Wysokoprzepustowa, obrazowa kwantyfikacja syntezy i dystrybucji mitochondrialnego DNA

Summary

Opisano procedurę badania dynamiki metabolizmu mitochondrialnego DNA (mtDNA) w komórkach przy użyciu formatu wielodołkowej płytki i automatycznego obrazowania immunofluorescencyjnego w celu wykrycia i ilościowego określenia syntezy i dystrybucji mtDNA. Można to dalej wykorzystać do zbadania wpływu różnych inhibitorów, stresów komórkowych i wyciszania genów na metabolizm mtDNA.

Abstract

Zdecydowana większość procesów komórkowych wymaga ciągłego dostarczania energii, której najczęstszym nośnikiem jest cząsteczka ATP. Komórki eukariotyczne wytwarzają większość ATP w mitochondriach przez fosforylację oksydacyjną. Mitochondria są wyjątkowymi organellami, ponieważ mają własny genom, który jest replikowany i przekazywany następnemu pokoleniu komórek. W przeciwieństwie do genomu jądrowego, w komórce znajduje się wiele kopii genomu mitochondrialnego. Szczegółowe badanie mechanizmów odpowiedzialnych za replikację, naprawę i utrzymanie genomu mitochondrialnego jest niezbędne do zrozumienia prawidłowego funkcjonowania mitochondriów i całych komórek zarówno w warunkach normalnych, jak i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metodę, która pozwala na wysokoprzepustową kwantyfikację syntezy i dystrybucji mitochondrialnego DNA (mtDNA) w komórkach ludzkich hodowanych in vitro. Podejście to opiera się na immunofluorescencyjnej detekcji aktywnie zsyntetyzowanych cząsteczek DNA znakowanych przez inkorporację 5-bromo-2'-deoksyurydyny (BrdU) i jednoczesnym wykrywaniu wszystkich cząsteczek mtDNA z przeciwciałami anty-DNA. Dodatkowo mitochondria są wizualizowane za pomocą określonych barwników lub przeciwciał. Hodowla komórek w formacie wielodołkowym i wykorzystanie automatycznego mikroskopu fluorescencyjnego ułatwiają badanie dynamiki mtDNA i morfologii mitochondriów w różnych warunkach eksperymentalnych w stosunkowo krótkim czasie.

Introduction

Dla większości komórek eukariotycznych mitochondria są niezbędnymi organellami, ponieważ odgrywają kluczową rolę w wielu procesach komórkowych. Przede wszystkim mitochondria są kluczowymi dostawcami energii dla komórek¹. Mitochondria są również zaangażowane w regulację homeostazy komórkowej (na przykład wewnątrzkomórkowa klasa redoks² i równowaga wapniowa < klasa sup = 'xref'>3), sygnalizacja komórkowa < klasa sup = 'xref'>4^,< klasa sup = 'xref'>5, apoptoza < klasa sup = 'xref'>6, synteza różnych związków biochemicznych < klasa sup = 'xref'> 7^,< klasa sup = 'xref'>8 oraz wrodzona odpowiedź immunologiczna< klasa sup = 'xref'>9. Dysfunkcja mitochondriów jest związana z różnymi stanami patologicznymi i chorobami ludzkimi¹⁰.

Funkcjonowanie mitochondriów zależy od informacji genetycznej znajdującej się w dwóch oddzielnych genomach: jądrowym i mitochondrialnym. Genom mitochondrialny koduje niewielką liczbę genów w porównaniu z genomem jądrowym, ale wszystkie geny kodowane przez mtDNA są niezbędne dla życia człowieka. Mitochondrialna maszyneria białkowa niezbędna do utrzymania mtDNA jest kodowana przez nDNA. Podstawowe składniki replikosmu mitochondrialnego, a także niektóre czynniki biogenezy mitochondriów, zostały już zidentyfikowane (omówione w poprzednich badaniach^11,12). Jednak mechanizmy replikacji i utrzymania mitochondrialnego DNA są nadal dalekie od zrozumienia. W przeciwieństwie do nDNA, genom mitochondrialny występuje w wielu kopiach, co zapewnia dodatkową warstwę do regulacji ekspresji genów mitochondrialnych. Obecnie znacznie mniej wiadomo na temat dystrybucji i segregacji mtDNA w organellach, w jakim stopniu procesy te są regulowane, a jeśli tak, to jakie białka są w nie zaangażowane¹³. Wzorzec segregacji ma kluczowe znaczenie, gdy komórki zawierają mieszaną populację mtDNA typu dzikiego i zmutowanego. Ich nierównomierne rozmieszczenie może prowadzić do powstawania komórek ze szkodliwą ilością zmutowanego mtDNA.

