Artykuł metodologiczny

Dwuetapowa izolacja mitochondriów bez znaczników w celu lepszego odkrywania białek i kwantyfikacji

9.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65252

⸱

2 czerwca 2023

 , 
1Department of Immunobiology, University of Lausanne

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy dwuetapowy protokół wysokiej jakości izolacji mitochondriów, który jest zgodny z odkrywaniem białek i kwantyfikacją w skali proteomu. Nasz protokół nie wymaga inżynierii genetycznej, a zatem nadaje się do badania mitochondriów z dowolnych pierwotnych komórek i tkanek.

Streszczenie

Większość procesów fizjologicznych i chorobowych, od centralnego metabolizmu, przez odpowiedź immunologiczną, po neurodegenerację, obejmuje mitochondria. Proteom mitochondrialny składa się z ponad 1000 białek, a obfitość każdego z nich może zmieniać się dynamicznie w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne lub podczas postępu choroby. W tym miejscu opisujemy protokół izolowania wysokiej jakości mitochondriów z pierwotnych komórek i tkanek. Dwuetapowa procedura obejmuje (1) homogenizację mechaniczną i wirowanie różnicowe w celu wyizolowania surowych mitochondriów oraz (2) immunologiczne wychwytywanie mitochondriów bez znaczników w celu wyizolowania czystych organelli i wyeliminowania zanieczyszczeń. Białka mitochondrialne z każdego etapu oczyszczania są analizowane za pomocą ilościowej spektrometrii mas i obliczane są wydajności wzbogacania, co pozwala na odkrycie nowych białek mitochondrialnych za pomocą proteomiki subtraktywnej. Nasz protokół zapewnia czułe i kompleksowe podejście do badania zawartości mitochondriów w liniach komórkowych, komórkach pierwotnych i tkankach.

Wprowadzenie

Mitochondria to złożone i dynamiczne organelle zdolne do wykrywania i dostosowywania się do potrzeb metabolicznych komórki. Kluczowe dla złożoności metabolizmu komórkowego mitochondria działają jako węzły metaboliczne, w których zbiegają się reakcje metabolizmu węglowodanów, białek, lipidów, kwasów nukleinowych i kofaktorów1. Służą również jako organelle sygnałowe dla szlaków wrodzonej odpowiedzi immunologicznej oraz w odpowiedzi na zmiany w jonach i reaktywnych formach tlenu2,3. Do tej pory około 1100 białek zostało zmapowanych do mitochondriów4,5,6, ale możemy założyć, że do odkrycia pozostaje jeszcze wiele innych, zwłaszcza tych ulegających ekspresji tylko w określonych typach komórek lub przejściowo w określonych warunkach środowiskowych. Opracowanie nowych podejść do ilościowego określania zmian w składzie mitochondriów w interesujących stanach metabolicznych zwiększy naszą wiedzę na temat tych organelli i wskaże nowe możliwości terapeutyczne dla zaburzeń charakteryzujących dysfunkcję mitochondriów7.

Obecnie dostępne są różne protokoły izolacji mitochondriów, o różnych wydajnościach i poziomach czystości8. Podejścia oparte na wirowaniu są najbardziej popularne ze względu na ich prostotę i niski koszt. Chociaż wirowanie różnicowe nadaje się do większości zastosowań, ma tę wadę, że pozwala uzyskać niższą czystość mitochondriów i wymaga dużych ilości materiału wyjściowego, gdy stosowane są bardziej złożone aplikacje oparte na gradientach gęstości. W ostatnich latach pojawiły się nowe metody izolacji mitochondriów, takie jak wychwytywanie immunologiczne oparte na znacznikach ("MITO-IP")9 i sortowanie organelli aktywowane fluorescencją10. Chociaż obie procedury mogą generować próbki o wysokiej czystości, pierwsza z nich wymaga inżynierii genetycznej do oznaczania mitochondriów w celu oczyszczenia powinowactwa, co sprawia, że protokoły są niekompatybilne z pierwotnym materiałem pochodzącym z niezmodyfikowanych organizmów lub ludzkich dawców. Tymczasem ta ostatnia jest uzależniona od dostępu do cytometrii przepływowej i przyrządów sortujących. Połączenie różnych metod izolacji daje nadzieję na wygenerowanie bardziej niezawodnych protokołów i zwiększoną czystość.

Tutaj prezentujemy nowy protokół izolacji mitochondriów oparty na połączeniu dwóch istniejących metod: (1) wirowania różnicowego w celu wyizolowania surowej frakcji mitochondrialnej oraz (2) bezznacznikowego immunologicznego wychwytywania mitochondriów za pomocą superparamagnetycznych kulek kowalencyjnie związanych z przeciwciałami przeciwko translokazie zewnętrznej błony mitochondrialnej 22 (Tomm22)11, wszechobecne białko mitochondrialne błony zewnętrznej (Rysunek 1). Opisana przez nas procedura jest kompatybilna z ilościową spektrometrią mas białek, a ponieważ nie zawiera znaczników i nie wymaga manipulacji genetycznej, może być stosowana do szerokiego zakresu modeli badawczych, od linii komórkowych, przez płyny ustrojowe, po całe tkanki zwierzęce. Co więcej, zastosowanie dwóch kroków w protokole umożliwia wykorzystanie proteomiki subtraktywnej6,12 w celu odkrycia nowych białek mitochondrialnych i badania ich ekspresji.

