Dwuetapowa izolacja mitochondriów bez znaczników w celu lepszego odkrywania białek i kwantyfikacji

Podsumowanie

Prezentujemy dwuetapowy protokół wysokiej jakości izolacji mitochondriów, który jest zgodny z odkrywaniem białek i kwantyfikacją w skali proteomu. Nasz protokół nie wymaga inżynierii genetycznej, a zatem nadaje się do badania mitochondriów z dowolnych pierwotnych komórek i tkanek.

Streszczenie

Większość procesów fizjologicznych i chorobowych, od centralnego metabolizmu, przez odpowiedź immunologiczną, po neurodegenerację, obejmuje mitochondria. Proteom mitochondrialny składa się z ponad 1000 białek, a obfitość każdego z nich może zmieniać się dynamicznie w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne lub podczas postępu choroby. W tym miejscu opisujemy protokół izolowania wysokiej jakości mitochondriów z pierwotnych komórek i tkanek. Dwuetapowa procedura obejmuje (1) homogenizację mechaniczną i wirowanie różnicowe w celu wyizolowania surowych mitochondriów oraz (2) immunologiczne wychwytywanie mitochondriów bez znaczników w celu wyizolowania czystych organelli i wyeliminowania zanieczyszczeń. Białka mitochondrialne z każdego etapu oczyszczania są analizowane za pomocą ilościowej spektrometrii mas i obliczane są wydajności wzbogacania, co pozwala na odkrycie nowych białek mitochondrialnych za pomocą proteomiki subtraktywnej. Nasz protokół zapewnia czułe i kompleksowe podejście do badania zawartości mitochondriów w liniach komórkowych, komórkach pierwotnych i tkankach.

Wprowadzenie

Mitochondria to złożone i dynamiczne organelle zdolne do wykrywania i dostosowywania się do potrzeb metabolicznych komórki. Kluczowe dla złożoności metabolizmu komórkowego mitochondria działają jako węzły metaboliczne, w których zbiegają się reakcje metabolizmu węglowodanów, białek, lipidów, kwasów nukleinowych i kofaktorów¹. Służą również jako organelle sygnałowe dla szlaków wrodzonej odpowiedzi immunologicznej oraz w odpowiedzi na zmiany w jonach i reaktywnych formach tlenu^2,3. Do tej pory około 1100 białek zostało zmapowanych do mitochondriów^4,5,6, ale możemy założyć, że do odkrycia pozostaje jeszcze wiele innych, zwłaszcza tych ulegających ekspresji tylko w określonych typach komórek lub przejściowo w określonych warunkach środowiskowych. Opracowanie nowych podejść do ilościowego określania zmian w składzie mitochondriów w interesujących stanach metabolicznych zwiększy naszą wiedzę na temat tych organelli i wskaże nowe możliwości terapeutyczne dla zaburzeń charakteryzujących dysfunkcję mitochondriów⁷.

Obecnie dostępne są różne protokoły izolacji mitochondriów, o różnych wydajnościach i poziomach czystości⁸. Podejścia oparte na wirowaniu są najbardziej popularne ze względu na ich prostotę i niski koszt. Chociaż wirowanie różnicowe nadaje się do większości zastosowań, ma tę wadę, że pozwala uzyskać niższą czystość mitochondriów i wymaga dużych ilości materiału wyjściowego, gdy stosowane są bardziej złożone aplikacje oparte na gradientach gęstości. W ostatnich latach pojawiły się nowe metody izolacji mitochondriów, takie jak wychwytywanie immunologiczne oparte na znacznikach ("MITO-IP")⁹ i sortowanie organelli aktywowane fluorescencją¹⁰. Chociaż obie procedury mogą generować próbki o wysokiej czystości, pierwsza z nich wymaga inżynierii genetycznej do oznaczania mitochondriów w celu oczyszczenia powinowactwa, co sprawia, że protokoły są niekompatybilne z pierwotnym materiałem pochodzącym z niezmodyfikowanych organizmów lub ludzkich dawców. Tymczasem ta ostatnia jest uzależniona od dostępu do cytometrii przepływowej i przyrządów sortujących. Połączenie różnych metod izolacji daje nadzieję na wygenerowanie bardziej niezawodnych protokołów i zwiększoną czystość.

