Procedura kriosekcji kriosekcji zwoju korzenia grzbietowego myszy

Podsumowanie

Prezentowany jest tutaj rozwój konsekwentnego pozyskiwania wysokiej jakości sekcji kriostatu zwoju korzenia grzbietowego.

Streszczenie

Wysokiej jakości sekcje kriostatu kriostatu zwoju korzenia grzbietowego myszy (DRG) są kluczowe dla prawidłowego barwienia immunochemicznego i badań RNAscope w badaniach nad bólem zapalnym i neuropatycznym, swędzeniem, a także innymi obwodowymi schorzeniami neurologicznymi. Jednak konsekwentne uzyskiwanie wysokiej jakości, nienaruszonych i płaskich skrawków kriostatu na szkiełkach podstawowych pozostaje wyzwaniem ze względu na niewielki rozmiar próbki tkanki DRG. Do tej pory nie ma artykułu opisującego optymalny protokół kriosekcji DRG. Protokół ten przedstawia metodę krok po kroku mającą na celu rozwiązanie często napotykanych trudności związanych z kriosekcją DRG. W prezentowanym artykule wyjaśniono, w jaki sposób usunąć otaczającą ciecz z próbek tkanek DRG, umieścić skrawki DRG na szkiełku skierowanym w tę samą orientację i spłaszczyć skrawki na szkiełku bez zakrzywiania się do góry. Chociaż protokół ten został opracowany do kriosekcji próbek DRG, może być stosowany do kriosekcji wielu innych tkanek o małej wielkości próbki.

Wprowadzenie

Zwój korzenia grzbietowego (DRG) zawiera główne neurony czuciowe, makrofagi tkankowe i komórki satelitarne, które otaczają główne neurony czuciowe^1,2,3,4. Jest to kluczowa struktura anatomiczna w przetwarzaniu nieszkodliwych i szkodliwych sygnałów i odgrywa kluczową rolę w bólu, swędzeniu i różnych zaburzeniach nerwów obwodowych^{5,6,7,8,9,10,....}

Protokół

Dla niniejszego badania, eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez UCSF Institutional Animal Care and Use Committee i zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Wykorzystano tu dorosłe, 8-12-tygodniowe samce i samice myszy C57BL/6 (wyhodowane w domu).

1. Przygotowanie próbki DRG

1. Znieczulić myszy 2,5% Avertin (patrz Tabela Materiałów). Zapewnij odpowiednie znieczulenie przy braku reakcji na bolesną stymulację. Perfuzję zwierząt przezskórnie z 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), a następnie 4% formaldehyd....

Wyniki

W niniejszym badaniu pobrano około 16 ciągłych, wysokiej jakości przekrojów z jednego zwoju korzeni grzbietowych (DRG) kręgu L4 myszy. Uzyskane przekroje nie wykazywały żadnych zniekształceń. Rysunek 1 przedstawia procedurę kriosekcjonowania krok po kroku. Usuwanie nadmiaru cieczy z przekrojów tkankowych pokazano na Rysunku 2. Proces zatapiania tkanek w OCT przedstawiono na Rysunku 3. Rysunek 4 ukazuje .......

Dyskusja

Protokół ten zapewnia łatwą procedurę krok po kroku do cięcia kriostatu myszy DRG w celu niezawodnego uzyskania wysokiej jakości przekrojów DRG na szkiełkach. W tym protokole istnieją cztery kluczowe kroki. Po pierwsze, próbka DRG i pęseta muszą być suche przed umieszczeniem próbki DRG na podstawie OCT. Każda ciecz otaczająca próbkę DRG utworzy wokół niej lodową skorupę, co spowoduje oddzielenie się odcinków DRG od OCT i zakrzywienie do góry. Po drugie, jeśli blok aluminiowy nie ma znaku lub jeśli OCT podstawy zakrywa zn.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Avertin	Sigma-Aldrich	T48402-25G	Znieczulenie zwierząt
Epredia  Kriokassety kriostotowe Cryocasettes, średnica 25 mm Zakreskowany	Fisherbrand	1910	Przytrzymaj sekcję OCT na dole
Pęseta Ergo	Fisherbrand	S95310	Za pomocą końcówki pęsety delikatnie dotknij dna (6 o' zegar) sekcji tak, aby przylegała do powierzchni platformy, aby zapobiec zakrzywianiu się sekcji do tyłu w rolce
Marka rybacka  Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus	Fisherbrand	1255015	Aby zebrać sekcję DRG
Pisaki do znakowania	Fisherbrand	133794	Zaznacz orientację bazy OCT
Scigen  Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisherbrand	23730571	Podłoże do zatapiania zamrożonych próbek tkanek w celu zapewnienia optymalnej temperatury cięcia (O.C.T.).