Do tej pory, czynniki białkowe niezbędne do utrzymania mtDNA były identyfikowane głównie za pomocą metod biochemicznych, analiz bioinformatycznych lub badań związanych z chorobami. W niniejszej pracy, w celu zapewnienia dużej szansy na zidentyfikowanie czynników, które wcześniej wymykały się identyfikacji, opisano inną strategię. Metoda opiera się na znakowaniu mtDNA podczas replikacji lub naprawy za pomocą 5-bromo-2'-deoksyurydyny (BrdU), nukleozydowego analogu tymidyny. BrdU jest łatwo włączany do powstających nici DNA podczas syntezy DNA i, ogólnie rzecz biorąc, jest używany do monitorowania replikacji jądrowego DNA¹⁴. Jednak opracowana tutaj procedura została zoptymalizowana pod kątem wykrywania BrdU wbudowanego w mtDNA za pomocą immunofluorescencji przeciwciał anty-BrdU.

Podejście pozwala na wysokoprzepustową kwantyfikację syntezy i dystrybucji mtDNA w ludzkich komórkach hodowanych in vitro. Strategia wysokiej przepustowości jest niezbędna do przeprowadzenia testów w różnych warunkach eksperymentalnych w stosunkowo krótkim czasie; W związku z tym w protokole proponuje się wykorzystanie formatu wielodołkowego do hodowli komórek i zautomatyzowanej mikroskopii fluorescencyjnej do obrazowania. Protokół obejmuje transfekcję ludzkich komórek HeLa z biblioteką siRNA, a następnie monitorowanie replikacji lub naprawy mtDNA za pomocą znakowania metabolicznego nowo zsyntetyzowanego DNA za pomocą BrdU. Podejście to łączy się z barwieniem immunologicznym DNA za pomocą przeciwciał anty-DNA. Oba parametry są analizowane za pomocą ilościowej mikroskopii fluorescencyjnej. Dodatkowo mitochondria są wizualizowane za pomocą określonego barwnika. Aby zademonstrować specyficzność protokołu, barwienie BrdU przetestowano na komórkach pozbawionych mtDNA (komórki rho0), na komórkach HeLa po wyciszeniu dobrze znanych czynników podtrzymujących mtDNA oraz na komórkach HeLa po leczeniu inhibitorem replikacji mtDNA. Poziomy mtDNA mierzono również niezależną metodą, a mianowicie qPCR.

Protocol

1. Przygotowanie mieszaniny siRNA

1. Na dzień przed rozpoczęciem eksperymentu komórki nasienne (np. HeLa) umieszcza się na szalce o średnicy 100 mm, tak aby następnego dnia osiągnęły 70%-90% konfluencji.
   UWAGA: Wszystkie operacje muszą być wykonywane w sterylnych warunkach w komorze z przepływem laminarnym.
2. Przygotować odpowiednią ilość siRNA rozcieńczonego do stężenia 140 nM w pożywce Opti-MEM (patrz tabela materiałów). Jako zbiornik może służyć 96-dołkowa płytka.
3. Dodać 5 μl roztworu siRNA (lub pożywki Opti-MEM dla próbek kontrolnych) do każdej studzienki czarnej 384-dołkowej mikropłytki do hodowli komórkowej.
   UWAGA: W zależności od liczby badanych próbek siRNA można użyć pipety elektronicznej lub wielokanałowej.
4. Przygotować odpowiednią ilość roztworu odczynnika do transfekcji RNAiMAX (patrz tabela materiałów) w pożywce Opti-MEM. Dodać 1 μL RNAiMAX na każde 100 μL pożywki.
5. Dodać 10 μl roztworu odczynnika do transfekcji do każdego dołka płytki 384-dołkowej. Najwygodniejszym i najszybszym sposobem na to jest użycie dozownika odczynników.
6. Inkubować siRNA z odczynnikiem do transfekcji przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

