Artykuł metodologiczny

Procedura kriosekcji kriosekcji zwoju korzenia grzbietowego myszy

8.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65232

⸱

9 czerwca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pain Management, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, 2Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California San Francisco, 3Department of Anesthesiology, Sun Yat-Sen University, 4University of Washington

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany jest tutaj rozwój konsekwentnego pozyskiwania wysokiej jakości sekcji kriostatu zwoju korzenia grzbietowego.

Streszczenie

Wysokiej jakości sekcje kriostatu kriostatu zwoju korzenia grzbietowego myszy (DRG) są kluczowe dla prawidłowego barwienia immunochemicznego i badań RNAscope w badaniach nad bólem zapalnym i neuropatycznym, swędzeniem, a także innymi obwodowymi schorzeniami neurologicznymi. Jednak konsekwentne uzyskiwanie wysokiej jakości, nienaruszonych i płaskich skrawków kriostatu na szkiełkach podstawowych pozostaje wyzwaniem ze względu na niewielki rozmiar próbki tkanki DRG. Do tej pory nie ma artykułu opisującego optymalny protokół kriosekcji DRG. Protokół ten przedstawia metodę krok po kroku mającą na celu rozwiązanie często napotykanych trudności związanych z kriosekcją DRG. W prezentowanym artykule wyjaśniono, w jaki sposób usunąć otaczającą ciecz z próbek tkanek DRG, umieścić skrawki DRG na szkiełku skierowanym w tę samą orientację i spłaszczyć skrawki na szkiełku bez zakrzywiania się do góry. Chociaż protokół ten został opracowany do kriosekcji próbek DRG, może być stosowany do kriosekcji wielu innych tkanek o małej wielkości próbki.

Wprowadzenie

Zwój korzenia grzbietowego (DRG) zawiera główne neurony czuciowe, makrofagi tkankowe i komórki satelitarne, które otaczają główne neurony czuciowe1,2,3,4. Jest to kluczowa struktura anatomiczna w przetwarzaniu nieszkodliwych i szkodliwych sygnałów i odgrywa kluczową rolę w bólu, swędzeniu i różnych zaburzeniach nerwów obwodowych5,6,7,8,9,10,11,12,13. Chociaż opracowano kilka metod preparowania tkanki DRG z rdzenia kręgowego myszy14,15,16, kriosekcja tkanki DRG pozostaje wyzwaniem, ponieważ tkanka DRG jest dość mała, a skrawki kriostatu próbek DRG mają tendencję do zakrzywiania się w rolki, co utrudnia prawidłowe przeniesienie sekcji kriostatu na szkiełka podstawowe. Jednak prawidłowa kriosekcja tkanki DRG ma kluczowe znaczenie dla badań immunohistochemicznych i struktury neuronów czuciowych DRG17,18,19,20,21,22,23. Ponadto, ponieważ wyniki sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki ujawniły niezwykłą heterogeniczność neuronów czuciowych DRG zarówno u ludzi24, jak i myszy25, prawidłowa kriosekcja tkanki DRG ma kluczowe znaczenie dla zbadania funkcjonalnej roli różnych komórek DRG w różnych stanach fizjologicznych i patologicznych.

Chociaż technika oczyszczania tkanek została zastosowana do zbadania rekonstrukcji 3D DRG26 jako alternatywna technika kriosekcji DRG, technika oczyszczania tkanek jest czaso- i pracochłonna. Dla porównania, kriosekcja DRG jest szybka i stosunkowo łatwa do przeprowadzenia, a zatem pozostaje kluczową techniką w badaniach immunohistochemicznych i strukturalnych DRG i innych obszarów ośrodkowego układu nerwowego. Jednak uzyskanie wysokiej jakości, nienaruszonych i płaskich skrawków kriostatu na szkiełkach podstawowych pozostaje wyzwaniem w badaniach neurobiologicznych ze względu na niewielki rozmiar próbki tkanek, takich jak DRG i niektóre regiony mózgu, i nie ma w tym momencie artykułu opisującego optymalny protokół kriosekcji małych próbek tkanek, takich jak DRG myszy.

Ten protokół zapewnia łatwą, krok po kroku technikę kriostatu do cięcia DRG myszy, aby niezawodnie uzyskać jak najwięcej wysokiej jakości przekrojów DRG na szkiełkach do kolejnych badań DRG. Chociaż technika ta została specjalnie zaprojektowana do kriosekcji próbek DRG, może być potencjalnie stosowana do kriosekcji różnych innych tkanek o małym rozmiarze próbki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Dla niniejszego badania, eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez UCSF Institutional Animal Care and Use Committee i zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Wykorzystano tu dorosłe, 8-12-tygodniowe samce i samice myszy C57BL/6 (wyhodowane w domu).

