Precyzyjna i wymierna metoda zbierania hemolimfy z małych stawonogów

Summary

Opisujemy metodę skutecznego zbierania mierzalnych hemolimfów od małych stawonogów do późniejszej analizy.

Abstract

Stawonogi są znane z przenoszenia różnych wirusów o znaczeniu medycznym i rolniczym poprzez swoją hemolimfę, co jest niezbędne do przenoszenia wirusów. Kolekcja Hemolymph to podstawowa technologia do badania interakcji wirus-wektor. W tym miejscu opisujemy nowatorską i prostą metodę ilościowego zbierania hemolimfy od małych stawonogów przy użyciu Laodelphax striatellus (mały brązowy skoczek roślinny, SBPH) jako modelu badawczego, ponieważ ten stawonogów jest głównym wektorem wirusa pasków ryżowych (RSV). W tym protokole proces rozpoczyna się od delikatnego uszczypnięcia jednej nogi zamrożonego stawonoga pęsetą z cienką końcówką i wyciśnięcia hemolimfy z rany. Następnie prosta mikropipeta składająca się z kapilary i gruszki pipety służy do zbierania transudywnej hemolimfy z rany zgodnie z zasadą sił kapilarnych. Na koniec zebraną hemolimfę można rozpuścić w określonym buforze do dalszych badań. Ta nowa metoda zbierania hemolimfy od małych stawonogów jest użytecznym i skutecznym narzędziem do dalszych badań nad arbowirusami i interakcjami wektor-wirus.

Introduction

Zarówno wirusy zwierzęce, jak i roślinne mogą być przenoszone przez stawonogi, a wirusy te stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego i powodują ogromne straty ekonomiczne w rolnictwie^1,2^,3. Co ważne, hemolimfa stawonogów, która pełni funkcję układu krążenia i jest istotnym elementem układu odpornościowego u stawonogów, odgrywa ważną rolę w regulacji transmisji arbowirusowej. Wirusy nabyte przez jelita stawonogów są transportowane do innych tkanek dopiero po udanej ucieczce z niekorzystnego środowiska hemolimfy^4,5,6,7. Cykl życiowy wirusów w hemolimfie stawonogów obejmuje przeżycie wirusa w płynnym osoczu, wnikanie do hemocytu i transport do innych tkanek, a w hemolimfie8^,9,10,11,12. Na przykład pionowa transmisja RSV przez SBPH jest zależna od interakcji molekularnej między białkiem witellogeniny SBPH a białkiem kapsydu RSV (wirusa ryżowego pasiastego) ^13,14. Niektóre wirusy mogą uciec przed odpowiedzią immunologiczną hemolimfy poprzez wiązanie określonych czynników wektorowych^15,16,17,18. Dlatego badanie interakcji wektor-wirus w hemolimfie stawonogów jest ważne dla lepszego zrozumienia transmisji arbowirusa.

Półimimfa niektórych małych owadów, takich jak skoczki roślinne, skoczki liściowe i niektóre komary, jest trudna do zebrania ze względu na ich rozmiar. Aby rozwiązać ten problem, opracowano kilka metod zbierania hemolimfy, w tym wprowadzenie igły strzykawkowej bezpośrednio do ciała owada w celu ekstrakcji mikroobjętości hemolimfy, zbieranie wysięku z miejsca rany za pomocą pęsety z cienką końcówką oraz bezpośrednie wirowanie. Metody te umożliwiły pomiar względnych poziomów ekspresji genów i mian wirusów w obrębie klasy hemolymph19^,20,21. Jednak skuteczna metoda ilościowego określania objętości hemolimfy, która jest niezbędna do liczenia hemocytów, kwantyfikacji białek i analizy aktywności enzymów, nie jest obecnie dostępna dla tych małych owadów.