Protokół

Rękawice muszą być noszone przez cały czas, a etapy hodowli komórkowej wykonywane pod kapturem z przepływem laminarnym. Komórki są utrzymywane w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Badania przedstawione w tym protokole zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Uniwersytetu w Lozannie i Szwajcarii dotyczącymi wykorzystywania zwierząt.

1. Hodowla linii komórkowej makrofagów RAW264.7

  1. Hoduj komórki makrofagów myszy RAW264.7 w zmodyfikowanym pożywce orła (DMEM) firmy Dulbecco z wysoką glukozą i glutaminą uzupełnioną 5% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (HI-FBS) i 100 j.m./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (P / S).
    UWAGA: Do wyizolowania mitochondriów wystarczy pojedyncza zlewająca się płytka o średnicy 15 cm (około 70 x 107 komórek RAW264.7).
  2. Utrzymuj komórki RAW264.7 na płytkach do hodowli tkankowych. Początkowa gęstość wysiewu 1 x 105 komórek/ml prowadzi do zlewającej się płytki w ciągu 3 dni. Użyj 25 ml zawiesiny komórek w pożywce na płytkę o średnicy 15 cm. Komórki RAW264.7 mają wysoki współczynnik podziałów komórkowych i muszą być dzielone częściej niż większość linii komórkowych.
  3. Odłączanie ogniw RAW264.7
    1. Odessać pożywkę i raz przepłukać komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
    2. Na płytkę o średnicy 15 cm dodać 8 ml ciepłego buforu dysocjacyjnego RAW (270 mM chlorku potasu, 30 mM dwuwodnego cytrynianu sodu wH2O, sterylnie przefiltrowany) i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    3. Dodać równoważną objętość pożywki do płytek (rozcieńczenie buforu dysocjacyjnego w stosunku 1:1) i odpipetować w celu odłączenia i homogenizacji komórek.
    4. Przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki i odwirować probówkę o masie 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości pożywki (opisanej w kroku 1.1) do zliczania komórek.
      UWAGA: Można zastosować inne metody odłączania ogniw RAW264.7, takie jak trypsyna lub skrobak do komórek. Jednak metody te są ostrzejsze dla komórek i mogą prowadzić do ich polaryzacji do makrofagów podobnych do M1 w ciągu kilku dni po odłączeniu.

2. Izolacja i hodowla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM)

UWAGA: Opisany tutaj protokół jest przeznaczony dla pojedynczej myszy i może być skalowany w górę dla wielu myszy. Szczegółowe protokoły izolacji i hodowli BMDM zostały opisane w innym miejscu13,14.

  1. Poświęć 8-12-tygodniową mysz C57BL/6 z wysoką dawką CO2,
    UWAGA: Można użyć myszy płci męskiej lub żeńskiej.
  2. Spryskaj mysz 75% etanolem, aby ją wysterylizować.
  3. Przeanalizuj i zbierz biodra, kości udowe i piszczele z mouse15.
  4. Aby pobrać szpik kostny z kości udowych i piszczelowych, usuń koniec stawu kolanowego z obu kości15. Odzyskaj szpik kostny z bioder poprzez usunięcie panewki.
  5. Przenieś kości do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z 4 ml pożywki BMDM trzymanej na lodzie (DMEM z wysoką glukozą i glutaminą uzupełnioną 5% HI-FBS, P/S i 10 mM HEPES).
    UWAGA: Ważne jest, aby utrzymać kości w podłożu, aby uniknąć wysuszenia szpiku kostnego podczas sekcji.
  6. Dodaj 4 ml PBS i 4 ml ciepłej pożywki BMDM do dwóch różnych dołków na płytce 6-dołkowej.
  7. Przenieść kości i podłoże z probówki stożkowej o pojemności 50 ml do pustego dołka płytki 6-dołkowej.
  8. Za pomocą kleszczy przenieś kości do PBS, aby je umyć.
  9. Przenieś kości do studzienki zawierającej ciepłą pożywkę BMDM.
  10. Wykonaj otwór o średnicy 1-2 mm na dnie dwóch probówek o pojemności 0,5 ml za pomocą kleszczyków i umieść je w probówce o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: W tym szybkim kroku nie jest konieczne dodawanie nośnika do tuby.
  11. W każdej probówce o pojemności 0,5 ml umieść kość udową, piszczelową i biodro w taki sposób, aby szpik kostny odsłoniętych kości był skierowany w stronę dolnej części probówek.
  12. Odwirować probówki o masie 13 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, aby zebrać szpik kostny i resztki pożywki przez otwór w probówce 0,5 ml i do probówki o pojemności 1,5 ml. Wyrzuć probówki o pojemności 0,5 ml z kośćmi.
  13. Zawiesić granulki szpiku kostnego w pożywce BMDM i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  14. Dodaj pożywkę BMDM do 10 ml.
  15. Umieść sitko o wielkości 40 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml i przefiltruj przez nie zawiesinę szpiku kostnego.
  16. Odwirować przefiltrowaną zawiesinę o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby odzyskać nienaruszone komórki i usunąć drobne zanieczyszczenia z zawiesiny komórek.
  17. Przygotować 70 ml pożywki BMDM uzupełnionej 50 ng/ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF).
  18. Zawiesić osad w 10 ml pożywki BMDM uzupełnionej M-CSF.
  19. Dodać 9 ml pożywki BMDM uzupełnionej M-CSF do każdej z siedmiu 10-centymetrowych szalek Petriego.
  20. Umieść 1 ml komórek (około 1 x 10 7 komórek) w każdej z siedmiu 10-centymetrowych szalek Petriego.
  21. Homogenizować zawiesinę komórkową w każdej płytce, ostrożnie pipetując płytkę w górę i w dół, a następnie przenieść płytki do inkubatora.
  22. Po 3 dniach dodaj 5 ml ciepłej pożywki BMDM uzupełnionej 50 ng/ml M-CSF do każdej płytki.
  23. Po 3 dniach (6 dzień, po izolacji szpiku kostnego) sprawdzić adhezję i różnicowanie BMDM pod mikroskopem.
    UWAGA: W tym momencie możliwe jest bezpośrednie przejście do izolacji mitochondriów (krok 3). Alternatywnie można ponownie platerować BMDM, co pozwala na leczenie ich cytokinami i małymi cząsteczkami.
  24. Odłączanie BMDM
    1. Odessać pożywkę z każdej płytki i dodać 7 ml zimnego PBS uzupełnionego 5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).
    2. Inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez 7-8 minut.
    3. Odłącz BMDM, ostrożnie pipetując w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
    4. Połączyć zawieszone BMDM ze wszystkich siedmiu płytek w jednej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i wirować przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 40 ml ciepłej pożywki BMDM do zliczania komórek.
      UWAGA: Na jedną mysz uzyskuje się od 7 do 9 x 107 BMDM. W proteomice zaleca się co najmniej 6 x 107 BMDM do izolacji mitochondriów.
    6. W razie potrzeby płytkę i potraktuj BMDM zgodnie z celem eksperymentalnym. Jeśli nie, przejdź bezpośrednio do kroku 3.3.

