Opisujemy metodę skutecznego zbierania mierzalnych hemolimfów od małych stawonogów do późniejszej analizy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Precyzyjna i wymierna metoda zbierania hemolimfy z małych stawonogów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Stawonogi są znane z przenoszenia różnych wirusów o znaczeniu medycznym i rolniczym poprzez swoją hemolimfę, co jest niezbędne do przenoszenia wirusów. Kolekcja Hemolymph to podstawowa technologia do badania interakcji wirus-wektor. W tym miejscu opisujemy nowatorską i prostą metodę ilościowego zbierania hemolimfy od małych stawonogów przy użyciu Laodelphax striatellus (mały brązowy skoczek roślinny, SBPH) jako modelu badawczego, ponieważ ten stawonogów jest głównym wektorem wirusa pasków ryżowych (RSV). W tym protokole proces rozpoczyna się od delikatnego uszczypnięcia jednej nogi zamrożonego stawonoga pęsetą z cienką końcówką i wyciśnięcia hemolimfy z rany. Następnie prosta mikropipeta składająca się z kapilary i gruszki pipety służy do zbierania transudywnej hemolimfy z rany zgodnie z zasadą sił kapilarnych. Na koniec zebraną hemolimfę można rozpuścić w określonym buforze do dalszych badań. Ta nowa metoda zbierania hemolimfy od małych stawonogów jest użytecznym i skutecznym narzędziem do dalszych badań nad arbowirusami i interakcjami wektor-wirus.
Wprowadzenie
Zarówno wirusy zwierzęce, jak i roślinne mogą być przenoszone przez stawonogi, a wirusy te stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego i powodują ogromne straty ekonomiczne w rolnictwie1,2,3. Co ważne, hemolimfa stawonogów, która pełni funkcję układu krążenia i jest istotnym elementem układu odpornościowego u stawonogów, odgrywa ważną rolę w regulacji transmisji arbowirusowej. Wirusy nabyte przez jelita stawonogów są transportowane do innych tkanek dopiero po udanej ucieczce z niekorzystnego środowiska hemolimfy4,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Hodowla owadów
- Podnieś SBPH użyte w tym eksperymencie w siewkach ryżu (Oryza sativa cv. Nipponbare). Posadź 20 sadzonek ryżu w inkubatorze (65 mm x 200 mm) i uprawiaj w temperaturze 25 °C w świetle przez 16 godzin, w ciemnym fotoperiodze przez 16 godzin.
2. Analiza SBPH dla kolekcji hemolimfy
- Włóż SBPH do probówki wirówkowej i umieść je w łaźni lodowej na 10-30 min.
UWAGA: Nie umieszczaj SBPH w łaźni lodowej na mniej niż 10 minut, w przeciwnym razie owady mogą się ożywić. - Umieścić zamrożony SBPH na szkiełku podstawowym (patrz Tabela materia....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Model mikropipety i pobieranie hemolimfy
Opracowaliśmy prostą mikropipetę, której działanie opiera się na siłach kapilarnych rurki kapilarnej. Mikropipeta składa się z rurki kapilarnej oraz gruszki do pipetowania (Rysunek 1A). Rurki kapilarne są dostępne w różnych rozmiarach objętości od 1 µL do 20 µL, a objętość rurki kapilarnej jest dobierana zgodnie z wymaganiami. Nie zaleca się stosowania rurek kapilarnych o mniejszych objętościach, ponieważ bardzo wąskie otwory rure.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Hemolimfa jest pożywką układu krążenia u stawonogówów, a arbowirusy mogą atakować inne tkanki stawonogów tylko wtedy, gdy są w stanie przetrwać we wrogim środowisku hemolimfy. Pobranie wysokiej jakości próbki hemolimfy jest pierwszym krokiem w badaniu interakcji wektor-wirus, które zachodzą w hemolimfie. Doniesiono, że hemolimfę owada można uzyskać z kilku miejsc na ciele owada, w tym z rany na przedniej nodze, niewielkiego nacięcia w okolicy głowy lub rany łzowej na brzuchu 26,27,28,29.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (nr 2022YFD1401700) oraz przez Narodową Fundację Nauki Chin (nr 32090013 i nr 32072385).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10% SDS-PAGE żel białkowy | Bio-rad | 4561035 | Separacja i detekcja białek |
| 4% paraformaldehyd | Solarbio P1110 | Do utrwalania komórek lub tkanek | |
| Odczynnik barwnikowy Bradford | Bio-rad | 5000205 | Wykrywanie stężenia białka |
| Kapilara | Hirschmann | 9000101 | Do zbierania hemolimfy |
| Komora do liczenia komórek | ACMEC | AYA0810 | Liczenie hemocytów |
| Szkiełko | szklane Gitoglas | 10127105A | Do trzymania owadów |
| Szkiełko szklane pokryte silanem | Sigma | S4651-72EA | Do przechowywania próbek mikroskopowych |
| Złoty odczynnik zapobiegający blaknięciu z DAPI | Invitrogen | P36935 | Barwienie jąder |
| Szkło pokrywy mikroskopu | Gitoglas | 10212424C | Do obserwacji mikroskopowej |
| Żarówka do pipet | Hirschmann | 9000101 | Do zbierania hemolimfy |
| Oprogramowanie Prism 8.0 | Oprogramowanie GraphPad | / | Analizy statystyczne |
| Mikroskop stereoskopowy | Motic | SMZ-168 | Do preparacji owadów |
| Pęseta | Tianld | P5622 | Do preparacji owadów |
| Mikroskop odwrócony Zeiss | Zeiss | Observer Z1 | Obserwacja hemocytów |
Bibliografia
- Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Ray, S., Casteel, C. L. Effector-mediated plant-virus-vector interactions. Plant Cell. ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