1. Przygotowanie próbki DRG

  1. Znieczulić myszy 2,5% Avertin (patrz Tabela Materiałów). Zapewnij odpowiednie znieczulenie przy braku reakcji na bolesną stymulację. Perfuzję zwierząt przezskórnie z 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), a następnie 4% formaldehydem, jak opisano wcześniej14,15,16.
  2. Wypreparuj tkankę DRG z rdzenia kręgowego, zgodnie z wcześniejszym opisem14,15,16.
  3. Po utrwaleniu wypreparowanych DRG w 4% formaldehydzie przez 3 godziny w temperaturze pokojowej.
  4. Umieścić DRG w 30% sacharozie w PBS w temperaturze 4 °C na noc.
  5. Przygotowanie podstawy optymalna temperatura cięcia (OCT)
    1. Dodaj związek OCT (patrz Tabela materiałów), aby pokryć górną powierzchnię bloku aluminiowego i zamrażać w temperaturze -20 °C przez 5-10 minut (Rysunek 1A).
    2. Odetnij górną część OCT za pomocą kriostatu (patrz Tabela materiałów) o grubości 30 μm, aż jego powierzchnia będzie płaska jak baza OCT (Rysunek 1B).
    3. Zrób znak na dole (pozycja godziny szóstej) podstawy OCT, aby zaznaczyć jego orientację, zanim zdejmiesz aluminiowy blok z kriostatu (Rysunek 1C).
    4. W kolejnych krokach utrzymuj znak na godzinie szóstej, aby zachować tę samą orientację, co może prowadzić do uzyskania większej liczby sekcji próbki DRG.
      UWAGA: Jeśli orientacja zostanie utracona, a próbka DRG zostanie przycięta pod innym kątem, próbki DRG nie można całkowicie przeciąć od góry do dołu, co pozostawi niektóre próbki pozostawione na bazowym OCT i zmarnowane, ponieważ podczas próby przecięcia próbki DRG napotka się podstawowy OCT (Rysunek 1C).
  6. Wykonywanie osadzania OCT DRG
    1. Wysuszyć tkankę DRG przed umieszczeniem jej na OCT.
      1. Przed dodaniem DRG do bloku należy upewnić się, że usunięto 30% roztwór sacharozy/PBS wokół próbki.
      2. Wysuszyć próbkę DRG, umieszczając ją na suchej szalce Petriego (Rysunek 2A) i przenosząc ją z jednego miejsca na drugie dwa lub trzy razy za pomocą suchej pęsety (Rysunek 2B).
      3. Osusz pęsetę niestrzępiącą się chusteczką przed przeniesieniem kolejnej próbki DRG (Rysunek 2C).
    2. Umieść suchy DRG na podstawie OCT.
      1. Za pomocą suchej pęsety umieść suchy DRG na podstawie OCT w pozycji godziny 12 (Rysunek 1D).
      2. Zachować co najmniej 5 mm między górną krawędzią DRG a górną krawędzią podstawowego KTZ.
      3. Umieść grzbietową część DRG w pozycji godziny 12, a część brzuszną w pozycji godziny szóstej (Rysunek 1D).
    3. Osadź tkankę DRG za pomocą OCT.
      1. Dodaj więcej OCT, aby pokryć całą próbkę DRG w okrągłym lub owalnym kształcie, z DRG w środku (Rysunek 1E).
      2. Upewnij się, że górna krawędź OCT zakrywa DRG na górnej krawędzi podstawowego OCT ( Rysunek 1F), ponieważ ułatwia to przeniesienie sekcji na szkiełko ( Rysunek 3A).
        UWAGA: Jeśli pokrywa OCT znajduje się w środku podstawowego OCT , górna krawędź podstawy OCT zablokuje szklany szkiełko, aby zebrać sekcję (Rysunek 3B).
      3. Zamrozić próbkę OCT i DRG w temperaturze -20 °C przez kolejne 5 minut (Rysunek 1G). Nie przycinaj OCT wokół DRG sample.
      4. Odetnij górną część pokrywy OCT o grubości 30 μm, aż DRG będzie widoczny.

