Artykuł metodologiczny

Rozwarstwienie rozstępu naczyniowego dorosłej myszy w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra lub barwienia immunologicznego

4.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65254

⸱

21 kwietnia 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Auditory Development and Restoration Program, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health

W tym artykule

Podsumowanie

Prążek naczyniowy jest niezbędny do generowania potencjału wewnątrzślimakowego. Tutaj przedstawiamy sekcję rozstępów naczyniowych dorosłej myszy w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra lub barwienia immunologicznego.

Streszczenie

Potencjał endoślimakowy, który jest generowany przez prążek naczyniowy, jest niezbędny do utrzymania środowiska sprzyjającego prawidłowej mechanotransdukcji komórek rzęsatych i ostatecznie słuchowi. Patologie rozstępu naczyniowego mogą powodować pogorszenie słuchu. Rozwarstwienie rozstępu naczyniowego dorosłego osobnika pozwala na skoncentrowane wychwycenie pojedynczego jądra, a następnie sekwencjonowanie pojedynczego jądra i barwienie immunologiczne. Techniki te są wykorzystywane do badania patofizjologii prążka naczyniowego na poziomie pojedynczej komórki.

Sekwencjonowanie pojedynczego jądra może być używane w analizie transkrypcyjnej prążka naczyniowego. Tymczasem barwienie immunologiczne jest nadal przydatne w identyfikacji określonych populacji komórek. Obie metody wymagają prawidłowego rozwarstwienia rozstępu naczyniowego jako warunku wstępnego, co może okazać się wyzwaniem technicznym.

Wprowadzenie

Ślimak składa się z trzech komór wypełnionych płynem, scala vestibuli, scala media i scala tympani. Przedsionek scala i błona bębenkowa zawierają perylimfę, która ma wysokie stężenie sodu (138 mM) i niskie stężenie potasu (6,8 mM)1. Pożywka scala zawiera endolimfę, która ma wysokie stężenie potasu (154 mM) i niskie stężenie sodu (0,91 mM)1,2,3. Ta różnica w stężeniu jonów może być określana jako potencjał wewnątrzślimakowy (EP) i jest generowana głównie przez ruch jonów potasu przez różne kanały jonowe i połączenia szczelinowe w prążkowiu naczyniowym (SV) wzdłuż bocznej ściany ślimaka4,5,6,7,8,9,10,11. SV jest heterogenną, silnie unaczynioną tkanką, która wyściela przyśrodkową część bocznej ściany ślimaka i zawiera trzy główne typy komórek: komórki brzeżne, pośrednie i podstawne12 (Rysunek 1).

Komórki brzeżne są połączone ścisłymi połączeniami, tworząc najbardziej przyśrodkową powierzchnię SV. Błona wierzchołkowa jest skierowana w stronę endolimfy pożywki scala i przyczynia się do transportu jonów potasu do endolimfy za pomocą różnych kanałów, w tym KCNE1/KCNQ1, SLC12A2 i Na+-K+-ATPazy (NKA)5,10,13,14. Komórki pośrednie to komórki barwnikowe, które znajdują się między komórkami brzeżnymi i podstawnymi i ułatwiają transport potasu przez SV za pomocą KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. Komórki podstawne leżą w bliskiej odległości od bocznej ściany ślimaka i są ściśle związane z fibrocytami więzadła spiralnego, aby promować recykling potasu z perilymph12. Patologia SV jest związana z licznymi zaburzeniami otologicznymi17,18. Mutacje w genach ulegających ekspresji w głównych typach komórek SV, takich jak Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 i Cldn11, mogą powodować głuchotę i dysfunkcję SV, w tym utratę EP19,20,21,22,23. Oprócz trzech głównych typów komórek, istnieją inne mniej zbadane typy komórek w SV, takie jak wrzecionowate komórki22, root cells12,24, makrophages25, pericytes26 i endothelial cells27, które mają niekompletnie zdefiniowane role związane z homeostazą jonową i generowaniem EP28.

W porównaniu do masowego sekwencjonowania RNA, sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder (sNuc-Seq) dostarcza informacji o niejednorodności komórek, a nie średniej mRNA w grupie komórek29, i może być szczególnie przydatne podczas badania heterogenicznego SV30. Na przykład sNuc-Seq przeprowadził analizę transkrypcyjną, która sugeruje, że komórki wrzeciona i korzenia mogą odgrywać rolę w wytwarzaniu EP, ubytku słuchu i chorobie Meniere'a18. Dalsza charakterystyka transkrypcyjna różnych typów komórek SV może dostarczyć nam bezcennych informacji na temat patofizjologii leżącej u podstaw różnych mechanizmów i podtypów fluktuacji słuchu i ubytku słuchu związanych z SV. Pobranie tych delikatnych struktur ucha wewnętrznego ma ogromne znaczenie dla optymalnej analizy tkanek.