SBPH (mały brązowy skoczek) to rodzaj małego owada o długości ciała około 2-4 mm. SBPH jest zdolny do przenoszenia różnych wirusów roślinnych, w tym RSV, wirusa szorstkiego karłowatego kukurydzy i wirusa czarnego karła ryżowego^22,23,24. Interakcja między SBPH a RSV została dogłębnie zbadana w ciągu ostatniej dekady. Aby ułatwić pracę z SBPH, opracowaliśmy nowatorską i prostą metodę zbierania hemolimfy. Ta metoda, która opiera się na zasadzie sił kapilarnych, wykorzystuje kapilarnę ze znacznikiem skali, aby uzyskać hemolimfę owada w precyzyjny i wymierny sposób. Dzięki temu możemy skutecznie zebrać określoną objętość hemolimfy od małych owadów i bardziej szczegółowo zbadać środowisko hemolimfy małych wektorów.

Protocol

1. Hodowla owadów

1. Podnieś SBPH użyte w tym eksperymencie w siewkach ryżu (Oryza sativa cv. Nipponbare). Posadź 20 sadzonek ryżu w inkubatorze (65 mm x 200 mm) i uprawiaj w temperaturze 25 °C w świetle przez 16 godzin, w ciemnym fotoperiodze przez 16 godzin.

2. Analiza SBPH dla kolekcji hemolimfy

1. Włóż SBPH do probówki wirówkowej i umieść je w łaźni lodowej na 10-30 min.
   UWAGA: Nie umieszczaj SBPH w łaźni lodowej na mniej niż 10 minut, w przeciwnym razie owady mogą się ożywić.
2. Umieścić zamrożony SBPH na szkiełku podstawowym (patrz Tabela materiałów) pod mikroskopem stereoskopowym (patrz Tabela materiałów) z brzuchem skierowanym do góry. Dostosuj ostrość na sześciu nogach owada.
3. Przygotuj dwie precyzyjne pęsety (patrz tabela materiałów) z bardzo cienkimi końcówkami. Użyj jednej pęsety, aby docisnąć ciało owada, aby utrzymać go na miejscu, a drugą użyj drugiej, aby ostrożnie ściągnąć jedną z nóg owada.
   UWAGA: W przypadku owadów o twardej skorupie można użyć skalpela okulistycznego do odcięcia jednej z nóg.
4. Delikatnie dociśnij klatkę piersiową owada pęsetą, aby hemolimfa wypłynęła przez ranę.
   UWAGA: Hemolimfa przedstawia się jako przezroczyste kropelki bez widocznej białej kłaczkówki. Wyrzuć lipid, jeśli jest jakaś biała kłaczkowa, która reprezentuje zanieczyszczenie ciała tłuszczowego.

3. Kolekcja hemolimfy za pomocą mikropipet

1. Przygotuj mikropipetę. Umieścić rurkę kapilarną (patrz tabela materiałów) o objętości 1 μl w bańce pipety (patrz tabela materiałów). Aby uzyskać dokładne pomiary, upewnij się, że linia skali jest widoczna.
   UWAGA: Konieczny jest mały otwór znajdujący się w górnej części bańki pipety.
2. Podczas pobierania hemolimfy należy przytrzymać gruszkę pipety mikropipety i umieścić rurkę kapilarną blisko rany owada. Zbierz hemolimfę wydzielającą się z rany, po prostu dotykając czubka naczynia włosowatego do hemolimfy.
3. Lekko zablokuj palcem mały otwór w górnej części bańki pipety, aby zatrzymać proces wchłaniania, gdy płyn wewnątrz rurki kapilarnej osiągnie żądaną linię skali.
   UWAGA: Pobieraj jedną próbkę 1 μl hemolimfy nieprzerwanie i szybko, aby uniknąć zanieczyszczenia lipidami i zatkania rurki.
4. Naciśnij gruszkę pipety, aby rozlać pobraną hemolimfę do 100 μl buforu PBS (137 mmol/L NaCI, 2,7 mmol/L KCI, 4,3 mmol/L Na₂HPO₄, 1,4 mmol/L KH₂PO₄, pH 7,2-7,4).
   UWAGA: Rurkę kapilarną wkłada się do bufora PBS.
5. Zmień rurkę kapilarną na nową podczas pobierania kolejnej próbki 1 μl hemolimfy.