3. Przygotowanie surowej frakcji mitochondrialnej przez wirowanie różnicowe

UWAGA: Wykonaj wszystkie etapy wirowania w temperaturze 4 °C. Wymagane są dwie wirówki, jedna z odchylanym wirnikiem i adapterami do probówek stożkowych o względnej sile odśrodkowej co najmniej 300 x g, druga o względnej sile odśrodkowej co najmniej 21 000 x g, odpowiednia do probówek o pojemności 1,5 ml. Używając komórek przylegających, użyj skrobaka do komórek.

  1. W przypadku komórek przylegających należy odessać pożywkę i dodać 10 ml PBS na 15 cm płytkę.
    UWAGA: Skrobanie komórek w PBS pozwala na ich jednoczesne mycie. Jeśli komórki znajdują się już w zawiesinie, przejdź bezpośrednio do kroku 3.3.
  2. Odłącz komórki za pomocą skrobaka do komórek i umieść je w jednej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Homogenizować zawiesinę komórkową, pipetując w górę i w dół.
    UWAGA: Komórki można odłączyć za pomocą skrobaka do komórek, ponieważ jest to szybsze i wkrótce potem zostaną poddane lizie.
  3. Dla każdego warunku doświadczalnego przenieś 5% objętości zawiesiny komórek do probówki o pojemności 1,5 ml i odwiruj ją przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Używając ogniw zawiesinowych, należy wcześniej umyć je raz PBS, aby usunąć ewentualne zanieczyszczenia z nośników, takich jak FBS.
  4. Odrzucić supernatant i pozostawić osad na lodzie.
    UWAGA: Będzie to reprezentować frakcję "całkowitej komórki" dla proteomiki.
  5. Pozostałe próbki z etapu 3.1 lub 3.2 odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Wykonaj wszystkie poniższe czynności na lodzie i przy użyciu lodowatych.
  7. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml lodowatego buforu mitochondrialnego (MB) (210 mM mannitolu, 70 mM sacharozy, 10 mM HEPES/NaOH [pH 7,4] i 1 mM EDTA).
  8. Odzyskać komórki przez odwirowanie w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 0,5 ml zimnego MB i przenieść go do probówki o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Ta procedura daje przybliżone stężenie komórek 1,5 x 108 komórek BMDM/ml lub 3 x 108 komórek RAW264,7/ml.
  10. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę 25 G, homogenizować zawiesinę komórkową przez 30 przejść przez igłę (Rysunek 1A).
  11. Dodaj 1 ml zimnego MB do probówki i wymieszaj przez odwrócenie. Odwirować homogenizowaną zawiesinę komórkową o stężeniu 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  12. Przenieść 1 ml supernatantu do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml na lodzie, nie naruszając osadu komórkowego. Ponownie zawiesić osad komórkowy i ponownie go homogenizować, jak w kroku 3.7.
  13. Zebrać homogenizowane osady komórkowe i supernatant z dwóch poprzednich etapów w jednej probówce o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: W tym momencie osad zawiera głównie jądra i nieuszkodzone komórki i jest odrzucany. Supernatant zawiera szczątki komórkowe, cytozol i organelle, w tym mitochondria (Rysunek 1B).
  14. Podzielić supernatant na cztery probówki o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Podział supernatantu na wiele probówek na tym etapie poprawia usuwanie zanieczyszczeń w kolejnych krokach.
  15. Dodać MB, aby uzyskać końcową objętość 1 ml w każdej z czterech probówek. Wymieszać przez odwrócenie i odwirować probówki o stężeniu 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Po tym kroku widoczny jest pellet z dwiema warstwami. Dolna, twarda, brązowa osadka zawiera mitochondria i jest przechowywana do dalszego oczyszczania (Rysunek 1C). Górna, luźna, biała osadka zawiera inne struktury komórkowe i może zostać wyrzucona.
  16. Wykonaj ten krok ostrożnie. Usunąć supernatant z jak największą ilością białego górnego osadu. Poprzez delikatne pipetowanie na nim możliwe jest ponowne zawieszenie białej granulki, a następnie wyrzucenie jej, pozostawiając brązową osadkę mitochondrialną w stanie nienaruszonym.
  17. Trzymaj jedną z czterech probówek z osadem mitochondrialnym na lodzie. Reprezentuje to frakcję "surowych mitochondriów" dla proteomiki.
  18. Zbierz pozostałe trzy granulki w probówce o pojemności 1,5 ml w końcowej objętości 1 ml MB.