W tym badaniu opisano podejście mikrodysekcji w celu uzyskania dostępu i odizolowania rozstępu naczyniowego od ślimaka dorosłej myszy w celu sNuc-Seq lub barwienia immunologicznego. Sekcja SV dorosłej myszy jest wymagana, aby zrozumieć różne typy komórek SV i dokładniej scharakteryzować ich rolę w słyszeniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty i procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Narodowego Instytutu Chorób Neurologicznych i Udaru Mózgu oraz Narodowego Instytutu Głuchoty i Innych Zaburzeń Komunikacyjnych, National Institutes of Health. Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania w Narodowym Instytucie Chorób Neurologicznych i Udaru Mózgu oraz w Narodowym Instytucie Głuchoty i Innych Zaburzeń Komunikacyjnych w Narodowym Instytucie Zdrowia. Wszystkie metody zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Narodowego Instytutu Chorób Neurologicznych i Udaru Mózgu oraz Narodowego Instytutu Głuchoty i Innych Zaburzeń Komunikacyjnych, Narodowych Instytutów Zdrowia.

1. Eutanazja zwierząt

  1. Użyj myszy transgenicznych C57BL/6J lub Kcnj10-ZsGreen, 30+ dzień po urodzeniu (P30+), które ważą od 15 do 20 g.
  2. Poddaj eutanazji dorosłą mysz (w wieku P30 lat lub starszą) przy użyciu zatwierdzonego protokołu (tutaj uduszenie CO2). Wykonaj dekapitację jako drugi krok.
    UWAGA: W przypadku barwienia immunologicznego niektóre przeciwciała mogą mieć sygnał tła z powodu niespecyficznego wiązania z krwią w naczyniach włosowatych SV. Perfuzja serca z utrwalaczem może rozwiązać ten problem poprzez usunięcie krwi z naczyń włosowatych SV. Jednak większość przeciwciał może osiągnąć dobre wyniki bez tej metody i nie zostanie ona uwzględniona w tym protokole.

2. Odsłanianie kostnego labiryntu

  1. Wyczyść mysz, spryskując ją 70% etanolem i wycierając ręcznikiem papierowym. Zwróć szczególną uwagę na obszar głowy, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia. Usuń skórę z czaszki, pociągając skórę w kierunku nosa.
  2. Za pomocą ostrych nożyczek rozłup czaszkę wzdłuż płaszczyzny strzałkowej, aby oddzielić lewą i prawą część.
  3. Usuń mózg z czaszki, aby odsłonić błędnik kostny.

3. Ekstrakcja ucha wewnętrznego

  1. Zidentyfikuj ucho wewnętrzne w kości skroniowej (Rysunek 2A) i zeskrob nerwy czaszkowe za pomocą kleszczy #55.
    UWAGA: Użytkownik powinien ustabilizować preparat ręką niedominującą za pomocą drugiego zestawu kleszczy #55. Różne obszary próbki mogą być chwytane kleszczami stabilizującymi przez cały czas sekcji, jeśli unika się krytycznych obszarów próbki (np. nie należy zgniatać ślimaka).
  2. Za pomocą kleszczy #55 wypreparuj bullę i kapsułkę, odrywając je od otaczającej kości. Usuń pozostałą tkankę miękką z powierzchni ucha wewnętrznego.
  3. Przenieś próbkę do przezroczystego naczynia do hodowli tkankowej zawierającego 1x zimny PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami), pH 7,4 i umieść pod zakresem preparacji (Ryc. 2B).

4. Rozwarstwienie SV

UWAGA: Przy odrobinie wprawy, możliwe jest rozłożenie SV na jeden długi kawałek przypominający wstążkę. SV jest kruchy, więc jeśli rozpadnie się na kawałki, mogą one być przechowywane razem. Alternatywnie można je przechowywać w oddzielnie oznaczonych studzienkach zgodnie z ich kolejnością (np. podstawowe, środkowe, wierzchołkowe).