2. Przygotowanie komórek do transfekcji

1. Podczas inkubacji (etap 1.6) odessać pożywkę za pomocą urządzenia ssącego (patrz Tabela Materiałów) i przemyć komórki 3 ml PBS.
2. Dodać 1,5 ml trypsyny rozcieńczonej w stosunku 1:2 w PBS i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
3. Sprawdź, czy komórki się odłączyły; jeśli tak, dodaj 3 ml pożywki DMEM z 10% FBS. Dokładnie zawieś komórki i przenieś je do probówki o pojemności 15 ml. Pobrać co najmniej 150 μl zawiesiny i policzyć komórki w komorze do liczenia komórek (patrz tabela materiałów).
4. Przygotuj zawiesinę komórkową o odpowiednim stężeniu (35 000/ml dla linii HeLa) w pożywce DMEM z 10% FBS, penicyliną i streptomycyną.

3. Transfekcja komórkowa

1. Dodać 20 μl zawiesiny komórek do każdego dołka płytki 384-dołkowej za pomocą dozownika odczynników. Spowoduje to wysianie 700 komórek w każdym dołku.
2. Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie umieścić je w inkubatorze na 72 godziny (37 °C i 5% CO₂ ).

4. Założenie BrdU

1. Przygotować 90 μM roztwór BrdU (patrz tabela materiałów) w podłożu DMEM z 10% FBS.
2. Po 56 godzinach od transfekcji siRNA (16 godzin przed utrwaleniem komórek) dodać 10 μl 90 μM roztworu BrdU do każdego dołka płytki 384-dołkowej (końcowe stężenie BrdU wynosi 20 μM).
   UWAGA: Czynność należy wykonać tak szybko, jak to możliwe; Dlatego najlepiej jest używać dozownika odczynników, pipety elektronicznej lub pipety z wieloma dozownikami. Należy pamiętać o przygotowaniu studzienek kontrolnych bez dodatku BrdU.
3. Inkubować komórki przez 16 godzin (37 °C i 5% CO₂ ).

5. Etykietowanie mitochondriów

1. Przygotować 20 μM roztwór BrdU w DMEM z 10% FBS i dodać do niego roztwór barwnika śledzącego mitochondria (patrz tabela materiałów) do stężenia 1,1 μM.
2. Po 15 godzinach od rozpoczęcia inkorporacji BrdU (1 godzinę przed utrwaleniem komórek) dodać 10 μl roztworu barwnika śledzącego mitochondria (patrz Tabela materiałów) do każdego dołka płytki 384-dołkowej (końcowe stężenie barwnika wynosi 200 nM).
   UWAGA: Użyj dozownika odczynników, pipety elektronicznej lub pipety z wieloma dozownikami. Pamiętaj, aby zachować studzienki kontrolne bez dodatku BrdU, ale z dodatkiem barwnika śledzącego mitochondria.
3. Inkubować komórki przez 1 godzinę (37 °C i 5% CO₂ ).

6. Utrwalanie komórek

UWAGA: Całe mycie najwygodniej przeprowadza się za pomocą myjki do mikropłytek, natomiast dodawanie odczynników najszybciej odbywa się za pomocą dozownika odczynników.