4. Niebieskie barwienie Coomassie

1. Pobrać 3 próbki hemolimfy o tej samej objętości (1 μl) od larw 3. stadium zgodnie z protokołami opisanymi w kroku 3 i rozładować pobraną hemolimfę do buforu PBS, aby uzyskać całkowitą objętość 100 μl.
2. Dodaj 25 μl 5x buforu ładującego białko (250 mmol/L Tris-HCI [pH 6,8], 10% w/v SDS, 0,05% w/V błękitu bromofenolowego, 50% w/V glicerolu, 5% w/V β-merkaptoetanolu) do 100 μl rozcieńczonych próbek hemolimfy i podgrzać w celu denaturacji białek.
3. Załadować 20 μl ugotowanych próbek do 10% żelu białkowego SDS-PAGE (patrz tabela materiałów) w celu oddzielenia białek.
4. Wybarwić żel w roztworze Coomassie Blue (zmieszać 1 g Coomassie Brilliant Blue R-250 z 250 ml izopropanolu, 100 ml lodowatego kwasu octowego i 650 ml ddH₂O i odfiltrować wszelkie cząstki za pomocą bibuły filtracyjnej) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie odbarwić żel przez 1 godzinę roztworem odbarwiającym (100 ml kwasu octowego, 400 ml metanolu, 500 ml ddH₂O).

5. Oznaczanie stężenia białka

1. Rozcieńczyć 10 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 5 mg/ml, 2,5 mg/ml, 1,25 mg/mL, 0,625 mg/ml i 0,3125 mg/ml buforem PBS metodą dwukrotnego rozcieńczenia.
2. Odessać 5 μl buforu PBS i każde stężenie roztworów BSA w kroku 5.1, dodać 1 ml 1x odczynnika barwnika Bradforda (patrz tabela materiałów) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Użyj buforu PBS w odczynniku barwnikowym Bradford jako kontroli i zera przy OD = 595 nm. Zmierzyć wartości absorbancji każdego z pozostałych stężeń białka i wykonać krzywą wzorcową.
3. Dodać 1 μl hemolimfy z larw, samic lub samców SBPH do 100 μl buforu PBS, a następnie odwirować próbki przy 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia hemocytów.
4. Odessać 90 μl supernatantu do nowej probówki wirówkowej i zmierzyć wartości absorbancji supernatantu zgodnie z instrukcjami w kroku 5.2.
5. Obliczyć stężenia białka w próbkach hemolimfy zgodnie z równaniem regresji krzywej standardowej. Uwzględnij w doświadczeniach trzy kontrpróby biologiczne i trzy kontrpróby techniczne.

6. Mikroskopijne detekcje

1. Użyj mikropipet, aby zebrać hemolimfę z 10-15 SBPH na różnych etapach rozwoju. Pobraną hemolimfę dodać do probówki zawierającej 20 μl 4% roztworu paraformaldehydu (patrz tabela materiałów). Inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby utrwalić hemolimfę.
2. Pobrać pipetę z 20 μl utrwalonych hemocytów na środek szkiełka pokrytego silanem (patrz Tabela Materiałów).
3. Wysuszyć kroplę na suszarce do szkiełek.
   UWAGA: Unikaj nadmiernego suszenia.
4. Przykryj próbkę złotym odczynnikiem zapobiegającym blaknięciu 4',6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI) (patrz tabela materiałów) i sprawdź szkiełko pod mikroskopem odwróconym (patrz tabela materiałów).