  1. Jeśli źródła światła lunety sekcyjnej można przesuwać, umieść jedno światło nad czaszą, a drugie źródło światła z boku, równolegle do powierzchni preparacji. Pozwala to na lepszy kontrast tkanki pod kością ślimaka.
  2. Za pomocą kleszczy #55 przytrzymaj próbkę za część przedsionkową ze ślimakiem skierowanym do góry.
  3. Za pomocą kleszczy #55 przebij kość ślimaka na wierzchołku.
    UWAGA: Kleszcze #5 są grubsze niż #55 i mogą być używane do łamania kości, ale wzrost rozmiaru/siły poświęca delikatność kleszczy i zdolność do manipulowania małymi tkankami. Rozważ użycie kleszczy wykonanych z materiału takiego jak inox lub dumostar, aby uniknąć uszkodzeń, które mogą wystąpić w przypadku delikatniejszych kleszczy. Unikaj wciskania kleszczy zbyt głęboko pod kość, aby uniknąć uszkodzenia SV.
  4. Używając kleszczyków #55, zeskrob wzdłuż wierzchołkowego zwoju (Rysunek 2C), przykładając delikatną siłę, aby oderwać małe kawałki zewnętrznej warstwy kości. Delikatnie unieś kość i odłącz ją od ściany bocznej.
    UWAGA: Pomocne może być myślenie o tej sekcji jako o "usuwaniu wszystkiego z SV", a nie "wycinaniu SV ze ślimaka".
  5. Kontynuuj używanie kleszczyków #55 do usuwania kawałków kości ślimaka z wierzchołkowego i środkowego zwoju (Rysunek 2D,E). Delikatnie dociskając boczną ścianę, podważ i usuń kawałki kościanej ściany w kierunku środkowego obrotu, aby odsłonić boczną ścianę wierzchołkowego i środkowego zwoju.
  6. Kontynuując używanie kleszczy #55, delikatnie odepchnij boczną ścianę wierzchołkowego skrętu, aby odsłonić spiralny ganglion. Odłączyć boczną ścianę wierzchołkowych i środkowych zwojów od spiralnego zwoju wzdłuż zewnętrznej warstwy komórek rzęsatych. Usuń kawałki spiralnego ganglionu z wnętrza ślimaka.
    UWAGA: Kleszczyki #55 są mniejsze i zapewniają przewagę podczas manipulowania małymi i delikatnymi tkankami. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie zginać ich ani nie uszkodzić.
  7. Aby mieć lepszy dostęp do bocznej ściany skrętu podstawy, odłącz ślimak od przedsionkowej części kości skroniowej za pomocą kleszczy #55. Umieść kleszcze #55 w okrągłym i owalnym oknie i popchnij w dół w kierunku przedsionka. Ślimak odczepia się. Usuń przedsionkową część ucha wewnętrznego.
  8. Kontynuując używanie kleszczy #55, usuń teraz kawałki podstawowej kości ślimaka, zaczynając od środkowego obszaru skrętu. Delikatnie wepchnij boczną warstwę ściany pod kość, aby ją odłączyć.
  9. Usuń najdalszą podstawową część ściany bocznej, podważając i delikatnie ciągnąc za tkankę. Kość w tym obszarze może być zbyt gruba, aby można ją było usunąć bez uszkodzenia tkanki miękkiej poniżej.
  10. Teraz, gdy podstawowa część ściany bocznej jest odłączona, oddziel jak największą część ściany bocznej od ślimaka. Można to zrobić, śledząc kleszcze #55 wzdłuż bocznej ściany. Delikatnie przeczesz kleszcze między kością a pozostałą ścianą boczną. Można to zrobić aż do wierzchołka w jednym kawałku, jeśli użytkownik jest doświadczony. Przenieś ścianę boczną na nową PBS.
    UWAGA: Chociaż większe kawałki SV mogą być łatwiejsze do zobrazowania, biorąc pod uwagę delikatną naturę tkanek, można pobrać mniejsze kawałki (Rysunek 2F, G) i w zależności od rozmiaru, mogą również działać do obrazowania.
  11. Użyj kleszczy #55, aby płasko ułożyć ścianę boczną. SV powinien być widoczny jako ciemniejsza warstwa tkanki po wewnętrznej stronie ściany bocznej.
    UWAGA: Użytkownicy mogą stwierdzić, szczególnie bliżej końca wierzchołkowego, że część tkanki SV przypadkowo odrywa się od ściany bocznej podczas sekcji.
  12. Delikatnie podważ warstwę SV, aby oderwać ją od bocznej ściany na jej podstawowym końcu (Rysunek 2H). Delikatnie odepchnij odłączony SV i przesuń kleszcze dalej w kierunku wierzchołkowego końca bocznej ściany, odczepiając SV jako jedną długą wstążkę, jeśli to możliwe (Rysunek 2I). Nie ściskaj SV kleszczami, aby go pociągnąć. Jeśli tkanka jest zbyt delikatna, aby można ją było chwycić, można ją alternatywnie pobrać za pomocą miarki do chusteczek, takiej jak kireta gradówkowa.
    UWAGA: Przesuwanie SV powinno zawsze odbywać się pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że nie zostanie utracone. Zawsze należy zachować ostrożność podczas chwytania za pomocą kleszczy ze względu na ryzyko uszkodzenia. Użytkownicy mogą uznać, że stosowanie kirety gradówkowej zmniejsza ryzyko uszkodzenia tkanki SV. W przypadku sekwencjonowania pojedynczego jądra należy przejść do sekcji 5. W przypadku barwienia immunologicznego SV należy przejść do sekcji 7.