1. Za pomocą myjki do mikropłytek (patrz tabela materiałów) przepłukać każdą studzienkę dwukrotnie 100 μl PBS. Po drugim płukaniu pozostaw 25 μl PBS w studzience.
   UWAGA: Pozostawienie PBS w studzience zmniejsza prawdopodobieństwo oderwania się komórek podczas dodawania płynu w następnym kroku. Wszystkie prania są zakończone z pozostawionym PBS; dlatego roztwór dodany w następnym kroku powinien być zawsze przygotowywany w stężeniu 2x, ponieważ zostanie dodany w równej objętości do pozostałego PBS.
2. Utrwalić komórki, dodając 25 μl 8% roztworu formaldehydu w PBS z 0,4% Triton X-100 i Hoechst 33342 w stężeniu 4 μg/ml (końcowe stężenia poszczególnych odczynników wynoszą odpowiednio 4%, 0,2% i 2 μg/ml) (patrz tabela materiałów).
3. Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

7. Blokowanie

1. Przepłukać każdą studzienkę czterokrotnie 100 μl PBS. Po ostatnim praniu pozostaw w studzience 25 μl PBS.
2. Dodać 25 μl 6% BSA w PBS (końcowe stężenie BSA wynosi 3%) do każdej studzienki.
3. Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

8. Dodanie pierwszorzędowych przeciwciał

1. Odessać BSA za pomocą myjki do mikropłytek i pozostawić 10 μl roztworu w studzience.
2. Dodać 10 μl pierwszorzędowego roztworu przeciwciała przygotowanego w 3% BSA w PBS. Stosować anty-BrdU w stężeniu 0,8 μg/ml i anty-DNA w stężeniu 0,4 μg/ml (końcowe stężenia przeciwciał wynoszą odpowiednio 0,4 μg/ml i 0,2 μg/ml) (patrz tabela materiałów).
3. Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze 4 °C przez noc.

9. Dodanie przeciwciał drugorzędowych

1. Przepłukać każdą studzienkę czterokrotnie 100 μl PBS. Po ostatnim praniu pozostaw w studzience 10 μl PBS.
2. Dodać 10 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych o stężeniu 4 μg/ml przygotowanego w 6% powierzchni ciała w PBS (końcowe stężenie wynosi 2 μg/ml). Stosować przeciwciała specyficzne dla izotypu (anty-mysie IgG1 i anty-mysie IgM) sprzężone z fluorochromami, takimi jak Alexa Fluor 488 i Alexa Fluor 555 (patrz tabela materiałów).
3. Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
4. Przepłukać każdą studzienkę czterokrotnie 100 μl PBS. Po ostatnim praniu pozostaw w studzience 50 μl PBS.
5. Uszczelnić płytkę samoprzylepną folią uszczelniającą (patrz tabela materiałów) i przechowywać ją w ciemności w temperaturze 4 °C. Obrazowanie należy wykonać w ciągu 2 tygodni.

10. Obrazowanie

UWAGA: Obrazowanie musi być wykonywane za pomocą automatycznego mikroskopu szerokokątnego; mikroskop musi być wyposażony w stopień motoryczny wyposażony w elementy sterujące do automatycznego obrazowania poszczególnych obszarów płytki.

1. Sprawdź ustawienia autofokusa w rogach płyty (dołki A1, A24, P24, P1) i pośrodku.
   UWAGA: Do obrazowania zaleca się używanie obiektywu o 20-krotnej krótkiej odległości roboczej (patrz Tabela materiałów) z najwyższym możliwym otworem numerycznym.
2. Na podstawie histogramów intensywności generowanych przez oprogramowanie do obrazowania w trybie podglądu na żywo wybierz wystarczająco długi czas naświetlania dla poszczególnych kanałów fluorescencji, aby uzyskany obraz nie był przesycony.
3. Ustaw odpowiednią liczbę płaszczyzn do obrazowania na osi z.
   UWAGA: Pole widzenia przy 20-krotnym powiększeniu jest na tyle duże, że nie wszystkie komórki znajdują się w tej samej płaszczyźnie ostrości, dlatego należy wykonać przekrój z, aby wyświetlić wszystkie komórki w ich prawidłowej płaszczyźnie ostrości. Zwykle wystarczy pięć samolotów. W zależności od dostępności miejsca na dysku, można zapisać pojedyncze stosy z lub tylko projekcje maksymalnej intensywności. Analiza obrazu przedstawiona w sekcji reprezentatywnych wyników opiera się na projekcjach maksymalnej intensywności.
4. Wybierz odpowiednią liczbę pól widoku do wyświetlenia dla każdego dołka.
   UWAGA: W zależności od konfluencji, w jednym polu widzenia można zobrazować około 60-300 komórek. Zazwyczaj w przypadku komórek HeLa o konfluencji 60%-90% obrazowanie pięciu pól widzenia pozwoli na analizę od 500 komórek do ponad 1000 komórek.
5. Wybierz studnie, które mają zostać zobrazowane, i rozpocznij obrazowanie.

