać cały sklarowany sklarat za pomocą pipety, dodać 5 ml PBS do kolby w celu zebrania resztek komórek, przepłukać komórkę w PBS delikatnym pipetowaniem i ponownie odwirować komórki przy 500 x g przez 2 minuty.
  5. Zawiesić osad w 1 ml PBS po ostrożnym usunięciu supernatantu i przeprowadzić delikatne pipetowanie w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej.
  6. Policzyć komórki za pomocą cytometru lub hemocytometru opartego na obrazie, w zależności od dostępności, i rozprowadzić je w probówkach do mikrowirówek w proporcjach 1 x 104 komórki/probówkę. Inkubować komórki w 0,5%-1% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) przez 0,5-1 godziny.
  7. Do każdej probówki dodaj 1-2 μl przeciwciał sprzężonych z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) i fikoerytryną (PE) dla markerów klastra różnicowania (CD) (tj. CD90 [0,4 μg], CD73 [0,8 μg], CD105 [0,4 μg], CD34 [0,8 μg], CD45 [0,4 μg] i HLA-DR [0,08 μg])6,7,8,9 i inkubować przez 0,5 godziny w ciemności w temperaturze pokojowej.
  8. Po 0,5 godziny rozdrobnić komórki przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 minut. Odessać supernatant, przepłukać osad komórek PBS i ponownie odwirować.
  9. Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad w PBS (200 μl/probówkę), przenieść zawiesinę komórek do probówek do cytometrii przepływowej i pobrać je za pomocą cytometru przepływowego. Każde komercyjne oprogramowanie może być użyte do dalszej analizy procentowej komórek dodatnich pod kątem różnych przeciwciał.
    UWAGA: Kroki od 4.7 do 4.9 należy wykonywać w ciemności w temperaturze pokojowej. Należy stosować odpowiednie kontrole izotypowe i niebarwione próbki, aby pominąć fluorescencję tła komórek.

5. Zróżnicowanie DPSC na wiele linii

UWAGA: Użyj 75%-80% zlewających się kultur DPSC w trzecim do piątym przejściu do oceny multipotencji. Kontrolna grupa komórkowa zawierająca α-MEM powinna być stosowana dla wszystkich typów różnicowania opisanych poniżej.

  1. Osteogenne różnicowanie DPSC, barwienie czerwienią alizaryny i oznaczanie ilościowe
    1. Wykonać zawiesinę jednokomórkową przy użyciu 0,25% trypsyny-EDTA, jak opisano powyżej w kroku 4.2, i ponownie zawiesić osad komórkowy w pełnej α-MEM.
    2. Policz komórki i wysiewaj je na 24-dołkowych płytkach poddanych działaniu kultur tkankowych o gęstości komórek 2 x 104 komórek/basenik, zawierających 0,4-0,5 ml kompletnej pożywki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    3. Po 48 godzinach wyjmij pożywkę ze studzienek i dodaj 0,4-0,5 ml osteogennych pożywek indukcyjnych (tj. α-MEM z osteogennymi czynnikami indukcyjnymi, takimi jak beta glicerofosforan [5 mM], fosforan monopotasowy [1,8 mM] i fosforan disodowy deksametazonu [0,01 mM])8. Przygotować studzienki kontrolne (komórki nieindukowane) zawierające tylko kompletny α-MEM bez żadnych osteogennych czynników indukcyjnych (pożywki kontrolne).
      UWAGA: Dodatek askorbinianu 50 μM zwiększa również różnicowanie osteogenne 30,31. Co trzeci dzień należy wymieniać pożywkę indukcyjną i pożywkę kontrolną na świeżą pożywkę i kulturę przez 21 dni (3 tygodnie). Pod koniec okresu indukcji wyjmij pożywkę z płytek hodowlanych, dodaj 0,5 ml PBS i umyj dwa razy.
    4. Po umyciu PBS utrwal komórki w 0,5 ml 10% neutralnego roztworu buforowanej formaliny (NBF) przez 20-30 minut w temperaturze pokojowej. Wykonaj utrwalenie w okapie oparowym/chemicznym.
  2. Czerwone zabarwienie alizaryny
    1. Przygotować czerwoną barwienie S alizaryny (2%), rozpuszczając 1 g czerwieni alizarynowej S w 50 ml podwójnie destylowanej wody (ddH2O) i dostosowując pH do 4,0-4,2 za pomocą kwasu solnego (HCL) lub wodorotlenku amonu (NH4OH). Przefiltruj plamę bibułą filtracyjną. Przechowywać plamę w ciemności (4 °C).
    2. Umyj komórki dwukrotnie wodą podwójnie destylowaną (ddH2O), dodaj barwnik czerwienią S alizaryny i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30-45 minut.
    3. Usunąć plamę ze wszystkich studzienek i umyć komórki cztery lub pięć razy ddH2O, aby usunąć wszelkie niezwiązane plamy. Uchwyć obrazy za pomocą mikroskopu jasnego pola.
  3. Ekstrakcja czerwonego barwnika alizaryny do analizy ilościowej
    1. Dodać bufor chlorku cetylopirydyniowego (CPC) (pH 7,0) do barwionych studzienek (0,4 ml/studzienkę) i inkubować komórki przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Dodatkowo komórki można również inkubować z 10% kwasem octowym w celu prawidłowego rozpuszczenia czerwonych kryształów alizaryny32. Trzymaj talerze na kołysce lub shakerze.
    2. Po inkubacji zebrać supernatant (wyekstrahowany barwnik), przenieść go na płytkę 96-dołkową i odczytać płytkę lub próbki przy długości fali 405 nm. Aby uzyskać pustą wartość, dodaj tylko bufor CPC (ten sam wolumin) i przeczytaj32,33 .