5. Zawiesina jednojądrowa SV

UWAGA: Ten protokół jest dostosowany do tkanki SV na podstawie opublikowanego protokołu zawiesiny jednojądrowej producenta. Można używać platform różnych producentów31. Biorąc pod uwagę warianty specyficzne dla platformy, zaleca się zapoznanie się z protokołem specyficznym dla producenta dostarczonym ze sprzętem. Aby osiągnąć optymalne wyniki dla sNuc-Seq i zminimalizować degradację RNA, im szybsza sekcja tkanki, tym lepiej (zalecane w ciągu 15-20 minut od eutanazji). Pomocne może być poddanie eutanazji jednego zwierzęcia na raz i tylko wtedy, gdy jest ono gotowe do przeprowadzenia sekcji. Jednoczesna praca wielu osób przy sekcjach może również wyeliminować czas degradacji (np. jeden personel laboratoryjny pracuje nad lewym uchem, podczas gdy inny pracuje nad prawym uchem).

  1. Jeśli tkanka SV będzie używana do sNuc-Seq, umieść tkankę w schłodzonym buforze do lizy (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,005% nonidetu P40 w wodzie wolnej od nukleaz).
    UWAGA: Jeśli sekwencjonowanie ma być wykonane bezpośrednio po sekcji, kontynuuj protokół. Jeśli pożądane jest wstrzymanie protokołu, zachowanie SV jest możliwe poprzez umieszczenie SV w RNAlater. Przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C, a następnie błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Gdy produkt jest gotowy do użycia, rozmrozić i umyć dwukrotnie w PBS przez 5 minut, a następnie przystąpić do homogenizacji (krok 5.2).
  2. Homogenizuj tkankę w homogenizatorze o pojemności 2 ml za pomocą 10-20 uderzeń na lód.
    UWAGA: Szklany cylinder ręcznie zetknie się z dnem szklanej rurki, rozdrobniwszy SV. SV jest delikatny, więc 20 uderzeń zwykle zapewnia udaną homogenizację.
  3. Lizować tkankę na lodzie przez 25 min.
    UWAGA: Czas lizy różni się w zależności od typu tkanki. 25-minutowa liza w tkance SV może osiągnąć niską żywotność komórek (mniej niż 4%), ale czas może być dostosowany, jeśli żywotność komórek jest zbyt wysoka (krok 5.8).
  4. Przefiltrować przez filtr 30 μm i wirować filtrat o masie 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu do płukania jąder i reprodukcji (1x PBS, 1% albuminy surowicy bydlęcej [BSA], 0,2U/μL inhibitora RNazy).
  6. Przefiltrować komórki przez filtr 10 μm i odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 50 μl buforu do płukania jąder i do ponownego zawieszenia.
  8. Policz jądra za pomocą licznika komórek i barwienia trypanem niebieskim. Rozcieńczyć 5 μl zawiesiny komórek w 50 μl 1x PBS do zliczania komórek; W tym momencie żywotność powinna być minimalna (3%-4%). Jeśli okaże się, że żywotność jest wyższa, dostosuj protokół do kroku 5.3 (liza) i ustandaryzuj czas lizy, aby zapewnić odpowiednią lizę komórek.
    UWAGA: Wysoka żywotność komórek w preparacie pojedynczego jądra oznacza, że jest więcej nienaruszonych komórek niż jest to pożądane i że może być wymagane dodatkowe trawienie.
  9. Załadować próbkę o żądanej gęstości jądrowej do aparatury/chipa producenta (patrz przewodnik producenta). Wychwyty pojedynczych jąder są już gotowe.
    UWAGA: Z jednej dorosłej myszy SV zwykle uzyskuje się 50 μl zawiesiny o stężeniu 150 000 jąder/ml.