4. Oczyszczanie mitochondriów oparte na superparamagnetycznych przeciwciałach

UWAGA: Wykonaj wszystkie poniższe kroki w chłodni o temperaturze 4 °C.

  1. Przenieść 1 ml surowego preparatu mitochondrialnego z etapu 3.18 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodać 7 ml MB uzupełnionego 150 mM NaCl (MB + NaCl).
    UWAGA: Dodatek NaCl poprawia wiązanie przeciwciał i zmniejsza niespecyficzne wiązanie zanieczyszczeń z kulkami i mitochondriami.
  2. Dodać 50 μl kulek Tomm22 do 8 ml surowej zawiesiny mitochondriów (Rysunek 1D) i inkubować probówkę przez 15 minut w temperaturze 4 °C na obracającym się kole z niską prędkością.
    UWAGA: Koraliki Tomm22 są kowalencyjnie związane z przeciwciałami monoklonalnymi Tomm22 wyhodowanymi u myszy, sprzężonymi z kulkami superparamagnetycznymi.
  3. W międzyczasie umieść kolumnę na magnesie.
  4. Zrównoważyć kolumnę z 8 ml MB + NaCl i odrzucić przepływ.
  5. Po 15-minutowej inkubacji próbki w temperaturze 4 °C z kulkami Tomm22 przenieść próbkę do kolumny. Wyrzuć flowthrough.
    UWAGA: Mitochondria pozostaną przyczepione do kulek magnetycznych w kolumnie (Rysunek 1E).
  6. Przemyć kolumnę trzykrotnie 8 ml MB + NaCl.
  7. Wyjmij kolumnę z magnesu i umieść ją w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  8. Eluować mitochondria, dodając 1,5 ml MB + NaCl do kolumny i natychmiast zastosować tłok, aby wymyć oczyszczone mitochondria do probówki.
  9. Przenieść eluowane mitochondria do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować w temperaturze 21 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Utworzy się brązowa granulka. Zawiera izolowane mitochondria i niektóre kulki sprzężone z przeciwciałami (Rysunek 1F).
  10. Ostrożnie usunąć supernatant z osadu. Osad reprezentuje frakcję "czystych mitochondriów" dla proteomiki. Granulki te wraz z granulkami z etapów 3.4 i 3.17 mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C i są gotowe do dalszych zastosowań.

Wyniki

W niniejszym protokole przygotowywane są trzy próbki o rosnącym stopniu czystości mitochondriów: całkowita zawiesina komórek, surowe mitochondria („mito-crude”) oraz czyste mitochondria („mito-pure”) (Rycina 1). Oczyszczanie mitochondriów z linii komórkowej makrofagów RAW264.7 zwalidowano poprzez nałożenie równych ilości białka z każdej frakcji na żel i przeprowadzenie immunoblottingu; stwierdzono, że mitochondrialna syntaza cytrynianowa (Cs) ulegała wzbogaceniu na każdym etapie oczyszczania, podczas gdy białka z cytozolu (GAPDH), błony komórkowej (Na/K ATPase), jądra komórkowego (Lamin B), lizosomów (Lamp1) oraz retikulum endoplazmatycznego (ER) (Pdi) stopniowo znikały (Rycina 2A). Podobne wyniki uzyskano z wykorzystaniem BMDM. W celu dalszej walidacji czystości i integralności wyizolowanych mitochondriów przeprowadzono badanie mikroskopowe frakcji czystych mitochondriów za pomocą mikroskopii elektronowej. Zaobserwowano mitochondria o klasycznym owalnym kształcie i nienaruszonych grzebieniach, otoczone elektronowo gęstymi cząsteczkami odpowiadającymi koralcom pokrytym przeciwciałami (Rycina 2B). Można zatem wywnioskować, że nasz protokół prowadzi do wzbogacenia frakcji mitochondrialnej, usunięcia innych komponentów komórkowych i zachowania integralności strukturalnej mitochondriów.