11. Ilościowa analiza obrazu

UWAGA: Analiza ilościowa pozyskanych obrazów może być przeprowadzona za pomocą oprogramowania typu open source, takiego jak Cell Profiler¹⁵. Na potrzeby niniejszego badania analizę przeprowadzono przy użyciu oprogramowania ScanR 3.0.0 (patrz tabela materiałów).

1. Rozpocznij analizę od wykonania korekcji tła dla wszystkich obrazów ze wszystkich kanałów fluorescencji. W zależności od wielkości analizowanych obiektów należy dobrać odpowiedni rozmiar filtra: 80 pikseli dla jąder komórkowych i 4 piksele dla plamek BrdU i mtDNA.
2. Segmentację obrazu należy rozpocząć od stworzenia maski głównego obiektu na podstawie stosunku intensywności sygnału fluorescencji do tła dla kanału odpowiadającego jądrom komórkowym.
3. Utwórz maski dla podobiektów reprezentujących odpowiednio plamki BrdU i mtDNA, korzystając z kanałów fluorescencyjnych odpowiednich dla danych struktur.
   UWAGA: Każdy podobiekt jest przypisany do najbliższego obiektu głównego (jądra komórkowego).
4. Ustaw parametry, które mają być mierzone podczas analizy, i zmierz intensywność poszczególnych pikseli w każdej masce dla wszystkich kanałów fluorescencji.
   UWAGA: Konieczne jest również obliczenie liczby podobiektów przypisanych do danego jądra komórkowego oraz powierzchni każdego podobiektu.
5. Zdefiniuj parametry pochodne, które mają być obliczane na podstawie uzyskanych danych. Aby uzyskać całkowite intensywności fluorescencji dla kanału BrdU lub mtDNA, należy zsumować natężenia wszystkich podobiektów przypisanych do danego jądra komórkowego. Aby uzyskać średnią intensywność fluorescencji, należy podzielić całkowitą intensywność fluorescencji przez sumę powierzchni podobiektów przypisanych do danego jądra komórkowego.
   UWAGA: Aby upewnić się, że utworzony podobiekt (plamka BrdU lub mtDNA) jest rzeczywiście zlokalizowany w mitochondriach, konieczne jest ich bramkowanie w oparciu o intensywność fluorescencji z barwnika śledzącego mitochondria.
6. Przeprowadź dalszą analizę danych uzyskanych za pomocą oprogramowania ScanR za pomocą oprogramowania statystycznego R 4.2.2 Software¹⁶ wraz z następującymi pakietami: dplyr¹⁷, data.table¹⁸, ggplot2¹⁹ i ggpubr²⁰. Ten krok jest opcjonalny.

Results

Schemat procedury wysokoprzepustowego badania dynamiki syntezy i dystrybucji mtDNA jest pokazany w Rysunek 1. Zastosowanie formatu płytki wielodołkowej umożliwia jednoczesną analizę wielu różnych warunków eksperymentalnych, takich jak wyciszanie różnych genów przy użyciu biblioteki siRNA. Warunki stosowane do znakowania nowo zsyntetyzowanych cząsteczek DNA za pomocą BrdU pozwalają na wykrycie DNA znakowanego BrdU w mitochondriach komórek HeLa (Rysunek 2A), ale mogą być ró...