6. Sekwencjonowanie pojedynczego jądra SV

  1. Wyślij próbki do głównego zakładu w celu sekwencjonowania.
    UWAGA: Ta część protokołu jest zgodna z ogólnymi krokami (1) generowania i kodowania kreskowego emulsji żelowej (GEM) kulek żelowych, (2) czyszczenia po GEM-RT i amplifikacji cDNA oraz (3) budowy biblioteki ekspresji genów 3'. Pozostała część protokołu sNuc-Seq jest stosunkowo długa i zaleca się, aby czytelnicy korzystali z protokołu specyficznego dla producenta. Przewodnik producenta prawdopodobnie będzie opisywał kroki wraz z konkretnymi szczegółami i towarzyszącymi obrazami. Na stronie producenta mogą znajdować się również filmy instruktażowe. Wygenerowane zestawy danych mogą być reprezentowane w sposób zredukowany wymiarowo, na przykład za pomocą jednorodnego przybliżenia i projekcji rozmaitości (UMAP; Rysunek 3). Wiele laboratoriów korzysta z rdzenia sekwencjonowania, który może wykonywać ten protokół dla użytkowników.

7. Barwienie immunologiczne SV i montaż tkanek

  1. Jeśli tkanka będzie używana do barwienia immunologicznego, przenieś ją na 24-dołkową płytkę, zanurzoną w 200 μl 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Pomocne jest wykonanie całego usuwania płynów, mycia i barwienia immunologicznego pod mikroskopem. Wizualizacja podczas pipetowania tkanki zapewni, że nie zostanie ona przypadkowo utracona podczas usuwania płynu. Objętość przeciwciał i roztworów do płukania można dostosowywać, o ile objętość jest wystarczająco duża, aby zanurzyć tkankę SV w roztworze.
  2. Po etapie utrwalania usunąć PFA, wykonując dwa krótkie płukania w 1x PBS (około 500 μL) w temperaturze 4 °C przez 5 minut każde na wytrząsarce orbitalnej przy niskich (30-50) obr./min. W przypadku przechowywania, tkanka może być przechowywana w 1x PBS w temperaturze 4 °C.
  3. Usunąć PBS i przepuszczalność i blokować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej w około 300 μl roztworu PBS-T (0,05 Tween20 w 1x PBS z 10% płodową surowicą bydlęcą).
    UWAGA: Przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe należy rozcieńczyć w tym roztworze blokującym.
  4. Wybarwić tkankę przeciwciałem pierwszorzędowym zgodnie ze specyfikacją konkretnego użytego przeciwciała, zwykle przez noc w temperaturze 4 °C. Usunąć pozostały PBS i dodać rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe.
    UWAGA: Rozcieńczenie należy dobrać na podstawie sugestii producenta, opublikowanych danych, wcześniejszych doświadczeń itp. Zwykle pierwszym stężeniem do zbadania jest rozcieńczenie 1:100-200. W przykładzie przedstawionym w tym artykule, przeciwciała GS-IB4 i DAPI rozcieńczono w stosunku 1:200. W przypadku barwienia dla więcej niż jednego białka, wiele przeciwciał pierwszorzędowych można połączyć w tym samym roztworze, o ile każde przeciwciało pierwszorzędowe ma innego gospodarza, aby uniknąć reaktywności krzyżowej przeciwciał drugorzędowych.
  5. Zmyj przeciwciało pierwszorzędowe z tkanki za pomocą około 500 μl 1x PBS dwa razy przez 10 minut każdy na wytrząsarce orbitalnej przy niskich obrotach.