Następnie przeprowadzono analizę proteomu każdej frakcji przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (LC/MS). Zidentyfikowano łącznie 6 248 białek w ekstrakcie z całkowitej populacji komórek, z czego 907 zostało wcześniej sklasyfikowanych jako mitochondrialne w inwentarzu MitoCarta3.05. Po odfiltrowaniu białek przy zastosowaniu progu co najmniej dwóch unikalnych peptydów, obliczono wynik wzbogacenia dla każdego białka w każdej próbce na podstawie ich intensywności w porównaniu do całkowitej populacji komórek. Następnie, korzystając z Gene Ontology (GO)16,17 oraz MitoCarta3.05 jako referencji, przypisano białka do siedmiu głównych przedziałów subkomórkowych: mitochondriów, ER, lizosomów, aparatu Golgiego, cytoszkieletu, jądra komórkowego i cytozolu. Co istotne, zaobserwowano średnie wzbogacenie białek mitochondrialnych ponad 10-krotne w surowych frakcjach mitochondrialnych i ponad 20-krotne w czystych frakcjach mitochondrialnych (Rycyna 2C). W przeciwieństwie do nich, składniki pozostałych sześciu analizowanych przedziałów komórkowych uległy usunięciu podczas procedury oczyszczania. Szczególną uwagę zwraca fakt, że w surowej frakcji mitochondrialnej zaobserwowano przejściowe wzbogacenie w białka ER i lizosomalne – dwie klasy białek zanieczyszczających często obecne po zastosowaniu protokołów wirowania różnicowego18. Mogło to wynikać z oddziaływań między organellami oraz podobnych współczynników sedymentacji, zwłaszcza w przypadku lizosomów, które występują w dużej liczbie w makrofagach19. Choć obie grupy zostały w większości usunięte po wychwycie immunologicznym, w czystej frakcji mitochondrialnej wykryto niewielki sygnał dla białek z miejsc kontaktu ER-mitochondria.

Następnie bezpośrednio porównaliśmy zawartość białek w całkowitych komórkach oraz w próbkach mito-pure, obserwując dwie odrębne populacje, odpowiadające białkom mitochondrialnym i niemitochondrialnym (Rycyna 2D). Podczas gdy ogromna większość białek z MitoCarta tworzyła jedną grupę, znaleźliśmy kilka (<5%), które grupowały się z białkami spoza MitoCarta. Białka te mogą reprezentować (1) cytozolowe białka oddziałujące z mitochondriami (nowa kategoria opisana w wersji 3.0 MitoCarta), (2) białka o podwójnej lokalizacji lub (3) białka błędnie adnotowane. Odwrotnie, znaleźliśmy kilka przypadków, w których białka spoza MitoCarta grupowały się z białkami mitochondrialnymi. Choć białka te mogą być zanieczyszczeniami powstałymi w procesie izolacji, mogą one również reprezentować białka, które nie zostały wcześniej sklasyfikowane jako obecne w mitochondriach.

Aby zbadać tę nową klasę potencjalnych białek mitochondrialnych, zastosowano proteomikę subtrakcyjną – podejście, które okazało się użyteczne w odkrywaniu proteomów organelli, w tym mitochondriów6,12zastosowano. Proteomika subtraktywna zakłada, że podczas etapów oczyszczania powinno dojść do wzbogacenia frakcji mitochondriów oraz usunięcia zanieczyszczeń6Na przykład, podczas gdy zanieczyszczenia mogą gromadzić się podczas centryfugacji różnicowej (np. ze względu na podobne właściwości sedymentacyjne) lub podczas wychwytu immunologicznego (np. z powodu niespecyficznego wiązania przeciwciał), jedynie bona fide białka mitochondrialne powinny znacząco kumulować się w obu próbkach. Możliwe jest zatem odfiltrowanie białek, które zostały znalezione we frakcji czystych mitochondriów, ale wykazywały niespójne wzorce wzbogacenia. W niniejszym przykładzie z wykorzystaniem komórek RAW264.7, poprzez ustawienie progu dla unikalnych peptydów na poziomie ≥1 dla próbek mito-crude i mito-pure oraz zastosowanie rygorystycznych progów wzbogacenia, udało nam się zawęzić listę odzyskanych proteomów mitochondrialnych z 1127 białek początkowo znalezionych w surowej frakcji mitochondrialnej po wirowaniu różnicowym do 481 białek po drugiej rundzie oczyszczania z wykorzystaniem immunoselekcji Tomm22. Zmniejszona liczba białek adnotowanych w MitoCarta we frakcji mito-pure odzwierciedla wysoką rygorystyczność zastosowanych kryteriów selekcji. Co ciekawe, 70 białek obecnych we frakcji mito-pure nie znajdowało się w inwentarzu MitoCarta3.0 (Rysunek 3A, BTe ostatnie białka mogą stanowić potencjalne nowe białka kandydackie mitochondriów, które mogą być eksprymowane wyłącznie w linii komórkowej makrofagów RAW264.7 oraz w komórkach pokrewnych i które zasługują na dalsze badania.