Discussion

Historycznie rzecz biorąc, znakowanie DNA przez inkorporację BrdU i wykrywanie przeciwciał było wykorzystywane w replikacji jądrowego DNA i badaniach nad cyklem komórkowym 14,27,28. Do tej pory wszystkie protokoły wykrywania DNA znakowanego BrdU obejmowały etap denaturacji DNA (kwaśny lub termiczny) lub trawienie enzymatyczne (DNaza lub proteinaza), aby umożliwić ekspozycję na epitopy i ułatwić penetrację przeciwciał. Protokoły ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2&,3′-Dideoksycytydyna (ddC)	Sigma-Aldrich	D5782
384  Mikropłytki do hodowli komórkowych Well, czarne	Greiner Bio-One	#781946
5-Bromo-2′-deoksyurydyna (BrdU)	Sigma-Aldrich	B5002-1G	Rozpuścić proszek BrdU w wodzie do 20 mM roztworu podstawowego i podwielokrotności. Użyj 20 i mikro; Rozwiązanie M BrdU do etykietowania.
Samoprzylepna folia uszczelniająca	Nerbe Plus	04-095-0060
Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-mysie IgG1	wtórne Thermo Fisher Scientific	A-21121
Alexa Fluor 555 kozie przeciwciało anty-mysie IgM	wtórne Thermo Fisher	Scientific A-21426
BioTek 405 LS myjka mikropłytek	Agilent
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
Komora do liczenia komórek Thoma	Heinz Herenz	REF:1080339
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle (DMEM)	Cytiva	SH30243.01
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Roztwór formaldehydu	Sigma-Aldrich	F1635	Formaldehyd jest toksyczny; prosimy o uważne zapoznanie się z kartą charakterystyki.
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
IgG1 mysie przeciwciało monoklonalne anty-BrdU (IIB5) pierwotne Santa	Cruz Biotechnology	sc-32323
Mysie przeciwciało monoklonalne IgM	Progen	# 61014
LightCycler 480 System	Roche
Lipofectamina RNAiMAX Odczynnik do transfekcji	Thermo Fisher Scientific	#13778150
MitoTracker Deep Red FM	Thermo Fisher Scientific	M22426	Barwnik śledzący mitochondria
Dozownik odczynników Multidrop Combi	Thermo Fisher Scientific
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	51985-042
Orca-R2 (C10600) Kamera CCD	Hamamatsu
Penicylina-Streptomycyna	Sigma-Aldrich	P0781-100ML
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher Scientific	A25742
qPCR starter Fw B2M (odniesienie)			CAGGTACTCCAAAGATTCAGG
Starter qPCR Fw GPI (gen referencyjny)			GACCTTTACTACCCAGGAGA
Starter qPCR Fw MT-ND1			TAGCAGAGACCAACCGAACC
Starter qPCR Fw POLG			TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC
qPCR starter Fw TFAM			GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT
qPCR primer Fw TWNK			GCCATGTGACACTGGTCATT
qPCR primer Rev B2M (odniesienie)			GTCAACTTCAATGTCGGATGG
Starter qPCR Rev GPI (gen referencyjny)			AGTAGACAGGGCAACAAAGT
starter qPCR Rev MT-ND1			ATGAAGAATAGGGCGAAGGG
Starter qPCR Rev POLG			GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG
Starter qPCR Rev TFAM			GGACTTCTGCCAGCATAATA
Starter qPCR Rev TWNK			AACATTGTCTGCTTCCTGGC
Mikroskop ScanR	Olympus
siRNA Ctrl	Dharmacon	D-001810-10-5
siRNA POLG	Invitrogen	POLGHSS108223
siRNA TFAM	Invitrogen	TFAMHSS144252
siRNA TWNK	Invitrogen	C10orf2HSS125597
Urządzenie ssące	NeoLab	2-9335	Urządzenie ssące do hodowli komórkowych
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML
Trypsin	Biowest	L0931-500
UPlanSApo 20x 0,75 NA cel	Olympus