    UWAGA: Kontynuuj upewnienie się, że tkanka SV jest zanurzona w roztworze i nie utknęła z boku studzienki.
  6. Barwienie przeciwciałem wtórnym zgodnie ze specyfikacją konkretnego użytego przeciwciała, zwykle przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej przy niskich obrotach. Przykryj płytkę 24-dołkową, tak aby znakowane fluorescencyjnie przeciwciało drugorzędowe było chronione przed światłem.
    UWAGA: Jeśli potrzebne jest więcej niż jedno przeciwciało drugorzędowe, połącz przeciwciała drugorzędowe w tym samym roztworze. Upewnij się, że unikasz etykietowania krzyżowego.
  7. Zmyj przeciwciało wtórne z tkanki za pomocą około 500 μl 1x PBS cztery razy przez 5 minut każdy na wytrząsarce orbitalnej przy niskich obrotach. Płytkę 24-dołkową należy przykryć w celu ochrony przed światłem.
  8. Przygotuj większe szkiełko podstawowe (75 mm x 25 mm), umieszczając dwie małe smugi kleju wzdłuż osi 25 mm, nieco mniejsze niż mniejsze szklane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 mm x 18 mm. Umieść jedną kroplę odczynnika montażowego (około 50 μl) między smugami kleju.
    UWAGA: Klej tworzy niewielką ilość przestrzeni w pionie, dzięki czemu po umieszczeniu drugiego szkiełka nakrywkowego na wierzchu, próbka tkanki SV może bezpiecznie istnieć, ale nadal pozostaje na miejscu. Chociaż grubość prążków wynosi 30-40 mikronów, należy unikać ściskania tkanki między szklanymi powierzchniami, aby zachować morfologię. Alternatywnie można również użyć przezroczystej taśmy.
  9. Używając kleszczyków #55, chwyć jak najmniej tkanki na jednym końcu SV i przenieś z PBS do kropli odczynnika montażowego na większym mikroszkiełku (75 mm x 25 mm). Umieść jeden koniec mniejszego szklanego szkiełka nakrywkowego (18 mm x 18 mm) na szkiełku podstawowym w miejscu, w którym umieszczono jedną smugę kleju i delikatnie zwolnij, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza. Szkiełko nakrywkowe spadnie na drugą smugę kleju i pokryje tkankę SV.
  10. Uszczelnij uchwyt, nakładając kroplę przezroczystego lakieru do paznokci na każdy róg uchwytu. Oznacz próbkę odpowiednio na szklanym szkiełku nakrywkowym z dala od pola wizualizacji. Jest teraz gotowy do mikroskopii konfokalnej (Rysunek 4).
  11. Wizualizuj tkankę SV za pomocą mikroskopu preparacyjnego, aby upewnić się, że leży płasko i nie znajduje się w pobliżu pęcherzyków powietrza. Jeśli tkanka SV nie jest prawidłowo zorientowana, użytkownik może spróbować wypchnąć pęcherzyki powietrza lub ostrożnie usunąć mniejsze szklane szkiełko nakrywkowe i zmienić położenie SV. Należy to zrobić delikatnie, aby uniknąć stłuczenia szklanych szkiełek nakrywkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiamy metodę izolacji SV, która może zostać wykorzystana do sNuc-Seq lub immunobarwienia. Odpowiednia anatomia (Rysunek 1) ślimaka w stosunku do SV może pomóc użytkownikom lepiej zrozumieć organizację SV oraz poszczególne etapy protokołu sekcji.