Schemat procesu oczyszczania mitochondriów; etapy wirowania; separacja jąder; sortowanie magnetyczne.
Rysunek 1: Ilustracja dwuetapowego protokołu izolacji mitochondriów bez użycia znaczników. (A) Zawiesina komórkowa jest rozbijana przez igłę 25 G. (B) Jądra i całe komórki są oddzielane poprzez wirowanie przy 2,000 x g , a nadosad jest zbierany. (C) Surowe mitochondria są izolowane poprzez wirowanie różnicowe nadosadu przy 13,000 x g (mito-crude). (D) Surowe mitochondria są następnie inkubowane z przeciwciałami przeciwko Tomm22 (Ab) kowalencyjnie związanymi z kuleczkami superparamagnetycznymi. (E) Kompleksy mitochondria-przeciwciało Tomm22-kuleczki są oddzielane od zanieczyszczeń przy użyciu kolumn magnetycznych i eluowane. (F) Czyste mitochondria są zbierane i zagęszczane przez wirowanie (mito-pure). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Analiza obfitości białek; zawiera wyniki immunoblottingu, mikroskopię elektronową, wykres ilościowy, wykres rozrzutu.
Rycina 2. Reprezentatywne wyniki izolacji mitochondriów z dwóch źródeł makrofagów. (A) Analiza immunoblottingowa białek komórek RAW264.7 (góra) i BMDM (dół) z użyciem przeciwciał przeciwko mitochondrialnej syntazie cytrynianowej (Cs – mitochondria), dehydrogenazie gliceraldo-3-fosforanowej (Gapdh – cytozol), pompie sodowo-potasowej (Na/K ATPase – błona plazmatyczna), laminie B (Lamin B – jądro), białku błony lizosomalnej 1 (Lamp1 – lizosom) oraz białkowej izomerazie disiarczkowej (Pdi – ER). (B) Mikroskopia elektronowa oczyszczonych mitochondriów z komórek RAW264.7. Cząstki o wysokiej gęstości otaczające mitochondria odpowiadają kuleczkom Tomm22, które pozostają w próbkach mito-pure po elucji z kolumn. Paski skali: 80 nm. (C) Wyniki wzbogacenia dla całkowitej liczby komórek, frakcji mito-crude i mito-pure z siedmiu przedziałów komórkowych w komórkach RAW264.7. Do adnotacji białek wykorzystano MitoCarta3.0 i GO; przedstawiono średnie wyniki. Skrót: ER = retikulum endoplazmatyczne. (D) Wartości obfitości białek (riBAQ) dla białek w całkowitych komórkach i próbkach mito-pure z komórek RAW264.7. Białka z MitoCarta3.0 zaznaczono kolorem pomarańczowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces wzbogacania białek mitochondrialnych; schemat i wykres przedstawiające stopień wzbogacenia i obfitość.
Rycina 3. Odkrywanie nowych białek mitochondrialnych z wykorzystaniem proteomiki subtraktywnej. (A) Strategia proteomiki subtraktywnej w celu odkrycia nowych białek mitochondrialnych. Zastosowano wysokie progi selekcji (4x i 2x), aby zminimalizować wybór wyników fałszywie dodatnich. (B) Wydajność wzbogacenia (krotność w stosunku do całkowitej liczby komórek) nowych kandydackich białek mitochondrialnych, które nie zostały wcześniej adnotowane w inwentarzu MitoCarta3.0. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Połączyliśmy wirowanie różnicowe i wychwytywanie immunologiczne, aby osiągnąć lepszą czystość izolacji mitochondriów. Nasza procedura umożliwia dostęp do materiału pierwotnego w celu identyfikacji i charakterystyki nowych białek mitochondrialnych. Protokół jest prosty i solidny i może być stosowany do linii komórkowych, komórek pierwotnych i tkanek bez konieczności modyfikacji genetycznej. Zwalidowaliśmy nasz protokół poprzez analizy immunoblottingowe i proteomiczne na próbkach pobranych na różnych etapach procedury oczyszczania.

W porównaniu z metodami pojedynczej izolacji, połączenie etapów wzbogacania o różnym charakterze - w tym przypadku wirowania i znakowania immunologicznego - generuje bardziej niezawodny protokół izolacji mitochondriów. Dzieje się tak dlatego, że podczas gdy białka mitochondrialne zostaną wzbogacone w obu oczyszczaniach, jest mało prawdopodobne, aby zanieczyszczenia również zostały wzbogacone po obu etapach wzbogacania. Chociaż wysoką czystość mitochondriów można również osiągnąć poprzez ultrawirowanie w gradionym gradiencie gęstości, takie podejście wymaga dużej ilości materiału wyjściowego i dostępu do ultrawirówki. Wreszcie, w przeciwieństwie do najnowszych metod opartych na izolacji mitochondriów opartej na znacznikach20, nasze podejście nie wymaga modyfikacji genetycznej próbki, dzięki czemu nadaje się ona do materiału pierwotnego z dowolnego źródła.