6. Adipogeniczne różnicowanie DPSC, barwienie czerwienią olejową O i kwantyfikacja

UWAGA: Początkowe etapy siewu są takie same jak powyżej (tj. krok różnicowania osteogennego 5.1).

  1. Po 48 godzinach wyjąć pożywkę ze studzienek i dodać 0,4-0,5 ml adipogennych pożywek indukcyjnych (tj. α-MEM z adipogennymi czynnikami indukcyjnymi, takimi jak izobutylo-metyloksyna [IBMX; 0,5 mM], deksametazon [1 μM], indometacyna [200 μM] i insulina [10 μM])8. Przygotować studzienki kontrolne zawierające komórki nieindukowane (tj. hodowane w α-MEM tylko bez czynników indukcyjnych {pożywki kontrolne]).
  2. Uzupełniaj pożywkę co trzeci dzień i hoduj komórki przez 3 tygodnie. Po 3 tygodniach odessać pożywkę z płytek hodowlanych i dodać 0,5 ml PBS, aby dwukrotnie przemyć komórki.
  3. Po umyciu PBS utrwal komórki w 10% roztworze NBF na 20-30 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Umyj komórki dwukrotnie wodą podwójnie destylowaną (ddH2O), dodaj czerwoną plamę olejową O i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30-40 minut.
  5. Usunąć plamę ze wszystkich studzienek i kilkakrotnie przepłukać studzienki zawierające komórki ddH2O, aż będą czyste (dwa do czterech razy). Obserwuj pod mikroskopem i rób obrazy.
  6. Ekstrakcja czerwieni olejowej O do analizy ilościowej
    1. Dodaj 0,4 ml 100% 2-propanolu do zabarwionych studzienek i inkubuj w temperaturze pokojowej, odpowiednio przykrywając płytkę przez 30 minut. Trzymaj płytkę na kołysce talerzowej lub shakerze.
    2. Po inkubacji zebrać supernatant, przenieść go na płytkę 96-dołkową, odczytać płytkę lub próbki przy długości fali 510 nm. Do wygaszania używaj 100% 2-propanolu.

7. Chondrogenne różnicowanie DPSC, barwienie błękitem alcyjskim i kwantyfikacja

UWAGA: Różnicowanie chondrogenne zostało wywołane w monowarstwowej hodowli DPSC. Początkowe etapy wysiewu są takie same jak powyżej (tj. etap różnicowania osteogennego 5.1).