Każdy krok tej mikrodysekcji pęcherzyków nasiennych (SV) u myszy w wieku P30 został szczegółowo opisany w powiązanym filmie, a migawki kluczowych etapów tej dysekcji i izolacji SV przedstawiono na

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przed pojawieniem się sekwencjonowania pojedynczych komórek wielu badaczy stosowało analizę tkanek masowych, która umożliwiła jedynie analizę transkryptomów uśrednionych w komórkach. W szczególności jednokomórkowość i sNuc-Seq umożliwiły wyizolowanie transkryptomu odpowiednio pojedynczej komórki lub pojedynczego jądra32. W tym przypadku transkryptomy jednojądrowe można zidentyfikować dla komórek brzeżnych, pośrednich i podstawnych, a także komórek wrzecionowatych30. Umożliw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było częściowo wspierane przez Intramural Research Program NIH, NIDCD to M.H. (DC000088)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10-&mikro; m filtr (Polyethylenterephthalat)PluriSelect#43-50010-01Filtr tkankowy podczas sNuc-Seq
18 x 18 mm szkło osłonoweFisher Scientific12-541ASzkiełko nakrywkowe do montażu SV
30-µ m filtr (Polyethylenterephthalat)PluriSelect#43-50030-03Filtruj tkankę podczas sNuc-Seq
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus MicroslideDaiggerEF15978ZMicroslide do montażu SV na
myszach C57BL/6JThe Jackson LaboratoryRRID: IMSR_JAX:000664Szczep myszy ogólnego przeznaczenia, który ma pigment łatwiej widoczny w komórkach pośrednich SV.
Licznik komórekLogos BiosystemsL20001Służy do liczenia komórek
Łyżeczka Chalizon 5 '', rozmiar 3 2,5 mmBiomedyczne instrumenty badawcze15-1020Służy do przenoszenia SV
Chromium Next GEM single cell 3' GEM Kit v3.1ChromiumPN-1000141Generuje biblioteki ekspresji genów 3' pojedynczej komórki
Bezbarwny lakier do paznokciFisher ScientificNC1849418Służy do uszczelniania mocowania SV
Corning Falcon Standardowe naczynia do hodowli tkankowych, 24-dołkoweCorning08-772BNaczynie hodowlane używane do przechowywania próbki podczas sekcji
DAPIInvitrogenD1306, RRID: AB_2629482Barwnik używany do znakowania jądra
Homogenizator DounceSigma-AldrichD8938Służy do homogenizacji tkanek do kleszczy
sNuc-seq Dumont #5Fine Science Tools11252-30Ogólne kleszcze do preparacji
Dumont #55 KleszczeFine Science Tools11255-20Kleszcze z cienką końcówką, która ułatwia manipulację SV
Płodowa surowica bydlęcaThermoFisher 16000044Używany do etapów sNuc-Seq
Klej w sztyfcieFisher ScientificNC0691392Służy do montażu przeciwciała
GS-IB4 SondyI21411, RRID: AB-2314662Przeciwciało używane do znakowania kapilarnego
myszy KCNJ10-ZsGreenn/a/aTransgeniczna mysz, która wykazuje ekspresję KCNJ10-ZsGreen, częściowo w komórkach pośrednich SV.
MgCl2ThermoFisherAM9530GUżywany do etapów sNuc-Seq
Odczynnik montażowyThermoFisher#S36940Odczynnik montażowy do
płytki SV Multiwell 24 dołkówCorning#353047Płytka używana do barwienia immunologicznego
NaClThermoFisherAAJ216183Używana do etapów sNuc-Seq
Nonidet P40Sigma-Aldrich9-16-45-9Używany do kroków sNuc-Seq
Woda wolna od nukleazThermoFisher4387936Używany do etapów sNuc-Seq
Wytrząsarka orbitalnaSilent ShakeSYC-2102AUżywany do etapów barwienia immunologicznego
PBSThermoFisherJ61196. APUżywany do etapów barwienia immunologicznego i sekcji
RNA PóźniejInvitrogenAM7021Używany do konserwacji SV dla sNuc-Seq
ScizzorsFine Science Tools14058-09Używany do rozłupywania czaszki myszy
Tris-HClSigma-Aldrich15506017Używany do etapów sNuc-Seq
Trypan blue barinGibco15250061Używany do liczenia komórek
Tween20ThermoFisherAAJ20605AP Używany do kroków sNuc-Seq
Mikroskop stereoskopowy Zeiss STEMI SV 11 ApoMikroskop Zeissn/aużywany do sekcji
molekularnego SV n