Tutaj prezentujemy nowy protokół izolacji mitochondriów oparty na połączeniu dwóch istniejących metod: (1) wirowania różnicowego w celu wyizolowania surowej frakcji mitochondrialnej oraz (2) bezznacznikowego immunologicznego wychwytywania mitochondriów za pomocą superparamagnetycznych kulek kowalencyjnie związanych z przeciwciałami przeciwko translokazie zewnętrznej błony mitochondrialnej 22 (Tomm22)¹¹, wszechobecne białko mitochondrialne błony zewnętrznej (Rysunek 1). Opisana przez nas procedura jest kompatybilna z ilościową spektrometrią mas białek, a ponieważ nie zawiera znaczników i nie wymaga manipulacji genetycznej, może być stosowana do szerokiego zakresu modeli badawczych, od linii komórkowych, przez płyny ustrojowe, po całe tkanki zwierzęce. Co więcej, zastosowanie dwóch kroków w protokole umożliwia wykorzystanie proteomiki subtraktywnej^6,12 w celu odkrycia nowych białek mitochondrialnych i badania ich ekspresji.

Protokół

Rękawice muszą być noszone przez cały czas, a etapy hodowli komórkowej wykonywane pod kapturem z przepływem laminarnym. Komórki są utrzymywane w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 .} Badania przedstawione w tym protokole zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Uniwersytetu w Lozannie i Szwajcarii dotyczącymi wykorzystywania zwierząt.

1. Hodowla linii komórkowej makrofagów RAW264.7

1. Hoduj komórki makrofagów myszy RAW264.7 w zmodyfikowanym pożywce orła (DMEM) firmy Dulbecco z wysoką glukozą i glutaminą uzupełnioną 5% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (HI-FBS) i 100 j.m./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (P / S).
   UWAGA: Do wyizolowania mitochondriów wystarczy pojedyncza zlewająca się płytka o średnicy 15 cm (około 70 x 10⁷ komórek RAW264.7).
2. Utrzymuj komórki RAW264.7 na płytkach do hodowli tkankowych. Początkowa gęstość wysiewu 1 x 10⁵ komórek/ml prowadzi do zlewającej się płytki w ciągu 3 dni. Użyj 25 ml zawiesiny komórek w pożywce na płytkę o średnicy 15 cm. Komórki RAW264.7 mają wysoki współczynnik podziałów komórkowych i muszą być dzielone częściej niż większość linii komórkowych.
3. Odłączanie ogniw RAW264.7
   1. Odessać pożywkę i raz przepłukać komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
   2. Na płytkę o średnicy 15 cm dodać 8 ml ciepłego buforu dysocjacyjnego RAW (270 mM chlorku potasu, 30 mM dwuwodnego cytrynianu sodu w_H2O, sterylnie przefiltrowany) i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
   3. Dodać równoważną objętość pożywki do płytek (rozcieńczenie buforu dysocjacyjnego w stosunku 1:1) i odpipetować w celu odłączenia i homogenizacji komórek.
   4. Przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki i odwirować probówkę o masie 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
   5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości pożywki (opisanej w kroku 1.1) do zliczania komórek.
      UWAGA: Można zastosować inne metody odłączania ogniw RAW264.7, takie jak trypsyna lub skrobak do komórek. Jednak metody te są ostrzejsze dla komórek i mogą prowadzić do ich polaryzacji do makrofagów podobnych do M1 w ciągu kilku dni po odłączeniu.

2. Izolacja i hodowla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM)

UWAGA: Opisany tutaj protokół jest przeznaczony dla pojedynczej myszy i może być skalowany w górę dla wielu myszy. Szczegółowe protokoły izolacji i hodowli BMDM zostały opisane w innym miejscu^13,14.