  1. Po 48 godzinach wyjąć pożywkę ze studzienek i dodać 0,4-0,5 ml chondrogenicznej pożywki indukcyjnej (tj. α-MEM z czynnikami indukcyjnymi specyficznymi dla różnicowania chondrogennego, kwasem askorbinowym [0,2 M], pirogronianem sodu [1 mM], transformującym czynnikiem wzrostu-beta 3 [TGF-β3; 10 μM], deksametazonem [1 mM] i 1x premiksem ITS [insulina, transferyna i kwas selenowy)10. Przygotować studzienki kontrolne zawierające komórki nieindukowane (tj. hodowane tylko w α-MEM bez czynników indukcyjnych [pożywki kontrolne]).
  2. Uzupełniaj pożywkę co trzeci dzień i hoduj komórki przez 3 tygodnie. Po zakończeniu okresu indukcji odessać pożywkę z płytek hodowlanych i dodać 0,5 ml PBS, aby dwukrotnie przemyć komórki.
  3. Po umyciu PBS utrwal komórki w 10% roztworze NBF na 15-20 minut w temperaturze pokojowej. Umyj komórki dwa lub trzy razy wodą podwójnie destylowaną (ddH2O), dodaj niebieską plamę alcjacką i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 45 minut.
  4. Usuń plamę ze wszystkich studzienek, a następnie spłucz 0,1 N HCL dwa lub trzy razy. Umyć komórki cztery razy lub oddzielić razy za pomocą ddH2O.
  5. Obserwuj komórki pod kątem proteoglikanów (kolor niebieski) pod mikroskopem i uchwyć obrazy.
  6. W celu ilościowego oznaczania błękitu alciańskiego należy wyekstrahować barwnik za pomocą 6 M chlorowodorku guanidyny i odczytać próbki przy gęstości optycznej (OD) 595 nm. Zestaw Alcian blue zastosowany w tym badaniu barwi kwaśne proteoglikany w chrząstce i specjalnie wiąże siarczanowane glikozaminoglikany (GAG) obecne w macierzy chondrocytów10.

8. Zróżnicowanie DPSC w kierunku linii wątrobowej i charakterystyka

  1. Wykonać jednokomórkową zawiesinę komórek przez leczenie trypsyną, jak opisano powyżej, i ponownie zawiesić osad komórkowy w pełnym α-MEM.
  2. Policz komórki i wysiewaj je na 24 dobrze traktowanych płytkach hodowlanych w 2 x 104 komórkach / studzience zawierających 0,4-0,5 ml kompletnej pożywki przez 48 godzin.
  3. Po 48 godzinach wyjąć pożywkę z dołków i inkubować komórki z pożywką do indukcji wątroby przez 14 dni. Pożywka indukcyjna składa się ze zmodyfikowanego podłoża orła o niskiej zawartości glukozy Dulbecco (DMEM) zawierającego deksametazon (0,5 μM), naskórkowy czynnik wzrostu (EGF; 2 ng/ml), premiks ITS+ (50 mg/ml) i czynnik wzrostu hepatocytów (HGF; 20 ng/ml) 6.
  4. Po 14 dniach zastąp pożywkę pożywką dojrzewającą przez kolejne 14 dni (α-MEM uzupełnioną onkostatyną M [OSM; 20 ng/mL], premiksem ITS [50 mg/mL] i deksametazonem [0,5 μM]) 6. Uzupełniaj pożywkę świeżą pożywką co trzeci dzień.
  5. Wykonaj analizę immunohistochemiczną i test lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) w celu potwierdzenia różnicowania podobnego do wątroby.
    1. Wychwyt LDL i barwienie immunofluorescencyjne dla receptora LDL
      UWAGA: Komórki podobne do hepatocytów po różnicowaniu scharakteryzowano za pomocą zestawu do oznaczania wychwytu LDL zgodnie z instrukcjami zestawu. Fluorochrom LDL-550 wykorzystano do oceny wychwytu LDL w zróżnicowanych komórkach w stanie żywym, a przeciwciało receptora LDL wykorzystano do wykrywania receptorów LDL w zróżnicowanych komórkach po utrwaleniu.
      1. Po różnicowaniu żywe komórki barwić LDL-550 (1:100) przez 3-4 godziny. Po 3-4 godzinach zastąp roztwór barwiący pożywką hodowlaną i obserwuj wychwyt LDL pod mikroskopem fluorescencyjnym zdolnym do wzbudzania i emisji jodku propidyny (PI) o długości fali odpowiednio przy 537 i 617 nm.
      2. Utrwalić komórki w roztworze utrwalającym przez 10 minut. Po utrwaleniu komórek zablokuj komórki w roztworze blokującym na 30 minut.
      3. Inkubować komórki z pierwszorzędowym przeciwciałem receptora LDL przez 1 godzinę, przemywać trzykrotnie 1x PBS, a następnie inkubować z 488 przeciwciałami drugorzędowymi (1:100) przez 1 godzinę w ciemności.
      4. Umyj komórki trzykrotnie PBS, aby usunąć nadmiar przeciwciał drugorzędowych. Dodaj 4′,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) jako barwnik jądrowy.
      5. Obserwuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym. Rób zdjęcia za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego zdolnego do pomiaru długości fal w zakresie wzbudzenia/emisji DAPI, PI i FITC.
        UWAGA: Parametry intensywności pojedynczej komórki można rejestrować w celu ilościowego określenia ekspresji przeciwciał receptora LDL i wychwytu LDL. Do barwienia immunofluorescencyjnego należy stosować właściwe kontrole przeciwciał drugorzędowych, aby pominąć fluorescencję tła wynikającą tylko z przeciwciała drugorzędowego.