7. Kwantyfikacja komórek

1. Za pomocą mikropipety zebrać 1 μl hemolimfy z SBPH i rozpuścić ją w 20 μl buforu PBS.
2. Próbki hemolimfy rozcieńczyć pięciokrotnie buforem PBS.
3. Odpipetować 20 μl roztworu hemolimfy do środka komory zliczania komórek (patrz Tabela Materiałów). Przykryj kroplę szkiełkiem nakrywkowym (patrz Tabela materiałów).
4. Policz komórki w pięciu kwadratach na komorze do liczenia komórek (rysunek uzupełniający 1), pod mikroskopem odwróconym (patrz tabela materiałów). Do każdego z doświadczeń należy dołączyć trzy kontrpróby biologiczne oraz trzy kontrpróby techniczne.
   Komórki/μl = całkowita liczba pięciu środkowych kwadratów × 5 × współczynnik rozcieńczenia × 10⁴

8. Analizy statystyczne

1. Przeprowadzaj analizy statystyczne za pomocą odpowiedniego oprogramowania (patrz tabela materiałów). Utwórz nowy plik, wybierz kolumnę, zaimportuj dane i wygeneruj wykres punktowy z paskiem.
2. Oblicz średnią i SD dla każdej grupy danych, korzystając ze statystyk kolumnowych, a następnie użyj jednoczynnikowego narzędzia ANOVA, aby ocenić istotność różnic między grupami. Określić średnią i SD z trzech kontrprób biologicznych za pomocą trzech niezależnych eksperymentów.

Results

Model mikropipet i kolekcja hemolimfy
Opracowaliśmy prostą mikropipetę, której działanie opiera się na siłach kapilarnych rurki kapilarnej. Mikropipeta składa się z rurki kapilarnej i gruszki pipety (Rysunek 1A). Rurki kapilarne są dostępne w różnych pojemnościach od 1 μl do 20 μl, a objętości kapilar są dobierane zgodnie z wymaganiami. Rurki kapilarne o mniejszych objętościach nie są sugerowane, ponieważ bardzo drobne otwory w rurkach o mniejszej objętości mogą utrudniać wchłania...

Discussion

Hemolimfa jest pożywką układu krążenia u stawonogówów, a arbowirusy mogą atakować inne tkanki stawonogów tylko wtedy, gdy są w stanie przetrwać we wrogim środowisku hemolimfy. Pobranie wysokiej jakości próbki hemolimfy jest pierwszym krokiem w badaniu interakcji wektor-wirus, które zachodzą w hemolimfie. Doniesiono, że hemolimfę owada można uzyskać z kilku miejsc na ciele owada, w tym z rany na przedniej nodze, niewielkiego nacięcia w okolicy głowy lub rany łzowej na brzuchu 26,27,28,29.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% SDS-PAGE żel białkowy	Bio-rad	4561035	Separacja i detekcja białek
4% paraformaldehyd		Solarbio P1110	Do utrwalania komórek lub tkanek
Odczynnik barwnikowy Bradford	Bio-rad	5000205	Wykrywanie stężenia białka
Kapilara	Hirschmann	9000101	Do zbierania hemolimfy
Komora do liczenia komórek	ACMEC	AYA0810	Liczenie hemocytów
Szkiełko	szklane Gitoglas	10127105A	Do trzymania owadów
Szkiełko szklane pokryte silanem	Sigma	S4651-72EA	Do przechowywania próbek mikroskopowych
Złoty odczynnik zapobiegający blaknięciu z DAPI	Invitrogen	P36935	Barwienie jąder
Szkło pokrywy mikroskopu	Gitoglas	10212424C	Do obserwacji mikroskopowej
Żarówka do pipet	Hirschmann	9000101	Do zbierania hemolimfy
Oprogramowanie Prism 8.0	Oprogramowanie GraphPad	/	Analizy statystyczne
Mikroskop stereoskopowy	Motic	SMZ-168	Do preparacji owadów
Pęseta	Tianld	P5622	Do preparacji owadów
Mikroskop odwrócony Zeiss	Zeiss	Observer Z1	Obserwacja hemocytów