1. Poświęć 8-12-tygodniową mysz C57BL/6 z wysoką dawką CO₂,
   UWAGA: Można użyć myszy płci męskiej lub żeńskiej.
2. Spryskaj mysz 75% etanolem, aby ją wysterylizować.
3. Przeanalizuj i zbierz biodra, kości udowe i piszczele z mouse¹⁵.
4. Aby pobrać szpik kostny z kości udowych i piszczelowych, usuń koniec stawu kolanowego z obu kości¹⁵. Odzyskaj szpik kostny z bioder poprzez usunięcie panewki.
5. Przenieś kości do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z 4 ml pożywki BMDM trzymanej na lodzie (DMEM z wysoką glukozą i glutaminą uzupełnioną 5% HI-FBS, P/S i 10 mM HEPES).
   UWAGA: Ważne jest, aby utrzymać kości w podłożu, aby uniknąć wysuszenia szpiku kostnego podczas sekcji.
6. Dodaj 4 ml PBS i 4 ml ciepłej pożywki BMDM do dwóch różnych dołków na płytce 6-dołkowej.
7. Przenieść kości i podłoże z probówki stożkowej o pojemności 50 ml do pustego dołka płytki 6-dołkowej.
8. Za pomocą kleszczy przenieś kości do PBS, aby je umyć.
9. Przenieś kości do studzienki zawierającej ciepłą pożywkę BMDM.
10. Wykonaj otwór o średnicy 1-2 mm na dnie dwóch probówek o pojemności 0,5 ml za pomocą kleszczyków i umieść je w probówce o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: W tym szybkim kroku nie jest konieczne dodawanie nośnika do tuby.
11. W każdej probówce o pojemności 0,5 ml umieść kość udową, piszczelową i biodro w taki sposób, aby szpik kostny odsłoniętych kości był skierowany w stronę dolnej części probówek.
12. Odwirować probówki o masie 13 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, aby zebrać szpik kostny i resztki pożywki przez otwór w probówce 0,5 ml i do probówki o pojemności 1,5 ml. Wyrzuć probówki o pojemności 0,5 ml z kośćmi.
13. Zawiesić granulki szpiku kostnego w pożywce BMDM i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
14. Dodaj pożywkę BMDM do 10 ml.
15. Umieść sitko o wielkości 40 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml i przefiltruj przez nie zawiesinę szpiku kostnego.
16. Odwirować przefiltrowaną zawiesinę o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby odzyskać nienaruszone komórki i usunąć drobne zanieczyszczenia z zawiesiny komórek.
17. Przygotować 70 ml pożywki BMDM uzupełnionej 50 ng/ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF).
18. Zawiesić osad w 10 ml pożywki BMDM uzupełnionej M-CSF.
19. Dodać 9 ml pożywki BMDM uzupełnionej M-CSF do każdej z siedmiu 10-centymetrowych szalek Petriego.
20. Umieść 1 ml komórek (około 1 x 10 7 komórek) w każdej z siedmiu 10-centymetrowych szalek Petriego.
21. Homogenizować zawiesinę komórkową w każdej płytce, ostrożnie pipetując płytkę w górę i w dół, a następnie przenieść płytki do inkubatora.
22. Po 3 dniach dodaj 5 ml ciepłej pożywki BMDM uzupełnionej 50 ng/ml M-CSF do każdej płytki.
23. Po 3 dniach (6 dzień, po izolacji szpiku kostnego) sprawdzić adhezję i różnicowanie BMDM pod mikroskopem.
    UWAGA: W tym momencie możliwe jest bezpośrednie przejście do izolacji mitochondriów (krok 3). Alternatywnie można ponownie platerować BMDM, co pozwala na leczenie ich cytokinami i małymi cząsteczkami.
24. Odłączanie BMDM
    1. Odessać pożywkę z każdej płytki i dodać 7 ml zimnego PBS uzupełnionego 5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).
    2. Inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez 7-8 minut.
    3. Odłącz BMDM, ostrożnie pipetując w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
    4. Połączyć zawieszone BMDM ze wszystkich siedmiu płytek w jednej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i wirować przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 40 ml ciepłej pożywki BMDM do zliczania komórek.
       UWAGA: Na jedną mysz uzyskuje się od 7 do 9 x 10^{7 BMDM}. W proteomice zaleca się co najmniej 6 x 10⁷ BMDM do izolacji mitochondriów.
    6. W razie potrzeby płytkę i potraktuj BMDM zgodnie z celem eksperymentalnym. Jeśli nie, przejdź bezpośrednio do kroku 3.3.

3. Przygotowanie surowej frakcji mitochondrialnej przez wirowanie różnicowe

UWAGA: Wykonaj wszystkie etapy wirowania w temperaturze 4 °C. Wymagane są dwie wirówki, jedna z odchylanym wirnikiem i adapterami do probówek stożkowych o względnej sile odśrodkowej co najmniej 300 x g, druga o względnej sile odśrodkowej co najmniej 21 000 x g, odpowiednia do probówek o pojemności 1,5 ml. Używając komórek przylegających, użyj skrobaka do komórek.