9. Neuronalne różnicowanie DPSC w kierunku linii neuronalnej i charakterystyka

  1. Po posianiu komórek, jak opisano powyżej, hodować komórki w α-MEM przez 48 godzin.
  2. Odessać pożywkę i zastąpić ją pożywką neurobazalną zawierającą czynniki wzrostu, takie jak 0,5% suplement G5, 0,2% suplement N2, 20 ng / ml naskórkowy czynnik wzrostu, 20 ng / ml podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów i suplement B27 (1%). Hoduj komórki w tym pożywce przez 25-41 dni7.
  3. Zmieniaj pożywkę co drugi lub trzeci dzień, w zależności od jej metabolizmu przez komórki. Aby osiągnąć efektywne dojrzewanie neuronów i więcej neuronów związanych z białkiem-2 (MAP-2+) związanych z mikrotubulami, usuń EGF i czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2) po etapie indukcji neuronów (14 dni).
    UWAGA: Z biegiem czasu i po wielokrotnej zmianie podłoża, zróżnicowane neurony mogą wykazywać oderwanie od studzienek płytki z powodu niskiej adherencji, co powoduje utratę neuronów w długotrwałej hodowli. Aby tego uniknąć, pokryj dołki płytki lamininą lub fibronektyną (opcjonalnie).
  4. Wykonaj analizę immunohistochemiczną w celu potwierdzenia różnicowania podobnego do neuronów.
    1. Barwienie immunologiczne zróżnicowanych DPSC
      UWAGA: Aby potwierdzić neuronalne różnicowanie DPSC, przeprowadzono immunocytochemię w zróżnicowanych komórkach przy użyciu przeciwciał MAP-2 i neurofilamentów (NFM), które są białkami specyficznymi dla linii neurogennej7.
      1. Usunąć pożywkę hodowlaną po zakończeniu różnicowania. Dodaj PBS, delikatnie zakręć płytką i wyjmij PBS za pomocą pipety. Powtórz ten krok.
      2. Utrwal komórki za pomocą 10% NBF lub 4% paraformaldehydu przez 20-30 minut w temperaturze pokojowej.
      3. Usuń utrwalacz i umyj komórki 1x PBS dwa lub trzy razy. Dodać roztwór do permeabilizacji (Triton-X-100; 0,1%) i inkubować komórki przez 5 minut.
      4. Wykonaj płukanie PBS dwa lub trzy razy i zablokuj komórki 0,5%-1% środkiem blokującym (BSA) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C. Usuń środek blokujący i umyj komórki 1x PBS.
      5. Inkubuj komórki przez noc z przeciwciałem pierwszorzędowym (przygotowanym w 0,1% BSA, NFM [1:50] i MAP-2 [1:200]).
      6. Usuń przeciwciało pierwszorzędowe i przemyj komórki 1x PBS trzy lub cztery razy, aby usunąć niezwiązane przeciwciała.
      7. Dodaj przeciwciało drugorzędowe (królicze przeciwciało anty-mysie 1:2,000) i inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 1,5-2 godziny w ciemności. Umyj komórki PBS (dwa lub trzy razy).
      8. Inkubować komórki w DAPI przez 10 minut i ponownie przemyć PBS. Zachować pozostałą objętość, aby uniknąć wysuszenia próbki. Obserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym.
        UWAGA: Dodatkowo, stabilność kariotypu 10 i charakterystyka starzenia mogą być również przeprowadzone, aby uzyskać lepsze wyobrażenie o czystości i funkcjonalności komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym materiale opisujemy, w jaki sposób badacze mogą ustanowić czystą hodowlę DPSCs poprzez metodę eksplantacji6,7,8,9,10 oraz indukować ich różnicowanie w kierunku wielu linii komórkowych, aby potwierdzić czystość hodowli do dalszych zastosowań.