Pewne względy techniczne i biologiczne muszą być brane pod uwagę w projekcie eksperymentalnym podczas stosowania naszego protokołu. (1) Ilość materiału wyjściowego ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wystarczającej ilości materiału. Nieuchronnie niewielka liczba mitochondriów zostanie utracona podczas homogenizacji (krok 3.10), ponieważ nie wszystkie komórki są poddawane lizie, lub podczas płukania trzech kolumn (krok 4.6). Podczas gdy nasz protokół koncentruje się na czystości, a nie na wydajności, skuteczność izolacji mitochondriów, a tym samym ich wydajność, nie została zmierzona ani zoptymalizowana. Oczekuje się, że użycie większej liczby koralików Tomm22 i większej liczby kolumn zwiększy wydajność odzyskiwania mitochondriów. Jednocześnie dokładna optymalizacja etapu homogenizacji może również prowadzić do poprawy wydajności mitochondriów. Ten protokół i początkowe numery komórek, które podajemy tutaj dla komórek RAW264.7 i BMDM, są odpowiednie dla proteomiki i mogą być dostosowane do innych zastosowań. W przypadku pierwotnych BMDM stwierdziliśmy, że pojedyncza mysz była wystarczająca do jednej replikacji. W razie potrzeby procedurę można zwiększyć w celu wyizolowania BMDM od wielu zwierząt, które następnie można połączyć w celu uzyskania wystarczającej ilości materiału. Liczba komórek można zoptymalizować w zależności od typu komórki, jej wielkości i zawartości mitochondriów. (2) Tomm22 ulega ekspresji w mitochondriach ze wszystkich typów komórek i tkanek21, ale jego poziom ekspresji może się różnić. Dlatego podczas projektowania eksperymentu w celu porównania różnych warunków ważne jest, aby upewnić się, że poziomy ekspresji Tomm22 są porównywalne. Ponadto, ze względu na wszechobecną ekspresję Tomm22, nie jest możliwe badanie specyficznych dla typu komórki białek mitochondrialnych w złożonych tkankach. (3) Czas niezbędny do wytworzenia czystych mitochondriów (około 2,5 godziny) jest niezgodny z badaniem zdarzeń przejściowych, takich jak zmiany w profilach metabolicznych. W takim przypadku zalecamy bezpośrednie wychwytywanie immunologiczne na podstawie znaczników9, które umożliwia również badanie mitochondriów specyficznych dla typu komórki in vivo20. (4) Chociaż badania na izolowanych mitochondriach uzyskanych przy użyciu samych kulek znakowanych przeciwciałem Tomm22 wykazały aktywność w testach funkcjonalnych11, pozostaje do ustalenia, czy mitochondria wygenerowane za pomocą naszego protokołu są zgodne z dalszymi testami opartymi na aktywności. MitoTracker lub barwienie nadchloranem metylu tetrametylorodaminy (TMRM) lub pomiary respirometryczne są potencjalnymi podejściami do ilościowego określania funkcjonalności izolowanych mitochondriów22. (5) Po wyluzowaniu "mito-czystej" próbki z kolumny, niektóre kulki Tomm22 będą obecne w czystej frakcji mitochondriów (Figura 2B). Chociaż nie zaobserwowaliśmy żadnych zakłóceń w trawieniu trypsyny i spektrometrii mas białek, obecność tych kulek i immunoglobulin powinna być brana pod uwagę w innych dalszych zastosowaniach. Przeciwciało Tomm22 jest przeciwciałem monoklonalnym wytwarzanym u myszy23, dlatego ważne jest, aby pamiętać, że podczas stosowania przeciwciał drugorzędowych przeciwko myszom w immunoblottingu będzie generować niespecyficzne prążki o wielkości łańcuchów immunoglobulin. (6) Całkowita homogenizacja zawiesiny komórkowej jest kluczem do pomyślnej izolacji mitochondriów. Tutaj używamy strzykawki z igłą 25 G do lizy zarówno komórek RAW264.7, jak i BMDM. Jednak w zależności od typu ogniwa i jego wielkości, inne metody homogenizacji mechanicznej, takie jak homogenizator Dounce lub bardziej kontrolowane podejścia, takie jak urządzenia do homogenizacji komórek, mogą być bardziej odpowiednie. Można również rozważyć niemechaniczne metody homogenizacji, takie jak delikatna sonikacja. Podejścia do homogenizacji tkanek są szerzej omówione w innych badaniach24,25. (7) Chociaż walidacja za pomocą immunoblottingu jest najprostszą i tańszą metodą, jej wyniki nie zawsze muszą korelować ze zmianami na poziomie całych organelli. Dlatego zalecamy stosowanie proteomiki, aby w pełni zweryfikować wzbogacenie lub zubożenie odpowiednio mitochondriów i innych organelli.

Opisany tutaj dwuetapowy protokół oczyszczania mitochondriów pozwolił nam wygenerować sekwencyjne próbki o rosnącej czystości mitochondriów, a to umożliwiło nam odkrycie nowych kandydatów na białka mitochondrialne poprzez proteomikę subtraktywną12. Do naszej analizy używamy rygorystycznych progów do selekcji znacznie wzbogaconych białek mitochondrialnych i chociaż może to nie zidentyfikować niektórych znanych białek mitochondrialnych (Figura 3A), odsetek wyników fałszywie dodatnich dla odkrycia nowych białek mitochondrialnych jest zmniejszony. Niemniej jednak ważne jest, aby podkreślić, że wszelkie białka kandydujące ujawnione przez nasz protokół muszą zostać zweryfikowane za pomocą podejść ortogonalnych. Zalecamy znakowanie karboksylowo-końcowym GFP lub stosowanie przeciwciał przeciwko endogennemu białku w celu walidacji związku z mitochondriami pod mikroskopem lub za pomocą testów ochrony proteazy.