1. W przypadku komórek przylegających należy odessać pożywkę i dodać 10 ml PBS na 15 cm płytkę.
   UWAGA: Skrobanie komórek w PBS pozwala na ich jednoczesne mycie. Jeśli komórki znajdują się już w zawiesinie, przejdź bezpośrednio do kroku 3.3.
2. Odłącz komórki za pomocą skrobaka do komórek i umieść je w jednej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Homogenizować zawiesinę komórkową, pipetując w górę i w dół.
   UWAGA: Komórki można odłączyć za pomocą skrobaka do komórek, ponieważ jest to szybsze i wkrótce potem zostaną poddane lizie.
3. Dla każdego warunku doświadczalnego przenieś 5% objętości zawiesiny komórek do probówki o pojemności 1,5 ml i odwiruj ją przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Używając ogniw zawiesinowych, należy wcześniej umyć je raz PBS, aby usunąć ewentualne zanieczyszczenia z nośników, takich jak FBS.
4. Odrzucić supernatant i pozostawić osad na lodzie.
   UWAGA: Będzie to reprezentować frakcję "całkowitej komórki" dla proteomiki.
5. Pozostałe próbki z etapu 3.1 lub 3.2 odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
6. Wykonaj wszystkie poniższe czynności na lodzie i przy użyciu lodowatych.
7. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml lodowatego buforu mitochondrialnego (MB) (210 mM mannitolu, 70 mM sacharozy, 10 mM HEPES/NaOH [pH 7,4] i 1 mM EDTA).
8. Odzyskać komórki przez odwirowanie w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
9. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 0,5 ml zimnego MB i przenieść go do probówki o pojemności 1,5 ml.
   UWAGA: Ta procedura daje przybliżone stężenie komórek 1,5 x 10⁸ komórek BMDM/ml lub 3 x 10⁸ komórek RAW264,7/ml.
10. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę 25 G, homogenizować zawiesinę komórkową przez 30 przejść przez igłę (Rysunek 1A).
11. Dodaj 1 ml zimnego MB do probówki i wymieszaj przez odwrócenie. Odwirować homogenizowaną zawiesinę komórkową o stężeniu 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
12. Przenieść 1 ml supernatantu do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml na lodzie, nie naruszając osadu komórkowego. Ponownie zawiesić osad komórkowy i ponownie go homogenizować, jak w kroku 3.7.
13. Zebrać homogenizowane osady komórkowe i supernatant z dwóch poprzednich etapów w jednej probówce o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: W tym momencie osad zawiera głównie jądra i nieuszkodzone komórki i jest odrzucany. Supernatant zawiera szczątki komórkowe, cytozol i organelle, w tym mitochondria (Rysunek 1B).
14. Podzielić supernatant na cztery probówki o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Podział supernatantu na wiele probówek na tym etapie poprawia usuwanie zanieczyszczeń w kolejnych krokach.
15. Dodać MB, aby uzyskać końcową objętość 1 ml w każdej z czterech probówek. Wymieszać przez odwrócenie i odwirować probówki o stężeniu 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Po tym kroku widoczny jest pellet z dwiema warstwami. Dolna, twarda, brązowa osadka zawiera mitochondria i jest przechowywana do dalszego oczyszczania (Rysunek 1C). Górna, luźna, biała osadka zawiera inne struktury komórkowe i może zostać wyrzucona.
16. Wykonaj ten krok ostrożnie. Usunąć supernatant z jak największą ilością białego górnego osadu. Poprzez delikatne pipetowanie na nim możliwe jest ponowne zawieszenie białej granulki, a następnie wyrzucenie jej, pozostawiając brązową osadkę mitochondrialną w stanie nienaruszonym.
17. Trzymaj jedną z czterech probówek z osadem mitochondrialnym na lodzie. Reprezentuje to frakcję "surowych mitochondriów" dla proteomiki.
18. Zbierz pozostałe trzy granulki w probówce o pojemności 1,5 ml w końcowej objętości 1 ml MB.

4. Oczyszczanie mitochondriów oparte na superparamagnetycznych przeciwciałach

UWAGA: Wykonaj wszystkie poniższe kroki w chłodni o temperaturze 4 °C.

1. Przenieść 1 ml surowego preparatu mitochondrialnego z etapu 3.18 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodać 7 ml MB uzupełnionego 150 mM NaCl (MB + NaCl).
   UWAGA: Dodatek NaCl poprawia wiązanie przeciwciał i zmniejsza niespecyficzne wiązanie zanieczyszczeń z kulkami i mitochondriami.
2. Dodać 50 μl kulek Tomm22 do 8 ml surowej zawiesiny mitochondriów (Rysunek 1D) i inkubować probówkę przez 15 minut w temperaturze 4 °C na obracającym się kole z niską prędkością.
   UWAGA: Koraliki Tomm22 są kowalencyjnie związane z przeciwciałami monoklonalnymi Tomm22 wyhodowanymi u myszy, sprzężonymi z kulkami superparamagnetycznymi.
3. W międzyczasie umieść kolumnę na magnesie.
4. Zrównoważyć kolumnę z 8 ml MB + NaCl i odrzucić przepływ.
5. Po 15-minutowej inkubacji próbki w temperaturze 4 °C z kulkami Tomm22 przenieść próbkę do kolumny. Wyrzuć flowthrough.
   UWAGA: Mitochondria pozostaną przyczepione do kulek magnetycznych w kolumnie (Rysunek 1E).
6. Przemyć kolumnę trzykrotnie 8 ml MB + NaCl.
7. Wyjmij kolumnę z magnesu i umieść ją w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
8. Eluować mitochondria, dodając 1,5 ml MB + NaCl do kolumny i natychmiast zastosować tłok, aby wymyć oczyszczone mitochondria do probówki.
9. Przenieść eluowane mitochondria do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować w temperaturze 21 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Utworzy się brązowa granulka. Zawiera izolowane mitochondria i niektóre kulki sprzężone z przeciwciałami (Rysunek 1F).
10. Ostrożnie usunąć supernatant z osadu. Osad reprezentuje frakcję "czystych mitochondriów" dla proteomiki. Granulki te wraz z granulkami z etapów 3.4 i 3.17 mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C i są gotowe do dalszych zastosowań.