Utworzyliśmy kulturę pierwotną DPSC z niewielkich fragmentów miazgi wy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Komórki macierzyste mają nadzieję na wyleczenie wielu chorób ze względu na ich plastyczność, wytrzymałość, właściwości immunomodulujące, mechanizmy parakrynne i skuteczność naprowadzania. Tkanka miazgi zęba jest uważana za najsilniejsze i najcenniejsze źródło komórek macierzystych, o wyjątkowej plastyczności i zdolności regeneracyjnych. Tutaj demonstrujemy izolację DPSC, wykorzystując szeroko przyjętą metodę hodowli eksplantatów, w której komórki migrują z kawałków tkanki miazgi lub eksplantatów, aby wyrosnąć na jednorod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak finansowego lub niefinansowego konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy za wsparcie finansowe dla AK od Departamentu Badań nad Zdrowiem (DHR), ICMR, Rządu Indii (DHR-NRI Grant # R.12015/01/2022-HR). SR otrzymał finansowanie od ICMR, rządu Indii (Grant # 2020-7593/SCR-BMS), a PS otrzymał stypendium od CSIR, rządu Indii. Jesteśmy również wdzięczni Pani Sandhya Tokhi i Pani Bhupinder Kaur za pomoc w zakresie cytometrii przepływowej oraz Central Sophisticated Instrumentation Core (CSIC) oraz PGIMER, Chandigarh za zapewnienie wsparcia infrastrukturalnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowychCostar3516Do hodowli komórkowych
Zestaw do barwienia chondrocytów Alcian Blue Stain EZstain, HiMediaCCK029
barwnik alizarynowy czerwony SSigma-AldrichTMS-008Barwnik osteogenny
Koktajl antybiotykowyHimediaA002-5X50MLAby zapobiec zanieczyszczeniu kultur
Kwas askorbinowyHimediaTC094-25GSuplement do indukcji chondrogennej
B27Gibco17504044Do indukcji neuronalnej
bFGF (podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów)GibcoPHG0024Do indukcji neuronalnej
CD 105BD-Pharmingen560839
CD 35Biolegend343604
CD 45Biolegend304006
CD 73Biolegend344016
CD 90Biolegend328107Charakterystyka
chlorku cetylopirydyniowego (CPC)Sigma-Aldrich1104006Do ekstrakcji czerwieni alizaryny
21-fosforan disodowy deksametazonSigma-AldrichD1159-100MG
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem DulbeccoHimediaTS1006-5LDo mycia
EGF (Epidermal Growth Factor)GibcoPHG0311Do indukcji wątrobowej i nerwowej 
Mikroskop EVOS LEDInvitrogenFor  obrazowanie fluorescencyjne
EZ barw Zestaw do barwienia chondrocytówHimediaCCK029-1KTZestaw do barwienia chondro
FACS Cytometr przepływowy CantoBD BiosciencesDla komórki charakterystyka
Surowica bydlęcapłodu Gibco16000044Do hodowli pierwotnej
Surowica bydlęcapłodu Sigma-AldrichF2442Do hodowli komórkowych
suplement G5Gibco17503012Do indukcji neuronów
HGF (czynnik wzrostu hepatocytów)Sigma-AldrichH1404Do indukcji wątroby
HLA-DRBiolegend307605
  Ludzki TGF-β 3Peprotech#100-36E-10U
Premiks insuliny-transferyny-kwasu selenowegoSigma-AldrichI3146Do indukcji wątroby
Premiks ITSCorning354350
Zestaw do oznaczania wychwytu LDLAbcamab133127Do charakterystyki wątroby
Niski poziom glukozy DMEMGibco11885-084Do indukcji
wątrobyPrzeciwciało MAP2Sigma-AldrichM4403Do charakterystyki neuronalnej
Suplement N2Gibco17502048Do indukcji neuronów
Neuronowe podłoże podstawoweGibco21103049Do indukcji neuronalnej
Przeciwciało NFMSigma-AldrichN4142Do charakterystyki neuronalnej
Mikroskop Nikon Elipse TS100NikonDla  obrazowanie fluorescencyjne
Olej Red OSigma-Aldrich01391-250MlBarwnik adipogenny
Onkostatyna MR& D Systems295-OM-010/CFDo indukcji wątroby
PetridishTarson460090-90MMDo cięcia tkanek
Fosforan potasu jednozasadowySigma-Aldrich15655-100GIndukcja osteogenna
Propan-2-olThermo FisherQ13827Do ekstrakcji oleju Red O
Roztwór pirogronianu soduSigma life sciencesS8636-100ML
Trypsin-EDTASigma-AldrichT4049Do pasażowania komórek
Bibuła filtracyjna WhatmanBibuła filtracyjnaMerckWHA1001325
alfa - Minimum Essential Media (α-MEM)Sigma-AldrichM0643-10X 1LPożywka do hodowli pierwotnej
i beta;-glicerofosforan sól disodowa hydratSigma-AldrichG9422-50G
i