Bezpośrednie zastosowanie naszej metody w przypadku niezmodyfikowanych komórek i tkanek stanowi potężne narzędzie do zbadania, w jaki sposób mitochondria zmieniają się i przystosowują do swojego środowiska w warunkach zdrowych i chorobowych. Zastosowanie naszego protokołu do linii komórkowych, modeli chorób zwierzęcych, płynów ludzkich, a nawet biopsji chirurgicznych może okazać się szczególnie przydatne w pogłębieniu naszej wiedzy na temat mitochondriów i związanych z nimi zaburzeń.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Manfredo Quadroni, Zakładowi Analizy Białek oraz Ośrodku Mikroskopii Elektronowej Uniwersytetu w Lozannie za pomoc. Dziękujemy również H.G. Sprengerowi, K. Maundrellowi i członkom laboratorium Jourdain za rady i opinie na temat manuskryptu. Prace te były wspierane przez Fundację Pierre-Mercier pour la Science oraz Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (grant projektu 310030_200796).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 1 mlBD Plastipal309628
Igła 25 G BD Microlance300400
40 µ m Sitko komórkoweCorning352340
Anti-TOM22 Mikrogranulki, myszMiltenyi Biotec130-127-693
Skrobak do komórekFisherScientific11577692
DMEM, wysoka glukoza, GlutaMAXThermoFisher31966
Kwas etylenodiaminotetraoctowyFisherScientificBP-120-1
Surowica bydlęca płoduGibco10270
HEPESBioConcept5-31F00-H
LS kolumny i tłokiMiltenyi Biotec130-042-401
Czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagówImmunotools12343115 
MannitolSigmaM4125
Chlorek soduSigma71380
SacharozaSigmaS1888
Penicylina/StreptomycynaBioConcept4-01F00-H
Szalki PetriegoCorningBH93B-102
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami 10XEurobio ScientificCS3PBS01-01
Separator QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976
Analizator żywotności komórek Vi-CELL BLU BeckmanCoulterC19196

Bibliografia

  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
  3. Chakrabarty, R. P., Chandel, N. S. Mitochondria as signaling organelles control mammalian stem cell fate. Cell Stem Cell. 28 (3), 394-408 (2021).
  4. Morgenstern, M., et al. Quantitative high-confidence human mitochondrial proteome and its dynamics in cellular context. Cell Metabolism. 33 (12), 2464-2483 (2021).
  5. Rath, S., et al. MitoCarta3.0: an updated mitochondrial proteome now with sub-organelle localization and pathway annotations. Nucleic Acids Research. 49, D1541-D1547 (2021).
  6. Pagliarini, D. J., et al. A mitochondrial protein compendium elucidates complex I disease biology. Cell. 134 (1), 112-123 (2008).
  7. Diaz-Vegas, A., et al. Is mitochondrial dysfunction a common root of noncommunicable chronic diseases. Endocrine Reviews. 41 (3), 005(2020).
  8. Bury, A. G., Vincent, A. E., Turnbull, D. M., Actis, P., Hudson, G. Mitochondrial isolation: when size matters. Wellcome Open Research. 5, 226(2020).
  9. Chen, W. W., Freinkman, E., Sabatini, D. M. Rapid immunopurification of mitochondria for metabolite profiling and absolute quantification of matrix metabolites. Nature Protocols. 12 (10), 2215-2231 (2017).
  10. Daniele, J. R., Heydari, K., Arriaga, E. A., Dillin, A. Identification and characterization of mitochondrial subtypes in Caenorhabditis elegans via analysis of individual mitochondria by flow cytometry. Analytical Chemistry. 88 (12), 6309-6316 (2016).
  11. Franko, A., et al. Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads. PLoS One. 8 (12), e82392(2013).
  12. Yates, J. R., Gilchrist, A., Howell, K. E., Bergeron, J. J. M. Proteomics of organelles and large cellular structures. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (9), 702-714 (2005).
  13. Trouplin, V., et al. marrow-derived macrophage production. Journal of Visualized Experiments. (81), e50966(2013).
  14. Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. Journal of Visualized Experiments. (76), e50323(2013).
  15. Toda, G., Yamauchi, T., Kadowaki, T., Ueki, K. Preparation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice for functional analysis. STAR Protocols. 2 (1), 100246(2020).
  16. Gene Ontology Consortium. The Gene Ontology resource: enriching a GOld mine. Nucleic Acids Research. 49, D325-D334 (2021).
  17. Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), 25-29 (2000).
  18. Hartwig, S., et al. A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation. Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).
  19. Delamarre, L., Pack, M., Chang, H., Mellman, I., Trombetta, E. S. Differential lysosomal proteolysis in antigen-presenting cells determines antigen fate. Science. 307 (5715), 1630-1634 (2005).
  20. Bayraktar, E. C., et al. MITO-Tag mice enable rapid isolation and multimodal profiling of mitochondria from specific cell types in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (1), 303-312 (2019).
  21. Nusinow, D. P., et al. Quantitative proteomics of the cancer cell line encyclopedia. Cell. 180 (2), 387-402 (2020).
  22. Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
  23. Hornig-Do, H. T., et al. Isolation of functional pure mitochondria by superparamagnetic microbeads. Analytical Biochemistry. 389 (1), 1-5 (2009).
  24. Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Methods in Cell Biology. 155, 3-31 (2020).
  25. Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods in Enzymology. 457, 349-372 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja mitochondriówwirowanie różnicowewychwytywanie immunologicznespektrometria masproteom mitochondrialnykwantyfikacja białekproteomika subtraktywnametabolizm energetycznyfunkcja mitochondrialnakomórki pierwotne
Dwuetapowa izolacja mitochondriów bez znaczników w celu lepszego odkrywania białek i kwantyfikacji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.