Wyniki

W obecnym protokole generowane są trzy próbki o rosnącym stopniu czystości mitochondrialnej: całkowita liczba komórek, surowe mitochondria ("mito-surowe") i czyste mitochondria ("mito-czyste") (Rysunek 1). Zwalidowaliśmy oczyszczanie mitochondriów z linii komórkowej makrofagów RAW264.7 poprzez ładowanie równych ilości białka każdej frakcji na żel i immunoblotting i stwierdziliśmy, że syntaza cytrynianu mitochondrialnego (Cs) była wzbogacana na każdym etapie oczyszczania; tymczasem białka z cytozolu (GAPDH), błony plazmatycznej (ATPaza Na/K), jądra (Lamina B), lizosomów (Lamp1) i retikulum endoplazmatycznego (ER) (Pdi) stopniowo zanikały (Figura 2A). Podobne wyniki uzyskano przy użyciu BMDM. W celu dalszej walidacji czystości i integralności izolowanych mitochondriów przeprowadzono mikroskopię elektronową na czystej frakcji mitochondrialnej. Zaobserwowaliśmy mitochondria o klasycznym owalnym kształcie i nienaruszonych grzebieniach otoczonych cząstkami o dużej gęstości elektronów odpowiadającymi kulkom pokrytym przeciwciałem (Figura 2B). Dlatego można stwierdzić, że nasz protokół wzbogaca mitochondria, zubaża inne składniki komórkowe i utrzymuje integralność strukturalną mitochondriów.

Następnie przeprowadzono analizę proteomu każdej frakcji za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (LC/MS). W sumie zidentyfikowano 6 248 białek w ekstrakcie z wszystkich komórek, z których 907 było wcześniej oznaczonych jako mitochondrialne w inwentarzu MitoCarta3.0 ⁵. Po przefiltrowaniu pod kątem białek o progu co najmniej dwóch unikalnych peptydów, obliczyliśmy wynik wzbogacenia dla każdego białka w każdej próbce na podstawie ich intensywności w porównaniu z całkowitą liczbą komórek. Następnie przydzieliliśmy białka do siedmiu głównych przedziałów subkomórkowych: mitochondriów, ER, lizosomów, aparatu Golgiego, cytoszkieletu, jądra i cytozolu, używając Gene Ontology (GO)^16,17 i MitoCarta3.0⁵ jako odniesienia. Co ważne, zaobserwowano średnie wzbogacenie białek mitochondrialnych ponad 10-krotnie i ponad 20-krotnie odpowiednio w surowej i czystej frakcji mitochondriów (Rysunek 2C). W przeciwieństwie do tego, składniki pozostałych sześciu analizowanych przedziałów komórkowych zostały wyczerpane podczas procedury oczyszczania. Na szczególną uwagę zasługuje fakt, że w surowej frakcji mitochondriów zaobserwowaliśmy przejściowe wzbogacenie białek ER i lizosomalnych, dwóch klas białek zanieczyszczających często występujących po protokołach wirowania różnicowego¹⁸. Było to prawdopodobnie spowodowane interakcjami organella-organella i podobnymi współczynnikami sedymentacji, szczególnie w przypadku lizosomów, które są bardzo obfite w makrofagi¹⁹. Podczas gdy oba były w większości wyczerpane po wychwyceniu immunologicznym, wykryliśmy niewielki sygnał dla białek z miejsc kontaktu ER-mitochondria we frakcji mito-czystej.

Następnie bezpośrednio porównaliśmy obfitość białek z wszystkich komórek oraz z próbek o czystości mito i zaobserwowaliśmy dwie odrębne populacje, odpowiadające białkom mitochondrialnym i niemitochondrialnym (Rysunek 2D). Podczas gdy zdecydowana większość białek MitoCarta grupowała się razem, znaleźliśmy kilka (<5%), które grupowały się z białkami innymi niż MitoCarta. Białka te mogą reprezentować (1) cytozolowe białka oddziałujące z mitochondriami (nowa kategoria opisana w wersji 3.0 MitoCarta), (2) białka podwójnie zlokalizowane lub (3) białka z błędnymi adnotacjami. I odwrotnie, znaleźliśmy kilka przypadków białek innych niż MitoCarta grupujących się z białkami mitochondrialnymi. Chociaż takie białka mogą reprezentować zanieczyszczenia w procedurze izolacji, mogą również reprezentować białka, które nie były wcześniej sklasyfikowane jako obecne w mitochondriach.