Bibliografia

  1. Bhattacharyya, S., Kumar, A., Lal Khanduja, K. The voyage of stem cell toward terminal differentiation: a brief overview. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 44 (6), 463-475 (2012).
  2. Prentice, D. A. Adult stem cells. Circulation Research. 124 (6), 837-839 (2019).
  3. Raik, S., Kumar, A., Bhattacharyya, S. Insights into cell-free therapeutic approach: Role of stem cell "soup-ernatant". Biotechnology and Applied Biochemistry. 65 (2), 104-118 (2018).
  4. Rodriguez-Fuentes, D. E., et al. Mesenchymal stem cells current clinical applications: a systematic review. Archives of Medical Research. 52 (1), 93-101 (2021).
  5. Yamazaki, K., Kawabori, M., Seki, T., Houkin, K. Clinical trials of stem cell treatment for spinal cord injury. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3994(2020).
  6. Kumar, A., et al. Molecular spectrum of secretome regulates the relative hepatogenic potential of mesenchymal stem cells from bone marrow and dental tissue. Scientific Reports. 7 (1), 15015(2017).
  7. Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells. Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).
  8. Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome proteins regulate comparative osteogenic and adipogenic potential in bone marrow and dental stem cells. Biochimie. 155, 129-139 (2018).
  9. Kumar, A., Bhattacharyya, S., Rattan, V. Effect of uncontrolled freezing on biological characteristics of human dental pulp stem cells. Cell Tissue Bank. 16 (4), 513-522 (2015).
  10. Raik, S., et al. Assessment of post-thaw quality of dental mesenchymal stromal cells after long-term cryopreservation by uncontrolled freezing. Applied Biochemistry and Biotechnology. 191 (2), 728-743 (2020).
  11. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  12. Tsutsui, T. W. Dental pulp stem cells: advances to applications. Stem Cells and Cloning. 13, 33-42 (2020).
  13. Huang, G. T. -J., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. Journal of Dental Research. 88 (9), 792-806 (2009).
  14. La Noce, M., et al. Dental pulp stem cells: state of the art and suggestions for a true translation of research into therapy. Journal of Dentistry. 42 (7), 761-768 (2014).
  15. Xiao, L., Tsutsui, T. Characterization of human dental pulp cells-derived spheroids in serum-free medium: stem cells in the core. Journal of Cellular Biochemistry. 114 (11), 2624-2636 (2013).
  16. Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y. Regenerative therapy for the cornea. Progress in Retinal and Eye Research. 87, 101011(2022).
  17. Gandia, C., et al. Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction. Stem Cells. 26 (3), 638-645 (2008).
  18. Yong, Z., et al. Comparison of the angiogenic ability between SHED and DPSC in a mice model with critical limb ischemic. Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 19 (4), 861-870 (2022).
  19. Zhang, X. M., et al. Therapeutic potential of dental pulp stem cell transplantation in a rat model of Alzheimer's disease. Neural Regeneration Research. 16 (5), 893-898 (2021).
  20. Kabir, R., et al. Imperative role of dental pulp stem cells in regenerative therapies: a systematic review. Nigerian Journal of Surgery. 20 (1), 1-8 (2014).
  21. Kumar, A., et al. Dental pulp stem cell secretome ameliorates d-galactose induced accelerated aging in rat model. Cell Biochemistry and Function. 40 (5), 535-545 (2022).