Bibliografia

  1. Bosher, S. K., Warren, R. L. Observations on the electrochemistry of the cochlear endolymph of the rat: a quantitative study of its electrical potential and ionic composition as determined by means of flame spectrophotometry. Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 171 (1023), 227-247 (1968).
  2. Patuzzi, R. Ion flow in stria vascularis and the production and regulation of cochlear endolymph and the endolymphatic potential. Hearing Research. 277 (1-2), 4-19 (2011).
  3. Wangemann, P. K+ cycling and the endocochlear potential. Hearing Research. 165 (1-2), 1-9 (2002).
  4. Adachi, N., et al. The mechanism underlying maintenance of the endocochlear potential by the K+ transport system in fibrocytes of the inner ear. The Journal of Physiology. 591 (18), 4459-4472 (2013).
  5. Hibino, H., Nin, F., Tsuzuki, C., Kurachi, Y. How is the highly positive endocochlear potential formed? The specific architecture of the stria vascularis and the roles of the ion-transport apparatus. Pflugers Archiv. 459 (4), 521-533 (2010).
  6. Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 293 (4), C1187-C1208 (2007).
  7. Liu, W., Schrott-Fischer, A., Glueckert, R., Benav, H., Rask-Andersen, H. The human "cochlear battery"-claudin-11 barrier and ion transport proteins in the lateral wall of the cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 239(2017).
  8. Marcus, D. C., Wu, T., Wangemann, P., Kofuji, P. KCNJ10 (Kir4.1) potassium channel knockout abolishes endocochlear potential. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (2), C403-C407 (2002).
  9. Spicer, S. S., Schulte, B. A. Differentiation of inner ear fibrocytes according to their ion transport related activity. Hearing Research. 56 (1-2), 53-64 (1991).
  10. Wangemann, P., Liu, J., Marcus, D. C. Ion transport mechanisms responsible for K+ secretion and the transepithelial voltage across marginal cells of stria vascularis in vitro. Hearing Research. 84 (1-2), 19-29 (1995).
  11. Yoshida, T., et al. The unique ion permeability profile of cochlear fibrocytes and its contribution to establishing their positive resting membrane potential. Pflugers Archiv. 468 (9), 1609-1619 (2016).
  12. Johns, J. D., Adadey, S. M., Hoa, M. The role of the stria vascularis in neglected otologic disease. Hearing Research. 428, 108682(2023).
  13. Kim, J., Ricci, A. J. In vivo real-time imaging reveals megalin as the aminoglycoside gentamicin transporter into cochlea whose inhibition is otoprotective. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (9), e2117846119(2022).
  14. Zdebik, A. A., Wangemann, P., Jentsch, T. J. Potassium ion movement in the inner ear: insights from genetic disease and mouse models. Physiology. 24, 307-316 (2009).
  15. Chen, J., Zhao, H. B. The role of an inwardly rectifying K+ channel (Kir4.1) in the inner ear and hearing loss. Neuroscience. 265, 137-146 (2014).
  16. Steel, K. P., Barkway, C. Another role for melanocytes: their importance for normal stria vascularis development in the mammalian inner ear. Development. 107 (3), 453-463 (1989).
  17. Ito, T., Nishio, A., Wangemann, P., Griffith, A. J. Progressive irreversible hearing loss is caused by stria vascularis degeneration in an Slc26a4-insufficient mouse model of large vestibular aqueduct syndrome. Neuroscience. 310, 188-197 (2015).
  18. Gu, S., et al. Characterization of rare spindle and root cell transcriptional profiles in the stria vascularis of the adult mouse cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 18100(2020).
  19. Gow, A., et al. Deafness in claudin 11-null mice reveals the critical contribution of basal cell tight junctions to stria vascularis function. The Journal of Neuroscience. 24 (32), 7051-7062 (2004).
  20. Chang, Q., et al. Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome. EMBO Molecular Medicine. 7 (8), 1077-1086 (2015).
  21. Faridi, R., et al. Mutational and phenotypic spectra of KCNE1 deficiency in Jervell and Lange-Nielsen Syndrome and Romano-Ward Syndrome. Human Mutation. 40 (2), 162-176 (2019).
  22. Wangemann, P., et al. Loss of KCNJ10 protein expression abolishes endocochlear potential and causes deafness in Pendred syndrome mouse model. BMC Medicine. 2, 30(2004).
  23. Kitajiri, S. -I., et al. Expression patterns of claudins, tight junction adhesion molecules, in the inner ear. Hearing Research. 187 (1-2), 25-34 (2004).
  24. Jagger, D. J., Nevill, G., Forge, A. The membrane properties of cochlear root cells are consistent with roles in potassium recirculation and spatial buffering. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (3), 435-448 (2010).
  25. Ito, T., Kurata, N., Fukunaga, Y. Tissue-resident macrophages in the stria vascularis. Frontiers in Neurology. 13, 818395(2022).
  26. Zhang, J., et al. VEGFA165 gene therapy ameliorates blood-labyrinth barrier breakdown and hearing loss. JCI Insight. 6 (8), e143285(2021).
  27. Shi, X. Pathophysiology of the cochlear intrastrial fluid-blood barrier (review). Hearing Research. 338, 52-63 (2016).
  28. Gu, S., et al. Identification of potential Meniere's disease targets in the adult stria vascularis. Frontiers in Neurology. 12, 630561(2021).
  29. Fischer, J., Ayers, T. Single nucleus RNA-sequencing: how it's done, applications and limitations. Emerging Topics in Life Sciences. 5 (5), 687-690 (2021).
  30. Korrapati, S., et al. Single cell and single nucleus RNA-Seq reveal cellular heterogeneity and homeostatic regulatory networks in adult mouse stria vascularis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 316(2019).
  31. Pyle, M. P., Hoa, M. Applications of single-cell sequencing for the field of otolaryngology: A contemporary review. Laryngoscope Investigative Otolaryngology. 5 (3), 404-431 (2020).
  32. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
  33. Shafer, M. E. R. Cross-species analysis of single-cell transcriptomic data. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 175(2019).
  34. Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-cell RNA-Seq technologies and related computational data analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317(2019).
  35. Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nature Reviews Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).
  36. Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. Journal of Pathology and Translational Medicine. 57 (1), 52-59 (2023).
  37. Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).
  38. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visuazlied Experiments. (107), e53561(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wewn trzne ucho myszysekcja stria vascularisboczna ciana limakaizolacja j der kom rkowychobrazowanie konfokalnepotencja endokochlearnymechanotransdukcja kom rek rz satych

Powiązane artykuły