Aby zbadać tę nową klasę potencjalnych białek mitochondrialnych, zastosowano proteomikę subtraktywną, podejście, które okazało się przydatne do odkrycia proteomów organellarnych, w tym mitochondriów^6,12. Proteomika subtraktywna zakłada, że mitochondria powinny zostać wzbogacone podczas etapów oczyszczania, a zanieczyszczenia powinny zostać wyczerpane⁶. Na przykład, podczas gdy zanieczyszczenia mogą gromadzić się podczas wirowania różnicowego (np. ze względu na podobne właściwości sedymentacji) lub podczas wychwytywania immunologicznego (np. z powodu niespecyficznego wiązania przeciwciał), tylko białka mitochondrialne w dobrej wierze powinny gromadzić się w znacznym stopniu w obu. W ten sposób możliwe jest odfiltrowanie białek, które znajdowały się w czystej frakcji mitochondriów, ale wykazywały niespójne wzorce wzbogacania. W obecnym przykładzie z komórkami RAW264.7, ustalając próg dla unikalnych peptydów ≥1 dla próbek mito-surowych i mito-czystych oraz stosując rygorystyczne progi wzbogacenia, byliśmy w stanie udoskonalić listę odzyskanych proteomów mitochondrialnych z 1,127 białek początkowo znalezionych w surowej frakcji mitochondrialnej po wirowaniu różnicowym, do 481 białek po drugiej rundzie oczyszczania przy użyciu immunoselekcji Tomm22. Zmniejszona liczba białek z adnotacjami MitoCarta we frakcji mito-pure odzwierciedla wysoką rygorystyczność zastosowaną przy selekcji. Co ciekawe, 70 białek obecnych we frakcji mito-pure nie było obecnych w inwentarzu MitoCarta3.0 (Figura 3A, B). Te ostatnie białka mogą reprezentować potencjalne nowe mitochondrialne białka kandydujące, które mogą ulegać ekspresji tylko w linii komórkowej makrofagów RAW264.7 i w komórkach pokrewnych, i które zasługują na dalsze badania.

Rysunek 1: Ilustracja dwuetapowego, wolnego od znaczników protokołu izolacji mitochondriów. (A) Zawiesina komórek jest przerywana przez igłę 25 G. (B) Jądra i całe komórki rozdziela się przez odwirowanie przy 2000 x g i oszczędza się supernatant. (C) Surowe mitochondria są izolowane przez różnicowe odwirowanie supernatantu przy 13 000 x g (mito-surowe). (D) Surowe mitochondria są następnie inkubowane z przeciwciałami Tomm22 (Ab) kowalencyjnie połączonymi z kulkami superparamagnetycznymi. (E) Kompleksy mitochondria-kulki przeciwciała-Tomm22 są oddzielane od zanieczyszczeń za pomocą kolumn magnetycznych i eluowane. (F) Czyste mitochondria są zbierane i zagęszczane przez wirowanie (mito-czyste). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki izolacji mitochondriów z dwóch źródeł makrofagów. (A) Analiza immunoblot białek komórek RAW264.7 (na górze) i BMDM (na dole) przy użyciu przeciwciał przeciwko syntazie cytrynianu mitochondriów (Cs - mitochondria), dehydrogenazie 3-fosforanowej aldehydu glicerynowego (Gapdh - cytozol), pompie sodowo-potasowej (ATPaza Na/K - błona plazmatyczna), Lamina B (Lamina B - jądro), białko błonowe związane z lizosomem 1 (Lamp1 - lizosom) i izomeraza dwusiarczkowa białka (Pdi - ER). (B) Mikroskopia elektronowa oczyszczonych mitochondriów z komórek RAW264.7. Cząstki o dużej gęstości otaczające mitochondria odpowiadają kulkom Tomm22, które są przenoszone z próbkami czystymi mito, po elucji z kolumn. Podziałka liniowa: 80 nm. (C) Wyniki wzbogacenia w wszystkich komórkach, mito-surowych i mito-czystych z siedmiu przedziałów komórkowych w komórkach RAW264.7. Do adnotacji białek użyto MitoCarta3.0 i GO i przedstawiono średnie wyniki. Skrót: ER = retikulum endoplazmatyczne. (D) Wartości obfitości białek (riBAQ) dla białek w komórkach ogółem i próbkach o czystości mito z komórek RAW264.7. Białka MitoCarta3.0 są pokazane na pomarańczowo. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Odkrycie nowych białek mitochondrialnych przy użyciu proteomiki subtraktywnej. (A) Strategia proteomiki subtraktywnej w celu odkrycia nowych białek mitochondrialnych. Wysokie progi wyboru (4x i 2x) są stosowane w celu zminimalizowania wyboru wyników fałszywie dodatnich. (B) Wzbogacenie daje (fałdowanie wszystkich komórek) nowych mitochondrialnych białek kandydujących, które nie były wcześniej oznaczone w inwentarzu MitoCarta3.0. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Połączyliśmy wirowanie różnicowe i wychwytywanie immunologiczne, aby osiągnąć lepszą czystość izolacji mitochondriów. Nasza procedura umożliwia dostęp do materiału pierwotnego w celu identyfikacji i charakterystyki nowych białek mitochondrialnych. Protokół jest prosty i solidny i może być stosowany do linii komórkowych, komórek pierwotnych i tkanek bez konieczności modyfikacji genetycznej. Zwalidowaliśmy nasz protokół poprzez analizy immunoblottingowe i proteomiczne na próbkach pobranych na różnych etapach procedury oczyszczania.