  22. Hirata, M., et al. Multifaceted therapeutic benefits of factors derived from dental pulp stem cells for mouse liver fibrosis. Stem Cells Translational Medicine. 5 (10), 1416-1424 (2016).
  23. Fujii, Y., et al. regeneration by human dental pulp stem cells using a helioxanthin derivative and cell-sheet technology. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 24(2018).
  24. Ferrua, C. P., et al. How has dental pulp stem cells isolation been conducted? A scoping review. Brazilian Oral Research. 31, e87(2017).
  25. Pilbauerova, N., Soukup, T., Suchankova Kleplova, T., Suchanek, J. Enzymatic isolation, amplification and characterization of dental pulp stem cells. Folia Biologica. 65 (3), 124-133 (2019).
  26. Tatullo, M., Marrelli, M., Shakesheff, K. M., White, L. J. Dental pulp stem cells: function, isolation and applications in regenerative medicine. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (11), 1205-1216 (2015).
  27. Hilkens, P., et al. Effect of isolation methodology on stem cell properties and multilineage differentiation potential of human dental pulp stem cells. Cell and Tissue Research. 353 (1), 65-78 (2013).
  28. Hendijani, F. Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues. Cell Proliferation. 50 (2), e12334(2017).
  29. Aryal Ac, S., Islam, M. S., Samsudin, A. R. Investigation of the effect of a time delay on the characteristics and survival of dental pulp stem cells from extracted teeth. Archives of Oral Biology. 119, 104896(2020).
  30. Langenbach, F., Handschel, J. Effects of dexamethasone, ascorbic acid and β-glycerophosphate on the osteogenic differentiation of stem cells in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4, 117(2013).
  31. Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 64 (2), 295-312 (1997).
  32. Bernar, A., Gebetsberger, J. V., Bauer, M., Streif, W., Schirmer, M. Optimization of the alizarin red S assay by enhancing mineralization of osteoblasts. International Journal of Molecular Sciences. 24 (1), 723(2022).
  33. Coe, C. L., Lubach, G. R., Schneider, M. L., Dierschke, D. J., Ershler, W. B. Early rearing conditions alter immune responses in the developing infant primate. Pediatrics. 90, 505-509 (1992).
  34. Bakopoulou, A., et al. Assessment of the impact of two different isolation methods on the osteo/odontogenic differentiation potential of human dental stem cells derived from deciduous teeth. Calcified Tissue International. 88 (2), 130-141 (2011).
  35. Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells. 26 (7), 1787-1795 (2008).
  36. Kim, B. C., et al. Osteoblastic/cementoblastic and neural differentiation of dental stem cells and their applications to tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 235-244 (2012).
  37. Ge, J., et al. Distal C terminus of CaV1.2 channels plays a crucial role in the neural differentiation of dental pulp stem cells. PLoS One. 8 (11), e81332(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Pierwotna kultura komórekmetoda hodowli eksplantówmezenchymalne komórki macierzysteróżnicowanie komórek macierzystychregeneracja tkanekmarkery powierzchni komórkowychtechniki hodowli 3Dsekwencjonowanie następnej generacjirekonstrukcja kraniofacjalna
Pierwotna hodowla komórek macierzystych miazgi zębowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.