2. Kriosekcja DRG

  1. Zmień grubość przekroju kriostatu na 12 μm, aby przyciąć sekcje DRG na szkiełku (Rysunek 1H).
  2. Przytrzymaj sekcję OCT na dole małym pędzlem schłodzonym do -20 °C.
    UWAGA: Ważne jest, aby nie ciąć całego odcinka całkowicie, ale pozostawić 1-3 mm nieprzycięte (Rysunek 1I).
  3. Za pomocą końcówki pęsety o temperaturze pokojowej delikatnie dotknij spodu (pozycja godziny szóstej) sekcji, tak aby przykleiła się do powierzchni platformy (Rysunek 1J). Zapobiega to zakrzywianiu się sekcji do tyłu w rolce, co utrudnia zebranie sekcji na szkiełku.
    UWAGA: Gdy dolna część sekcji przylega do powierzchni platformy, a górna część sekcji nadal łączy się z pokrywą OCT, sekcja ma płaski kształt (Rysunek 1K), co znacznie ułatwia zebranie sekcji na zjeżdżalni.
  4. Weź naładowane szkiełko (patrz Tabela materiałów) i powoli umieść szkiełko na sekcji. Jak tylko sekcja zacznie przylegać do suwaka, delikatnie pociągnij suwak do tyłu (Rysunek 1L).
  5. Postępuj zgodnie z tym samym procesem, aby umieścić więcej sekcji DRG na slajdzie bez nakładania się sekcji (Rysunek 1M). Upewnij się, że nowy odcinek DRG nie jest umieszczony nad OCT innego odcinka DRG (Rysunek 4), ponieważ taki odcinek nie może dobrze pozostać na szkiełku i może zostać zmyty podczas procesu barwienia immunochemicznego.

3. Barwienie Nissl sekcji DRG na szkiełku

  1. Myć sekcje przez 10 minut w PBS plus 0,1% Triton X-10. Następnie umyj skrawki dwukrotnie PBS.
  2. Na szkiełko nanieść barwnik 1:300 Nissl (patrz tabela materiałów) i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Umyj sekcję PBS plus 0,1% Triton X-100. Następnie należy dwukrotnie umyć skrawki PBS przez 5 min, a następnie przez 2 h w temperaturze pokojowej.
  4. Nałożyć 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) fluoromount-G (patrz tabela materiałów) w celu przykrycia odcinków szkiełkiem nakrywkowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym badaniu pobrano około 16 ciągłych, wysokiej jakości przekrojów DRG z jednego zwoju rdzeniowego grzbietowego (DRG) myszy z poziomu L4. Uzyskane przekroje nie wykazywały żadnych zniekształceń. Rysunek 1 przedstawia procedurę kriosekcjonowania krok po kroku. Usuwanie nadmiaru cieczy z przekrojów tkankowych pokazano na Rysunku 2. Proces zatapiania tkanek w OCT wyróżniono na Rysunku 3. Rysunek 4...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten zapewnia łatwą procedurę krok po kroku do cięcia kriostatu myszy DRG w celu niezawodnego uzyskania wysokiej jakości przekrojów DRG na szkiełkach. W tym protokole istnieją cztery kluczowe kroki. Po pierwsze, próbka DRG i pęseta muszą być suche przed umieszczeniem próbki DRG na podstawie OCT. Każda ciecz otaczająca próbkę DRG utworzy wokół niej lodową skorupę, co spowoduje oddzielenie się odcinków DRG od OCT i zakrzywienie do góry. Po drugie, jeśli blok aluminiowy nie ma znaku lub jeśli OCT podstawy zakrywa zn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AvertinSigma-AldrichT48402-25GZnieczulenie zwierząt
Epredia  Kriokassety kriostotowe Cryocasettes, średnica 25 mm ZakreskowanyFisherbrand1910Przytrzymaj sekcję OCT na dole 
Pęseta ErgoFisherbrandS95310Za pomocą końcówki pęsety delikatnie dotknij dna (6 o' zegar) sekcji tak, aby przylegała do powierzchni platformy, aby zapobiec zakrzywianiu się sekcji do tyłu w rolce 
Marka rybacka  Szkiełka mikroskopowe Superfrost PlusFisherbrand1255015Aby zebrać sekcję DRG 
Pisaki do znakowaniaFisherbrand133794  Zaznacz orientację bazy OCT
Scigen  Tissue-Plus O.C.T. CompoundFisherbrand  23730571Podłoże do zatapiania zamrożonych próbek tkanek w celu zapewnienia optymalnej temperatury cięcia (O.C.T.).