W porównaniu z metodami pojedynczej izolacji, połączenie etapów wzbogacania o różnym charakterze - w tym przypadku wirowania i znakowania immunologicznego - generuje bardziej niezawodny protokół izolacji mitochondriów. Dzieje się tak dlatego, że podczas gdy białka mitochondrialne zostaną wzbogacone w obu oczyszczaniach, jest mało prawdopodobne, aby zanieczyszczenia również zostały wzbogacone po obu etapach wzbogacania. Chociaż wysoką czystość mitochondriów można również osiągnąć poprzez ultrawirowanie w gradionym gradiencie gęstości, takie podejście wymaga dużej ilości materiału wyjściowego i dostępu do ultrawirówki. Wreszcie, w przeciwieństwie do najnowszych metod opartych na izolacji mitochondriów opartej na znacznikach²⁰, nasze podejście nie wymaga modyfikacji genetycznej próbki, dzięki czemu nadaje się ona do materiału pierwotnego z dowolnego źródła.

Pewne względy techniczne i biologiczne muszą być brane pod uwagę w projekcie eksperymentalnym podczas stosowania naszego protokołu. (1) Ilość materiału wyjściowego ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wystarczającej ilości materiału. Nieuchronnie niewielka liczba mitochondriów zostanie utracona podczas homogenizacji (krok 3.10), ponieważ nie wszystkie komórki są poddawane lizie, lub podczas płukania trzech kolumn (krok 4.6). Podczas gdy nasz protokół koncentruje się na czystości, a nie na wydajności, skuteczność izolacji mitochondriów, a tym samym ich wydajność, nie została zmierzona ani zoptymalizowana. Oczekuje się, że użycie większej liczby koralików Tomm22 i większej liczby kolumn zwiększy wydajność odzyskiwania mitochondriów. Jednocześnie dokładna optymalizacja etapu homogenizacji może również prowadzić do poprawy wydajności mitochondriów. Ten protokół i początkowe numery komórek, które podajemy tutaj dla komórek RAW264.7 i BMDM, są odpowiednie dla proteomiki i mogą być dostosowane do innych zastosowań. W przypadku pierwotnych BMDM stwierdziliśmy, że pojedyncza mysz była wystarczająca do jednej replikacji. W razie potrzeby procedurę można zwiększyć w celu wyizolowania BMDM od wielu zwierząt, które następnie można połączyć w celu uzyskania wystarczającej ilości materiału. Liczba komórek można zoptymalizować w zależności od typu komórki, jej wielkości i zawartości mitochondriów. (2) Tomm22 ulega ekspresji w mitochondriach ze wszystkich typów komórek i tkanek²¹, ale jego poziom ekspresji może się różnić. Dlatego podczas projektowania eksperymentu w celu porównania różnych warunków ważne jest, aby upewnić się, że poziomy ekspresji Tomm22 są porównywalne. Ponadto, ze względu na wszechobecną ekspresję Tomm22, nie jest możliwe badanie specyficznych dla typu komórki białek mitochondrialnych w złożonych tkankach. (3) Czas niezbędny do wytworzenia czystych mitochondriów (około 2,5 godziny) jest niezgodny z badaniem zdarzeń przejściowych, takich jak zmiany w profilach metabolicznych. W takim przypadku zalecamy bezpośrednie wychwytywanie immunologiczne na podstawie znaczników⁹, które umożliwia również badanie mitochondriów specyficznych dla typu komórki in vivo²⁰. (4) Chociaż badania na izolowanych mitochondriach uzyskanych przy użyciu samych kulek znakowanych przeciwciałem Tomm22 wykazały aktywność w testach funkcjonalnych¹¹, pozostaje do ustalenia, czy mitochondria wygenerowane za pomocą naszego protokołu są zgodne z dalszymi testami opartymi na aktywności. MitoTracker lub barwienie nadchloranem metylu tetrametylorodaminy (TMRM) lub pomiary respirometryczne są potencjalnymi podejściami do ilościowego określania funkcjonalności izolowanych mitochondriów²². (5) Po wyluzowaniu "mito-czystej" próbki z kolumny, niektóre kulki Tomm22 będą obecne w czystej frakcji mitochondriów (Figura 2B). Chociaż nie zaobserwowaliśmy żadnych zakłóceń w trawieniu trypsyny i spektrometrii mas białek, obecność tych kulek i immunoglobulin powinna być brana pod uwagę w innych dalszych zastosowaniach. Przeciwciało Tomm22 jest przeciwciałem monoklonalnym wytwarzanym u myszy²³, dlatego ważne jest, aby pamiętać, że podczas stosowania przeciwciał drugorzędowych przeciwko myszom w immunoblottingu będzie generować niespecyficzne prążki o wielkości łańcuchów immunoglobulin. (6) Całkowita homogenizacja zawiesiny komórkowej jest kluczem do pomyślnej izolacji mitochondriów. Tutaj używamy strzykawki z igłą 25 G do lizy zarówno komórek RAW264.7, jak i BMDM. Jednak w zależności od typu ogniwa i jego wielkości, inne metody homogenizacji mechanicznej, takie jak homogenizator Dounce lub bardziej kontrolowane podejścia, takie jak urządzenia do homogenizacji komórek, mogą być bardziej odpowiednie. Można również rozważyć niemechaniczne metody homogenizacji, takie jak delikatna sonikacja. Podejścia do homogenizacji tkanek są szerzej omówione w innych badaniach^24,25. (7) Chociaż walidacja za pomocą immunoblottingu jest najprostszą i tańszą metodą, jej wyniki nie zawsze muszą korelować ze zmianami na poziomie całych organelli. Dlatego zalecamy stosowanie proteomiki, aby w pełni zweryfikować wzbogacenie lub zubożenie odpowiednio mitochondriów i innych organelli.

Opisany tutaj dwuetapowy protokół oczyszczania mitochondriów pozwolił nam wygenerować sekwencyjne próbki o rosnącej czystości mitochondriów, a to umożliwiło nam odkrycie nowych kandydatów na białka mitochondrialne poprzez proteomikę subtraktywną¹². Do naszej analizy używamy rygorystycznych progów do selekcji znacznie wzbogaconych białek mitochondrialnych i chociaż może to nie zidentyfikować niektórych znanych białek mitochondrialnych (Figura 3A), odsetek wyników fałszywie dodatnich dla odkrycia nowych białek mitochondrialnych jest zmniejszony. Niemniej jednak ważne jest, aby podkreślić, że wszelkie białka kandydujące ujawnione przez nasz protokół muszą zostać zweryfikowane za pomocą podejść ortogonalnych. Zalecamy znakowanie karboksylowo-końcowym GFP lub stosowanie przeciwciał przeciwko endogennemu białku w celu walidacji związku z mitochondriami pod mikroskopem lub za pomocą testów ochrony proteazy.

Bezpośrednie zastosowanie naszej metody w przypadku niezmodyfikowanych komórek i tkanek stanowi potężne narzędzie do zbadania, w jaki sposób mitochondria zmieniają się i przystosowują do swojego środowiska w warunkach zdrowych i chorobowych. Zastosowanie naszego protokołu do linii komórkowych, modeli chorób zwierzęcych, płynów ludzkich, a nawet biopsji chirurgicznych może okazać się szczególnie przydatne w pogłębieniu naszej wiedzy na temat mitochondriów i związanych z nimi zaburzeń.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Strzykawka 1 ml	BD Plastipal	309628
Igła 25 G BD Microlance		300400
40 µ m Sitko komórkowe	Corning	352340
Anti-TOM22 Mikrogranulki, mysz	Miltenyi Biotec	130-127-693
Skrobak do komórek	FisherScientific	11577692
DMEM, wysoka glukoza, GlutaMAX	ThermoFisher	31966
Kwas etylenodiaminotetraoctowy	FisherScientific	BP-120-1
Surowica bydlęca płodu	Gibco	10270
HEPES	BioConcept	5-31F00-H
LS kolumny i tłoki	Miltenyi Biotec	130-042-401
Czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów	Immunotools	12343115
Mannitol	Sigma	M4125
Chlorek sodu	Sigma	71380
Sacharoza	Sigma	S1888
Penicylina/Streptomycyna	BioConcept	4-01F00-H
Szalki Petriego	Corning	BH93B-102
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami 10X	Eurobio Scientific	CS3PBS01-01
Separator QuadroMACS	Miltenyi Biotec	130-090-976
Analizator żywotności komórek Vi-CELL BLU Beckman	Coulter	C19196