Bibliografia

  1. Guan, Z., et al. Injured sensory neuron-derived CSF1 induces microglial proliferation and DAP12-dependent pain. Nature Neuroscience. 19 (1), 94-101 (2016).
  2. Yu, X., et al. Dorsal root ganglion macrophages contribute to both the initiation and persistence of neuropathic pain. Nature Communications. 11 (1), 264(2020).
  3. Costa, F. A. L., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Brazilian Journal of Anesthesiology. 65 (1), 73-81 (2015).
  4. Noguri, T., Hatakeyama, D., Kitahashi, T., Oka, K., Ito, E. Profile of dorsal root ganglion neurons: study of oxytocin expression. Molecular Brain. 15 (1), 44(2022).
  5. Su, P. P., Zhang, L., He, L., Zhao, N., Guan, Z. The role of neuro-immune interactions in chronic pain: implications for clinical practice. Journal of Pain Research. 15, 2223-2248 (2022).
  6. Esposito, M. F., Malayil, R., Hanes, M., Deer, T. Unique characteristics of the dorsal root ganglion as a target for neuromodulation. Pain Medicine. 20, S23-S30 (2019).
  7. Chen, X. J., Sun, Y. G. Central circuit mechanisms of itch. Nature Communications. 11 (1), 3052(2020).
  8. Guan, Z., Hellman, J., Schumacher, M. Contemporary views on inflammatory pain mechanisms: TRPing over innate and microglial pathways. F1000Research. , (2016).
  9. Boadas-Vaello, P., et al. Neuroplasticity of ascending and descending pathways after somatosensory system injury: reviewing knowledge to identify neuropathic pain therapeutic targets. Spinal Cord. 54 (5), 330-340 (2016).
  10. Guha, D., Shamji, M. F. The dorsal root ganglion in the pathogenesis of chronic neuropathic pain. Neurosurgery. 63, 118-126 (2016).
  11. Shorrock, H. K., et al. UBA1/GARS-dependent pathways drive sensory-motor connectivity defects in spinal muscular atrophy. Brain. 141 (10), 2878-2894 (2018).
  12. Sleigh, J. N., et al. Trk receptor signaling and sensory neuron fate are perturbed in human neuropathy caused by Gars mutations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (16), E3324-E3333 (2017).
  13. Rubio, M. A., Herrando-Grabulosa, M., Gaja-Capdevila, N., Vilches, J. J., Navarro, X. Characterization of somatosensory neuron involvement in the SOD1(G93A) mouse model. Scientific Reports. 12 (1), 7600(2022).
  14. Sleigh, J. N., West, S. J., Schiavo, G. A video protocol for rapid dissection of mouse dorsal root ganglia from defined spinal levels. BMC Research Notes. 13 (1), 302(2020).
  15. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82(2016).
  16. Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333(2021).
  17. Haberberger, R. V., Barry, C., Matusica, D. Immortalized dorsal root ganglion neuron cell lines. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 184(2020).
  18. Pokhilko, A., Nash, A., Cader, M. Z. Common transcriptional signatures of neuropathic pain. Pain. 161 (7), 1542-1554 (2020).
  19. Martin, S. L., Reid, A. J., Verkhratsky, A., Magnaghi, V., Faroni, A. Gene expression changes in dorsal root ganglia following peripheral nerve injury: roles in inflammation, cell death and nociception. Neural Regeneration Research. 14 (6), 939-947 (2019).
  20. Miller, R. J., Jung, H., Bhangoo, S. K., White, F. A. Cytokine and chemokine regulation of sensory neuron function. Handbook of Experimental Pharmacology. (194), 417-449 (2009).
  21. Neto, E., et al. Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3D organotypic cultures of adult dorsal root ganglia. PLoS One. 12 (7), e0181612(2017).
  22. Nascimento, A. I., Mar, F. M., Sousa, M. M. The intriguing nature of dorsal root ganglion neurons: Linking structure with polarity and function. Progress in Neurobiolology. 168, 86-103 (2018).
  23. Middleton, S. J., Perez-Sanchez, J., Dawes, J. M. The structure of sensory afferent compartments in health and disease. Journal of Anatomy. 241 (5), 1186-1210 (2022).
  24. Nguyen, M. Q., von Buchholtz, L. J., Reker, A. N., Ryba, N. J., Davidson, S. Single-nucleus transcriptomic analysis of human dorsal root ganglion neurons. eLife. 10, e71752(2021).
  25. Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
  26. Hunt, M. A., et al. DRGquant: A new modular AI-based pipeline for 3D analysis of the DRG. Journal of Neuroscience Methods. 371, 109497(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kriosekcjonowanie zwoj w korzeni grzbietowych DRGprzekroje DRG myszysekcjonowanie w krioztaciezatapianie w OCTprzygotowanie szkie ek przedmiotowychbarwienie immunohistochemicznebadania RNAscopemikroskopia konfokalnaobwodowe schorzenia neurologiczne

Powiązane artykuły